KR20220123437A

KR20220123437A - 피리도피리미딘 유도체의 결정형 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR20220123437A
Application number: KR1020227026482A
Authority: KR
Inventors: 치 우; 전싱 두; 지에 왕; 린 왕; 웨이동 루; 치윈 사오; 쥔 펑; 펑 허
Original assignee: 지앙수 헨그루이 파마슈티컬스 컴퍼니 리미티드; 샹하이 헨그루이 파마수티컬 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2020-01-02
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2022-09-06
Also published as: AU2020416484A1; WO2021136488A1; CN114929232B; US20230058425A1; TW202128692A; EP4085914A4; CN114929232A; JP2023509175A; CA3163386A1; MX2022008286A; EP4085914A1

Abstract

본 발명은 피리도피리미딘 유도체의 결정형 및 이의 제조 방법을 개시하고, 구체적으로 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 및 이의 제조 방법을 개시한다. 신규한 결정형은 우수한 물리화학적 특성을 가지고 임상 치료에 더 효과적이다.

Description

피리도피리미딘 유도체의 결정형 및 이의 제조 방법

관련된 출원의 상호참조

본 출원은 출원일자가 2020년 1월 2일인 중국특허출원 CN202010002822.9의 우선권을 주장한다. 본 출원은 상기 중국 특허출원의 전문을 인용한다.

본 발명은 피리도피리미딘 유도체의 결정형 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 구체적으로 식 (I)로 표시되는 화합물의 결정형 및 제조 방법에 관한 것이다.

톨유사수용체(toll-like receptors; TLRs)는 선천면역에 참여하는 중요한 수용체이다. TLR은 막 횡단 비촉매성 수용체로, 일반적으로 대식 세포 및 수지상 세포 등 보초병 세포에서 발현되며, 미생물에 의해 생성된 구조적으로 보존된 분자를 식별할 수 있다. 이러한 미생물이 피부 또는 장 점막과 같은 물리적 장벽을 뚫으면 TLRs에 의해 인식되어 면역 세포 반응을 활성화한다(Mahla, RS. etal., Front Immunol. 4: 248 (2013)). 면역체계가 병원성 미생물을 광범위하게 인식할 수 있는 것은 톨유사수용체가 광범위하게 존재하기 때문이라고도 할 수 있다.

포유동물에는 적어도 10가지 부동한 TLR이 있다. 이들 수용체 중 일부에 대한 리간드 및 상응하는 신호전달 캐스케이드가 이미 확인되었다. TLR8은 비-헥소제닉 핵산 인식을 전문으로 하는 세포의 엔도솜 구획으로 제한된 TLRs(TLR 3, 7, 8, 9)의 하위 그룹의 구성원이다. TLR8은 주로 단핵 세포, NK 세포 및 골수 수지상 세포(mDC)에 의해 인체에서 발현된다. TLR8 작용제는 IL-6, IL-12, TNF-α 및 IFN-γ와 같은 다양한 전 염증성 사이토카인의 방출을 유발할 수 있다.

TLR8은 신체의 선천면역과 후천면역에서 중요한 역할을 한다. TLR8 작용제는 면역 조절제로서 난소암, 흑색종, 비소세포폐암, 간세포암, 기저세포암, 신세포암, 골수종, 알레르기 비염, 천식, 만성 폐쇄성 폐렴(COPD), 궤양성 대장염, 간 섬유증, HBV, 플라비 바이러스과 바이러스, HCV, HPV, RSV, SARS, HIV 또는 감기의 유행성 바이러스 감염 등과 같은 다양한 면역 관련 질병의 치료에 사용될 수 있다.

TLR8과 TLR7은 매우 높은 상동성을 보이기에 대부분의 경우 TLR8 작용제는 TLR7 작용제이기도 하다. 따라서, WO2009111337, WO2011017611, WO2011068233, WO2011139348, WO2012066336, WO20130311345 및 WO2017046112 등 많은 특허에 TLR8 및 TLR7의 이중 작용제가 보고되어 있다. VentiRX의 VTX-2337(WO2007024612)과 Gilead의 GS-9688(WO2016141092)과 같은 TLR8 선택적 작용제에 대한 보고는 거의 없지만 이 두 화합물은 여전히 TLR7에 대해 특정 활성을 가지고 있으며, Cyp 및 hERG에 대한 선택성도 좋지 않다. 따라서, 여전히 안전하고 보다 효과적인 TLR8 작용제를 개발할 필요가 있다.

WO2020007275(출원 번호: PCT/CN/2019/094310)는 화학식 (I)로 표시되는 화합물에 관한 것으로, 화학명이 (R)-2-((2-아미노-7-(6-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)피리딘-3-일)피리도[3,2-d]피리미딘-4-일)아미노)-2-메틸헥산-1-올인 새로운 TLR8 작용제이며, 임상적 효능 또는 적응증 및 안전성 면에서 개선되었으며 그 구조는 다음과 같다.

약물 활성 성분의 결정 구조는 종종 약물의 화학적 안정성에 영향을 미치며, 상이한 결정화 조건 및 보관 조건으로 인해 화합물의 결정 구조가 변화할 수 있으며, 때로는 다른 결정형이 생성되기도 한다. 일반적으로 비정질 의약품은 규칙적인 결정 구조가 없으며, 종종 제품 안정성 불량, 결정화 미세화, 여과 어려움, 응집 용이성 및 유동성 불량 등 결함이 있다. 따라서 위에서 언급한 제품의 다양한 특성을 개선할 필요가 있으며, 결정 순도가 더 높고 화학적 안정성이 좋은 새로운 결정형을 찾아내기 위해 심도 있는 연구를 수행하여야 한다.

본 발명의 목적은 안정성이 양호하고 임상에서 더 효과적으로 사용될 수 있는 식(I)으로 표시되는 화합물의 새로운 결정형을 제공하는 것이다.

한 측면에서, 본 발명은 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A를 제공하며, 이의 분말 X선 회절 패턴은 8.610, 9.740, 13.903, 15.313, 16.354, 17.675, 17.879, 19.184, 19.905, 20.901, 21.365, 22.319 및 23.057인 2θ 각에서 특징적 피크를 가진다.

일부 실시형태에 있어서, 본 발명은 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A를 제공하며, 이의 분말 X선 회절 패턴은 8.610, 9.740, 10.949, 13.314, 13.903, 15.313, 16.060, 16.354, 16.794, 17.675, 17.879, 19.184, 19.905, 20.901, 21.365, 22.319, 23.057, 23.748, 24.430, 25.428, 26.576, 27.270, 27.863, 28.957, 29.842, 및 31.506인 2θ 각에서 특징적 피크를 가진다.

일부 실시형태에 있어서, 본 발명은 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A를 제공하며, 이의 분말 X선 회절 패턴은 도 2에 도시된 바와 같다.

본 발명은 구체적으로 하기 단계를 포함하는 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A의 제조 방법을 제공한다:

식(I)으로 표시되는 화합물을 적당량의 용매와 혼합하여, 휘발 및 결정화하는 단계를 포함하되, 상기 용매는 메탄올, n-헵탄, 시클로헥산, n-헥산, 석유에테르 및 n-프로판올 중 하나 또는 그 이상에서 선택되거나;

식(I)으로 표시되는 화합물을 적당량의 용매와 혼합하여, 가열 및 용해하고, 냉각 및 결정화하는 단계를 포함하되, 상기 용매는 에틸아세테이트일 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 B를 제공하며, 이의 분말 X선 회절 패턴은 4.60, 8.77, 9.90, 13.86, 15.45, 16.44, 17.74, 18.03, 19.31, 19.91, 21.07, 21.52, 22.48 및 23.22인 2θ 각에서 특징적 피크를 가진다.

일부 실시형태에 있어서, 본 발명은 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 B를 제공하며, 이의 분말 X선 회절 패턴은 4.60, 8.77, 9.20, 9.90, 11.17, 13.86, 14.51, 15.45, 16.44, 17.74, 18.03, 18.19, 18.51, 19.31, 19.91, 20.07, 21.07, 21.52, 22.48, 23.22, 24.00, 24.61, 25.64, 26.78, 27.43, 28.04, 29.31, 31.21, 32.09, 32.57, 33.23 및 34.01인 2θ 각에서 특징적 피크를 가진다.

일부 실시형태에 있어서, 본 발명은 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 B를 제공하며, 이의 분말 X선 회절 패턴은 도 4에 도시된 바와 같다.

본 발명은 구체적으로 하기 단계를 포함하는 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 B의 제조 방법을 제공한다:

식(I)으로 표시되는 화합물에 적당량의 용매를 혼합하여, 휘발 및 결정화하는 단계를 포함하되, 상기 용매는 물, 이소프로판올, 에틸아세테이트, 아세토니트릴, 아세토페논, 디클로로메탄, N,N-디메틸포름아미드, 1,2-디클로로에탄 중 하나 또는 복수에서 선택되거나;

식(I)으로 표시되는 화합물을 적당량의 용매와 혼합하여, 가열 및 용해시키고, 냉각 및 결정화하는 단계를 포함하되, 상기 용매는 이소프로판올 또는 디메틸술폭시드일 수 있다.

분말 X선 회절 패턴(XRPD) 및 시차 주사 열량계(DSC)를 통해, 본 명세서에서 얻어진 결정형에 대한 구조적 결정 및 결정형 연구를 수행하였다.

일부 실시형태에 있어서, 식(I)으로 표시되는 화합물을 적당량의 용매(예컨대 아세톤, 아세트산이소프로필, 메틸tert-부틸에테르, 2-부탄온, 메틸이소부틸케톤, 니트로메탄, 에틸아세테이트/n-헵탄, 부틸아세테이트, p-자일렌, 프로필렌글리콜 모노메틸에테르, 이소펜탄올, 물/에탄올, 물/아세톤, 에틸아세테이트/에탄올, 트리클로로메탄 등)와 혼합하고 휘발 및 결정화하여 결정형 A와 결정형 B의 혼합 결정을 얻을 수 있다. 이의 분말 X선 회절 패턴은 도 6에 도시된 바와 같다.

본 발명에서 결정형의 결정화 방법은 휘발 결정화, 냉각 결정화 또는 실온에서의 결정화 등 통상적인 방법이다.

본 발명의 결정형의 제조 방법에 사용되는 출발 물질은 임의의 형태의 식(I)으로 표시되는 화합물일 수 있으며, 구체적인 형태는 비정질, 임의의 결정형, 수화물, 용매화물 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 구체적으로 약학적 조성물을 제공하며, 상기 약학적 조성물은 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A 및/또는 결정형 B, 및 하나 또는 복수의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다.

본 발명은 구체적으로 약학적 조성물을 제공하며, 상기 약학적 조성물은 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A 및/또는 결정형 B를 하나 또는 복수의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 혼합하여 제조된다.

본 발명은 구체적으로 약학적 조성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A 및/또는 결정형 B와 하나 또는 복수의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 혼합하는 단계를 포함한다.

본 발명은 추가로 TLR8 작용제 약물의 제조에서의 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A 또는 결정형B, 또는 약학적 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명은 추가로 바이러스에 의해 유발되는 감염 치료용 약물의 제조에서의 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A 또는 결정형B, 또는 약학적 조성물의 용도를 제공하며, 상기 바이러스는 바람직하게는 B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 에이즈 바이러스 중 하나 또는 복수이다.

본 발명은 추가로 면역체계 조절용 약물의 제조에서의, 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A 또는 결정형B, 또는 약학적 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명은 추가로 종양 치료 또는 예방용 약물 제조에서의, 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A 또는 결정형B, 또는 약학적 조성물의 용도를 제공한다.

본출원의 명세서 및 특허청구의 범위에 있어서, 별다른 설명이 없는 한, 본 발명에 사용되는 과학 및 기술 용어는 해당 기술분야의 통상의 뜻에 따라 이해하여야 한다. 본 발명의 보다 나은 이해를 위하여 일부 관련 용어에 대한 정의 및 설명은 하기 뜻을 구비한다. 또한, 본문에서 제공하는 용어의 정의 및 설명이 해당 기술분야의 통상의 뜻과 일치하지 않을 경우, 본 발명에서 제공되는 용어의 정의와 설명을 우선으로 해야 한다.

본 발명에 사용된 용어 “슬러리화”는 용매에 대한 물질의 용해도가 낮으나 용매에 대한 불순물의 용해도가 좋은 물질의 특성을 이용하여 정제하는 방법을 의미한다. 슬러리화 정제는 색상을 제거하거나, 결정형을 변경하거나 또는 소량의 불순물을 제거할 수 있다.

본 발명에 사용된 용어 "분말 X선 회절 패턴 또는 XRPD"는 Bragg 공식 2d sinθ=nλ(여기서 λ는 X선의 파장이고, 회절 차수 n은 임의의 양의 정수이며 일반적으로 1차 회절 피크를 취하며, n=1)에 의해, X선이 결정체 또는 일부 결정체 시료의 격자면 간격이 d인 원자면에 스침각 θ(입사각의 상보각, 또한 브래그 각도로 알려짐)로 입사될 때, Bragg 방정식을 만족할 수 있으며, 따라서 이 세트의 분말 X선 회절 패턴을 측정하였다.

본 발명에 사용된 용어 "분말 X선 회절 패턴 또는 XRPD"는 분말 X선 회절계에서 Cu-Kα 방사선을 사용하여 얻은 패턴이다.

본 발명에 사용된 용어 "시차주사열량계 또는 DSC"는 열 효과와 관련된 모든 물리적 변화 및 화학적 변화를 특성화하여 샘플의 상전이 정보를 얻기 위해 샘플의 가열 또는 일정한 온도 동안 샘플과 기준 물질사이의 온도 차이 및 열 흐름 차이를 측정하는 것을 의미한다.

본 발명에서, "2θ 또는 2θ 각"은 회절각을 의미하고, θ는 브래그각(Bragg angle)이고, 단위는 ° 또는 도이며, 2θ의 오차 범위는 ±0.3 또는 ±0.2 또는 ±0.1이다.

본 발명에서, "격자 간격 또는 격자면의 면간격(d값)"은 공간 격자에서 3개의 비평행인 인접한 두 격자를 연결하는 단위 벡터 a, b, c를 선택하며, 이들이 격자를 병치된 평행 육면체 단위로 분할하며, 면간 간격(interplanar)이라고 한다. 결정된 평행 육면체 단위 연결에 따라 공간 격자가 분할되어 일련의 직선 격자가 얻어지며, 이를 공간 격자 또는 격자라고 한다. 공간 격자와 격자는 각각 기하학적 점과 선을 사용하여 결정 구조의 주기성을 나타내며, 상이한 결정 평면은 다른 면간 간격(즉 인접한 두 개의 평행 결정 평면 사이의 거리)을 가지며, 단위는 Å 또는 옹스트롬이다.

[발명의 효과]

본 발명에서 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A 및 결정형 B는 순도가 높고, 조명 조건, 고온 및 고습 조건하에서 결정형의 안정성이 양호하며, HPLC 순도의 변화가 적고, 물리화학적 안정성이 높아 원료의 저장 및 사용에 더욱 유리하다.

도 1은 식(I)으로 표시되는 화합물의 비정질 XRPD 패턴이다.
도 2는 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A의 XRPD 패턴이다.
도 3은 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A의 DSC 차트이다.
도 4는 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 B의 XRPD 패턴이다.
도 5는 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 B의 DSC 차트이다.
도 6은 결정형 A 및 결정형 B의 식 (I)으로 표시되는 화합물의 혼합 결정의 XRPD 패턴이다.

이하에서는 구체적인 실시예를 참조하여 상세하게 설명하였고, 실시예는 본 발명의 기술적 해결 방안을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 실질 및 범위에 대한 제한이 아니다.

실험에 사용되는 기기의 테스트 조건:

1. 시차주사열량계(Differential Scanning Calorimeter, DSC)

기기 모델: Mettler Toledo DSC 1 STARe 시스템.

퍼지 가스: 질소.

가열 속도: 10.0 ℃/min.

온도 범위: 40 내지 300℃.

2. 시차주사열량계(Differential Scanning Calorimeter, DSC)

기기 모델: Mettler Toledo DSC 3+.

퍼지 가스: 질소.

가열 속도: 10.0 ℃/min.

온도 범위: 25 내지 300℃.

3. 분말 X선 회절 패턴(XRPD)

기기 모델: BRUKER D8 DISCOVERY 분말 X선 회절계.

광선: 단색 Cu-Ka 광선(Cu-Kα1의 파장은 1.5406Å, Cu-Kα2의 파장은 1.54439Å, Cu-Kα의 파장은 Kα1 및 Kα2 λ=1.5418Å의 가중 평균을 취한다.)

스캔 모드:q/2q, 스캔 범위: 5-48°.

전압: 40KV, 전류: 40mA.

4. 분말 X선 회절 패턴(XRPD)

기기 모델: BRUKER D8 Focus 분말 X선 회절계.

방사선: 단색 Cu-Ka 선(Cu-Kα1의 파장은 1.5406Å, Cu-Kα2의 파장은 1.54439Å, Cu-Kα 파장은 Kα1 및 Kα2의 가중 평균값 λ=1.5418Å을 취한다.)

스캔 모드: /2, 스캔 범위: 2 내지 40°.

전압: 40KV, 전류: 40mA.

여기서, 2θ의 소수점 2자리 데이터는 BRUKER D8 Focus 분말 X선 회절계로 측정하였다.

실시예에 별다른 설명이 없는 한, 모든 반응은 아르곤 분위기 또는 질소 분위기에서 진행될 수 있다.

아르곤 또는 질소 분위기는 반응 플라스크가 약 1L 부피의 아르곤 또는 질소 풍선에 연결되어 있는 것을 의미한다.

수소 분위기는 반응 플라스크가 약 1L 부피의 수소 풍선에 연결되어 있는 것을 의미한다.

가압 수소화 반응은 Parr 3916EKX 수소화 장치와 Qinglan QL-500 수소 발생기 또는 HC2-SS 수소화 장치를 사용하였다.

수소화 반응은 일반적으로 진공으로 한 후 수소를 충전하며, 이 작업을 3회 반복하였다.

마이크로파 반응은 CEM Discover-S 908860 마이크로파 반응기를 사용하였다.

실시예에 별다른 설명이 없는 한, 용액은 수용액을 지칭한다.

실시예에 별다른 설명이 없는 한, 반응 온도는 상온이고, 20℃ 내지 30℃이다.

실시예의 반응 과정은 박층 크로마토그래피(TLC)로 모니터링하고, 반응에 사용되는 전개제, 화합물 정제에 사용되는 컬럼 크로마토그래피의 용리액 시스템 및 박층 크로마토그래피 방법의 전개제 시스템은 다음과 같은 것을 포함한다: A: 디클로로메탄/메탄올계, B: n-헥산/아세트산에틸계, C: 석유에테르/아세트산에틸계 용매의 부피비는 화합물의 극성에 따라 조절하고, 소량의 트리에틸아민과 초산 등 알칼리성 또는 산성 시약으로 조정하여 추가할 수도 있다.

실시예 1

단계 1

(R)-2-((7-브로모-2-클로로피리도[3,2-d]피리미딘-4-일)아미노)-2-메틸헥산-1-올 1c

화합물 1a(400mg, 1.434mmol, 특허출원 WO2014022728에 개시된 방법으로 제조됨)를 10mL의 테트라하이드로퓨란에 첨가한 후, (R)-2-아미노-2-메틸헥산-1-올 1b(377mg, 2.873mmol)를 첨가하고, N,N-디이소프로필에틸아민(556mg, 4.302mmol)을 첨가한 다음, 튜브를 밀봉하고 100℃에서 16시간 동안 교반하였고, 반응 종료 후, 상온으로 냉각시켜, 불용물을 여과하여 제거하고, 여액을 감압농축한 다음, 용리액 시스템 A를 사용하는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제하여 표제 생성물 1c(4.0g, 수율: 55.3%)를 얻었다.

MS m/z(ESI): 373.1 [M+1].

단계 2

(R)-2-((7-브로모-2-((2,4-디메톡시벤질)아미노)피리도[3,2-d]피리미딘-4-일)아미노)-2-메틸헥산-1-올 1d

화합물 1c(250mg, 0.669mmol)를 테트라하이드로푸란 10mL에 첨가한 후, 2,4-디메톡시벤질아민(560mg, 3.349mmol)을 첨가하고, N,N-디이소프로필에틸아민(259mg, 2.004mmol)을 첨가한 다음, 튜브를 밀봉하고 100℃에서 16시간 동안 교반한 후, 반응액에 물 20mL를 첨가하고, 디클로로메탄(20mL×3)으로 추출하고, 유기상을 합하고, 유기상을 각각 물(20mL), 포화 염화나트륨 용액(20mL)으로 세척하였으며, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 건조제를 여과하여 제거하고, 여액을 감압농축한 다음, 용리액 시스템 B를 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제하여 표제 생성물 1d(295mg, 수율: 87.5%)를 얻었다.

MS m/z(ESI): 504.1 [M+1]

단계 3

(R)-2-((2-((2,4-디메톡시벤질)아미노)-7-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보로란-2-일)피리도[3 ,2-d]피리미딘-4-일)아미노)-2-메틸헥산-1-올 1e

화합물 1d(295mg, 0.54mmol)를 에틸렌글리콜디메틸에테르 5mL에 첨가한 후, 비스(피나콜라토)디보론(223mg, 878.169μmol)을 첨가하고, [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II)(43mg, 0.059mmol)을 첨가하고, 포타슘 아세테이트(173mg, 1.76mmol)를 첨가한 다음, 아르곤가스로 3회 치환하고, 온도를 80℃로 높인 후, 반응물을 2시간 동안 교반하였다. 반응액을 감압농축한 후, 물 20ml를 첨가하고, 디클로로메탄(10ml×3)으로 추출하고, 유기상을 합하고, 물(20ml) 및 포화 염화나트륨 용액(20mL)으로 각각 세척하였으며, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 건조제를 여과하여 제거하고, 여액을 감압농축한 다음, 조질의 표제 생성물 1e(322mg, 수율: 100%)를 얻었다.

단계 4

(R)-2-((2-((2,4-디메톡시벤질)아미노)-7-(6-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)피리딘-3-일)피리도[3,2-d]피리미딘-4-일)아미노)-2-메틸헥산-1-올 1g

화합물 1e(650mg, 1.178mmol)를 20mL의 1,4-디옥산 및 4mL의 물에 첨가한 후, 1-((5-브로모피리딘-2-일)메틸)-4-메틸피페라진 1f(318mg, 1.170mmol, 특허출원 WO20020026052에 개시된 방법으로 제조됨)를 첨가하고, [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II)(86mg, 0.117mmol)를 첨가하고, 탄산칼륨(489mg, 3.538mmol)을 첨가한 다음, 아르곤가스로 3회 치환하고, 온도를 80℃로 높인 후, 반응물을 2시간 동안 교반하였다. 반응액을 감압농축한 후, 물 30ml를 첨가하고, 디클로로메탄(30ml×3)으로 추출하고, 유기상을 합하고, 유기상을 물(30ml) 및 포화 염화나트륨 용액(30mL)으로 각각 세척하였으며, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 건조제를 여과하여 제거하고, 여액을 감압농축한 다음, 용리액 시스템 B를 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제하여 표제 생성물 1g(650 mg, 수율: 89.70%)를 얻었다.

단계 5

(R)-2-((2-아미노-7-(6-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)피리딘-3-일)피리도[3,2-d]피리미딘-4-일)아미노)-2-메틸헥산-1-올 I

화합물 1g(650mg, 0.138mmol)를 트리플루오로아세트산 5mL에 첨가하고, 상온에서 3시간 동안 반응시킨 후, 반응액을 감압농축하고, 반응액에 포화탄산수소나트륨 20mL를 첨가한 다음, 포화 탄산수소나트륨을 첨가하고, 디클로로메탄 (20mLХ3)으로 추출하고, 유기상을 합하고, 포화 염화나트륨 용액(30 mL)으로 세척하였으며, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 건조제를 여과하여 제거하고, 여액을 감압농축한 다음, 용리액 시스템 B를 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제하여 생성물 I(320mg 수율: 65.14%)을 얻었다. 화합물은 분말 X선 회절로 검출된 비정질이며, XRPD 스펙트럼은 도 1에 나타낸 바와 같다.

MS m/z(ESI): 465.1[M+1]

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.87-8.88 (d, 1H ), 8.60-8.61 (m, 1H), 8.14-8.16 (d, 1H), 7.79-7.80 (s, 1H), 7.51-7.53 (d, 1H), 7.20 (s, 1H), 6.36 (br, 2H), 5.12-5.15 (t, 1H), 3.66 (s, 2H), 3.68-3.70 (m, 1H), 3.48-2.53 (m, 1H), 2.32-3.42 (m, 8H), 2.12 (s, 3H), 1.90-1.92 (m, 2H), 1.40 (s, 3H), 1.22-1.23 (m, 4H), 0.80-0.84 (m, 3H).

실시예 2

실시예 1에서 얻어진 식(I)으로 표시되는 화합물(200mg, 0.43mmol)을 10mL의 에틸아세테이트에 첨가한 후, 가열 환류하고, 교반하여 용해한 다음, 온도를 천천히 상온으로 낮추고 교반하고 여과한 후, 필터 케이크를 에틸아세테이트로 세척하고 케이크를수집하였으며, 진공에서 건조시켜, 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A 100mg을 얻었으며, 이의 특징적인 피크 위치는 하기 표에 나타낸 바와 같다.

결정형 A의 XRD 특징적 피크 위치

피크 번호	2θ[°]	d[Å]	I[%]
피크1	8.610	10.26190	10.4
피크2	9.740	9.07396	12.2
피크3	10.949	8.07412	6.7
피크4	13.314	6.64495	26.4
피크5	13.903	6.36460	18.2
피크6	15.313	5.78147	77.2
피크7	16.060	5.51419	28.1
피크8	16.354	5.41587	58.8
피크9	16.794	5.27492	24.5
피크10	17.675	5.01392	83.2
피크11	17.879	4.95721	100.0
피크12	19.184	4.62284	33.6
피크13	19.905	4.45695	27.8
피크14	20.901	4.24682	25.8
피크15	21.365	4.15559	67.5
피크16	22.319	3.98004	50.2
피크17	23.057	3.85426	42.3
피크18	23.748	3.74370	13.4
피크19	24.430	3.64063	31.5
피크20	25.428	3.49996	47.0
피크21	26.576	3.35135	22.2
피크22	27.270	3.26761	26.7
피크23	27.863	3.19940	25.9
피크24	28.957	3.08098	4.6
피크25	29.842	2.99166	1.5
피크26	31.506	2.83726	13.6
피크27	32.420	2.75938	12.9

실시예 3

식(I)으로 표시되는 화합물(400mg, 0.86mmol)을 8mL의 이소프로판올에 첨가하고, 고체가 녹을 때까지 가열 환류한 후, 상온으로 자연 냉각시키고 교반하였으며, 여과한 다음, 얻은 필터 케이크를 이소프로필알코올로 세척하고, 진공에서 건조시키고, 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 B 200 mg을 얻었으며, 이의 특징적인 피크 위치는 하기 표에 나타낸 바와 같다.

결정형 B의 XRD 특징적 피크 위치

피크 번호	2θ[°]	d[Å]	I[%]
피크1	4.60	19.186	100
피크2	8.77	10.075	0.1
피크3	9.20	9.605	0.3
피크4	9.90	8.925	0.2
피크5	11.17	7.914	0.1
피크6	13.86	6.386	0.2
피크7	14.51	6.099	0.1
피크8	15.45	5.730	0.1
피크9	16.44	5.386	0.3
피크10	17.74	4.996	0.7
피크11	18.03	4.916	0.3
피크12	18.19	4.873	0.4
피크13	18.51	4.789	1.8
피크14	19.31	4.593	0.2
피크15	19.91	4.456	0.2
피크16	20.07	4.422	0.1
피크17	21.07	4.214	0.2
피크18	21.52	4.126	0.3
피크19	22.48	3.953	0.6
피크20	23.22	3.828	0.7
피크21	24.00	3.705	0.2
피크22	24.61	3.614	0.1
피크23	25.64	3.472	0.2
피크24	26.78	3.326	0.1
피크25	27.43	3.248	0.4
피크26	28.04	3.180	0.2
피크27	29.31	3.045	0.1
피크28	31.21	2.863	0.1
피크29	32.09	2.787	0.1
피크30	32.57	2.747	0.1
피크31	33.23	2.694	0.1
피크32	34.01	2.634	0.1

실시예 4

식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A 및 결정형 B를 깨끗한 칭량병에 넣고, 가열(40℃, 60℃), 빛(4500lx±500lx), 고습(90%±5%, 75%±5%)의 조건에서 시료의 안정성을 조사하였으며, 조사 기간은 30일이다.

결정형 A에 영향을 미치는 요인의 30일 테스트 결과

조건	시간(일)	순도%	결정형
시작	0	97.83	A
4500 Lux	5	95.82
	10	94.99
	30	92.51	A
40℃	5	96.98
	10	96.98
	30	95.47	A
60℃	5	95.87
	10	95.72
	30	93.74	A
RH 75%	5	97.83
	10	97.85
	30	97.47	A
RH 90%	5	97.91
	10	97.84
	30	97.53	A

결정형 B에 영향을 미치는 요인의 30일 테스트 결과

조건	시간(일)	순도%	결정형
시작	0	98.65	B
4500 Lux	5	95.48
	10	92.61
	30	88.03	B
40℃	5	98.19
	10	98.17
	30	97.23	B
60℃	5	97.87
	10	97.53
	30	96.24	B
RH 75%	5	98.65
	10	98.69
	30	97.96	B
RH 90%	5	98.69
	10	98.75
	30	97.99	B

실시예 5

식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 B를 3개월 기간 장기간(25℃, 60%RH) 및 가속(40℃, 75%RH)의 조건에서 안정성을 조사하였으며, 조사 결과는 하기 표에 나타낸 바와 같다.

식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 B의 장기 가속 안정성

시료	정치 조건	순도%				결정형
시료	정치 조건	시작	1개월	2개월	3개월	결정형
결정형 B	25℃，60%RH	99.71	99.70	99.71	99.62	B
결정형 B	40℃，75%RH	99.71	99.69	99.68	99.54	B

실험 결과: 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 B는 장기간(25℃, 60%RH) 및 가속(40℃, 75%RH)의 안정성 조건에서 3개월 동안 방치되었으며, 물리화학적 안정성이 비교적 우수한 것으로 나타났다.

시험예:

생물학적 평가

시험예 1. 본 발명의 화합물이 인간 TLR8 및 TLR7에 대한 작용 활성 측정

본 발명의 화합물이 HEK-Blue^TM hTLR8 안정적으로 형질감염된 세포에서 발현되는 hTLR8에 대한 활성화 효과는 하기 실험 방법으로 측정하였다.

1. 실험재료 및 기기,

1). DMEM(Gibco, 10564-029),

2). 소 태아 혈청(GIBCO, 10099),

3). 트리판 블루 용액(Sigma, T8154-100ML),

4). Flexstation 3 다기능 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices),

5). HEK-BlueTM hTLR8 세포주(InvivoGen, hkb-hTLR8) 또는 HEK-BlueTM hTLR7 세포주(InvivoGen, hkb-hTLR7),

6). HEK-Blue 검출 시약(InvivoGen, hb-det3),

인산염 완충액(PBS) pH 7.4(Shanghai Yuanpei Biotechnology Co., Ltd., B320).

2. 실험 단계

a. 인간 TLR8의 작용 활성의 측정

HEK-Blue 검출 배지를 제조하고, HEK-Blue 검출 건조 분말을 봉지에 넣고, 50ml의 엔도톡신 제거수를 넣어 용해시킨 다음, 37℃ 인큐베이터에 넣고 10분 후 멸균 여과하였다. 화합물은 먼저 20mM 스톡 용액으로 제조하였다. 다음, 순수 DMSO로 최대 농도 6Х10⁶nM까지 희석한 후， 3배 구배로 희석하여 총 10개 포인트로 하였다. 먼저 화합물을 배지로 20배 희석하고, 다음 20μl의 희석된 화합물을 각 웰에 첨가하였다.

HEK-Blue^TM hTLR8 세포를 취하고, 먼저 상층액을 제거한 후, 예열한 PBS를 2ml 내지 5ml 첨가하고, 인큐베이터에 1분 내지 2분 동안 넣은 다음, 세포를 부드럽게 피펫팅하고, 트리판 블루 염색법으로 계수하였다. HEK-Blue 검출 배지에서 세포를 재현탁하여 농도를 2.2Х10⁵ cells/ml로 조정하고, 20μl의 약물이 첨가된 상기 96웰 세포 배양 플레이트에 180μl의 세포를 첨가하고, 37℃에서 6시간 내지 16시간 동안 배양하였다.

Microplate 리더로 판독하고, 파장은 620nm이다. 해당 OD 값을 얻을 수 있으며, 약물의 EC₅₀ 값은 Graphpad Prism으로 계산할 수 있다.

b. 인간 TLR7의 작용 활성의 측정

HEK-Blue 검출 배지를 제조하고, HEK-Blue 검출 건조 분말을 봉지에 넣고, 50ml의 엔도톡신 제거수를 넣어 용해시킨 다음, 37℃ 인큐베이터에 넣고 10분 후에 멸균 여과하였다. 화합물을 먼저 20mM 스톡 용액으로 제조하였다. 순수 DMSO로 최대 농도 6Х10⁶nM까지 회석하고, 3배 구배로 희석하여 총 10포인트로 하였다.

먼저 상기 제조된 화합물을 배지로 20배 희석하고, 다음 20μl의 희석된 화합물을 각 웰에 첨가하였다.

인간 TLR8 및 TLR7에 대한 화합물의 활성화 효과는 상기 실험에 의해 측정되었으며, 측정된 EC₅₀ 값은 표 1-1에 나타낸 바와 같다.

[표 1-1]

인간 TLR8 및 TLR7에 대한 화합물의 EC₅₀

결론: 본 발명의 화합물은 인간 TLR8에 대한 우수한 활성화 효과를 가지고, 인간 TLR7에 대한 활성화 효과가 없으므로 본 발명의 화합물이 TLR8에 대한 선택성을 가지고 있다.

시험예 2. 본 발명의 화합물이 인간 간 마이크로솜에서 CYP3A4 미다졸람 대사 부위의 효소 활성에 대한 억제 효과

본 발명의 화합물이 인간 간 마이크로솜에서 CYP3A4 미다졸람 대사 부위에 대한 효소 활성을 하기 실험 방법으로 측정하였다.

1. 실험재료 및 기기,

1). 인산염 완충액(PBS),

2). NADPH(Sigma N-1630),

3). 인간 간 마이크로솜(Corning Gentest),

4). ABI QTrap 4000 LC/MS(AB 사이엑스),

5). Inertsil C8-3 컬럼, 4.6Х50mm, 5μm(Dima Corporation, USA),

6). CYP 프로브 기질(15μM의 미다졸람, SIGMA UC429) 및 양성 대조군 억제제(케토코나졸, SIGMA K1003).

2. 실험 단계

100mM PBS 완충액을 제조하고，해당 완충액을 사용하여 2.5mg/ml 마이크로솜 용액과 5mM NADPH 용액을 제조하고， PBS로 5X 농도의 화합물 작업 용액(150, 50, 15, 5, 1.5, 0.15, 0.015, 0μM)을 구배로 희석하였다. PBS로 5X 농도의 케토코나졸 작업 용액(150, 50, 15, 5, 1.5, 0.15, 0.015, 0μM)을 구배로 희석하였다. PBS로 미다졸람 작업 용액을 15μM 농도로 희석하였다.

2.5mg/ml의 마이크로솜 용액, 15μM의 미다졸람 작업 용액, MgCl₂ 용액 및 화합물 작업 용액(150, 50, 15, 5, 1.5, 0.15, 0.015, 0μM, 각 농도는 서로 다른 반응 시스템을 설정함)을 각각 20μl를 취하여 골고루 혼합시켰다. 양성 대조군은 화합물을 동일한 농도의 케토코나졸로 대체하였다. 동시에, 5mM NADPH 용액을 37℃에서 5분 동안 함께 사전 배양하였다. 5분 후, NADPH 20μl를 각 웰에 첨가하여 반응을 시작하고 30분 동안 배양하였다. 30분 후 모든 시료에 내부 표준물질이 포함된 아세토니트릴 250μl를 첨가하고 골고루 섞은 후, 800rpm에서 10분 동안 흔든 다음, 3700rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액 80μl를 취하여 LC-MS/MS로 옮겨 분석하였다.

CYP3A4 미다졸람(Midazolam) 대사 부위에 대한 약물의 IC₅₀ 값은 Graphpad Prism에 의해 계산되었으며, IC₅₀ 값은 표 1-2에 나타낸 바와 같다.

[표 1-2]

CYP3A4 미다졸람 대사 부위에 대한 화합물의 IC₅₀

결론: 본 발명의 화합물은 인간 간 마이크로솜에서 CYP3A4의 미다졸람 대사 부위에 대한 억제 효과가 없고, 보다 우수한 안전성을 나타내어, CYP3A4 대사 미다졸람 대사 부위로 인한 대사 약물 상호작용이 일어나지 않을 것임을 제시하였다.

시험예 3. 본 발명의 화합물이 인간 간 마이크로솜 CYP2D6 효소 활성에 대한 억제 효과

본 발명의 화합물이 인간 간 마이크로솜 CYP2D6에 대한 효소 활성을 하기 실험 방법으로 측정하였다.

1. 실험재료 및 기기,

1). 인산염 완충액(PBS),

2). NADPH(Sigma N-1630),

3). 인간 간 마이크로솜(Corning Gentest),

4). ABI QTrap 4000 LC/MS(AB 사이엑스),

5). Inertsil C8-3 컬럼, 4.6Х50mm, 5μm(Dima Corporation, USA),

6). CYP 프로브 기질(20μM 덱스트로메토르판, SIGMA Q0750) 및 양성 대조군 억제제(퀴니딘, SIGMA D9684).

2. 실험 단계

100mM PBS 완충액을 준비하고，완충액을 사용하여 2.5mg/ml 마이크로솜 용액과 5mM NADPH 용액을 준비하고， PBS로 5X 농도의 화합물 작업 용액(150, 50, 15, 5, 1.5, 0.15, 0.015, 0μM)을 구배로 희석하였다. PBS로 5X 농도의 퀴니딘 작업 용액(150, 50, 15, 5, 1.5, 0.15, 0.015, 0μM)을 구배로 희석하였다. PBS로 덱스트로메토르판 작업 용액을 20μM 농도로 희석하였다.

2.5mg/ml의 마이크로솜 용액, 20μM의 덱스트로메토르판 작업 용액, MgCl₂ 용액 및 화합물 작업 용액(150, 50, 15, 5, 1.5, 0.15, 0.015, 0μM, 각 농도는 서로 다른 반응 시스템을 설정함)을 각각 20μl를 취하여 골고루 혼합시켰다. 양성 대조군은 화합물을 동일한 농도의 퀴니딘으로 대체하였다. 동시에, 5mM의 NADPH 용액을 37℃에서 5분 동안 함께 사전 배양하였다. 5분 후, NADPH 20μl를 각 웰에 첨가하여 반응을 시작하고 30분 동안 배양하였다. 모든 배양 시료는 이중 샘플링되었다. 30분 후 모든 시료에 내부 표준물질이 포함된 아세토니트릴 250μl를 첨가하고 골고루 섞은 후, 800rpm에서 10분 동안 흔든 다음, 3700rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액 80μl를 취하여 LC-MS/MS로 옮겨 분석하였다.

CYP2D6 대사 부위에 대한 약물의 IC₅₀ 값은 Graphpad Prism에 의해 계산되었으며, IC₅₀ 값은 표 1-3에 나타낸 바와 같다.

[표 1-3]

CYP2D6 대사 부위에 대한 화합물의 IC₅₀

결론: 본 발명의 화합물은 인간 간 마이크로솜 CYP2D6의 효소 활성에 대한 억제 효과가 약하고, 보다 우수한 안전성을 나타내어, CYP2D6으로 인한 대사 약물 상호작용이 일어나지 않을 것임을 제시하였다.

시험예 4. 본 발명의 화합물이 인간 간 마이크로솜에서 CYP3A4 테스토스테론 대사 부위의 효소 활성에 대한 억제 효과

본 발명의 화합물이 인간 간 마이크로솜에서 CYP3A4 테스토스테론 대사 부위에 대한 효소 활성을 하기 실험 방법으로 측정하였다.

1. 실험재료 및 기기,

1). 인산염 완충액(PBS),

2). NADPH(Sigma N-1630),

3). 인간 간 마이크로솜(Corning Gentest),

4). ABI QTrap 4000 LC/MS(AB 사이엑스),

5). Inertsil C8-3 컬럼, 4.6×50mm, 5μm(Dima Corporation, USA),

6). CYP 프로브 기질(테스토스테론/100μM, SIGMA K1003) 및 양성 대조군 억제제(케토코나졸, Dr. Ehrenstorfer GmbH, C17322500).

2. 실험 단계

100mM PBS 완충액을 제조하고， 해당 완충액을 사용하여 2.5mg/ml의 마이크로솜 용액과 5mM의 NADPH 용액을 제조하였으며， PBS로 5X 농도의 화합물 작업 용액(150, 50, 15, 5, 1.5, 0.15, 0.015, 0μM)을 구배로 희석하였다. PBS로 5X 농도의 케토코나졸 작업 용액(150, 50, 15, 5, 1.5, 0.15, 0.015, 0μM)을 구배로 희석하였다. PBS로 덱스트로메토르판 작업 용액을 50μM 농도로 희석하였다.

2.5mg/ml의 마이크로솜 용액, 50μM의 테스토스테론 작업 용액, MgCl₂ 용액 및 화합물 작업 용액(150, 50, 15, 5, 1.5, 0.15, 0.015, 0μM, 각 농도는 서로 다른 반응 시스템을 설정함)을 각각 20μl를 취하여 골고루 혼합시켰다. 양성 대조군은 화합물을 동일한 농도의 케토코나졸로 대체하였다. 동시에, 5mM의 NADPH 용액을 37℃에서 5분 동안 함께 사전 배양하였다. 5분 후, NADPH 20μl를 각 웰에 첨가하여 반응을 시작하고 30분 동안 배양하였다. 모든 배양 샘플은 이중 샘플링되었다. 30분 후 모든 시료에 내부 표준물질이 포함된 아세토니트릴 250μl를 첨가하고 골고루 섞은 후, 800rpm에서 10분 동안 흔든 다음, 3700rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액 80μl를 취하여 LC-MS/MS 로 옮겨 분석하였다.

CYP3A4 테스토스테론 대사 부위에 대한 약물의 IC₅₀ 값은 Graphpad Prism에 의해 계산되었으며, 표 1-4에 나타낸 바와 같다.

[표 1-4]

CYP3A4 테스토스테론 대사 부위에 대한 화합물의 IC₅₀

결론: 본 발명의 화합물은 인간 간 마이크로솜 CYP3A4의 테스토스테론 대사 부위에 대한 억제 효과가 없고, 보다 우수한 안전성을 보여, CYP3A4의 테스토스테론 대사 부위로 인한 대사 약물 상호 작용이 일어나지 않을 것임을 제시하였다.

시험예 5. 본 발명의 화합물이 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 자극하여 IL12 및 IFNγ를 분비하는 능력 측정

본 발명의 화합물이 IL12 및 IFNγ를 분비하도록 PBMC를 자극하는 능력을 하기 실험 방법으로 측정하였다.

1. 실험재료 및 기기

1).RPMI 1640(Invitrogen, 11875),

2). FBS(Gibco, 10099-141),

3). Ficoll-Paque PREMIUM(GE, 17-5442-02),

4). 트리판 블루 용액(Sigma, T8154-100ML),

5). SepMateTM-50(Stemcell, 15460),

6). Bright-Line™ 혈구 계수기(Sigma, Z359629-1EA),

7). 96웰 플랫 바닥 플레이트(Corning, 3599),

8). 96웰 v-바닥 플레이트(Corning, 3894),

9). 인간 IL-12 ELISA 키트(Xinbosheng, EHC152.96),

10). 인간 IFNγ 키트(cisbio, 62HIFNGPEG)

11). PHERAStar 다기능 마이크로플레이트 리더(BMG, PHERAStar).

2. 실험 단계

화합물을 순수 DMSO로 최대 5mM 농도까지 총 9 포인트로 4배로 구배 희석하였다. 화합물 4μl을 취하여 10% FBS를 포함하는 196μl의 RMPI 1640 배지에 첨가하여 골고루 섞었다. 50μl를 취하여 새로운 96웰 세포 배양 플레이트에 옮겼다.

모든 시약을 실온으로 평형화하고, 250ml 배양 플라스크에 혈액 60ml과 동일한 부피의 PBS+2% FBS를 첨가하고, 부드럽게 파이펫팅하여 혼합 및 희석하였다. 50ml의 PBMC 분리 튜브 SepMateTM-50에 림프구 분리액 Ficoll-Paque PREMIUM 15ml를 넣은 후, 희석된 혈액 30ml를 첨가하였다. 실온에서 10분 동안 1200g에서 원심분리하였다. 상층액을 취하여 300g에서 8분 동안 원심분리하였다. 10% FBS가 포함된 RMPI 1640 배지에 재현탁 및 계수하고, PBMC의 수를 3.33Х10⁶ cells/ml로 조정하고, 150μl를 취하여 화합물이 첨가된 세포 배양 플레이트에 첨가하고, 37℃, 5.0% CO₂에서 24시간 동안 배양하였다. 세포 배양 플레이트를 원심분리기에 넣고 실온에서 1200rpm으로 10분 동안 원심분리하고 각 웰에서 상층액을 150μl 취하였다.

Human IL-12 검출 키트의 시약을 상온으로 평형화하였고, 키트 설명에 의하면 표준물질의 최대 농도는 2000pg/ml이고, 2배 구배 희석은 총 8포인트이다. 테스트할 샘플을 20배 희석한 다음, 100μl/well을 사전 코팅된 플레이트에 추가하였다. 37℃에서 90분 동안 배양하였다. 플레이트를 세척하고 100μl/well의 항생제 처리된 항체를 추가하였다. 37℃에서 60분 동안 배양하고, 플레이트를 세척하고, HRP 결합 효소 100μl/well을 첨가하였다. 37℃에서 30분 동안 배양하고, 플레이트를 세척하였다; TMB를 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양하였다. 마지막으로 정지용액을 첨가하여 반응을 종결시키고, 마이크로플레이트 리더로 450nm에서의 흡광도 값을 판독하였다.

Human IFN γ 검출 키트의 시약을 상온으로 평형화하였고, 차광 조건에서 키트 설명서에 따라 표준물질과 검출항체를 제조하였다. 원심분리하여 얻어진 상청액 16μl를 각 웰에 첨가한 후, 혼합된 검출 항체 4μl를 각 웰에 첨가하고 흔들어 골고루 섞은 다음, 실온에서 밤새 차광하에서 배양하고 PHERAStar의 htrf 프로그램을 사용하여 판독하였다.

PBMC를 자극하여 무첨가 화합물군의 평균값보다 3배 더 높은 SD(무첨가 화합물군의 SD)를 생성하도록 자극하는 화합물의 농도를 화합물의 MEC(Minimal Effective Concentration) 값으로 정의하였다.

본 발명의 화합물이 PBMC를 자극하여 IL12 및 IFNγ를 분비하도록 하는 능력은 상기 실험에 의해 측정되었고, 측정된 MEC 값은 표 1-5에 나타낸 바와 같다.

[표 1-5]

화합물이 PBMC를 자극하여 IL12 및 IFNγ를 분비하는 MEC

결론: PBMC를 자극하여 IL12 및 IFNγ를 분비하는 활성 데이터로부터, 본 별명의 화합물은 보다 낮은 유효 농도의 이점을 갖는다.

시험예 6

1. 실험 목적

본 발명의 화합물이 hERG 칼륨 전류에 대한 차단 효과를 완전 자동 패치 클램프를 사용하여 hERG 칼륨 채널로 형질감염된 안정한 세포주에서 시험하였다.

2. 실험 방법

2.1 실험재료 및 기기

2.1.1 실험재료:

2.1.2 실험기기:

2.2 자동 패치 클램프의 실험 절차

HEK293-hERG 안정 세포주는 MEM/EBSS 배지(10% FBS, 400μg/ml G418, 1% MEM 비필수 아미노산 용액(100x), 1% 피루브산나트륨 용액)에서 1:4의 밀도로 계대 배양하였고, 48시간 내지 72시간 이내에 완전 자동화된 패치 클램프 실험을 수행하였다. 실험 당일 0.25% 트립신으로 세포를 분해한 후, 원심분리하여 세포를 채취하고, 세포외액(140mM NaCl, 4mM KCl, 1mM MgCl₂, 2mM CaCl₂, 5mM Dglucose monohydrate, 10mM Hepes, pH7.4, 298mOsmol)으로 세포를 재현탁하여 세포 현탁액으로 제조하였다. 세포 현탁액을 Patchliner 기기의 세포 은행에 놓고, Patchliner 기기는 음압 컨트롤러를 사용하여 칩(NPC-16)에 세포를 추가하여 개별 세포를 칩의 작은 홀에 흡인하였다. 전체 셀 모드가 형성되면 기기는 설정된 hERG 전류 및 전압 프로그램에 따라 hERG 전류를 얻은 다음, 기기가 자동으로 화합물을 저농도에서 고농도로 관류하였다. HEAK Patchmaster, HEAK EPC10 패치 클램프 증폭기(Nanion), Pathlinersoftware 및 Pathcontrol HTsoftware에 의해 제공하는 데이터 분석 소프트웨어를 통해 화합물의 각 농도별 전류 및 블랭크 대조 전류를 분석하였다.

2.3 테스트 결과

본 발명의 화합물이 hERG 칼륨 전류에 대한 차단 효과는 상기 실험에 의해 측정되었고, 측정된 IC₅₀ 값은 표 1-6에 나타낸 바와 같다.

[표 1-6]

화합물이 hERG 칼륨 전류에 대한 차단 효과의 IC₅₀

결론: 본 발명의 화합물은 hERG에 대한 억제 효과가 약하며, hERG 경로에 의한 부작용을 감소시킬 수 있다.

Claims

분말 X선 회절 패턴은 8.610, 9.740, 13.903, 15.313, 16.354, 17.675, 17.879, 19.184, 19.905, 20.901, 21.365, 22.319 및 23.057인 2θ 각에서 특징적 피크를 가지는 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A.
제1항에 있어서,
상기 결정형의 분말 X선 회절 패턴은 8.610, 9.740, 10.949, 13.314, 13.903, 15.313, 16.060, 16.354, 16.794, 17.675, 17.879, 19.184, 19.905, 20.901, 21.365, 22.319, 23.057, 23.748, 24.430, 25.428, 26.576, 27.270, 27.863, 28.957, 29.842, 및 31.506인 2θ 각에서 특징적 피크를 가지는 것을 특징으로 하는 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A.
제1항에 있어서,
분말 X선 회절 패턴은 도 2에 도시된 바와 같은 것을 특징으로 하는 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A.
분말 X선 회절 패턴은 4.60, 8.77, 9.90, 13.86, 15.45, 16.44, 17.74, 18.03, 19.31, 19.91, 21.07, 21.52, 22.48 및 23.22인 2θ 각에서 특징적 피크를 가지는 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 B.
제4항에 있어서,
상기 결정형의 분말 X선 회절 패턴은 4.60, 8.77, 9.20, 9.90, 11.17, 13.86, 14.51, 15.45, 16.44, 17.74, 18.03, 18.19, 18.51, 19.31, 19.91, 20.07, 21.07, 21.52, 22.48, 23.22, 24.00, 24.61, 25.64, 26.78, 27.43, 28.04, 29.31, 31.21, 32.09, 32.57, 33.23 및 34.01인 2θ 각에서 특징적 피크를 가지는 것을 특징으로 하는 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 B.
제4항에 있어서,
분말 X선 회절 패턴은 도 4에 도시된 바와 같은 것을 특징으로 하는 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 B.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 2θ 각의 오차 범위가 ±0.2인 것을 특징으로 하는 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형.
식(I)으로 표시되는 화합물을 적당량의 용매와 혼합하여, 휘발 및 결정화하는 단계를 포함하되, 상기 용매는 메탄올, n-헵탄, 시클로헥산, n-헥산, 석유에테르 및 n-프로판올 중 하나 또는 복수에서 선택되거나;
또는, 식(I)으로 표시되는 화합물을 적당량의 용매와 혼합하여, 가열 및 용해하고, 냉각 및 결정화하는 단계를 포함하되, 상기 용매는 에틸아세테이트인 것을 특징으로 하는,
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A의 제조 방법.
식(I)으로 표시되는 화합물에 적당량의 용매를 혼합하여, 휘발 및 결정화하는 단계를 포함하되, 상기 용매는 물, 이소프로판올, 에틸아세테이트, 아세토니트릴, 아세토페논, 디클로로메탄, N,N-디메틸포름아미드 및 1,2-디클로로에탄 중 하나 또는 복수에서 선택되거나;
또는 식(I)으로 표시되는 화합물을 적당량의 용매와 혼합하여, 가열 및 용해시키고, 냉각 및 결정화하는 단계를 포함하되, 상기 용매는 이소프로판올 또는 디메틸술폭시드에서 선택되는 것을 특징으로 하는,
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 B의 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A 및/또는 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 B, 및 하나 또는 복수의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A 및/또는 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 B를 하나 또는 복수의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 혼합하여 제조되는 약학적 조성물.
TLR8 작용제 약물의 제조에서의, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A 또는 결정형 B, 또는 제10항, 제11항에 따른 약학적 조성물의 용도.
바이러스에 의해 유발되는 감염 치료용 약물의 제조에서의, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A 또는 결정형 B, 또는 제10항, 제11항에 따른 약학적 조성물의 용도로서,
상기 바이러스는 바람직하게는 B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 에이즈 바이러스 중 하나 또는 복수인 용도.
면역체계 조절용 약물의 제조에서의, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A 또는 결정형 B, 또는 제10항, 제11항에 따른 약학적 조성물의 용도.
종양의 치료 또는 예방용 약물의 제조에서의, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A 또는 결정형 B, 또는 제10항, 제11항에 따른 약학적 조성물의 용도.
식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 A 및/또는 결정형 B와 하나 또는 복수의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 혼합하는 단계를 포함하는 제10항 또는 제11항에 따른 약학적 조성물의 제조 방법.