CN114929232B

CN114929232B - 一种吡啶并嘧啶类衍生物的结晶形式及其制备方法

Info

Publication number: CN114929232B
Application number: CN202080091758.4A
Authority: CN
Inventors: 吴琪; 杜振兴; 王捷; 王林; 陆伟栋; 邵启云; 冯君; 贺峰
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2020-01-02
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2023-06-16
Anticipated expiration: 2040-12-31
Also published as: CN114929232A; JP2023509175A; KR20220123437A; CA3163386A1; US20230058425A1; EP4085914A4; TW202128692A; AU2020416484A1; MX2022008286A; WO2021136488A1; EP4085914A1

Abstract

一种吡啶并嘧啶类衍生物的结晶形式及其制备方法，具体而言，涉及式(I)化合物的结晶形式及制备方法。新晶型具备良好的理化性质，更有利于临床治疗。

Description

一种吡啶并嘧啶类衍生物的结晶形式及其制备方法

本申请要求申请日为2020年1月2日的中国专利申请CN202010002822.9的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。

技术领域

本公开涉及一种吡啶并嘧啶类衍生物的结晶形式及其制备方法，具体地涉及式(I)化合物的结晶形式及制备方法。

背景技术

Toll样受体(toll-like receptors；TLRs)是参与先天免疫的一类重要受体。TLRs是单体跨膜的非催化性受体，通常在岗哨细胞如巨噬细胞和树突状细胞中表达，可以识别由微生物产生的结构保守的分子。一旦这些微生物突破如皮肤或肠道粘膜的物理屏障，就会被TLRs识别，继而激活免疫细胞应答(Mahla,R S.等人,Front Immunol.4:248(2013))。免疫系统之所以具有广泛识别病原微生物的能力，某种程度上是由于Toll样免疫受体的广泛存在。

在哺乳动物中至少有10种不同的TLRs。一些此类受体的配体和相应的信号级联放大已经被鉴定出。TLR8是TLRs(TLRs 3、7、8和9)亚组的成员，局限于专门识别非己核酸的细胞的内涵体隔室。TLR8在人身上主要通过单核细胞，NK细胞和髓样树突细胞(mDC)表达。TLR8激动剂可以导致各种不同的促炎细胞因子的释放，如IL-6，IL-12，TNF-α和IFN-γ。

TLR8在机体的固有免疫和获得性免疫都起着重要的作用。TLR8激动剂作为免疫调节剂，可以用于各种不同与免疫相关的疾病的治疗，如卵巢癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝细胞癌、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、肾细胞癌、骨髓瘤、变应性鼻炎、哮喘、慢性阻塞性肺炎(COPD)、溃疡性结肠炎、肝纤维化，HBV、黄病毒科(Flaviviridae)病毒、HCV、HPV、RSV、SARS、HIV或流行性感冒的病毒感染等。

由于TLR8和TLR7高度同源，因此TLR8激动剂在大多数情况下也是TLR7激动剂。因此TLR8和TLR7的双重激动剂在很多专利里都有报道，如WO2009111337，WO2011017611，WO2011068233，WO2011139348，WO2012066336，WO2013033345和WO2017046112。TLR8选择性的激动剂报道的比较少，主要有VentiRX公司的VTX-2337(WO2007024612)和Gilead公司的GS-9688(WO2016141092)，但这两个化合物对TLR7仍然有一定的活性，对Cyp和hERG选择性也较差。所以仍有必要继续研发安全的和治疗上更有效的TLR8激动剂。

WO2020007275(申请号：PCT/CN/2019/094310)涉及一种式(I)所示化合物，化学名为(R)-2-((2-氨基-7-(6-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-3-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基己烷-1-醇，该化合物为新型TLR8激动剂，在临床疗效或适应症，及安全性等方面均有所改善，其结构如下所示：

药用的活性成分的晶型结构往往影响到该药物的化学稳定性，结晶条件及储存条件的不同有可能导致化合物的晶型结构的变化，有时还会伴随着产生其他形态的晶型。一般来说，无定型的药物产品没有规则的晶型结构，往往具有其它缺陷，比如产物稳定性较差，析晶较细，过滤较难，易结块，流动性差等。因此，改善上述产物的各方面性质是很有必要的，我们需要深入研究找到晶型纯度较高并且具备良好化学稳定的新晶型。

发明内容

本公开的目的在于提供一种式(I)所示化合物新的晶型，其具备良好的稳定性，可更好地应用于临床。

本公开一方面提供了一种式(I)所示化合物的A晶型，其X-射线粉末衍射图谱在2θ角为8.610、9.740、13.903、15.313、16.354、17.675、17.879、19.184、19.905、20.901、21.365、22.319和23.057处有特征峰，

在某些实施方式中，本公开提供一种式(I)所示化合物的A晶型，其X-射线粉末衍射图谱在2θ角为8.610、9.740、10.949、13.314、13.903、15.313、16.060、16.354、16.794、17.675、17.879、19.184、19.905、20.901、21.365、22.319、23.057、23.748、24.430、25.428、26.576、27.270、27.863、28.957、29.842和31.506处有特征峰。

在某些的实施方案中，本公开提供一种式(I)所示化合物的A晶型，其X-射线粉末衍射图谱如图2所示。

本公开进一步提供一种制备上述的式(I)所示化合物的A晶型的方法，所述方法包括：

将式(I)所示化合物与适量的溶剂混合，挥发结晶，所述溶剂可以为甲醇、正庚烷、环己烷、正己烷、石油醚、正丙醇中的一种或多种；或，

将式(I)所示化合物与适量的溶剂混合，升温溶解，降温结晶，所述溶剂可以为乙酸乙酯。

本公开一方面提供了一种式(I)所示化合物的B晶型，其X-射线粉末衍射图谱在2θ角为4.60、8.77、9.90、13.86、15.45、16.44、17.74、18.03、19.31、19.91、21.07、21.52、22.48和23.22处有特征峰，

在某些实施方式中，本公开提供一种式(I)所示化合物的B晶型，其X-射线粉末衍射图谱在2θ角为4.60、8.77、9.20、9.90、11.17、13.86、14.51、15.45、16.44、17.74、18.03、18.19、18.51、19.31、19.91、20.07、21.07、21.52、22.48、23.22、24.00、24.61、25.64、26.78、27.43、28.04、29.31、31.21、32.09、32.57、33.23和34.01处有特征峰。

在某些的实施方案中，本公开提供一种式(I)所示化合物的B晶型，其X-射线粉末衍射图谱如图4所示。

本公开进一步提供一种制备上述的式(I)所示化合物的B晶型的方法，所述方法包括：

将式(I)所示化合物与适量的溶剂混合，挥发结晶，所述溶剂可以为水、异丙醇、乙酸乙酯、乙腈、苯乙酮、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺和1,2-二氯乙烷中的一种或多种；或，

将式(I)所示化合物与适量的溶剂混合，升温溶解，降温结晶，所述溶剂可以为异丙醇或二甲亚砜。

通过X-射线粉末衍射图谱(XRPD)、差示扫描量热分析(DSC)对本公开所得到晶型进行结构测定、晶型研究。

在某些的实施方案中，采用某些溶剂制备可得到A晶型与B晶型的混晶，例如，将式(I)所示化合物与适量的溶剂(例如丙酮、乙酸异丙酯、甲基叔丁基醚、2-丁酮、甲基异丁基酮、硝基甲烷、乙酸乙酯/正庚烷、乙酸丁酯、对二甲苯、丙二醇单甲醚、异戊醇、水/乙醇、水/丙酮、乙酸乙酯/乙醇、三氯甲烷等)混合，挥发结晶可得。其X-射线粉末衍射图谱如图6所示。

本公开中晶型的析晶方法是常规的，例如挥发析晶、降温析晶或室温下析晶。

本公开晶型制备方法中所用的起始原料可以是任意形式的式(I)所示化合物，具体形式包括但不限于：无定形、任意晶型、水合物、溶剂合物等。

本公开进一步提供一种药物组合物，其包含上述的式(I)所示化合物的A晶型和/或B晶型，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

本公开进一步提供一种药物组合物，其通过上述的式(I)所示化合物的A晶型和/或B晶型与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合制备得到。

本公开进一步提供一种制备药物组合物的方法，包括将上述的式(I)所示化合物的A晶型和/或B晶型与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合的步骤。

本公开进一步提供本公开所述的式(I)所示化合物的A晶型或B晶型或药物组合物在制备用于激动TLR8的药物中的用途。

本公开进一步提供本公开所述的式(I)所示化合物的A晶型或B晶型或药物组合物在制备用于治疗由病毒引起的感染的药物中的用途，所述病毒优选乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、疱疹病毒和艾滋病毒中的一种或多种。

本公开进一步提供本公开所述的式(I)所示化合物的A晶型或B晶型或药物组合物在制备用于调节免疫系统的药物中的用途。

本公开进一步提供本公开所述的式(I)所示化合物的A晶型或B晶型或药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的用途。

在本申请的说明书和权利要求书中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。然而，为了更好地理解本公开，下面提供了部分相关术语的定义和解释。另外，当本申请所提供的术语的定义和解释与本领域技术人员所通常理解的含义不一致时，以本申请所提供的术语的定义和解释为准。

本公开所述的“打浆”是指利用物质在溶剂中溶解性差，但杂质在溶剂中溶解性好的特性进行纯化的方法，打浆提纯可以去色、改变晶型或去除少量杂质。

本公开所述的“X-射线粉末衍射图谱或XRPD”是指根据布拉格公式2d sinθ＝nλ(式中，λ为X射线的波长，衍射的级数n为任何正整数，一般取一级衍射峰，n＝1)，当X射线以掠角θ(入射角的余角，又称为布拉格角)入射到晶体或部分晶体样品的某一具有d点阵平面间距的原子面上时，就能满足布拉格方程，从而测得了这组X射线粉末衍射图。

本公开所述的“X-射线粉末衍射图谱或XRPD”是通过在X-射线粉末衍射仪中使用Cu-Kα辐射得到的图谱。

本公开所述的“差示扫描量热分析或DSC”是指在样品升温或恒温过程中，测量样品与参考物之间的温度差、热流差，以表征所有与热效应有关的物理变化和化学变化，得到样品的相变信息。

本公开所述的“2θ或2θ角度”是指衍射角，θ为布拉格角，单位为°或度，2θ的误差范围为±0.3或±0.2或±0.1。

本公开所述的“晶面间距或晶面间距(d值)”是指空间点阵选择3个不相平行的连结相邻两个点阵点的单位矢量a，b，c，它们将点阵划分成并置的平行六面体单位，称为晶面间距。空间点阵按照确定的平行六面体单位连线划分，获得一套直线网格，称为空间格子或晶格。点阵和晶格是分别用几何的点和线反映晶体结构的周期性，不同的晶面，其面间距(即相邻的两个平行晶面之间的距离)各不相同；单位为

或埃。

发明的有益效果

本公开制备的式(I)所示化合物的A晶型、B晶型纯度高，在光照、高温、高湿的条件下晶型稳定性良好，HPLC纯度变化小、物理化学稳定性高，更有利于原料的存储和使用。

附图说明

图1为式(I)所示化合物的无定形的XRPD图谱。

图2为式(I)所示化合物的A晶型的XRPD图谱。

图3为式(I)所示化合物的A晶型的DSC图谱。

图4为式(I)所示化合物的B晶型的XRPD图谱。

图5为式(I)所示化合物的B晶型的DSC图谱。

图6为式(I)所示化合物的A晶型与B晶型的混晶的XRPD图谱。

具体实施方式

以下将结合实施例更详细地解释本公开，本公开的实施例仅用于说明本公开的技术方案，并非限定本公开的实质和范围。

试验所用仪器的测试条件：

1、差示扫描量热仪(Differential Scanning Calorimeter,DSC)

仪器型号：Mettler Toledo DSC 1STAR^e System。

吹扫气：氮气。

升温速率：10.0℃/min。

温度范围：40-300℃。

2、差示扫描量热仪(Differential Scanning Calorimeter,DSC)

仪器型号：Mettler Toledo DSC 3+。

吹扫气：氮气。

升温速率：10.0℃/min。

温度范围：25-300℃。

3、X-射线衍射谱(X-ray Powder Diffraction,XRPD)

仪器型号：BRUKER D8 DISCOVERY X-射线粉末衍射仪。

射线：单色Cu-Kα射线(Cu-Kα1波长为

Cu-Kα2波长为/>

Cu-Kα波长取Kα1与Kα2的加权平均值/>

)。

扫描方式：θ/2θ，扫描范围：5-48°。

电压：40KV，电流：40mA。

4、X-射线衍射谱(X-ray Powder Diffraction,XRPD)

仪器型号：BRUKER D8 Focus X-射线粉末衍射仪。

射线：单色Cu-Kα射线(Cu-Kα1波长为

Cu-Kα2波长为/>

Cu-Kα波长取Kα1与Kα2的加权平均值/>

)。

扫描方式：θ/2θ，扫描范围：2-40°。

电压：40KV，电流：40mA。

其中，2θ保留2位小数的数据通过BRUKER D8 Focus X-射线粉末衍射仪测得。

实施例中无特殊说明，反应能够均在氩气氛或氮气氛下进行。

氩气氛或氮气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氩气或氮气气球。

氢气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氢气气球。

加压氢化反应使用Parr 3916EKX型氢化仪和清蓝QL-500型氢气发生器或HC2-SS型氢化仪。

氢化反应通常抽真空，充入氢气，反复操作3次。

微波反应使用CEM Discover-S 908860型微波反应器。

实施例中无特殊说明，溶液是指水溶液。

实施例中无特殊说明，反应的温度为室温，为20℃～30℃。

实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC)，反应所使用的展开剂，纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系和薄层色谱法的展开剂体系包括：A：二氯甲烷/甲醇体系，B：正己烷/乙酸乙酯体系，C：石油醚/乙酸乙酯体系溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺和醋酸等碱性或酸性试剂进行调节。

实施例1

第一步

(R)-2-((7-溴-2-氯吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基己烷-1-醇1c

将化合物1a(400mg,1.434mmol,采用专利申请WO2014022728公开的方法制备而得)加入到10mL四氢呋喃中，加入(R)-2-氨基-2-甲基己烷-1-醇1b(377mg,2.873mmol)，加入N,N-二异丙基乙胺(556mg,4.302mmol),100℃封管搅拌反应16小时，反应结束，冷却到室温，过滤去不溶物，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化所得残余物，得到标题产物1c(4.0g，产率：55.3％)。

MS m/z(ESI):373.1[M+1]。

第二步

(R)-2-((7-溴-2-((2,4-二甲氧基苄基)氨基)吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基己烷-1-醇1d

将化合物1c(250mg,0.669mmol)加入到10mL四氢呋喃中，加入2,4-二甲氧基苯甲胺(560mg,3.349mmol)，加入N,N-二异丙基乙胺(259mg,2.004mmol)，封管100℃搅拌16小时，向反应液中加入20mL水，用二氯甲烷萃取(20mL×3)，合并有机相，有机相分别用水(20mL)，饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤除去干燥剂，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物1d(295mg，产率：87.5％)。

MS m/z(ESI):504.1[M+1]

第三步

(R)-2-((2-((2,4-二甲氧基苄基)氨基)-7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂戊硼烷-2-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基己烷-1-醇1e

将化合物1d(295mg,0.54mmol)加入到5mL乙二醇二甲醚中，加入联硼酸频那醇酯(223mg,878.169μmol)，加入1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯(43mg,0.059mmol)，加入乙酸钾(173mg,1.76mmol)，置换氩气三次，升温到80℃搅拌反应2小时。反应液减压浓缩后，向体系中加入水20ml，用二氯甲烷萃取(10mL×3)，合并有机相，有机相分别用水(20mL)，饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤除去干燥剂，滤液减压浓缩得到粗品标题产物1e(322mg，产率：100％)。

第四步

(R)-2-((2-((2,4-二甲氧基苄基)氨基)-7-(6-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-3-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基己烷-1-醇1g

将化合物1e(650mg，1.178mmol)加入到20mL 1,4-二氧六环和4mL水中，加入1-((5-溴吡啶-2-基)甲基)-4-甲基哌嗪1f(318mg，1.170mmol,采用专利申请WO20020026052公开的方法制备而得)，加入1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯(86mg,0.117mmol)，加入碳酸钾(489mg,3.538mmol)，置换氩气三次，升温到80℃搅拌反应2小时。反应液减压浓缩后，向体系中加入水30ml，用二氯甲烷萃取(30mL×3)，合并有机相，有机相分别用水(30mL)，饱和氯化钠溶液(30mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤除去干燥剂，滤液减压浓缩用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物得到标题产物1g(650mg，产率：89.70％)。

MS m/z(ESI):615.1[M+1]。

第五步

(R)-2-((2-氨基-7-(6-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-3-基)吡啶并[3,2-d]嘧啶-4-基)氨基)-2-甲基己烷-1-醇I

将化合物1g(650mg,0.138mmol)加入到5mL三氟乙酸，室温反应3小时，反应液减压浓缩，向反应液中加入20mL饱和碳酸氢钠，用二氯甲烷(20mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠溶液(30mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤除去干燥剂，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到产物I(320mg产率：65.14％)。经X-射线粉末衍射检测，该化合物为无定形，XRPD谱图如图1。

MS m/z(ESI):465.1[M+1]

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.87-8.88(d,1H),8.60-8.61(m,1H),8.14-8.16(d,1H),7.79-7.80(s,1H),7.51-7.53(d,1H),7.20(s,1H),6.36(br,2H),5.12-5.15(t,1H),3.66(s,2H),3.68-3.70(m,1H),3.48-2.53(m,1H),2.32-3.42(m,8H),2.12(s,3H),1.90-1.92(m,2H),1.40(s,3H),1.22-1.23(m,4H),0.80-0.84(m,3H)。

实施例2

将实施例1得到的式(I)所示化合物(200mg，0.43mmol)加入到10mL乙酸乙酯中，升温至回流，搅拌溶解，然后溶液缓慢降至室温搅拌，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，收集滤饼，真空干燥，得到100mg式(I)所示化合物的A晶型，其特征峰位置如下表所示：

表1：A晶型的XRD特征峰位置

实施例3

将式(I)所示化合物(400mg，0.86mmol)加入到8mL异丙醇中，加热回流至固体溶清，然后自然冷却至室温搅拌，过滤，滤饼用异丙醇洗涤，收集滤饼，真空干燥，得到200mg式(I)所示化合物的B晶型，其特征峰位置如下表所示：

表2：B晶型的XRD特征峰位置

实施例4

取式(I)所示化合物的A晶型与B晶型于开口的洁净称量瓶中，考察在加热(40℃、60℃)、光照(4500lx±500lx)、高湿(90％±5％、75％±5％)条件下样品的稳定性，取样考察期为30天。

表3：A晶型影响因素30天试验结果

/>

表4：B晶型影响因素30天试验结果

/>

实施例5

取式(I)所示化合物的B晶型进行3个月的长期(25℃、60％RH)、加速(40℃、75％RH)稳定性考察，结果如下表：

表5：式(I)所示化合物的B晶型长期加速稳定性

实验结果显示：式(I)所示化合物的B晶型长期(25℃、60％RH)、加速(40℃、75％RH)稳定性条件下放置3个月，物理化学稳定性较好。

测试例：

生物学评价

测试例1、本公开化合物对人源TLR8和TLR7激动活性的测定

本公开化合物对HEK-Blue^TM hTLR8稳转株细胞表达的hTLR8激活作用采用如下实验方法测定：

一、实验材料及仪器

1.DMEM(Gibco，10564-029),

2.胎牛血清(GIBCO,10099),

3.台盼蓝溶液(Sigma,T8154-100ML),

4.Flexstation 3多功能酶标仪(Molecμlar Devices),

5.HEK-Blue^TM hTLR8细胞系(InvivoGen,hkb-hTLR8),或HEK-Blue^TM hTLR7细胞系(InvivoGen,hkb-hTLR7),

6.HEK-Blue检测试剂(InvivoGen,hb-det3),

7.磷酸盐缓冲液(PBS)pH7.4(上海源培生物科技股份有限公司，B320)。

二、实验步骤

a.对人源TLR8激动活性的测定

配置HEK-Blue检测培养基，取HEK-Blue检测干粉一袋，加入50ml去内毒素水溶解，再放入37℃培养箱，10分钟后无菌过滤。化合物先配制成20mM的原液；再用纯DMSO稀释至最高浓度为6×10⁶nM，然后3倍梯度稀释，共10个点；用培养基先把化合物稀释20倍，然后每孔加入20μl稀释后的化合物。

取HEK-Blue^TM hTLR8细胞，先去掉上清，加入2-5ml预热的PBS，放入培养箱1-2分钟，轻轻吹打细胞，台盼蓝染色计数。用HEK-Blue检测培养基重悬细胞调整浓度为2.2×10⁵个细胞/ml，加180μl细胞至上述已加入20μl药物的96孔细胞培养板中，37℃，培养6-16h。

酶标仪读数，波长为620nm。可获得相应的OD值，经Graphpad Prism计算得到药物的EC₅₀值。

b.对人源TLR7激动活性的测定

配置HEK-Blue检测培养基，取HEK-Blue检测干粉一袋，加入50ml去内毒素水溶解，再放入37℃培养箱，10分钟后无菌过滤。化合物先配制成20mM的原液；再用纯DMSO稀释至最高浓度为6×10⁶nM，经3倍梯度稀释，共10个点。

用培养基先把上述配制好的化合物稀释20倍，然后每孔加入20μl稀释后的化合物。

取HEK-Blue^TM hTLR7细胞，先去掉上清，再加入2-5ml预热的PBS，放入培养箱1-2分钟，轻轻吹打细胞，台盼蓝染色计数。用HEK-Blue检测培养基重悬细胞调整浓度为2.2×10⁵个细胞/ml，加180μl细胞至上述已加入20μl药物的96孔细胞培养板中，37℃，培养6-16h。

本公开化合物对人源TLR8和TLR7激活作用可通过以上的试验进行测定，测得的EC₅₀值见表1-1。

表1-1：本公开化合物对人源TLR8和TLR7的EC₅₀

结论：本公开化合物对人源TLR8具有较好的激活作用，对人源TLR7没有激活作用，说明本公开化合物对TLR8具有选择性。

测试例2、本公开化合物对人肝微粒体CYP3A4咪达唑仑代谢位点的酶活性的抑制作用

本公开化合物对人肝微粒体CYP3A4咪达唑仑代谢位点的酶活性采用如下实验方法测定：

一、实验材料及仪器

1.磷酸缓冲液(PBS),

2.NADPH(Sigma N-1630),

3.人肝微粒体(Corning Gentest),

4.ABI QTrap 4000液质两用仪(AB Sciex),

5.Inertsil C8-3柱,4.6×50mm,5μm(美国迪马公司),

6.CYP探针底物(15μM的咪达唑仑，SIGMA UC429)和阳性对照抑制剂(酮康唑，SIGMA K1003)。

二、实验步骤

配置100mM的PBS缓冲液，用该缓冲液配制2.5mg/ml的微粒体溶液和5mM的NADPH溶液，用PBS梯度稀释5X浓度的化合物工作液(150、50、15、5、1.5、0.15、0.015、0μM)。用PBS梯度稀释5X浓度的酮康唑工作液(150、50、15、5、1.5、0.15、0.015、0μM)。用PBS稀释至15μM浓度的咪达唑仑工作液。

分别取2.5mg/ml的微粒体溶液、15μM的咪达唑仑工作液、MgCl₂溶液和化合物工作液(150、50、15、5、1.5、0.15、0.015、0μM，每个浓度设置不同的反应体系)各20μl，混合均匀。阳性对照组用相同浓度的酮康唑代替化合物。同时将5mM的NADPH溶液一起在37℃预孵育5分钟。5分钟之后取20μl NADPH加入到个孔中，启动反应，孵育30分钟。所有孵育样品设双样本。30分钟后向所有样本中加入250μl含内标的乙腈，混匀，800rpm摇10分钟，然后3700rpm离心10分钟。取80μl的上清液，转移至LC-MS/MS分析。

数值经Graphpad Prism计算得到药物对CYP3A4咪达唑仑代谢位点的IC₅₀值见表1-2。

表1-2：本公开化合物对CYP3A4咪达唑仑代谢位点的IC₅₀值

实施例编号	IC₅₀(μM)
		1	>30

结论：本公开化合物对人肝微粒体CYP3A4的咪达唑仑代谢位点没有抑制作用，表现出更好的安全性，提示不会发生基于CYP3A4代谢咪达唑仑代谢位点的代谢性药物相互作用。

测试例3、本公开化合物对人肝微粒体CYP2D6酶活性的抑制作用

本公开化合物对人肝微粒体CYP2D6酶活性采用如下实验方法测定：

一、实验材料及仪器

1.磷酸缓冲液(PBS),

2.NADPH(Sigma N-1630),

3.人肝微粒体(Corning Gentest),

4.ABI QTrap 4000液质两用仪(AB Sciex),

5.Inertsil C8-3柱,4.6×50mm,5μm(美国迪马公司),

6.CYP探针底物(20μM的右美沙芬，SIGMA Q0750)和阳性对照抑制剂(奎尼丁，SIGMA D9684)。

二、实验步骤

配置100mM的PBS缓冲液，用该缓冲液配制2.5mg/ml的微粒体溶液和5mM的NADPH溶液，用PBS梯度稀释5X浓度的化合物工作液(150、50、15、5、1.5、0.15、0.015、0μM)。用PBS梯度稀释5X浓度的奎尼丁工作液(150、50、15、5、1.5、0.15、0.015、0μM)。用PBS稀释至20μM浓度的右美沙芬工作液。

分别取2.5mg/ml的微粒体溶液、20μM的右美沙芬工作液、MgCl₂溶液和化合物工作液(150、50、15、5、1.5、0.15、0.015、0μM，每个浓度设置不同的反应体系)各20μl，混合均匀。阳性对照组用相同浓度的奎尼丁代替化合物。同时将5mM的NADPH溶液一起在37℃预孵育5分钟，5分钟之后取20μl NADPH加入到个孔中，启动反应，孵育30分钟。所有孵育样品设双样本。30分钟后向所有样本中加入250μl含内标的乙腈，混匀，800rpm摇10分钟。3700rpm离心10分钟。取80μl的上清液，转移至LC-MS/MS分析。

数值经Graphpad Prism计算得到药物对CYP2D6代谢位点的IC₅₀值见表1-3。

表1-3：本公开化合物对CYP2D6代谢位点的IC₅₀值

实施例编号	IC₅₀(μM)
		1	>30

结论：本公开化合物对人肝微粒体CYP2D6的酶活性抑制作用弱，表现出更好的安全性，提示不会发生基于CYP2D6发生代谢性药物相互作用。

测试例4、本公开化合物对人肝微粒体CYP3A4睾酮代谢位点的酶活性的抑制作用

本公开化合物对人肝微粒体CYP3A4睾酮代谢位点的酶活性采用如下实验方法测定：

一、实验材料及仪器

1.磷酸缓冲液(PBS),

2.NADPH(Sigma N-1630),

3.人肝微粒体(Corning Gentest),

4.ABI QTrap 4000液质两用仪(AB Sciex),

5.Inertsil C8-3柱,4.6×50mm,5μm(美国迪马公司),

6.CYP探针底物(睾酮/100μM，SIGMA K1003)和阳性对照抑制剂(酮康唑，Dr.Ehrenstorfer GmbH,C17322500)。

二、实验步骤

配置100mM的PBS缓冲液，用该缓冲液配制2.5mg/ml的微粒体溶液和5mM的NADPH溶液，用PBS梯度稀释5X浓度的化合物工作液(150、50、15、5、1.5、0.15、0.015、0μM)。用PBS梯度稀释5X浓度的酮康唑工作液(150、50、15、5、1.5、0.15、0.015、0μM)。用PBS稀释至50μM浓度的右美沙芬工作液。

分别取2.5mg/ml的微粒体溶液、50μM的睾酮工作液、MgCl₂溶液和化合物工作液(150、50、15、5、1.5、0.15、0.015、0μM，每个浓度设置不同的反应体系)各20μl，混合均匀。阳性对照组用相同浓度的酮康唑代替化合物。同时将5mM的NADPH溶液一起在37℃预孵育5分钟。5分钟之后取20μl NADPH加入到个孔中，启动反应，孵育30分钟。所有孵育样品设双样本。30分钟后向所有样本中加入250μl含内标的乙腈，混匀，800rpm摇10分钟。3700rpm离心10分钟。取80μl的上清液，转移至LC-MS/MS分析。

数值经Graphpad Prism计算得到药物对CYP3A4睾酮代谢位点的IC₅₀值见表1-4。

表1-4：本公开化合物对CYP3A4睾酮代谢位点的IC₅₀值

实施例编号	IC₅₀(μM)
		1	>30

结论：本公开化合物对对人肝微粒体CYP3A4的睾酮代谢位点没有抑制作用，表现出更好的安全性，提示不会发生基于CYP3A4的睾酮代谢位点的代谢性药物相互作用。

测试例5、本公开中化合物刺激外周血单个核细胞(PBMC)分泌IL12和IFNγ能力的测定

本公开中化合物刺激PBMC分泌IL12和IFNγ能力采用如下实验方法测定：

一、实验材料及仪器

1.RPMI 1640(Invitrogen,11875),

2.FBS(Gibco,10099-141),

3.Ficoll-Paque PREMIUM(GE,17-5442-02),

4.台盼蓝溶液(Sigma,T8154-100ML),

5.SepMateTM-50(Stemcell,15460),

6.Bright-Line^TM血细胞计数仪(Sigma,Z359629-1EA),

7. 96孔平底板(Corning,3599),

8. 96孔v底板(Corning,3894),

9.Human IL-12ELISA kit(欣博盛,EHC152.96),

10.Human IFNγkit(cisbio,62HIFNGPEG)

11.PHERAStar多功能酶标仪(BMG，PHERAStar).

二、实验步骤

化合物用纯DMSO稀释，最高浓度为5mM，4倍梯度稀释，共9个点。然后取4μl化合物，加入到196μl含10％FBS的RMPI 1640培养基中，混匀。取50μl至新的96孔细胞培养板。

所有试剂平衡到室温，取250ml培养瓶，将60ml血液和等体积的PBS+2％FBS加入其中，轻轻吹打混匀稀释。取50ml PBMC分离管SepMateTM-50，加入15ml淋巴细胞分离液Ficoll-Paque PREMIUM，然后加入30ml稀释后血液。1200g室温离心10分钟。取上清，然后300g，离心8分钟。用含10％FBS的RMPI 1640培养基重悬并计数，调整PBMC数量至3.33×10⁶个细胞/ml，取150μl至已加入化合物的细胞培养板中，37℃，5.0％CO2的培养箱中培养24h。将细胞培养板放入离心机中，1200rpm，室温离心10分钟，每孔取出150μl上清。

平衡Human IL-12检测试剂盒的试剂至常温，根据试剂盒说明书，标准品的最高浓度为2000pg/ml，二倍梯度稀释共8个点。待测样本稀释20倍。然后100μl/well加入预包被好的板子内。37℃孵育90min。.洗板，加入抗生素化抗体100μl/well。37℃孵育60min。洗板，加入HRP结合酶100μl/well。37℃孵育30min，洗板；加入TMB，室温孵育5min。最后加入终止液终止反应，酶标仪读取450nm处的吸光值。

平衡Human IFNγ检测试剂盒的试剂至常温，在避光条件下根据试剂盒说明书，配制标准品及检测抗体。每孔加入16μl的离心取得的上清液，再每孔加入4μl现配的混合检测抗体，震荡混匀，室温避光孵育过夜，PHERAStar使用htrf程序读数

我们将能刺激PBMC产生比未加化合物组平均值高3倍SD(未加化合物组的SD)所对应化合物浓度，定义为该化合物的MEC(Minimal Effective Concentration)值。

本公开化合物刺激PBMC分泌IL12和IFNγ的能力通过以上的试验进行测定，测得的MEC值见表1-5。

表1-5：本公开化合物刺激PBMC分泌IL12和IFNγ的MEC

实施例编号	IL12 MEC(nM)	IFNγMEC(nM)
			1	41	-

结论：从刺激PBMC分泌IL12和IFNγ的活性的数据上看，本公开化合物具有起效浓度较低的优势。

测试例6

1、实验目的

应用全自动膜片钳在转染hERG钾通道的稳定细胞株上测试本公开化合物对hERG钾电流的阻断作用。

2、实验方法

2.1实验材料与仪器

2.1.1实验材料：

2.1.2实验仪器：

2.2全自动膜片钳实验步骤

HEK293-hERG稳定细胞株按照1:4的密度在MEM/EBSS培养基(10％FBS，400μg/mlG418,1％MEM非必需氨基酸溶液(100×),1％丙酮酸钠溶液)中进行传代培养，培养48-72小时之内进行全自动膜片钳实验。实验当天将细胞用0.25％胰酶消化后，离心收集细胞，用细胞外液(140mM NaCl，4mM KCl，1mM MgCl₂，2mM CaCl₂，5mMD一水葡萄糖，10mM Hepes,pH7.4,298mOsmol)重悬细胞制成细胞悬液。将细胞悬液放置在Patchliner仪器的细胞库上，Patchliner仪器利用负压控制器将细胞加到芯片(NPC-16)上，负压将单个细胞吸引在芯片的小孔上。当形成全细胞模式后，仪器将按照设定的hERG电流电压程序得到hERG电流，然后仪器自动的由低浓度到高浓度，进行化合物灌流。通过HEAK Patchmaster,HEAK EPC10膜片钳放大器(Nanion)和Pathlinersoftware以及Pathcontrol HTsoftware提供的数据分析软件，对化合物各浓度下的电流以及空白对照电流进行分析。

2.3测试结果

本公开化合物对hERG钾电流的阻断作用通过以上的试验进行测定，测得的IC₅₀值见表1-6。

表1-6：本公开化合物对hERG钾电流的阻断作用的IC₅₀

实施例编号	IC₅₀(μM)
		1	26

结论：本公开化合物对hERG的抑制作用弱，可降低由hERG通路引起的副作用。

Claims

1.一种式(I)所示化合物的A晶型，其X-射线粉末衍射图谱在2θ角为8.610、9.740、10.949、13.314、13.903、15.313、16.060、16.354、16.794、17.675、17.879、19.184、19.905、20.901、21.365、22.319、23.057、23.748、24.430、25.428、26.576、27.270、27.863、28.957、29.842和31.506处有特征峰，

2.根据权利要求1所述的式(I)所示化合物的A晶型，其X-射线粉末衍射图谱如图2所示。

3.一种式(I)所示化合物的B晶型，其X-射线粉末衍射图谱在2θ角为4.60、8.77、9.20、9.90、11.17、13.86、14.51、15.45、16.44、17.74、18.03、18.19、18.51、19.31、19.91、20.07、21.07、21.52、22.48、23.22、24.00、24.61、25.64、26.78、27.43、28.04、29.31、31.21、32.09、32.57、33.23和34.01处有特征峰，

4.根据权利要求3所述的式(I)所示化合物的B晶型，其X-射线粉末衍射图谱如图4所示。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的式(I)所示化合物的晶型，其中所述2θ角的误差范围为±0.2。

6.一种制备如权利要求1-2任意一项所述的式(I)所示化合物的A晶型的方法，所述方法包括：将式(I)所示化合物与适量的溶剂混合，挥发结晶，所述溶剂选自甲醇、正庚烷、环己烷、正己烷、石油醚和正丙醇中的一种或多种；或将式(I)所示化合物与适量的溶剂混合，升温溶解，降温结晶，所述溶剂为乙酸乙酯。

7.一种制备如权利要求3-4任意一项所述的式(I)所示化合物的B晶型的方法，所述方法包括：将式(I)所示化合物与适量的溶剂混合，挥发结晶，所述溶剂选自水、异丙醇、乙酸乙酯、乙腈、苯乙酮、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺和1,2-二氯乙烷中的一种或多种；或将式(I)所示化合物与适量的溶剂混合，升温溶解，降温结晶，所述溶剂选自异丙醇或二甲亚砜。

8.一种药物组合物，其包含如权利要求1-2任意一项所述的式(I)所示化合物的A晶型和/或如权利要求3-4任意一项所述的式(I)所示化合物的B晶型，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

9.一种药物组合物，其通过如权利要求1-2任意一项所述的式(I)所示化合物的A晶型和/或如权利要求3-4任意一项所述的式(I)所示化合物的B晶型与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合制备得到。

10.一种如权利要求1-5任意一项所述的式(I)所示化合物的A晶型或B晶型或权利要求8或9所述的药物组合物在制备用于激动TLR8的药物中的用途。

11.一种如权利要求1-5任意一项所述的式(I)所示化合物的A晶型或B晶型或权利要求8或9所述的药物组合物在制备用于治疗由病毒引起的感染的药物中的用途。

12.如权利要求11所述的用途，所述病毒为乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、疱疹病毒和艾滋病毒中的一种或多种。

13.一种如权利要求1-5任意一项所述的式(I)所示化合物的A晶型或B晶型或权利要求8或9所述的药物组合物在制备用于调节免疫系统的药物中的用途。

14.一种如权利要求1-5任意一项所述的式(I)所示化合物的A晶型或B晶型或权利要求8或9所述的药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的用途。

15.一种制备如权利要求8或9所述的药物组合物的方法，其包括将式(I)所示化合物的A晶型和/或B晶型与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合的步骤。