CN117224663A - 一种猪伪狂犬病病毒亚单位的疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪伪狂犬病病毒亚单位的疫苗组合物及其制备方法和应用，所述疫苗组合物包含哺乳动物细胞表达系统表达的猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB、以及药学上可以接受的佐剂。本发明的疫苗组合物具有免疫原性强、安全性好、无免疫干扰的优点；且能有效预防和保护猪免受猪伪狂犬病的感染。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，具体地说，涉及猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗及其制备方法，以及该疫苗的应用。
背景技术
猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)感染引起的猪急性传染病，是目前我国流行的主要猪病之一。我国于上世纪70年代引进了Bartha-K61疫苗，使得该病在1990年～2010年间得到了较好的控制。然而自2011年以来，许多使用猪伪狂犬病活疫苗Bartha-K61免疫的规模化猪场发生了由猪伪狂犬病病毒变异毒株引起的猪伪狂犬病。目前，猪伪狂犬病病毒变异毒株已经遍布我国主要养猪地区，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。
国内已上市利用变异毒株制备的灭活疫苗或变异弱毒制备的活疫苗，对我国猪伪狂犬病的防控起到重要作用。但活疫苗的使用仍存在病毒重组，毒力返强的风险，灭活疫苗在生产过程中存在散毒的风险。因此，研制出能够抵御猪伪狂犬病病毒变异毒株且安全有效的基因工程亚单位疫苗，并能通过血清学方法对猪伪狂犬病病毒野毒感染猪和疫苗接种猪进行鉴别诊断对我国实现猪伪狂犬病的净化具有重要的意义。
猪伪狂犬病毒表面糖蛋白gB和gD都能在体内外产生中和抗体。是研发和制作PRV亚单位疫苗的首选糖蛋白。
gD蛋白又称gp50或gVI蛋白，是由病毒US6基因编码的一种I型跨膜糖蛋白。gD是细胞外病毒穿透细胞所必需的受体结合蛋白，缺失了gD的PRV病毒虽然能产生噬斑，但子代病毒并不具有感染性，再次进入宿主的效率非常低，只能以细胞间直接转移方式侵染邻近细胞。gD蛋白是重要的保护性抗原，能够刺激机体产生保护性中和抗体。Marchioli(Marchioli CC,Yancey RJ,Petrovskis EA,Timmins JG,Post LE.Evaluation ofpseudorabies virus glycoprotein gp50 as a vaccine for Aujeszky’s disease inmice and swine:expression by vaccinia virus and Chinese hamster ovary cells.)等利用CHO表达系统表达gD蛋白，用20LD50的RICE毒株对小鼠进行攻毒，免疫后的小鼠存活率为80～100％，而用40LD50的RICE毒株对猪进行接种攻毒，免疫后的猪存活率为100％，但攻毒后3～7日部分猪的鼻拭子存在散毒。Zhang(Zhang T,Liu Y,Chen Y,Wang A,Feng H,Wei Q,et al.A single dose glycoprotein D-based subunit vaccine againstpseudorabies virus infection.Vaccine 2020；38:6153–61.)等用杆状病毒表达纯化gD蛋白并免疫小鼠，5LD50剂量的PRV-HNLH进行攻毒，小鼠存活率87.5％。因此，gD蛋白能有效抵御PRV病毒的攻击，但由于gD蛋白较容易产生变异，单独免疫gD蛋白产生的保护力不能完全满足临床上的需求，这与我们利用CHO系统表达纯化后的gD蛋白免疫猪攻毒后的结果一致。
gB蛋白又称gII蛋白，也是病毒的主要免疫原性蛋白。gB蛋白是病毒融合进入细胞必需的糖蛋白，缺失了gB蛋白的病毒既不能进入细胞也不能在细胞间传递。此外，gB蛋白不仅可以诱导宿主细胞产生补体依赖性的中和抗体，而且还可诱导一个不依赖于补体的中和抗体1H1。该中和抗体表位可广泛中和不同的经典毒株和变异毒株(如Bartha、HB98、RA、SU、HN、HN1201和BH1等毒株)，且表位的序列在不同的毒株中完全相同(Li X,Yang F,Hu X,TanF,Qi J,Peng R,et al.Two classes of protective antibodies against Pseudorabiesvirus variant glycoprotein B:Implications for vaccine design.PLoS Pathog2017；13:e1006777.)。gB真核表达质粒免疫猪后，能够显著降低攻毒后排毒量，然而gC或gD真核表达质粒免疫猪后仍存在较明显排毒。Tsuchida(Tsuchida MA,Katayama S,Okada N,Okabe T,Sasaki N.Protection from Pseudorabies Virus Challenge in Mice by aCombination of Purified gII,gIII and gVI Antigens.J Vet Med Sci1992；54:447–52.)等用纯化后的gB蛋白免疫小鼠，用8.5×103pfu的剂量攻毒，小鼠的存活率为82％。Wang(Wang Y,Wang T,Yan H,Yang F,Guo L,Yang Q,et al.Research and developmentof a novel subunit vaccine for the currently circulating pseudorabies virusvariant in China.Front Agric Sci Eng 2015；2:216.)等用杆状病毒表达gB蛋白(200μg)免疫猪，28日后用2×107.0TCID50的HN1201变异毒株攻毒，结果显示，所有免疫猪均存活，有两头免疫猪体温超过40℃，5日后恢复，未出现临床症状。而对照组猪，体温超过41℃，出现典型的猪伪狂犬症状，5～7日后全部死亡。因此，gB蛋白是重要的保护性抗原，能有效抵御PRV病毒攻击，但单独的gB单独蛋白产生的保护力也不能完全满足临床上的需求。
专利CN106267182A，2017.1.4公开了采用杆状病毒表达系统表达gD和gB亚单位蛋白，得到的亚单位疫苗，在攻毒实验中，样本表现出不同程度的临床症状，因此为非安全良好的亚单位疫苗。
专利CN110327461A，2019.10.15公开了一种由gB、gD、gC、gH和gL组成的免疫疫苗组合物，组成复杂，不利用工业化生产。
研究表明当前流行的PRV的遗传背景和经典毒株存在显著差异，而且致病力显著增强，导致现有的猪伪狂犬病弱毒疫苗的免疫效果显著下降，不能有效控制当前PRV变异毒株的流行。
因此，有必要研制一种生产成本低、安全有效、生产效率高以及疫苗免疫效果好的猪伪狂犬病病毒疫苗，具有重要的现实意义。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗，及其制备方法和应用，其优点是免疫效力良好、安全性高、副反应小、生产成本低，并且安全、有效、质量可控。
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种猪伪狂犬病病毒亚单位的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB、以及药学上可以接受的佐剂；其中，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB均为哺乳动物细胞表达系统表达的糖基化蛋白，并且，所述疫苗组合物中的抗原仅含有所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB。
在本发明的疫苗组合物的优选技术方案中，优选地，所述哺乳动物细胞表达系统为CHO表达系统。
在本发明的疫苗组合物的优选技术方案中，优选地，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB按照1-2:2-1质量比混合。
在本发明的疫苗组合物的优选技术方案中，优选地，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB按照等质量比混合。
在本发明的疫苗组合物的优选技术方案中，优选地，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB的蛋白浓度均为25μg/头份～100μg/头份。
在本发明的疫苗组合物的优选技术方案中，优选地，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB的蛋白浓度均为50μg/头份～100μg/头份
在本发明的疫苗组合物的优选技术方案中，优选地，所述药学上可以接受的佐剂为水包油包水双相乳化佐剂。
在本发明的疫苗组合物的优选技术方案中，优选地，所述药学上可以接受的佐剂为ISA 201VG。
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种制备所述疫苗组合物的方法，包括以下步骤：1)制备猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB；其中，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB为哺乳动物细胞表达系统表达的糖基化蛋白；2)将步骤1)中制备的所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB用无菌PBS稀释，以得到符合抗原蛋白含量要求的水相；3)将水包油包水双相乳化佐剂进行灭菌，以得到油相；4)将步骤2)的所述水相与步骤3)的所述油相进行预热，再将所述水相和所述油相进行混合乳化，以得到乳化后液体；其中，所述水相与所述油相的重量比为1：1，或者所述水相与所述油相的体积比为46:54；以及5)将步骤4)的所述乳化后液体进行定量分装。
在本发明的方法的优选技术方案中，优选地，步骤2)中，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB按照1-2:2-1质量比混合。
在本发明的方法的优选技术方案中，优选地，步骤2)中，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB按照等质量比混合。
在本发明的方法的优选技术方案中，优选地，步骤3)中，所述水包油油包水两相乳化佐剂为ISA 201VG。
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种所述疫苗组合物在制备用于预防猪伪狂犬病毒感染的疫苗中的应用。
本发明选用了相对较保守的gB蛋白和相对较容易变异的gD蛋白作为亚单位疫苗的保护性抗原，制备成双组份基因工程亚单位疫苗，使两种抗原相辅相成，能更加满足国内猪场经典毒株和变异毒株共存的形势，更好地发挥免疫保护作用，保护猪免受PRV病毒的攻击。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。
实施例1：猪伪狂犬病亚单位蛋白gD和gB的制备
1.1猪伪狂犬病亚单位蛋白gD蛋白的制备：参照本申请人的公开号为CN109206491A的发明申请中的gD蛋白的制备方法。
1.2猪伪狂犬病亚单位蛋白gB蛋白的制备：参照本申请人的公开号为CN112142827A的发明申请中的gB蛋白的制备方法。
实施例2：猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗的制备
所用制备疫苗的耗材和材料都需预先经过无菌处理，制备过程是在生物安全柜或其他可以保证整个制备过程都无菌的仪器或环境中完成。
2.1水相的制备：将实施例1中制备得到的猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB用无菌PBS稀释，得到符合抗原蛋白含量要求的水相。
2.2将水包油包水双相乳化佐剂进行灭菌或除菌，以得到油相；所述水包油包水双相乳化佐剂为ISA 201VG。
2.3将水相与油相进行预热，再将所述水相和所述油相进行混合乳化，以得到乳化后液体。其中，所述水相与所述油相的重量比为1：1，或者所述水相与所述油相的体积比为46:54。
2.4将乳化后液体进行定量分装得到亚单位疫苗。
实施例3：亚单位蛋白的攻毒实验
3.1试验动物分组
选用28日龄PRV抗原、抗体双阴性的健康易感仔猪，分为4组，每组5头，其中3组免疫，1组不免疫作为对照组。
3.2免疫接种
对第1组猪颈部肌肉接种201906a批疫苗、第2组颈部肌肉接种201906b批疫苗，第3组颈部肌肉接种201906c批疫苗，1ml/头份，21日后各组以相同的疫苗、相同的剂量、相同的途径进行二免，第4组不免疫作对照；同条件下分栏饲养。参见表1。
表1：疫苗配方表
3.3攻毒及观察
3.3.1攻毒
二免后21日，所有猪经鼻腔接种猪伪狂犬病病毒LY株(病毒含量为105.0TCID50/ml)，2ml/头。
3.3.2攻毒后观察
攻毒后每日测温，并连续观察14日，记录仔猪发病情况。
3.4各免疫组攻毒后观察结果
3.4.1gD单组分疫苗免疫组
201906a批疫苗免疫组，3头猪在攻毒后，体温升高至41℃以上，持续1日后开始下降，表现精神沉郁、食欲下降，剩余2头猪攻毒后体温升高，体温最高达40.5℃，但持续不超过2日，有轻微的精神沉郁、食欲下降，2/5保护，详见表1。
3.4.2gB单组分疫苗免疫组
201906b批疫苗免疫组有2头猪在攻毒后，体温升高至41℃，持续1日后开始下降，表现精神沉郁、食欲下降，剩余3头猪攻毒后体温有升高，体温最高达40.5℃，但持续不超过2日，有轻微的精神沉郁、食欲下降，3/5保护。详见表1。
3.4.3gD+gB双组份疫苗免疫组
201906c批疫苗免疫组2头猪在攻毒后出现体温升高，但不超过40.3℃，持续1～2日后开始下降，无任何临床症状；其余3头猪攻毒后体温正常，无任何临床症状，5/5保护，详见表1。
3.4.4对照组
对照组仔猪在攻毒后，体温升高至41℃以上，并持续高热，在攻毒后出现食欲不振，精神萎靡，对照组5头猪全部发病，随即于第7日和第8日各死亡1头，其中1头猪在后期出现站立不稳，转圈等神经症状。5/5发病，2/5死亡。详见表2。
表2：疫苗组分筛选免疫攻毒保护结果
注：
+表示出现死亡；或者出现明显神经症状(共济失调、转圈、划水等)；或者攻毒后体温超过40.5℃，持续至少3个温次。
-表示存活；或者不出现神经症状(共济失调、转圈、划水等)；或者攻毒后体温不超过40.5℃，持续不超过2个温次。
根据表2可以看出，在同等蛋白浓度下，gD+gB双组份明显优于单组份。
实施例4：疫苗组分配比试验研究
4.1方法
4.1.1试验动物筛选与分组
选用28日龄猪伪狂犬病抗原、抗体双阴性的健康易感猪20头，随机分为4组。第1～3组为疫苗免疫组，第4组为对照组。详见表3。
表3：试验动物分组
4.1.2免疫接种
第1～3组猪分别颈部肌肉注射01319002a批、01319002b批、01319001b批猪伪狂犬病基因工程gD+gB双组份亚单位疫苗(CHO细胞)，1ml/头。一免21日后各组以相同途径和剂量加强免疫一次，第4组不免疫对照，同条件下分栏饲养。
4.1.3攻毒
免疫组猪在二免后21日，连同对照组5头猪，经鼻腔接种猪伪狂犬病病毒LY株(病毒含量为105.0TCID50/ml)，2ml/头，连续观察14日。
4.1.4攻毒后观察
攻毒期间对所有猪每日上午测温1次，并且观察记录临床症状。
4.2结果
4.2.1免疫组攻毒后结果
从攻毒前2日开始每日测温1次，攻毒当日不测温。
4.2.2免疫01319002a批疫苗组(gD:gB为25μg/ml:50μg/ml)
攻毒后有1头猪表现精神沉郁、有轻微的厌食，体温最高至40.6℃。其余4头猪攻毒后出现体温升高，但不超过40.4℃，4/5保护。详见表4。
4.2.3免疫01319002b批疫苗组(gD:gB为50μg/ml:25μg/ml)
攻毒后有1头猪表现精神沉郁、有轻微的厌食，体温最高升高至40.8℃。其余4头猪攻毒后出现体温升高，但不超过40.4℃，4/5保护。详见表4。
4.2.3免疫01319001b批疫苗组(gD:gB为37.5μg/ml:37.5μg/ml)
攻毒后有1头猪表现精神沉郁、有轻微的厌食，体温最高升高至40.7℃。其余4头猪攻毒后出现体温升高，但不超过40.4℃，4/5保护。详见表4。
4.2.4不免疫对照组
对照组猪在攻毒后均出现体温升高，体温均超过41.0℃，并表现为明显的精神沉郁、厌食，其中1头猪出现转圈等神经症状，其中2头猪发热3日后，体温下降，并分别在攻毒后第6日和第7日死亡。对照组5/5发病，2/5死亡。详见表4。
表4：不同配比疫苗免疫攻毒保护结果
注：
+表示出现死亡；或者出现明显神经症状(共济失调、转圈、划水等)；或者攻毒后体温超过40.5℃，持续至少3个温次。
-表示存活；或者不出现神经症状(共济失调、转圈、划水等)；或者攻毒后体温不超过40.5℃，持续不超过2个温次。
根据表4可以看出，不同配比疫苗免疫攻毒保护结果无明显差异，和疫苗中的总蛋白含量有关。
实施例5：免疫攻毒试验
5.1方法：
5.1.1 28日龄仔猪效力试验
取SY19002、SY19003批疫苗，每批疫苗颈部肌肉注射28日龄仔猪5头，1ml/头，21日后，以相同的途径和剂量进行二免。另设5头不免疫作对照。
二免后21日，所有猪采血分离血清，进行中和抗体检测。
二免后21日，所有猪鼻腔接种猪伪狂犬病病毒LY株(病毒含量为105.0TCID50/ml)，2ml/头，每日测温并连续观察14日，记录仔猪发病情况。
5.2结果：
5.2.1 2批实验室制品免疫28日龄仔猪，二免后21日攻毒，攻毒后免疫猪精神状态良好，采食饮水正常。
SY19002批疫苗免疫组，有3头猪在攻毒后，除有一过性体温升高外(不超过40.4℃)，无其他任何临床症状，剩余2头猪攻毒后体温均正常，5/5保护。
SY19003批疫苗免疫组有3头猪在攻毒后，除有一过性体温升高外(不超过40.4℃)，无其他任何临床症状，剩余2头猪攻毒后体温正常，5/5保护。
对照组仔猪在攻毒后，体温升高至41℃以上，并持续高热，在攻毒后出现食欲不振，精神萎靡，对照组5头猪全部发病，随即于第7日和第8日各死亡1头，其中有1头猪在后期出现站立不稳，转圈等神经症状。5/5发病，2/5死亡(详见表5)。
表5：2批疫苗对28日龄仔猪的免疫效力
注：
+表示出现死亡；或者出现明显神经症状(共济失调、转圈、划水等)；或者攻毒后体温超过40.5℃，持续至少3个温次。
-表示存活；或者不出现神经症状(共济失调、转圈、划水等)；或者攻毒后体温不超过40.5℃，持续不超过2个温次。
根据表5可以看出，疫苗中的总蛋白含量需不低于100μg。
实施例6：不同毒株免疫攻毒试验
攻毒实验方法如同实施例3；
疫苗配方如同实施例3中的201906c；
选用28日龄PRV抗原、抗体双阴性的健康易感仔猪，分为6组，每组5头，其中1～3组免疫，4～6组不免疫作为对照组。
第一组免疫组猪鼻腔接种猪伪狂犬病病毒LY株(病毒含量为105.0TCID50/ml)，2ml/头；
第二组免疫组猪鼻腔接种猪伪狂犬病病毒PrVFa株(病毒含量为105.0TCID50/ml)，2ml/头；
第三组免疫组猪鼻腔接种猪伪狂犬病病毒HN1201株(病毒含量为105.0TCID50/ml)，2ml/头；
第四组不免疫对照组，经鼻腔接种伪狂犬病病毒LY株(病毒含量为105.0TCID50/ml)，2ml/头；
第五组不免疫对照组，经鼻腔接种猪伪狂犬病病毒PrVFa株(病毒含量为105.0TCID50/ml)，2ml/头；
第六组不免疫对照组，经鼻腔接种猪伪狂犬病病毒HN1201株(病毒含量为105.0TCID50/ml)，2ml/头；
对照组均发病，攻毒后体温均升高至41℃，持续3天以上；均精神不振，食欲下降乃至废绝，明显消瘦和呼吸症状；个别猪出现流涎，原地转圈等神经症状；第五组观察期内出现2头死亡；疫苗组全部存活，未观察到明显临床症状，仔猪正常生长，说明产品具有良好的免疫原性。
需要声明的是，上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换、或改进。
Claims (13)
1.一种猪伪狂犬病病毒亚单位的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包含猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB、以及药学上可以接受的佐剂；其中，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB均为哺乳动物细胞表达系统表达的糖基化蛋白，并且所述疫苗组合物中的抗原仅含有所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述哺乳动物细胞表达系统为CHO表达系统。
3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB按照1-2:2-1质量比混合。
4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB按照等质量比混合。
5.根据权利要求1、3或4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB的蛋白浓度均为25μg/头份～100μg/头份。
6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB的蛋白浓度均为50μg/头份～100μg/头份。
7.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述药学上可以接受的佐剂为水包油包水双相乳化佐剂。
8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于，所述药学上可以接受的佐剂为ISA201 VG。
9.一种制备如权利要求1-8任一权利要求所述疫苗组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB；其中，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB为哺乳动物细胞表达系统表达的糖基化蛋白；
2)将步骤1)中制备的所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB用无菌PBS稀释，以得到符合抗原蛋白含量要求的水相；
3)将水包油包水双相乳化佐剂进行灭菌，以得到油相；
4)将步骤2)的所述水相与步骤3)的所述油相进行预热，再将所述水相和所述油相进行混合乳化，以得到乳化后液体；其中，所述水相与所述油相的重量比为1：1，或者所述水相与所述油相的体积比为46:54；
5)将步骤4)的所述乳化后液体进行定量分装。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB按照1-2:2-1质量比混合。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gD和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gB按照等质量比混合。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述水包油包水双相乳化佐剂为ISA 201 VG。
13.一种如权利要求1-8任一权利要求所述的疫苗组合物在制备用于预防猪伪狂犬病毒感染的疫苗中的应用。
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