CN117263879A - 二甲基吗啉衍生物的制备方法 - Google Patents

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CN117263879A CN202310724786.0A CN202310724786A CN117263879A CN 117263879 A CN117263879 A CN 117263879A CN 202310724786 A CN202310724786 A CN 202310724786A CN 117263879 A CN117263879 A CN 117263879A
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冷传新
王玉兵
房玺
刘培元
刘涛
张永晖
孔祥金
刘润来
高艺
林栋�
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Abstract

本发明提供一种二甲基吗啉衍生物的制备方法，通过控制加料顺序，筛选成盐步骤溶剂体系得到收率和纯度较高的产品，该方法适合工业化生产。

Description

二甲基吗啉衍生物的制备方法
本申请要求申请日为2022年6月21日的中国专利申请CN202210702060.2的优先权，本申请引用上述中国专利申请的全文。
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及3CLpro蛋白酶抑制剂的制备方法。
背景技术
3CLPro(3C-like protease，又称3C样蛋白酶)是新型冠状病毒(COVID-19,SARS-CoV-2)产生的主要蛋白酶，冠状病毒大多数功能蛋白(非结构蛋白)由ORF1ab基因编码，先翻译成一个多蛋白体(7096aa)，再由3CLPro切割成多个有活性的蛋白如病毒复制蛋白RdRp。此外，该蛋白可能切割胞内蛋白NEMO从而抑制干扰素信号途径的活化。因此抑制3CLPro能够有效抑制病毒的感染与复制。
WO2023036140A记载了一种3CLPro蛋白酶抑制剂，其中化合物(5-溴-2-((R)-1-(5-(甲氨基)烟碱酰)哌啶-3-基)氨基)-3-硝基苯基((2R,6S)-2,6-二甲基吗啉基)甲酮对SARS-CoV-23CLpro/Mpro蛋白酶具有良好的抑制作用，且在小鼠体内具有较高的暴露量和生物利用度，有望开发为临床药物，其结构如式(I)所示：
但该专利记载的制备方法通过柱层析和色谱柱分离纯化总体收率较低，不利于放大生产，因此，需要开发一种新的提高收率、操作简单、适合工业化生产的制备方法。
发明内容
本发明提供一种制备由下式(IV)表示的化合物的方法：
所述方法包括：
[步骤1]：将式(II)化合物和缩合剂加入反应溶剂中；
[步骤2]：向[步骤1]的混合液中加入式(III)化合物；
[步骤3]：向[步骤2]的混合液中加入有机碱，搅拌反应。
本发明某些实施方案，[步骤1]的缩合剂选自2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)。
本发明某些实施方案，[步骤1]的缩合剂选自2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)或O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)。
本发明某些实施方案，[步骤3]的有机碱选自三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、N-甲基吗啉、吡啶中的一种或多种任意组合。
本发明某些实施方案，[步骤1]的反应溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺或N-甲基吡咯烷酮中的一种或多种任意组合。
本发明某些实施方案，式(II)化合物与式(III)化合物的摩尔比为1:1～1:2。
优选地，式(II)化合物与式(III)化合物的摩尔比为1:1.2～1:2.0。
进一步优选，式(II)化合物与式(III)化合物的摩尔比为1:1.4～1:1.6。
本发明某些实施方案，式(II)化合物与式(III)化合物反应温度为20～40℃，优选反应温度为20～30℃。
本发明某些实施方案，其中将所制备的式(IV)化合物作为制备由下式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐的合成中间体：
在一些实施方案中，所述R1选自H或C1-4烷基；R2为硝基；R3为Br。本发明某些实施方案，制备的式(IV)的化合物如下使用：
使式(IV)化合物与式(V)所示的化合物
在缚酸剂作用下反应以便获得由下式(VI)所示的化合物
以及式(VI)所示的化合物中的Boc基脱保护得到式(VII)所示的化合物或其盐
以及式(VII)所示的化合物或其盐与式(VIII)所示的化合物
发生酰化反应得到式(I)化合物或其药学上可接受的盐
在一些实施方案中，所述R1选自H或甲基；R2为硝基；R3为Br。
本发明某些实施方案，将式(I)化合物溶于醇类溶剂中，加入HCl反应得到式(Ia)化合物
在一些实施方案中，所述R1为甲基，R2为硝基，R3为Br
本发明某些实施方案，其特征在于，醇类溶剂为甲醇。
本发明某些实施方案，其特征在于，纯化步骤式(I)化合物溶于甲醇中纯化，式(I)化合物：甲醇的重量体积比为1：3～1：5，单位为g/mL。
本发明某些实施方案，其中式(IV)化合物为晶型A形式，使用Cu-Kα辐射，所述晶型A的X-射线粉末衍射图谱在2θ值为6.96处有特征峰，2θ误差范围为±0.2°。
本发明某些实施方案，使用Cu-Kα辐射，所述晶型A的X-射线粉末衍射图谱在2θ值为6.96、13.93、14.68、18.91、22.94处有特征峰，2θ误差范围为±0.2°。
本发明某些实施方案，使用Cu-Kα辐射，所述晶型A的X-射线粉末衍射图谱在2θ值为6.96、13.93、14.68、15.03、18.91、21.80、22.23、22.66、22.94、24.66处有特征峰，2θ误差范围为±0.2°。
本发明某些实施方案，所述晶型A的X-射线粉末衍射图谱衍射峰的解析数据如表1所示：
表1晶型A的XRPD衍射峰解析数据
本发明某些实施方案，所述晶型A的X-射线粉末衍射图谱基本如图1所示。
本发明某些实施方案，所述晶型A的TGA-DSC图谱在114±2℃处有吸热峰。
本发明某些实施方案，所述晶型A的TGA-DSC图谱基本如图2所示。
本发明某些实施方案，[步骤3]搅拌反应时还可以加入晶型A进行搅拌析晶。
本发明某些实施方案，搅拌析晶温度为0～40℃。
本发明某些实施方案，搅拌析晶温度为20℃～40℃，优选20℃～30℃。
在式(IV)的制备过程中，申请人通过多次实验研究，发现加料顺序至关重要，其中(1)首先将式(II)化合物和缩合剂溶于反应溶剂，(2)其次加入式(III)化合物，(3)再次加入有机碱，按照此添加顺序可显著提高收率。
式(IV)制备过程中，主要杂质为副反应杂质I和杂质II，以及缩合剂HATU的降解杂质III，申请人通过研究发现加入晶种可降低杂质I和杂质II的含量。
在式(Ia)的纯化过程中，申请人通过实验筛选，发现溶剂体系影响收率和产品质量，醇类溶剂反应可降低杂质IV和杂质V的含量，产品纯度更高，质量更好。
说明和定义
除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。
本发明中“药学上可接受的盐”是指本发明化合物与相对无毒的酸或碱制备得到的衍生物。这些盐可以在化合物合成、分离、纯化期间就被制备，或者单独使用经过纯化的化合物的游离形式与适合的酸或碱反应。当化合物中含有相对酸性的官能团时，与碱金属、碱土金属氢氧化物或有机胺反应得到碱加成盐，包括基于碱金属与碱土金属的阳离子。当化合物中含有相对碱性的官能团时，与有机酸或无机酸反应得到酸加成盐。
本领域公知，X-射线粉末衍射图谱根据测量条件的微小变化，而具有一种或多种测量误差，本发明公开或要求保护的结晶、晶体或晶型的结构可能根据试验条件、纯度、设备和本领域技术人员已知的其它常几变量在合理误差范围内表现出类似但不完全相同的分析特性。例如，粉末X-射线粉末衍射中的衍射角(2θ)通常产生±0.20°的范围内的误差，所以，本发明不仅包括粉末X-射线粉末衍射中的衍射角完全一致的结晶，还包括在±0.20°的误差范围内衍射角一致的结晶。本发明式(IV)化合物的结晶形式并不仅限于具有与附图中所示的X-射线粉末衍射图谱相同的X射线粉末衍射图谱的晶体，具有基本上与附图中所示相同的X-射线粉末衍射图谱的任何晶体均属于本发明范围内。
文中出现的“与附图中所示X-射线粉末衍射图谱基本上相同的X-射线粉末衍射图谱。应了解，在该上下文中使用的术语“基本上相同”亦意指示X-射线粉末衍射图谱的2θ角度值可因伴随这些测量的固有实验变化而具有轻微变化，两者为同一晶体形式。
应当理解用不同类型设备或用不同的测试条件可能给出稍微不同的DSC图谱和吸热转变温度读数。该数值将受化合物纯度、样品重量、加热速度、粒径和测试设备的校验和维修的影响。晶型的最大吸热转变温度可以在上述公开的具体数值±2.0℃的范围内。
本发明还采用热失重分析(TGA)对晶型发生分解或升华、蒸发的程度(失去重量)与温度的关系进行了分析。应当理解同种晶型受样品纯度、粒径、不同类型设备、不同的测试方法等的影响，所得到的数值存在一定误差。晶型发生分解或升华、蒸发时的温度可以在上述公开的具体数值±3.0℃的范围内，例如±2.0℃的范围内。
本发明中，“Boc基脱保护”所用的脱保护试剂包括但不限于三氟乙酸(TFA)、三氟乙酸/二氯甲烷、HCl/1,4-二氧六环、HCl/甲醇、HCl/乙醇、浓盐酸、硫酸、氢溴酸等。
本发明中，缚酸剂包括有机碱或无机碱，其中无机碱包括但不限于碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化锂、氢氧化钙、碳酸氢钠等。
本发明中，“有机碱”包括但不限于三乙胺(TEA)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、N-甲基吗啉(NMM)、吡啶(Py)、乙二胺(EDA)、一乙醇胺(MEA)、4-N,N-二甲氨基吡啶(DMAP)、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)、叔丁醇钾、叔丁醇钠、正丁基锂、叔丁基锂、二(三甲基硅基)氨基钠(NaHMDS)、二异丙基氨基锂(LDA)等。
本发明的中间体及化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。
在本发明实施例中，化合物的命名是借助Chemdraw通过化合物结构转化过来的。若化合物名称与化合物结构存在不一致的情况，可通过综合相关信息和反应路线辅助确定；无法通过其他来确认的，以给出的化合物结构式为准。
本发明中部分化合物的制备方法引用了前述类似化合物的制备方法。本领域人员应当知晓，在使用或参照使用其引用的制备方法时，反应物的投料比、反应溶剂、反应温度等可根据反应物的不同，进行适当的调整。
缩写 名称
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
附图说明
图1为式(IV)化合物晶型A的XRPD谱图；
图2为式(IV)化合物晶型A的TGA-DSC谱图；
图3为实施例1得到的式(IV)化合物的HPLC图谱；
图4为实施例2得到的式(IV)化合物的HPLC图谱。
具体实施方式
实施例1式(IV)化合物的制备方法
氮气保护，将式(II)化合物(10.0g)、HATU(21.0g)加入DMF(47.0g)中搅拌溶解，降温至10±5℃，控温≤25℃搅拌加入式(III)化合物(6.5g)，降温至10±5℃，控温≤25℃加入DIPEA(15.0g)，控制反应体系于20±5℃搅拌，向反应体系滴加加入纯化水(80g)，于25±5℃搅拌析晶2±1h；抽滤，滤饼用30g纯化水洗涤，滤饼于60±5℃鼓风干燥6～8h，得到式(IV)化合物11.6g，收率84.8％，纯度97.61％(杂质I含量0.04％，杂质II含量2.05％)。
将所得的式(IV)化合物进行XRPD和TGA-DSC表征，该样品为晶型A形式，其XRPD谱图基本如图1所示，TGA-DSC谱图如图2所示。
HPLC有关物质按照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)测定。
供试品溶液：取本品适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含0.4mg的溶液。
系统适用性溶液：取式(IV)对照品适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含0.4mg的溶液。
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Xbridge C18，4.6mm×150mm，3.5μm或效能相当的色谱柱)；以10mmol/L甲酸铵溶液(取甲酸铵0.63g，加水溶解并稀释至1000ml，摇匀)为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱；在梯度混合器和进样器之间安装捕集柱(Ghost Trap DS，7.6mm×30mm或效能相当的捕集柱)；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；样品室温度为5℃；检测波长为250nm；进样体积10μl。
系统适用性要求：系统适用性溶液色谱图中，主峰理论板数不低于5000，拖尾因子不大于2.0。
测定法：精密量取供试品溶液，注入液相色谱仪，色谱图如说明书附图3所示。
X-射线粉末衍射(XRPD)
固体样品用X-射线粉末衍射仪(X’Pert PRO)进行分析，取供试品细粉适量，置于样品架凹槽中，用玻璃片压制成平整致密的平面，XRPD测量参数见表2。
表2 XRPD测试参数
仪器 PANalytical，X’Pert PRO型
光源 Cu靶
扫描角度 3-45°(2θ)
扫描速度 8°/min
光管电压/电流 40KV/40mA
发散狭缝 1/8°
使用梅特勒托利多的同步热分析仪对固体进行热重-差示扫描量热连用分析。用小勺取供试品适量置于坩埚中，使铺布均匀，称重其重量，按照表3中所列参数对样品进行加热，使用STARe对数据进行分析。
表3TGA-DSC分析方法参数
条件1参考WO2023036140A记载的加料顺序
氮气保护，将式(II)化合物(1g)加入DMF(10mL)中搅拌溶解，降温至10±5℃，向上述反应液中依次加入N,N-二异丙基乙胺(1.4g,11.4mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，2g,5.32mmol)和式(III)化合物(526mg,4.56mmol)，该反应体系在0℃下继续搅拌5分钟，向反应体系滴加加入纯化水，搅拌20±10min，25±5℃搅拌析晶2±1h，未析出固体，反应液用乙酸乙酯(30mL×3次)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(50mL×2次)洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，所得残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂:石油醚/乙酸乙酯＝4/1，体积比)，得到式(IV)化合物0.6g，收率44.0％，纯度97.62％。
条件2改变加料顺序
氮气保护，将式(II)化合物(1g)加入DMF(10mL)中搅拌溶解，降温至10±5℃，加入式(III)化合物(526mg)和N,N-二异丙基乙胺(1.4g)，向上述反应液中加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，2g)，该反应体系在0℃下继续搅拌15分钟，TLC监测显示产生较多杂质，向反应体系滴加加入纯化水，搅拌20±10min，未析出固体，于25±5℃搅拌析晶2±1h，仍未析出固体，HPLC-MS检测，约生成20％的式(IV)化合物，不再处理。
条件3改变加料顺序
氮气保护，将2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，2g)加入DMF(10mL)中搅拌溶解，加入式(III)化合物(526mg)和N,N-二异丙基乙胺(1.4g)，降温至10±5℃，向上述反应液中加入式(II)化合物(1g)，该反应体系在10±5℃下继续搅拌15分钟，TLC监测显示产生较多杂质，向反应体系滴加加入纯化水，搅拌20±10min，未析出固体，于25±5℃搅拌析晶2±1h，仍未析出固体，HPLC-MS检测，约生成10％的式(IV)化合物，不再处理。
改变加料顺序对反应的影响对比结果如表4所示：
表4式(IV)化合物制备过程中加料顺序对反应的影响
从表4可以看出，加料顺序对反应有重大影响，反应时先加式(II)化合物和缩合剂，再加入式(III)化合物，最后加入有机碱可显著提高收率。
实施例2式(IV)化合物的制备方法
氮气保护，将式(II)化合物(10.0kg)、HATU(21.0kg)加入DMF(47.0kg)中搅拌溶解，降温至10±5℃，控温≤25℃搅拌加入式(III)化合物(6.5kg)，降温至10±5℃，控温≤25℃加入DIPEA(15.0kg)，控制反应体系于20±5℃下继续搅拌TLC监测反应结束，向反应体系滴加加入纯化水(26kg)，加入晶型A(0.1kg)，搅拌20±10min，继续加入纯化水(54kg)，于20℃～30℃搅拌析晶2±1h，离心，滤饼用纯化水(30kg)洗涤，滤饼于60±5℃鼓风干燥6～8h，得到式(IV)化合物11.82kg，收率86.4％，纯度99.70％(杂质II含量0.08％，杂质I含量0.04％)。
实施例3式(IV)化合物的制备方法
氮气保护，将式(II)化合物(10.0g)、HATU(21.0g)加入DMF(47.0g)中搅拌溶解，降温至10±5℃，控温≤25℃搅拌加入式(III)化合物(6.5g)，降温至10±5℃，控温≤25℃加入DIPEA(15.0g)；控制反应体系于20±5℃下继续搅拌，TLC监测反应结束；向反应体系滴加加入纯化水(26g)，加入晶型A(0.1g)，搅拌20±10min，继续加入纯化水(54g)，于0～10℃搅拌析晶2±1h；离心，滤饼用纯化水(30g)洗涤，滤饼于60±5℃鼓风干燥6～8h，得到式(IV)化合物12.5g，收率85.4％，纯度89.58％(杂质II含量0.12％，杂质III含量9.60％，杂质I含量0.62％，其他单个杂质≤0.07％)。
实施例4式(IV)化合物的制备方法
氮气保护，将式(II)化合物(10.0g)、HATU(21.0g)加入DMF(47.0g)中搅拌溶解，降温至10±5℃，控温≤25℃搅拌加入式(III)化合物(6.5g)，降温至10±5℃，控温≤25℃加入DIPEA(15.0g)；控制反应体系于20±5℃下继续搅拌，TLC监测反应结束；向反应体系滴加加入纯化水(26g)，加入晶型A(0.1g)，搅拌20±10min，继续加入纯化水(54g)，于30℃～40℃搅拌析晶2±1h，离心，滤饼用纯化水(30g)洗涤，滤饼于60±5℃鼓风干燥6～8h，得到式(IV)化合物12.5g，收率73.1％，纯度99.68％(杂质II含量0.07％，杂质III含量0.04％，杂质I含量0.01％，其他单个杂质≤0.04％)。
析晶过程是否加入晶种以及不同析晶温度对产品的质量影响如下表5所示：
表5析晶温度
备注：晶种为A晶型。
由表5可以看出，加入晶种可以降低杂质II的含量；同时加入晶种后，搅拌析晶温度越高，杂质I含量越低，但当析晶温度升高时，对收率也造成一定的降低，优选析晶温度20℃～30℃。
实施例5式(VI)化合物的制备方法
在氮气保护下，将式(IV)化合物(11.4kg)加入乙腈(90kg)中搅拌，依次加入式(V)化合物(7.64kg)和DIPEA(12.3kg)，升温，反应体系于80±5℃下搅拌，TLC监测反应结束，体系降温至50±5℃，减蒸出约60～90％乙腈，停止减蒸，降温至25±5℃，加入乙酸乙酯(100kg)，搅拌溶解，用0.1mol/L盐酸水溶液(110kg)、饱和氯化钠水溶液(110kg)洗涤、分液，有机相用无水硫酸钠干燥，水相弃去、离心、滤饼用乙酸乙酯洗涤，滤液减蒸，得到红色油状的式(VI)化合物，无需分离纯化，直接进行下一步。
实施例6式(VII)化合物的制备方法
在氮气保护下，将1,4-二氧六环(33kg)加入上一步得到的式(VI)化合物，搅拌溶解，加入4mol/L的HCl/二氧六环溶液(92kg)中搅拌，反应体系于25±5℃下搅拌反应1小时后，TLC监测反应结束，体系于50±5℃减蒸至基本无液滴滴出，降温至25±5℃，加入甲基叔丁基醚，搅拌打浆，离心，滤饼用甲基叔丁基醚洗涤，滤饼于60±5℃烘干4～6h，得到式(VII)化合物。
实施例7式(I)化合物的制备方法
氮气保护，将式(VII)化合物(12.0kg)加入DMF(114kg)中搅拌溶解，降温，体系降温至-5±5℃，依次加入HATU(16.8kg)、式(VIII)化合物(6.1kg)；搅拌加入DIPEA(16.2kg)，控温≤0℃，控制反应体系于-5±5℃下继续搅拌，TLC监测反应结束，向反应体系滴加加入纯化水，分别用300kg、120kg乙酸乙酯萃取水相两次，保留有机相，水相弃去，有机相分别用240kg×3的8％碳酸氢钠溶液、300kg的20％氯化钠溶液、300kg的10％氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，加入活性炭脱色30±10min，抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，滤液于50±5℃减蒸，得到式(I)化合物粗品13.0kg。
实施例8式(Ia)化合物的制备方法
将式(I)化合物粗品(13.0kg)加入甲醇(39L)中搅拌溶解，升温至25±5℃，加入活性炭，脱色30±10min，抽滤，滤饼用甲醇洗涤，滤液中加入饱和氯化氢乙醇溶液，于25±5℃搅拌析晶1±0.5h，再降温至5±5℃，搅拌析晶2±1h，抽滤，滤饼用洗涤，滤饼于70±5℃真空烘干6±1h，得到式(Ia)化合物10.36kg，收率71.1％，纯度：99.31％。
实施例9式(Ia)化合物的制备方法
将式(I)化合物粗品(13.0g)加入甲醇(65mL)中搅拌溶解，升温至25±5℃，加入活性炭，脱色30±10min，抽滤，滤饼用甲醇洗涤，滤液中加入饱和氯化氢乙醇溶液，于25±5℃搅拌析晶1±0.5h，再降温至5±5℃，搅拌析晶2±1h，抽滤，滤饼用洗涤，滤饼于70±5℃真空烘干6±1h，得到式(Ia)化合物9.0g，收率65.1％，纯度：99.49％。
对比例1：
取5.0g式(I)化合物粗品加入20mL甲醇溶解，加入60mL甲基叔丁基醚，27.5℃，滴加30％的盐酸乙醇溶液1.6g，室温搅拌4h后抽滤，50℃真空干燥2h。
对比例2：
取5.0g式(I)化合物粗品的盐酸盐无定形手动研磨5分钟后，加入20mL乙醇，100mL甲基叔丁基醚，室温搅拌2.5h，抽滤，70℃真空干燥3h。
对比例3：
取5.0g式(I)化合物粗品加入20mL丙酮溶解，100mL甲基叔丁基醚，30℃，滴加30％的盐酸乙醇溶液1.6g，室温搅拌4h后抽滤，70℃真空干燥3h。
对比例4：
取5.0g式(I)化合物粗品加入20mL甲醇溶解，100mL乙酸乙酯，25℃，滴加30％的盐酸乙醇溶液1.6g，室温放置2天后抽滤，70℃真空干燥3h。
成盐溶剂体系对产品质量的影响如下表6所示：
表6纯化溶剂筛选
编号 溶剂 杂质IV含量 杂质V含量 总杂含量
实施例8 甲醇 0.16％ 0.12％ 0.69％
实施例9 甲醇 0.15％ 0.12％ 0.51％
对比例1 甲醇/甲基叔丁基醚(1:3) 0.32％ 0.49％ 1.73％
对比例2 乙醇/甲基叔丁基醚(1:5) 0.52％ 0.71％ 2.18％
对比例3 丙酮/甲基叔丁基醚(1:5) 0.22％ 1.57％ 2.62％
对比例4 甲醇/乙酸乙酯(1:5) 0.09％ 0.41％ 1.46％
从表6可以看出，用甲醇作为溶剂时，得到的式(Ia)化合物杂质含量较低。
生物学测试评价
测试例1：评价式(I)化合物对SARS-CoV-2 3CLpro/Mpro靶点的抑制效果
本实验采用荧光共振能量转移的方法来检测SARS-CoV-2 3CLpro/Mpro蛋白酶的活性，并得出化合物对SARS-CoV-2 3CLpro/Mpro蛋白酶的半数抑制浓度IC50。
新型冠状病毒Mpro/3CLpro抑制剂筛选试剂盒(P0315M)购自Beyotime公司。
用反应缓冲液配置酶溶液，在各孔中加49.5μL的酶溶液；在Min孔中加49.5μL的反应缓冲溶液。化合物检测IC50，测试终浓度为10μM起始，3倍稀释，10个浓度，每个浓度设置复孔测试。将待测化合物稀释成200倍终浓度的溶液，使用D300e(TECAN)超微量加样器加入250nL梯度稀释的待测化合物到384孔反应板中。Max孔和Min孔中均转移250nL的100％DMSO。置冰上孵育10分钟。用D300e(TECAN)在各孔中加入250nL底物溶液。将反应板1000rpm离心1min，使用Envision酶标仪(PerkinElmer)连续读取30分钟的荧光信号。使用GraphPadPrism 8软件进行数据分析，计算化合物的IC50。
实验测得，式(I)化合物的IC50值为26nM，对SARS-CoV-2 3CLpro/Mpro蛋白酶具有良好的抑制活性。
测试例2：CD1小鼠的体内药代动力学实验
以雄性CD1小鼠为受试动物，研究本发明化合物对雄性CD1小鼠体内药代动力学行为。
供试品：对照化合物和式(I)化合物。
试验动物
种属：雄性CD1小鼠(3只/组)
等级：SPF级
体重：约20～30g
年龄：6～8周
来源：维通利华
雄性CD1小鼠灌胃给予供试品溶液，给药剂量为10mg/kg，给药体积为10mL/kg。
供试品溶液的配制：供试品采用溶媒(10％DMSO+50％PEG400+40％纯净水)溶解，配制时依次加入DMSO、PEG400和纯净水。
对照组：CN113072497A专利化合物2，其结构式如下：
实验组：式(I)化合物。
分别于给药前(0h)和给药后0.25h,0.5h,1h,2h,4h,8h,24h，按照设置的采血时间点，从小鼠足背静脉采集约0.025～0.03mL全血(用EDTA-K2抗凝)，置于湿冰条件下，并在采集后30min内以4000g离心力、4℃、离心5min，分离血浆并转移到检测管中。
药代动力学主要参数用WinNonlin(PhoenixTM,version 6.1)计算得到，药代动力学参数参见表7和表8。
表7CD1小鼠静脉给药的药代动力学参数
表8CD1小鼠口服给药的药代动力学参数
备注：NA代表无相应数据。
结果显示：与对照组相比，式(I)化合物在小鼠体内具有较高的暴露量和生物利用度，具有良好的药代动力学性质。
测试例3：食蟹猴的体内药代动力学实验
以雄性食蟹猴为受试动物，研究式(I)化合物在10mg/kg下口服给药在食蟹猴体内血浆的药代动力学行为。
1.试验方案
1.1供试品：
式(I)化合物。
1.2试验动物
动物基本信息
种属：食蟹猴
等级：普通级
数量：18只食蟹猴(雄)用于给药实验
体重：约2.5～4.5kg
年龄：约3～5岁
来源：从化市华珍动物养殖场(普通合伙)
1.3给药：
9只雄性食蟹猴，3只/组，共3组。动物给药前禁食12小时，灌胃给药供试品溶液(10mg/kg)，给药体积2.5mL/kg。
供试品溶液的配制：供试品采用10％DMSO+50％PEG400+40％纯净水溶解，配制时依次加入DMSO、PEG400和纯净水。
1.4样品采集：
分别于给药前(0min)、给药后0.25h，0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，12h，24h和48h(11个)。
按照设置的采血时间点，由从猴后肢静脉采血约1.5mL，置于湿冰条件下，并在采集后
1.5h内离心，以1700g离心力，4℃，离心10min。离心之后，取血浆加入到检测管中。离心后2小时内可将血浆样本置于-20℃以下的冰箱中保存。
2.实验结果与分析
药代动力学主要参数用WinNonlin 8.1.0.3530计算得到，结果显示，式(I)化合物具有良好的药代动力学性质。
表9食蟹猴口服给药的药代动力学参数

Claims (13)

1.制备由下式(IV)表示的化合物的方法：
所述方法包括：
[步骤1]：将式(II)化合物和缩合剂加入反应溶剂中；
[步骤2]：向[步骤1]的混合液中加入式(III)化合物；
[步骤3]：向[步骤2]的混合液中加入有机碱，搅拌反应。
2.根据权利要求1所述的方法，[步骤1]的缩合剂选自2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)或6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，[步骤3]的有机碱选自三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、N-甲基吗啉或吡啶中的一种或多种任意组合。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，[步骤1]的反应溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺或N-甲基吡咯烷酮中的一种或多种任意组合。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中将所制备的式(IV)化合物作为制备由下式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐的合成中间体：
其中，所述R1选自H或C1-4烷基；
R2为硝基；R3为溴。
6.根据权利要求5所述的方法，制备的式(IV)的化合物如下使用：
使式(IV)化合物与式(V)所示的化合物
在缚酸剂作用下反应以便获得由下式(VI)所示的化合物
以及式(VI)所示的化合物中的Boc基脱保护得到式(VII)所示的化合物或其盐
以及式(VII)所示的化合物或其盐与式(VIII)所示的化合物
发生酰化反应得到式(I)化合物或其药学上可接受的盐
其中，R1选自H或甲基；
R2为硝基；
R3为Br。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将式(I)化合物溶于醇类溶剂中，加入HCl反应得到式(Ia)化合物
R1为甲基，R2为硝基，R3为Br。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，醇类溶剂为甲醇。
9.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中式(IV)化合物为晶型A形式，使用Cu-Kα辐射，所述晶型I的X-射线粉末衍射图谱在2θ值为6.96处有特征峰，2θ误差范围为±0.2°；
优选地，所述晶型A的X-射线粉末衍射图谱在2θ值为6.96、13.93、14.68、18.91、22.94处有特征峰，2θ误差范围为±0.2°；
更优选地，所述晶型A的X-射线粉末衍射图谱在2θ值为6.96、13.93、14.68、15.03、18.91、21.80、22.23、22.66、22.94、24.66处有特征峰，2θ误差范围为±0.2°。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述晶型A的X-射线粉末衍射图谱基本如图1所示。
11.根据权利要求9-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述晶型A的TGA-DSC图谱在114±2℃处有吸热峰；
优选地，所述晶型A的TGA-DSC图谱基本如图2所示。
12.根据权利要求1所述的方法，[步骤3]搅拌反应时还可以加入权利要求9-11中任一项所述的晶型A进行搅拌析晶。
13.根据权利要求12所述的方法，搅拌析晶温度为0～40℃；
优选地，搅拌析晶温度为20℃～40℃；进一步优选地，搅拌析晶温度为20℃～30℃。
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