CN116515751A - 一种自体特异性t细胞的体外扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种自体特异性T细胞的体外扩增方法，包括如下步骤：步骤(1)，从患者的外周血中分离外周血单个核细胞(即PBMCs)；步骤(2)，根据需要加入相应的T细胞刺激因子，在相应的培养基中对所述外周血单个核细胞(PBMCs)进行体外培养来扩增T细胞，本发明提供了自体细胞进行体外培养的标准方法，细胞体外扩增效果稳定，成功率高，可以根据临床的各种需求制备相应功能的免疫活性细胞，可以通过体外培养使其紊乱的T细胞体系恢复常态，并能达到百倍的多克隆化的扩增，回输至患者体内后可以用于患者的免疫系统重建，另外，也可以培养出具有杀伤病毒和肿瘤作用的高度特异性的克隆化T细胞。
Description
技术领域
本发明涉及一种自体特异性T细胞的体外扩增方法，属于细胞技术领域。
背景技术
肿瘤的治疗一直采用三种传统治疗方法，即放疗、化疗及手术治疗。传统的手术治疗只能解决局部问题，放疗及化疗在杀伤癌细胞的同时还会使人体正常组织和细胞受到损伤，尤其是对主导细胞免疫的T细胞的免疫功能影响极大，易形成二次肿瘤。因此，放疗、化疗及手术三大传统治疗方式一直存在着不彻底、易转移、副作用大等弊端。
近年来，一个新的肿瘤自体细胞免疫治疗方法(也称肿瘤生物治疗)已成为现代肿瘤治疗的第四种模式。包括CIK(Cytokine Induced Killer,细胞因子诱导的杀伤细胞)细胞免疫疗法、LAK细胞(Lymphokine Activated Killer Cells,淋巴因子激活的杀伤细胞)免疫疗法、TIL细胞(Tumor Infiltrating Lymphocyte,肿瘤浸润淋巴细胞)免疫疗法和DC细胞(树突状细胞)免疫疗法以及CAR-T等。
其中，CIK细胞是用CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(又称CD3AK细胞)，是LAK和TIL之后出现的一种较新型的抗肿瘤效应细胞，目前在国内应用较多。CIK细胞具有体外扩增能力强和一定的抗瘤能力等特点，克服了LAK和TIL细胞在肿瘤治疗中的一些不足，但是CIK疗法的主要局限性是此法细胞体外激活具有广谱性，缺乏对某些肿瘤细胞特异的杀伤作用。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种自体特异性T细胞的体外扩增方法及培养得到的产品(自体特异性T细胞体系)、该产品在制药中的应用和对该产品组分的监测方法，采用该体外扩增方法可以在GMP的环境下根据临床的不同需要制备出不同功能性的多克隆免疫活性细胞，可用于肿瘤、病毒感染或放、化疗引起的免疫损伤后的免疫重建,用于抗肿瘤及抗病毒的细胞免疫治疗，相应的组分监测方法可用于所制备的自体特异性T细胞体系或药物的质量监控与评价，以保证该体外扩增方法及其制备的自体特异性T细胞体系的规范化与标准化，并可以对临床疗效进行有效的评价。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种自体特异性T细胞的体外扩增方法，包括如下步骤：
步骤(1)，从患者的外周血中分离外周血单个核细胞(即PBMCs)；
步骤(2)，根据需要加入相应的T细胞刺激因子，在相应的培养基中对所述外周血单个核细胞(PBMCs)进行体外培养来扩增T细胞。优选地，所述步骤(2)包括：
步骤(2.1)，所述培养基设为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM培养基，用CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM培养基将所述外周血单个核细胞(PBMCs)制成细胞密度为1x106/ml2x106/ml的细胞悬液；
步骤(2.2)，在所述细胞密度为1x106/ml2x106/ml的细胞悬液中加入HUMAN T-ACTIVATOR CD3/CD28、IL-Ⅱ、IL-15和IL-7培养48-72小时；
步骤(2.3)，所述步骤(2.2)之后再加入TWS119和TNF-A在CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM培养基里继续培养；
步骤(2.4)，收获T细胞。
优选地，所述加入HUMAN T-ACTIVATOR CD3/CD28、IL-Ⅱ、IL-15和IL-7的方式为先分别制成IL-Ⅱ的以及IL-15和IL-7的混合物，然后再分别添加。
优选地，所述步骤(1)中采用密度梯度法分离外周血单个核细胞。
一种自体特异性T细胞体系，其中的全部或部分T细胞为采用上述的自体特异性T细胞的体外扩增方法经体外扩增制得的。
优选地，所述体系中的中的T细胞总量(CD3+T细胞)高于98％。
当所述体系用于免疫重建时，其中的CD4 T细胞亚群(CD3+CD4+T细胞)含量高于60％；当所述体系用于免疫治疗时，其中的CD4 T细胞亚群(CD3+CD4+T细胞)含量不低于15％；
当所述体系用于免疫重建时，其中的CD8 T细胞亚群(CD3+CD8+T细胞)含量不高于40％且不低于20％；当所述体系用于免疫治疗时，其中的CD8 T细胞亚群(CD3+CD8+T细胞)含量高于80％；
所述体系中T细胞含量高于90％；
所述活化的T细胞亚群包括CD4+CD38+HLADR+和CD8+CD38+HLADR+两个T细胞亚群；
所述体系中的抗肿瘤活性T细胞亚群(CD8+CD45RO+CD62L+，Tcm)含量高于70％，优选为高于90％；
所述抗肿瘤活性T细胞亚群(CD8+CD45RO+CD62L+，Tcm)不超过5％不表达CD62L；
所述体系中的记忆T细胞亚群含量高于95％，所述记忆T细胞亚群通常应为CD8+CD45RO+。
优选为，上述任一种自体特异性T细胞体系，其中的调节性T细胞亚群(CD4+CD25+FoxP3+，Treg)含量低于5％。
本发明的有益效果：
1本发明提供了自体细胞进行体外培养的标准方法，细胞体外扩增效果稳定，成功率高，可以根据临床的各种需求制备相应功能的免疫活性细胞，如对于因肿瘤、病毒感染或放疗、化疗引起免疫损伤的患者，可以通过体外培养使其紊乱的T细胞体系恢复常态，并能达到百倍的多克隆化的扩增，回输至患者体内后可以用于患者的免疫系统重建，另外，也可以培养出具有杀伤病毒和肿瘤作用的高度特异性的克隆化T细胞，可以用于抗肿瘤和抗病毒的细胞免疫治疗，尤其是可以在培养体系中产生大量的具有抗肿瘤能力和免疫活性的CTC细胞前体，使得克隆化的T细胞在患者体内的存留更加持久，有利于提高疗效；
2对于同源的平行样本，采用本发明的方法培养后，CD3+CD8+T细胞表达高达92.46％，远高于现有技术的49.25％，且几乎全部为高表达的CD8+T细胞，尤其是几乎全部表达CD3CD8细胞，与现有技术的方法培养后尚有很多低表达的CD8+T细胞和不表达的CD3CD8细胞相比有益效果明显，更为重要的是，采用本发明的方法培养后的样本中，表型为CD8CD45ROCD62L具有高度肿瘤杀伤作用的中央型记忆细胞(Tcm)高达92.85％，且其中仅仅0.09％不表达CD62L，而用现有技术的方法培养后的样本中，其Tcm只占39.64％，且其中有47.77％的记忆细胞(CD45RO)不表达CD62L；
3本发明的组分监测方法可以对培养后的细胞体系进行有效的分析和评价，不仅可以在应用前、后分别进行分析和评价，尤其是可以全程追踪T细胞的克隆化变化，可以准确反应细胞体系中的有效成分含量，为评价细胞体系的疗效及患者的恢复状况提供了有效的监测，有助于治疗方案的调整，有助于达到最佳的疗效。
附图说明
图1为本发明提供的一种自体特异性T细胞的体外扩增方法的细胞表型流式分析结果表；
图2是采用本发明的自体特异性T细胞的体外扩增方法与现有技术对同一份样本进行培养，并采用本发明的监测方法对得到的体系进行细胞表型分析所得到的结果对照示意图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
第一实施例：一种自体特异性T细胞的体外扩增方法，包括如下步骤：
步骤(1)，采集患者50ml外周血，从患者的外周血中分离外周血单个核细胞(即PBMCs)，优选地，外周血可以用EDTA或肝素抗凝，可以采用密度梯度法分离外周血单个核细胞；
步骤(2)，根据需要加入相应的T细胞刺激因子，加入或不加入相应的细胞生长因子，在相应的培养基中对步骤(1)分离出的外周血单个核细胞进行体外培养来扩增T细胞。
优选地，所述步骤(2)包括：
步骤(2.1)，用CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM培养基将所述步骤(1)分离得到的外周血单个核细胞制成细胞密度为1x106/ml～2x106/ml的细胞悬液40ml；
步骤(2.2)，所述步骤(2.1)之后，加入HUMAN T-ACTIVATOR CD3/CD28、IL-Ⅱ、IL-15和IL-7进行供培养，培养时间一般为48-72小时左右，之后，去除或不去除T细胞刺激因子的附加物，所述加入/>HUMAN T-ACTIVATOR CD3/CD28、IL-Ⅱ、IL-15和IL-7的方式优选为先分别制成IL-Ⅱ的以及IL-15和IL-7的混合物，然后再分别添加；
步骤(2.3)，所述步骤(2.2)之后再加入TWS119和TNF-A在CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM培养基里继续培养，所述加入TWS119和TNF-A的方式优选为二者分别添加。
通常，所述步骤(2.3)之后还包括：步骤(2.4)，收获T细胞。
可以根据细胞数量确定培养时间，例如，通常，所述收获T细胞的条件可以为下列任一条件：所述步骤(2.3)的培养时间达到10-12天(用于免疫重建时)或10-14天(用于免疫治疗时)；或者，T细胞数量达到培养要求；或者，全程体外培养时间达到10-12天(用于免疫重建时)或10-14天(用于免疫治疗时)。
第二实施例：一种自体特异性T细胞体系，其中的全部或部分T细胞为采用上述上述第一实施例所用的方法经体外扩增制得的。
优选地，其中的T细胞总量(CD3+T细胞)高于98％。
当所述体系用于免疫重建时，其中的CD4 T细胞亚群(CD3+CD4+T细胞)含量高于60％；当所述体系用于免疫治疗时，其中的CD4 T细胞亚群(CD3+CD4+T细胞)含量不低于15％。
当所述体系用于免疫重建时，其中的CD8 T细胞亚群(CD3+CD8+T细胞)含量不高于40％且不低于20％；当所述体系用于免疫治疗时，其中的CD8 T细胞亚群(CD3+CD8+T细胞)含量高于80％，优选为高于90％。
其中T细胞含量高于90％，优选为高于95％。所述活化的T细胞亚群通常应包括CD4+CD38+HLADR+和CD8+CD38+HLADR+两个T细胞亚群，优选地，CD4+CD38+HLADR+和CD8+CD38+HLADR+各自的含量均高于45％。
其中的抗肿瘤活性T细胞亚群(CD8+CD45RO+CD62L+，Tcm)含量高于70％，优选为高于90％。
所述抗肿瘤活性T细胞亚群(CD8+CD45RO+CD62L+，Tcm)不超过5％不表达CD62L，优选为不超过1％不表达CD62L，更优选为不超过0.1％不表达CD62L。
其中的记忆T细胞亚群含量高于95％。所述记忆T细胞亚群通常应为CD8+CD45RO+，优选地，CD8+CD45RO+的含量高于95％。
优选为，上述任一种自体特异性T细胞体系，其中的调节性T细胞亚群(CD4+CD25+FoxP3+，Treg)含量低于5％。
本发明提供了自体细胞进行体外培养的标准方法，细胞体外扩增效果稳定，成功率高，可以根据临床的各种需求制备相应功能的免疫活性细胞，如对于因肿瘤、病毒感染或放疗、化疗引起免疫损伤的患者，可以通过体外培养使其紊乱的T细胞体系恢复常态，并能达到百倍的多克隆化的扩增，回输至患者体内后可以用于患者的免疫系统重建，另外，也可以培养出具有杀伤病毒和肿瘤作用的高度特异性的克隆化T细胞，可以用于抗肿瘤和抗病毒的细胞免疫治疗，尤其是可以在培养体系中产生大量的具有抗肿瘤能力和免疫活性的CTC细胞前体，使得克隆化的T细胞在患者体内的存留更加持久，有利于提高疗效；
本发明的自体特异性T细胞体系较为完善，可以对许多不可控因素进行控制，能够扩增足量的细胞数量，降低了扩增失败的概率，且培养后的细胞缺乏杀伤肿瘤的特异性；
第三实施例：一种自体特异性T细胞体系在制备用于免疫系统重建和免疫治疗的药物中的应用，所述自体特异性T细胞体系由上述第二实施例的自体特异性T细胞体系构成。
通常，所述免疫系统重建主要指对于因肿瘤、病毒感染或放疗、化疗引起的免疫系统损伤后的免疫系统重建，所述免疫治疗主要指对于肿瘤、病毒感染的细胞免疫生物治疗。
上述第二实施例的自体特异性T细胞体系在制备药物中的应用，其药物中的有效成分可以全部为所述自体特异性T细胞体系(即该体系的独立应用)，也可以部分为所述自体特异性T细胞体系(即该体系与其它成分的混合应用)。
第四实施例：一种自体特异性T细胞体系的组分监测方法，可以用于上述第二实施例的自体特异性T细胞体系的组分监测。
可以采用流式细胞分析术进行所述的细胞表型分析。例如，可以首先采用荧光标记单克隆抗体与所述体系中的细胞进行组合，然后进行细胞表型的定量分析。
所述单克隆抗体可以包括下列中的任意一种、任意几种或全部：抗CD3+，CD4+，CD8+，CD45RO+，CD62L+。
所述细胞表型分析的具体监测项目包括：T细胞总量(CD3+T细胞)、CD4 T细胞亚群(CD3+CD4+T细胞)、CD8 T细胞亚群(CD3+CD8+T细胞)、抗肿瘤活性T细胞亚群(CD8+CD45RO+CD62L+，Tcm)；
采用现有技术的方法培养之后的样本中，CD3+CD8+T细胞表达49.25％，且有很多低表达的CD8+T细胞和不表达的CD3CD8细胞(参见图A1)，相比较，采用本发明的方法培养之后的样本中，CD3+CD8+T细胞表达92.46％，尤其是几乎全部为高表达的CD8+T细胞，并且几乎全部表达CD3CD8细胞(参见图A2)。更为重要的是，具有高度肿瘤杀伤作用的中央型记忆细胞(Tcm)其表型为CD8CD45ROCD62L，用现有技术的方法培养后的样本中，其Tcm只占39.64％，且有47.77％的记忆细胞(CD45RO)不表达CD62L(参见图B1)，而采用本发明的方法培养后的样本中，其Tcm可高达92.85％，而仅仅0.09％的记忆细胞不表达CD62L。
本发明的组分监测方法可以对培养后的细胞体系进行有效的分析和评价，不仅可以在应用前、后分别进行分析和评价，尤其是可以全程追踪T细胞的克隆化变化，可以准确反应细胞体系中的有效成分含量，为评价细胞体系的疗效及患者的恢复状况提供了有效的监测，有助于治疗方案的调整，有助于达到最佳的疗效。
上述自体特异性T细胞体系的组分监测方法能够在细胞回输患者体内后，对其疗效进行准确和及时的评价，方便于这项新技术规范化与标准化的实施。
虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (8)
1.一种自体特异性T细胞的体外扩增方法，包括如下步骤：
步骤(1)，从患者的外周血中分离外周血单个核细胞(即PBMCs)；
步骤(2)，根据需要加入相应的T细胞刺激因子，在相应的培养基中对所述外周血单个核细胞(PBMCs)进行体外培养来扩增T细胞。
2.根据权利要求1所述的自体特异性T细胞的体外扩增方法，其特征在于：所述步骤(2)包括：
步骤(2.1)，所述培养基设为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM培养基，用CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM培养基将所述外周血单个核细胞(PBMCs)制成细胞密度为1x106/ml2x106/ml的细胞悬液；
步骤(2.2)，在所述细胞密度为1x106/ml2x106/ml的细胞悬液中加入HUMAN T-ACTIVATOR CD3/CD28、IL-Ⅱ、IL-15和IL-7培养48-72小时；
步骤(2.3)，所述步骤(2.2)之后再加入TWS119和TNF-A在CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM培养基里继续培养；
步骤(2.4)，收获T细胞。
3.根据权利要求2所述的自体特异性T细胞的体外扩增方法，其特征在于：所述加入HUMAN T-ACTIVATOR CD3/CD28、IL-Ⅱ、IL-15和IL-7的方式为先分别制成IL-Ⅱ的以及IL-15和IL-7的混合物，然后再分别添加。
4.根据权利要求2或3所述的自体特异性T细胞的体外扩增方法，其特征在于：所述步骤(1)中采用密度梯度法分离外周血单个核细胞。
5.一种自体特异性T细胞体系，其中的全部或部分T细胞为采用上述任一项权力要求所述的自体特异性T细胞的体外扩增方法经体外扩增制得的。
6.根据权利要求5所述的自体特异性T细胞体系，其特征在于：所述体系中的T细胞总量(CD3+T细胞)高于98％。
7.根据权利要求5或6所述的自体特异性T细胞体系，其特征在于：当所述体系用于免疫重建时，其中的CD4 T细胞亚群(CD3+CD4+T细胞)含量高于60％；当所述体系用于免疫治疗时，其中的CD4 T细胞亚群(CD3+CD4+T细胞)含量不低于15％；
当所述体系用于免疫重建时，其中的CD8 T细胞亚群(CD3+CD8+T细胞)含量不高于40％且不低于20％；当所述体系用于免疫治疗时，其中的CD8 T细胞亚群(CD3+CD8+T细胞)含量高于80％；
所述体系中T细胞含量高于90％；
所述活化的T细胞亚群包括CD4+CD38+HLADR+和CD8+CD38+HLADR+两个T细胞亚群；
所述体系中的抗肿瘤活性T细胞亚群(CD8+CD45RO+CD62L+，Tcm)含量高于70％，优选为高于90％；
所述抗肿瘤活性T细胞亚群(CD8+CD45RO+CD62L+，Tcm)不超过5％不表达CD62L；
所述体系中的记忆T细胞亚群含量高于95％，所述记忆T细胞亚群通常应为CD8+CD45RO+。
8.根据权利要求7所述的自体特异性T细胞体系，其特征在于：所述体系中的调节性T细胞亚群(CD4+CD25+FoxP3+，Treg)含量低于5％。
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