CN117157324A - 抗cntn4抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗CNTN4抗体及其抗原结合片段、含有其的药物组合物及其用于激活T细胞以上调细胞介导的免疫反应的用途，例如用于治疗癌症。

Description

抗CNTN4抗体及其用途
技术领域
本发明涉及抗CNTN4抗体或其抗原结合片段、含有其的药物组合物及其用于激活T细胞的用途，例如用于治疗癌症。
背景技术
人体有一个防御系统，其保护自身免受外部侵入物(病毒、毒素等)和内部有害变化(癌细胞突变)的侵害。与正常细胞不同，癌细胞在其表面上具有特异性抗原，并在癌症发展的早期阶段被免疫系统破坏。然后，当想要无限增殖的癌细胞和想要攻击癌细胞的免疫细胞的力量平衡崩溃时，癌细胞开始大量增殖。当癌细胞进一步生长时，它们会扰乱体内的免疫系统，并且一些癌细胞通过使用免疫细胞的免疫检查点来逃避免疫，而当免疫检查点抑制剂抑制免疫检查点时，免疫细胞的力量增加，从而杀伤癌细胞。
免疫检查点抑制剂是通过阻断参与T细胞抑制的免疫检查点蛋白的激活来激活T细胞来攻击癌细胞的药物，包括CTLA-4、PD-1、PD-L1抑制剂等。目前可市售获得的代表性药物包括作为CTLA-4单克隆抗体的伊匹单抗(产品名称：)，作为PD-1单克隆抗体的纳武单抗(产品名称：/>)和派姆单抗(产品名称：/>)，以及作为PD-L1单克隆抗体的阿特朱单抗(产品名称：/>)和德瓦鲁单抗(产品名称：)。
然而，仍然存在无法用现有免疫检查点抑制剂治疗的癌，因此需要开发新的抗癌治疗。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供抗CNTN4抗体或其抗原结合片段，其与CNTN4蛋白特异性结合。特别是，本发明旨在提供抗体或其抗原结合片段，其与CNTN4蛋白结合以中和CNTN4的免疫逃逸机制。
本发明还旨在提供组合物，其用于预防或治疗由T细胞活性降低引起的疾病，如癌症，通过使用所述抗体或其抗原结合片段以阻断CNTN4的免疫逃逸机制并激活T细胞来进行。
本发明还旨在提供组合物，其使用所述抗体或抗原结合片段，用于分析或检测CNTN4蛋白。
问题的解决方案
本发明提供一种抗CNTN4抗体或其抗原结合片段，其与CNTN4蛋白特异性结合。所述抗体或抗原结合片段与CNTN4蛋白(例如人或小鼠CNTN4蛋白)特异性结合，以中和CNTN4的免疫逃逸机制。因此，本发明的抗体或抗原结合片段可以增加已被CNTN4抑制的T细胞(如CD4+T细胞或CD8+T细胞)的活性。
在实施方案中，本发明提供抗CNTN4抗体或其抗原结合片段，其包含：
轻链CDR1，其包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列；
轻链CDR2，其包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列；
轻链CDR3，其包含SEQ ID NO：116的氨基酸序列；
重链CDR1，其包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列；
重链CDR2，其包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列；和
重链CDR3，其包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列。
在实施方案中，本发明提供抗CNTN4抗体或其抗原结合片段，其包含：
轻链可变区，其包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列；和
重链可变区，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在实施方案中，本发明提供抗CNTN4抗体或其抗原结合片段，其包含：
轻链可变区，其包含SEQ ID NO：156的氨基酸序列；和
重链可变区，其包含SEQ ID NO：159的氨基酸序列。
在实施方案中，本发明的抗原结合片段可以是选自以下的抗体片段：Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、单链抗体scFv、(Fab')2片段、单结构域抗体、双体抗体(dAb)或线性抗体，并且抗体可以是嵌合抗体或人源化抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供了编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子和包含所述核酸分子的重组表达载体。
在另一个实施方案中，本发明还提供用于预防或治疗癌症的组合物，所述组合物包含所述抗体或其抗原结合片段作为活性成分。药物组合物可以与另外的抗癌剂组合使用，如免疫检查点抑制剂或化学治疗剂，或者可以与放射疗法组合使用。
在另一个实施方案中，本发明还提供用于分析或检测CNTN4蛋白的组合物，所述组合物包含所述抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中，本发明提供抗CNTN4抗体或其抗原结合片段用于预防或治疗癌症的用途。
在另一个实施方案中，本发明提供抗CNTN4抗体或其抗原结合片段用于制备药物的用途，所述药物用于预防或治疗癌症。
在另一个实施方案中，本发明提供预防或治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中，本发明提供预防或治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段，以及有效量的另外的抗癌剂。作为另外的抗癌剂，例如可以使用免疫检查点抑制剂或化学治疗剂。
发明的有利效果
本发明的新型抗CNTN4抗体或其抗原结合片段通过阻断CNTN4的免疫逃逸机制来激活T细胞，因此可以有效地用于预防或治疗由T细胞活性降低引起的疾病，特别是癌症。因此，当使用本发明的抗CNTN4抗体时，对于现有免疫疗法无法达到治疗效果的癌症，可以表现出优异的抗癌效果。
附图说明
图1和图2显示了选自噬菌体展示文库的scFv抗体片段的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列。实线和虚线标记的序列表示每个区的CDR序列。
图3显示了用于制备抗CNTN4人源化抗体的可变区的氨基酸序列。
图4显示了本发明的抗体A-01和L1H2有效地中和CNTN4蛋白以增殖T细胞。
具体实施方式
抗CNTN4抗体或其抗原结合片段
本发明提供抗CNTN4抗体或其抗原结合片段，其与CNTN4蛋白特异性结合。
在实施方案中，本发明的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段包含：
轻链CDR1，其包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列；
轻链CDR2，其包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列；
轻链CDR3，其包含SEQ ID NO：116的氨基酸序列；
重链CDR1，其包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列；
重链CDR2，其包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列；和
重链CDR3，其包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列。
表1显示了本发明的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段的每个轻链可变区和重链可变区的CDR序列。
[表1]
在另一个具体的实施方案中，本发明的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段可以包含如表4和表5所列出的每对轻链可变区和重链可变区。例如，本发明的抗体或其抗原结合片段可以包含：轻链可变区，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列；和重链可变区，其包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列(S1)。类似地，本发明的抗体或其抗原结合片段可以包含：轻链可变区，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；和重链可变区，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列(S2)。另一抗体或其抗原结合片段也可以以相同的方式包含两对轻链可变区和重链可变区。
在优选的实施方案中，本发明的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变区，其包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列；和重链可变区，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在另一个具体的实施方案中，本发明的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段可以包含如表12所列出的每对轻链可变区和/或重链可变区。例如，本发明的抗体或其抗原结合片段可以包含：轻链可变区，其包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列；和重链可变区，其包含SEQ IDNO：159的氨基酸序列(LAH2)。类似地，本发明的抗体或其抗原结合片段可以包含：轻链可变区，其包含SEQ ID NO：156的氨基酸序列；和重链可变区，其包含SEQ ID NO：159的氨基酸序列(L1H2)。可替选地，本发明的抗体或其抗原结合片段可以包含：轻链可变区，其包含SEQID NO：158的氨基酸序列；和重链可变区，其包含SEQ ID NO：159的氨基酸序列(L2H2)。
在优选的实施方案中，本发明的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变区，其包含SEQ ID NO：156的氨基酸序列；和重链可变区，其包含SEQ ID NO：159的氨基酸序列。
如本文所用，轻链可变区或重链可变区包含特定氨基酸序列是指所述轻链可变区或重链可变区包含整个氨基酸序列，具有整个氨基酸序列，或由该氨基酸序列组成。
在一个示例中，抗体或其抗原结合片段包含：轻链CDR1，其具有SEQ ID NO：70的氨基酸序列；轻链CDR2，其具有SEQ ID NO：88的氨基酸序列；轻链CDR3，其具有SEQ ID NO：116的氨基酸序列；重链CDR1，其具有SEQ ID NO：58的氨基酸序列；重链CDR2，其具有SEQ IDNO：89的氨基酸序列；和重链CDR3，其具有SEQ ID NO：115的氨基酸序列。
在另一个示例中，抗体或其抗原结合片段包含：轻链CDR1，其基本上由SEQID NO：70的氨基酸序列组成；轻链CDR2，其基本上由SEQ ID NO：88的氨基酸序列组成；轻链CDR3，其基本上由SEQ ID NO：116的氨基酸序列组成；重链CDR1，其基本上由SEQ ID NO：58的氨基酸序列组成；重链CDR2，其基本上由SEQ ID NO：89的氨基酸序列组成；和重链CDR3，其基本上由SEQ ID NO：115的氨基酸序列组成。
在另一个示例中，抗体或其抗原结合片段包含：轻链CDR1，其由SEQ ID NO：70的氨基酸序列组成；轻链CDR2，其由SEQ ID NO：88的氨基酸序列组成；轻链CDR3，其由SEQ IDNO：116的氨基酸序列组成；重链CDR1，其由SEQ ID NO：58的氨基酸序列组成；重链CDR2，其由SEQ ID NO：89的氨基酸序列组成；和重链CDR3，其由SEQ ID NO：115的氨基酸序列组成。
在另一个示例中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，其具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列；和重链可变区，其具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列；或包含轻链可变区，其具有SEQ ID NO：156的氨基酸序列；和重链可变区，其具有SEQID NO：159的氨基酸序列。
在另一个示例中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，其基本上由SEQID NO：18的氨基酸序列组成；和重链可变区，其基本上由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成；或包含轻链可变区，其基本上由SEQ ID NO：156的氨基酸序列组成；和重链可变区，其基本上由SEQID NO：159的氨基酸序列组成。
在另一个示例中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，其由SEQ ID NO：18的氨基酸序列组成；和重链可变区，其由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成；或包含轻链可变区，其由SEQ ID NO：156的氨基酸序列组成；和重链可变区，其由SEQ ID NO：159的氨基酸序列组成。
如本文所用，术语“包含”或其修改的词语是指开放的含义。作为示例，包含所列氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段可以包含未列出的另外的氨基酸序列，无论是否必需。
如本文所用，术语“基本上由……组成”或其修改的短语包括任何所提及的元素，并且允许存在实质上不影响实施方案的基本特征和新颖或功能特征的元素。作为示例，基本上由所列氨基酸序列组成的抗体或其抗原结合片段可以包含实质上不影响抗体或其片段的特征的一个或多个氨基酸残基的替换。
如本文所用，术语“由……组成”或其修改的短语是指如本文所述的各组分不允许在该实施方案的描述中未陈述或列出的任何元素的情况。
如本文所用，术语“互补决定区”(CDR；CDR1、CDR2和CDR3)是指抗原结合所必需的抗体可变区内的氨基酸残基。每个可变区通常具有三个CDR区，分别标识为CDR1、CDR2和CDR3。
在另一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以包含其中scFv的框架区完全或部分人源化的序列。与完全人源化的序列相比，部分人源化的序列可以是至少约60％、至少约70％、至少约80％人源化的，并且一些完全人源化的序列(例如，1、2、3、4或5等)可以回复突变。包含人源化序列的抗体或其抗原结合片段可以具有等同的与CNTN-4结合的能力或在与CNTN-4的结合能力方面没有实质性的很大区别，即使与非人源化抗体或其抗原结合片段相比也是如此。
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其能够与靶标(如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽、蛋白质等)特异性结合，所述结合通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点进行。本文的术语“抗体”不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，还涵盖其抗原结合片段，和包含抗体片段的融合蛋白，以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型。
抗体包括五类免疫球蛋白(Ig)M、IgD、IgG、IgA和IgE，其分别包含由重链恒定区基因μ、δ、γ、α和ε制造的重链。抗体的轻链和重链分为可变区和恒定区，每种抗体的可变区具有不同的氨基酸序列，恒定区具有相同的氨基酸序列，并且重链恒定区包含CH1、H(铰链)、CH2和CH3结构域。每个结构域由两个β-片层组成，分子内二硫键在其之间连接。
一种抗体，其包含由SEQ ID NO：18的氨基酸序列组成的轻链可变区；和由SEQ IDNO：2的氨基酸序列组成的重链可变区，在本文中称为“A-01”。
此外，一种抗体，其包含由SEQ ID NO：156的氨基酸序列组成的轻链可变区；和由SEQ ID NO：159的氨基酸序列组成的重链可变区，在本文中称为“L1H2”。
本发明的抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指其中可变区序列源自一个物种且恒定区序列源自另一个物种的抗体，如其中可变区序列源自小鼠或鸡抗体且恒定区序列源自人抗体的抗体。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指其中源自另一个哺乳动物物种(如小鼠或鸡)种系的CDR序列已被移植至人框架序列上的抗体。例如，框架序列可以经由回复突变而进一步重新修饰。
如本文所用，术语“人抗体”是指其中框架区和CDR区均包含源自人免疫球蛋白序列的可变区的抗体。抗体的恒定区也源自人免疫球蛋白序列。
如本文所用，术语“抗原结合片段”或“抗体片段”是指抗体的抗原结合片段和类似物，其通常包含亲本抗体的至少一部分抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗体片段保留了亲本抗体的至少一些结合特异性。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、F(ab')2片段、单链抗体scFv、单结构域抗体、双体抗体(dAb)或线性抗体。
具体地，Fab片段是指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段。
Fab'片段与Fab片段的不同之处在于，在CH1结构域的羧基末端添加了数个残基，包含来自抗体铰链区的至少一个半胱氨酸。
Fab'-SH是指其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离硫醇基团的Fab'。
F(ab')2抗体片段作为一对Fab'片段经由Fab'片段之间的铰链半胱氨酸生成。
Fv是含有完整抗原识别位点和抗原结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密非共价关联的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。从这两个区的折叠中产生六个高变环(由重链和轻链各产生三个环)，其为抗原结合贡献氨基酸残基，并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区也具有识别并结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点。
单链抗体scFv是包含连接成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，scFv多肽进一步包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。本文中的scFv多肽也称为scFv抗体片段、scFv抗原结合片段、scFv抗体、抗体scFv或简称scFv。
双体抗体是指小的抗体片段，其通过在VH和VL结构域之间使用短接头(约5-10个残基)构建scFv片段来制备，使得V结构域实现链间而非链内配对，从而产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双体抗体是由两个“交叉”scFv片段组成的异二聚体，其中两种抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。
本发明的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段可以特异性地与CNTN4蛋白(优选人或小鼠CNTN4蛋白)结合。
如本文所用，术语“与……特异性结合”或“对……具有特异性”是指可测量且可重现的相互作用，如靶标和抗体之间的结合，其决定了在异质分子群体(包括生物分子)的存在下靶标的存在。例如，与特定靶标(例如表位)特异性结合的抗体是相比于与其他靶标的结合，所述抗体与该靶标的结合具有更大的亲和力、结合能力、更容易和/或持续时间更长。
如本文所用，术语“与人CNTN4蛋白特异性结合”可以指与人CNTN4蛋白结合的解离常数(Kd)为5×10-7M或更小，或优选1×10-7M或更小的抗体。因此，本发明的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段与人CNTN4蛋白结合的解离常数(Kd)可以为5×10-7M或更小，优选1×10-7M或更小。
如本文所用，术语“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数，其中所述常数的单位为M。可以使用本领域广泛建立的方法来确定抗体的Kd值。确定抗体Kd值的优选方法是通过使用表面等离子体共振(SRP)，优选使用生物传感器系统，如系统。
在实施方案中，本发明的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段是单一特异性的，并与单个表位(即CNTN4蛋白)特异性结合。
在另一个实施方案中，本发明的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段是多特异性抗体分子，如双特异性或三特异性抗体分子。多特异性抗体分子包含多个可变区，每个可变区具有与不同表位的结合特异性。在实施方案中，双特异性抗体分子的第一可变区与第一表位(例如CNTN4蛋白)具有第一结合特异性，并且第二可变区与第二表位(例如CNTN4蛋白以外的靶标蛋白，例如包括但不限于CTLA-4、PD-1、或PD-L1)具有第二结合特异性。在一个具体的实施方案中，双特异性抗体分子与CNTN4特异性结合；以及与CTLA-4、PD-1或PD-L1中的任一种特异性结合。在另一个实施方案中，以上分子的任何组合可以用多特异性抗体分子制备，例如，三特异性抗体包括与CNTN4的第一结合特异性，以及与CTLA-4、PD-1或PD-L1中的至少两种结合的第二特异性和第三特异性。本发明的多特异性抗体分子可以使用本领域技术人员已知的标准分子生物学技术(例如重组DNA和蛋白质表达技术)来制备。
在另一个实施方案中，本发明的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段可以形成抗体-药物缀合物(ADC)。如本文所用，术语“抗体-药物缀合物”或“ADC”可以用式M-[L-D]n表示，其中M表示抗体分子，即本发明的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段，L是任选的接头或接头单元，D是合适的药物或前药，且n是约1至约20的整数。包含在ADC中的药物可以根据治疗或诊断用途进行适当选择，只要该药物不干扰本发明的抗体的特异性结合即可。在实施方案中，药物包括但不限于细胞毒性剂(例如化学治疗剂)、前药转化酶、放射性同位素或化合物、或毒素。可以包含在ADC中的药物和接头及其制备方法可以按照本领域已知的方法。
在另一个实施方案中，如通过ELISA测定所确定的，本发明的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段与CNTN4蛋白(例如人或小鼠CNTN4蛋白)结合的EC50为5nM或更小，优选3nM或更小，更优选2nM，甚至更优选1nM或更小。
如本文所用，术语“EC50”是与使用抗体的体外或体内测定相关的术语，其是指诱导50％最大反应(即，在最大反应和基线之间的中等反应)的抗体浓度。
核酸分子和载体
本发明的另一方面涉及编码本发明的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
核酸可以存在于整个细胞中，存在于细胞裂解物中，或以特异性纯化或基本上纯的形式存在。当通过标准技术(包括碱性/SDS处理、CsCl条带、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其他技术)从其他细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白质)纯化分离时，核酸被“分离”或“变得基本上纯”。
本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或不含内含子序列。在优选的实施方案中，核酸是cDNA分子。
在实施方案中，本发明的核酸分子编码本发明的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段的轻链区、重链区、或轻链区和重链区两者，并且优选编码轻链可变区、重链可变区、或轻链可变区和重链可变区两者。在实施方案中，本发明的核酸分子编码包含SEQ ID NO：18或SEQID NO：156的氨基酸序列的轻链可变区，或编码包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：159的氨基酸序列的重链可变区。可替选地，本发明的核酸分子编码抗体A-01或抗体L1H2。
一旦获得编码VL和/或VH区的DNA片段，就可以通过标准重组DNA技术进一步操作此类DNA片段，例如，从而将可变区基因转换为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段与编码另一种蛋白质(例如抗体恒定区，如hIgG1 Fc区(hFc)或hCκ区，或柔性接头)的另一个DNA片段可操作连接。如本文所用，术语“可操作连接”是指两个DNA片段连接在一起，使得由所述两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内(in-frame)。
可以通过使编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一个DNA分子可操作结合，将编码VH区的分离的DNA转换为全长重链基因。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。
对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可以与仅编码重链CH1恒定区的另一个DNA分子可操作连接。
为了产生scFv基因，将编码VL和VH的DNA片段与编码柔性接头(例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一个片段可操作连接，使得VL和VH序列可以表达为连续的单链蛋白质，VL和VH区通过柔性接头连接。
本发明的核酸序列(如RNA或DNA)可以从多种来源分离，进行基因工程改造，扩增和/或重组表达。可以使用任何重组表达系统，除了细菌系统以外，还包括例如酵母、昆虫或哺乳动物系统。例如，核酸的操作(如亚克隆至表达载体中、标记探针、测序和杂交)可以如本领域已知的那样进行。
因此，本发明提供包含所述核酸分子的重组表达载体。
如本文所用，术语“载体”是指能够在原核和/或真核细胞中自我复制的DNA分子，并且与重组载体、克隆载体或表达载体可互换使用，其通常用作将基因或DNA片段递送至细胞等的载体。载体通常包含但不限于：可以在原核和/或真核细胞中复制的复制起点，可以赋予对特定条件/物质(如抗生素降解酶)的抗性的选择标记基因，能够在真核或原核细胞中转录基因的启动子，以及可翻译序列。
一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，另外的DNA片段可以连接至其中。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA片段可以连接至病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)。
本发明还提供包括所述载体的宿主细胞。宿主细胞包括但不限于哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细菌来源的细胞。细菌细胞包括的细胞来自革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌，如埃希氏菌属(如大肠杆菌)和假单胞菌属的数个物种。在真菌细胞组中，优选使用酵母细胞。可以通过使用酵母菌株(如其中包括毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha))来实现酵母中的表达。此外，昆虫细胞(如来自果蝇属的细胞和Sf9)可以用作宿主细胞。
此外，可以使用使用哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、猴COS细胞、BHK细胞、NSO细胞或Bowes黑色素瘤细胞)的表达系统。由于本发明的抗体或其抗原结合片段最终将施用于人，因此可以特别优选完整的人表达系统。在这种情况下，宿主细胞可以是人细胞，如HeLa、911、AT1080、A549、293和HEK293细胞。
抗体或其抗原结合片段的制备
本发明的抗体或其抗原结合片段可以按照常规已知的方法制备。
在实施方案中，可以通过根据本领域已知的方法将CNTN4抗原注射至测试受试者(例如小鼠)中，然后分离表达具有目的序列或功能特征的抗体的杂交瘤，来制备本发明的抗体，如单克隆抗体。
容易使用常规程序(例如，通过使用能够与编码单克隆抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)对编码单克隆抗体的DNA进行分离和测序。提供杂交瘤细胞作为这种DNA的优选来源。一旦分离，即可以将DNA放入表达载体中，然后将其转染至宿主细胞(如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、CHO细胞、或骨髓瘤细胞，其以其他方式则不产生免疫球蛋白)，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。
在另一个实施方案中，可以使用抗体展示技术(如噬菌体文库技术)来制备本发明的抗体或其抗原结合片段。
将抗体的噬菌体文库克隆成其中将人抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因融合至噬菌体载体中的噬菌体表面蛋白(pIII)以在大肠杆菌中表达的形式，然后感染M13辅助噬菌体以制备抗体文库，其中在噬菌体表面展示具有重链可变区和轻链可变区的各种组合序列的抗体片段(scFv或Fab)。从该文库中，使用淘选方法分离与特定抗原结合的抗体片段，对分离的抗体片段进行表征，然后转化为完整IgG形式并在动物细胞中大量表达，从而产生特异性的人单克隆抗体。
如本文所用，术语“噬菌体载体”是指具有噬菌体复制起点的质粒DNA，其通常具有抗生素耐药性基因作为选择标记。用于噬菌体展示的噬菌体载体包含M13噬菌体的gIII基因或其一部分，并且ScFv基因连接至gIII基因的5'末端并通过转化体表达。
“辅助噬菌体”是提供必需的遗传信息以便噬菌体被包装成噬菌体颗粒的噬菌体。由于噬菌体包含噬菌体的gIII基因或其一部分，因此用辅助噬菌体感染用噬菌体转化的宿主细胞(转化体)以提供剩余的噬菌体基因。辅助噬菌体包括M13K07或VCSM13，并且大多包含抗生素耐药性基因，如卡那霉素耐药性基因，以便可以选择感染有辅助噬菌体的转化体。此外，包装信号是缺陷的，因此噬菌体基因而不是辅助噬菌体基因被选择性包装成噬菌体颗粒。
用途和方法
本发明的抗体或其抗原结合片段恢复了由于CNTN4蛋白的结合而被抑制的免疫反应。已经发现CNTN4蛋白抑制T细胞(特别是CD4+T细胞和CD8+T细胞)的增殖。通过与CNTN4蛋白特异性结合从而增加T细胞活性(特别是CD4+T细胞或CD8+T细胞的活性)，本发明的抗体或其抗原结合片段可以用于治疗与免疫抑制有关的疾病。
在实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段增加了T细胞活性。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段可以激活T细胞，特别是CD4+T细胞或CD8+T细胞。在实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以增加已被CNTN4抑制的T细胞的增殖。本发明的抗体或其抗原结合片段具有优异的中和CNTN4的能力。
因此，本发明涉及通过使用抗CNTN4抗体或其抗原结合片段来诱导T细胞激活。在实施方案中，本发明提供诱导或增强T细胞激活的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，本发明提供抗CNTN4抗体或其抗原结合片段用于诱导或增强T细胞激活的用途。在另一个实施方案中，本发明提供用于诱导或增强T细胞激活的药物组合物，所述组合物包含抗CNTN4抗体或其抗原结合片段。
因此，本发明涉及通过使用抗CNTN4抗体或其抗原结合片段来预防、改善或治疗免疫抑制相关疾病。
在实施方案中，本发明提供预防、改善或治疗免疫抑制相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中，本发明提供抗CNTN4抗体或其抗原结合片段用于预防、改善或治疗免疫抑制相关疾病的用途。
在另一个实施方案中，本发明提供用于预防、改善或治疗免疫抑制相关疾病的药物组合物，所述组合物包含抗CNTN4抗体或其抗原结合片段。如本文所用，术语“受试者”意指包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，包括非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖动物和爬行动物，但是例如，优选非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、牛和马。优选的受试者是需要激活或增强免疫反应的人。
优选地，本发明的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段阻断CNTN4蛋白的结合，从而在癌症患者中激活T细胞和/或增强对癌细胞的免疫反应，从而可以抑制癌细胞的体内生长，因此可以有效地用于预防、改善或治疗癌症。
在另一个实施方案中，本发明提供抗CNTN4抗体或其抗原结合片段用于预防或治疗癌症的用途。
在另一个实施方案中，本发明提供抗CNTN4抗体或其抗原结合片段用于制备药物的用途，所述药物用于预防或治疗癌症。
在另一个实施方案中，本发明提供预防或治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中，本发明提供预防或治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段，以及有效量的另外的抗癌剂。
另外的抗癌剂可以是免疫检查点抑制剂或化学治疗剂，并且免疫检查点抑制剂可以是选自抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体中的一种或多种。
有效量的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段以及有效量的另外的抗癌剂可以作为单一制剂同时施用于受试者，也可以作为分开的制剂同时或顺序施用于受试者。
当使用本发明的抗体时，其生长可以被抑制的优选癌症包括通常对免疫疗法有反应的癌症。例如，本发明中的癌症包括但不限于黑色素瘤(例如转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、乳腺癌、结直肠癌、直肠癌、结肠癌和肺癌(例如非小细胞肺癌)。此外，本发明的待治疗受试者包括难治性或复发性恶性肿瘤，当使用本发明的抗体时，所述恶性肿瘤的生长可以被抑制。
可以使用本发明的方法治疗的其它癌症的示例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括石棉诱发的癌症)以及这些癌症的组合。
在另一个实施方案中，所述癌症可以是表达CNTN4的癌症。
在另一个实施方案中，所述癌症可以是难治性的或对常规免疫检查点抑制剂耐药(例如对PD-1途径抑制剂、PD-L1途径抑制剂或CTLA-4途径抑制剂耐药)。
本发明的抗体或抗原结合片段可以单独使用或与其他抗癌疗法组合使用。其他抗癌疗法可以包括例如标准癌症疗法(例如化学疗法、放射疗法或手术)；或其他抗癌剂，如细胞毒性剂、细胞抑制剂、抗血管生成剂或抗代谢物剂、肿瘤靶向剂、免疫刺激剂或免疫调节剂，或与细胞毒性剂、细胞抑制剂或其他毒性剂、免疫检查点抑制剂缀合的抗体等。
优选地，本发明的抗体或抗原结合片段可以与其他抗癌剂(如免疫检查点抑制剂、化学治疗剂或放射疗法)组合使用。免疫检查点抑制剂可以是例如抗CTLA-4抗体(例如伊匹单抗)、抗PD-1抗体(例如派姆单抗、纳武单抗)或抗PD-L1抗体(例如阿特朱单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗)。化学治疗剂包括但不限于烷化剂、抗代谢物剂、激酶抑制剂、纺锤体毒植物生物碱、细胞毒性/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、光敏剂、抗雌激素剂和选择性雌激素受体调节剂(SERM)、抗孕酮剂、雌激素受体下调剂(ERD)、雌激素受体拮抗剂、促黄体生成素释放激素激动剂、抗雄激素剂、芳香酶抑制剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、抑制牵涉异常细胞增殖或肿瘤生长的基因表达的反义寡核苷酸。本发明的化学治疗剂的具体示例包括吉西他滨、长春瑞滨、依托泊苷(VP-16)；铂类似物，如顺铂或卡铂；紫杉烷类，如紫杉醇、白蛋白结合紫杉醇和多西他赛等。其他癌症治疗剂包括表现出抗癌效果的益生菌，如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)GEN3013菌株(KCTC13426BP)、乳酸乳球菌GEN3033菌株(KCTC13684BP)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)MG731菌株(KCTC13452BP)等。
当本发明的抗体或抗原结合片段与其他抗癌剂组合使用时，它们可以分开施用，或者也可以以组合产品的形式应用，其中多种活性成分存在于单一药物制剂中。当它们作为分开的制剂施用时，两种制剂可以顺序施用或同时施用。对于同时施用，将它们一起给予患者。对于顺序施用，可以在不长的时间间隔内给予它们，例如可以在12小时或更短的时间内，或6小时或更短的时间内将这些制剂施用于患者。
在实施方案中，本发明提供预防、改善或治疗免疫抑制相关疾病(如癌症)的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段与另外的抗癌剂的组合。该实施方案不仅包括将含有抗CNTN4抗体或抗原结合片段以及另外的抗癌剂的单一组合物同时施用于有需要的患者，而且还包括将分开且分别含有抗CNTN4抗体或抗原结合片段以及另外的抗癌剂的组合物同时或顺序施用于有需要的患者。
在另一个实施方案中，本发明提供抗CNTN4抗体或其抗原结合片段用于与另外的抗癌剂组合的用途，用于预防、改善或治疗免疫抑制相关疾病，如癌症。
在另一个实施方案中，本发明提供用于预防、改善或治疗免疫抑制相关疾病(如癌症)的药物组合物或组合，所述组合物或组合包含抗CNTN4抗体或其抗原结合片段以及另外的抗癌剂。本文中的药物组合物或组合包含抗CNTN4抗体或其抗原结合片段以及另外的抗癌剂，不仅包括两种组分以单一制剂的形式物理上一起存在的情况，而且还包括两种组分在分开的制剂中同时施用或顺序施用的情况，其中两种药物可以分开提供或在单个试剂盒中一起提供。因此，本发明提供用于预防、改善或治疗免疫抑制相关疾病(如癌症)的试剂盒，所述试剂盒包含抗CNTN4抗体或其抗原结合片段以及另外的抗癌剂。
另外的抗癌剂可优选为免疫检查点抑制剂，更优选为抗CTLA-4抗体(例如伊匹单抗)、抗PD-1抗体(例如派姆单抗和纳武单抗)或抗PD-L1抗体(例如阿特朱单抗、阿维鲁单抗和德瓦鲁单抗)。
另一种优选的另外的抗癌剂可以包括化学治疗剂，如吉西他滨、长春瑞滨、依托泊苷(VP-16)；铂类似物，如顺铂或卡铂；紫杉烷类，如紫杉醇、白蛋白结合紫杉醇或多西他赛。
与本发明的抗体或其抗原结合片段一起使用的另一种优选的另外的抗癌疗法可以包括放射疗法。
本发明还提供了检测样品中CNTN4蛋白的存在或测量抗CNTN4抗体量的方法，其通过使用抗CNTN4抗体或其抗原结合片段作为活性成分来进行。所述方法包括在抗体或其抗原结合片段可以与CNTN4蛋白结合以形成复合物的条件下，使抗体或其抗原结合片段与样品和对照样品接触。然后，检测复合物是否已经形成，其中样品之间复合物形成程度与对照样品相比的差异是样品(例如血液)中存在人血液抗原的证据。
因此，本发明提供用于诊断癌症的组合物，所述组合物包含抗CNTN4抗体或其抗原结合片段。
药物组合物
本发明提供包含抗CNTN4抗体或其抗原结合片段的药物组合物。所述组合物可以含有非活性成分，即药学上可接受的赋形剂(参见药用赋形剂手册等)。可以通过将制剂与生理上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂混合，以例如冻干粉末、浆液、水溶液或悬浮液的形式制备治疗制剂和诊断制剂的组合物。
合适的施用途径包括肠胃外施用，如肌内、静脉内或皮下施用。用于本发明的药物组合物或用于实施本发明的方法的抗体的施用可以通过多种常规方法进行，如局部应用，或皮内、皮下、腹膜内、肠胃外、动脉内或静脉内注射。在实施方案中，本发明的抗体静脉内或皮下施用。
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。对于本领域技术人员将显而易见的是，这些实施例仅旨在更详细地描述本发明，并且本发明的范围不受根据本发明主题的这些实施例的限制。
实施例
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。以下实施例仅是说明本发明，并且本发明的范围不受此限制。
实施例1：特异性结合CNTN4的scFv抗体选择
1.1scFv抗体文库制备和抗体选择
(1)鸡scFv抗体文库的制备
将十五只鸡分成三组，每组五只，第一组接种小鼠CNTN4，第二组接种人CNTN4，且第三组交替接种小鼠CNTN4和人CNTN4，共接种四次以产生抗体。抗原接种量为第一次每组20μg/鸡，3周后第二次10μg/鸡，2周后第三次10μg/鸡，且2周后第四次10μg/鸡，且每组按此量得到免疫。每次抗原接种前，用注射器收集血液，以通过使血清与抗原结合的ELISA确认是否产生了抗体。第三次接种后，选择在ELISA中对人CNTN4和小鼠CNTN4均有反应性的总共四只鸡，具体地，选择了第一组中的第3只鸡(下文称为1-3)、1-4、3-2和3-5。处死后，提取血液、脾、骨髓和法氏囊，并提取总RNA。很好地鉴定了主要RNA，28S rRNA，并使用提取的RNA作为免疫抗体文库的PCR模板，使用SuperScriptTM IV第一链合成系统(Invitrogen，#18091050)合成cDNA。通过PCR获得scFv片段，其中抗体的轻链可变区和重链可变区用接头连接，使用限制性内切酶Sfi I在噬菌体载体pComb3X上进行克隆，用于噬菌体展示，并在具有F'菌毛的能够用M13辅助噬菌体感染的大肠杆菌ER2738上进行电穿孔。确认了scFv文库的复杂性，如表2所示。
[表2]
(2)scFv抗体选择
对于表2中编号1-3、1-4、3-2和3-5的每只鸡，通过合并和噬菌体扩增进行生物淘选。更具体地，通过以下组合来设置并执行总共四种条件(A-D)：通过将噬菌体与50μL蛋白A和免疫球蛋白复合物混合并在37℃孵育1小时来清除非特异性结合(Fc结合剂)的条件(预清除)；在37℃使用PBS(pH 7.4)或50mM乙酸钠(pH 5.5)作为结合缓冲液进行孵育4小时的条件；以及在洗脱步骤中用抗原进行竞争洗脱的条件，用0.5％吐温20的PBS溶液洗涤，然后加入100μL的抗CNTN4鸡血清，并洗涤加入洗脱(表3)。对于每种条件，进行1轮至3轮或至多5轮，同时控制噬菌体结合条件相对于抗原(20μg至1μg抗原)的严格性。
[表3]
噬菌体展示策略
为了选择候选抗体，在3或5轮的输出菌落中完成噬菌体营救(rescue)后，例如将单个菌落点样并放入介质中，培养至OD 600nm为0.7至0.8，用辅助噬菌体感染，然后培养过夜，并离心以获得噬菌体培养介质，然后进行噬菌体ELISA。对于噬菌体ELISA，首先在4℃用抗原(小鼠CNTN4或人CNTN4)包被板过夜，然后用3％BSA的PBS溶液封闭1小时。此后，将50μL噬菌体加入用抗原包被的板中，然后孵育2小时。将板与抗HA-HRP(二抗)孵育1小时后，向其中加入ABTS并显色以测量405nm处的吸光度。对来自鸡编号1-4和3-2的文库的总共950个菌落以及来自鸡编号1-3和3-5的文库的总共380个菌落进行ELISA筛选，分别选择138个和306个菌落作为与抗原CNTN4结合的阳性克隆，并通过测序筛选出26个和35个独特scFV序列，用于鉴定scFv序列。
1.2scFv的表达和纯化
为了对实施例1.1中选择的scFv抗体进行功能评估，以融合蛋白形式的用恒定人κ(hCk)标记的scFv、或人IgG4(S228P)的形式进行克隆，并在Expi293F细胞上进行瞬时转染。将分泌的scFv-hCk或IgG与培养介质中的κ选择结合，然后通过pH洗脱来纯化，通过透析换成PBS缓冲液，并对蛋白质进行定量以获得scFv-hCk或IgG。
作为结果，证实了表达总共25种scFv-hCk和总共27种IgG4，每种表达的scFv的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列示于图1和图2以及表4和表5(用实线和虚线指示的图1和图2所示的序列表示每个区的CDR序列)中。
[表4]
/>
/>
/>
/>
[表5]
/>
/>
/>
/>
1.3所选择scFv抗体的CNTN4结合能力的确认(1)根据ELISA确认scFv与抗原蛋白的结合能力
对在实施例1.2中确认了其表达的总共25种scFv-hCk和总共27种IgG进行ELISA测试。用200ng的抗原(人CNTN4-兔Fc或小鼠CNTN4-兔Fc)包被ELISA板。使用200ng的阴性对照(人抗原-兔Fc)作为标签蛋白。对于抗体结合，抗CNTN4 scFv-hCk从最大1μM连续稀释至0.001nM，每次稀释1/10×，而抗CNTN4IgG从最大10nM连续稀释至0.00001nM，每次稀释1/10×，从而与抗原结合。抗人κ-HRP或抗人IgG Fc-HRP用作抗体检测的二抗。使用显色试剂ABTS进行显色，并测量405nm处的吸光度。
如表6和表7所示，结果显示对大多数抗原的反应性良好，并且存在许多克隆对人抗原和小鼠抗原两者显示出相似的反应性。
[表6]
EC50，nM 阴性对照 人CNTN4 小鼠CNTN4
S1 N/A 4.44 1.53
S2 N/A 0.12 0.10
S4 N/A 2.60 1.15
S6 N/A 0.37 1.85
S7 N/A 1.51 1.20
S8 N/A 1.10 1.53
S9 N/A 0.08 0.09
S10 N/A 1.82 7.00
S11 N/A 1.44 2.39
S15 N/A 1.35 2.12
S24 N/A 1.12 2.07
S30 N/A 1.15 1.12
S46 N/A 1.22 1.20
S99 N/A 8.34 3.64
S129 N/A 0.55 0.37
S130 N/A 0.81 0.46
S131 N/A 0.74 0.56
S132 N/A 1.16 0.72
S134 N/A 0.75 0.75
S135 N/A 1.06 0.71
S137 N/A 0.41 0.52
S138 N/A 2.37 1.06
[表7]
/>
(3)根据FACS确认scFv与细胞表面上表达的抗原的结合能力
在293FT细胞中，经由瞬时转染在细胞膜上表达人CNTN4抗原，并且抗CNTN4 scFv-hCk或抗CNTN4 IgG以40μg/mL的浓度与其结合。通过使用FACS用抗hCk-PE或抗hFc-PE检测与抗原结合的抗CNTN4，确认了点偏移。
如表8和表9所示，结果显示对人CNTN4显示出结合能力的hCk型scFv克隆中的2、4、99、129、130、131、132、134、135、137和138属于具有大量点偏移的上组(>15.0％)，且所有IgG型抗CNTN4均表现出75％或更强的优异结合能力。
[表8]
/>
[表9]
/>
实施例2：抗CNTN4鸡-人嵌合IgG4抗体的制备及其结合能力的确认
2.1抗CNTN4鸡-人嵌合IgG4-S228P，A-01的制备
为了生产人嵌合IgG形式的抗体，选择通过实施例1确认了其结合能力的S129，并将其轻链区和重链区克隆至双顺反子表达载体中。将DNA瞬时转染至Expi293F细胞中并培养至50％的活力以进行IgG表达，并使培养介质与κ选择树脂(κ区捕获)结合以洗脱并首次纯化IgG。此后，通过与Mabselect结合(Fc区捕获)并洗脱并二次纯化IgG以清除轻链杂质，制备了抗CNTN4 129嵌合IgG4-S228P(下文称为“A-01”)，其在SEC-HPLC上纯度为72.4％。
2.2根据ELISA确认A-01与抗原蛋白的结合能力
对实施例2.1中制备的A-01进行ELISA测试。用200ng抗原(人CNTN4-10×His或小鼠CNTN4-10×His)包被ELISA板。对于抗体结合，将A-01从最大1μM连续稀释至0.0001nM，从而与抗原结合。抗人Fc-HRP用作抗体检测的二抗。使用显色试剂ABTS进行显色，并测量405nm处的吸光度。所得结合能力示于表10中。
[表10]
EC50，nM 人CNTN4 小鼠CNTN4
A-01 0.011 0.011
2.3根据表面等离子体共振(SPR)确认A-01与抗原蛋白的结合能力
对实施例2.1中制备的A-01进行SPR测试。
具体地，为了使用胺偶联来结合抗人IgG Fc(捕获抗体)，安装CM5芯片，允许运行缓冲液流动，激活芯片，然后使捕获抗体附着于其上。使用乙醇胺灭活未附着捕获抗体的糊精，然后使用3M氯化镁进行再生以清除捕获抗体以外的分析物。允许以0.05μg/mL的浓度制备的A-01以10μL/min的速率流动30秒以结合。此后，允许通过顺序稀释制备的人CNTN4(400nM至0.78nM)作为抗原以30μL/min的速率流动3分钟以结合，并进行解离5分钟。然后，为了清除附着于捕获抗体的所有分析物，允许再生溶液(3M氯化镁)以20μL/min的速率流动30秒，并进行再生。对于每种浓度的抗原，按顺序重复A-01的结合、抗原的结合、解离和再生。结果示于表11中。
[表11]
抗原 解离常数Kd
人CNTN-4蛋白 3.365×10-8M
由此，确认了本发明的抗体以高亲和力与人CNTN4蛋白结合。
实施例3：抗CNTN4人源化抗体的制备及结合能力的确认
3.1抗CNTN4人源化抗体的制备
使用A-01制备人源化抗体。
具体地，在A-01的可变区原始序列(VLA和VHA)中，将框架区完全变为人框架区的序列(VL1和VH1)与其中一些A-01原始序列留在VL1和VH1中的序列(VL2和VH2)组合(表12和图3)。当将A-01与完全人源化抗体(VL1和VH1)比较时，它显示出约78％的人源化。当将完全人源化抗体(VL1和VH1)与具有一些回复突变序列的VL2和VH2组合的抗体比较时，至少96％的序列是相同的。当将DNA瞬时转染至Expi293F细胞中并培养以制备总共八种人源化抗体(LAH1、LAH2、L1HA、L1H1、L1H2、L2HA、L2H1和L2H2)时，除了IgG4形式的A-01(LAHA)以外，具有其中重链可变区域完全人源化的VH1的抗体(LAH1、L1H1和L2H1)不表达。然后纯化具有VH2的抗体LAH2、L1H2和L2H2以分别获得4mg、11mg和12mg。
[表12]
/>
3.2根据ELISA确认人源化抗体与抗原蛋白的结合能力
将实施例3.1中制备的LAH2、L1H2和L2H2抗体与A-01一起进行ELISA测试。用200ng抗原(人CNTN4-10×His或小鼠CNTN4-10×His)包被ELISA板。对于抗体结合，将抗体从最大1μM连续稀释至0.0001nM，从而与抗原结合。抗人Fc-HRP用作抗体检测的二抗。使用显色试剂ABTS进行显色，并测量405nm处的吸光度。
所得结合能力示于表13中。确认了与A-01来源相比，人源化程度最高的L1H2与CNTN4蛋白的结合能力差异在3倍以内。
[表13]
EC50，nM 人CNTN4 小鼠CNTN4
A-01 0.011 0.011
LAH2 0.017 0.017
L1H2 0.028 0.029
L2H2 0.018 0.019
3.3根据表面等离子体共振(SPR)确认人源化抗体与抗原蛋白的结合能力
对实施例3.1中制备的抗体中人源化程度最高(约98％)的L1H2进行SPR测试。更具体地，为了使用胺偶联来结合抗人IgG Fc(捕获抗体)，安装CM5芯片，允许运行缓冲液流动，激活芯片，然后使捕获抗体附着于其上。使用乙醇胺灭活未附着捕获抗体的糊精，然后使用3M氯化镁进行再生以清除捕获抗体以外的分析物。允许以0.05μg/mL的浓度制备的L1H2以10μL/min的速率流动30秒以结合。此后，允许通过顺序稀释制备的人CNTN4(400nM至0.78nM)作为抗原以30μL/min的速率流动3分钟以结合，并进行解离5分钟。然后，为了清除附着于捕获抗体的所有分析物，允许再生溶液(3M氯化镁)以20μL/min的速率流动30秒，并进行再生。对于每种浓度的抗原，按顺序重复L1H2的结合、抗原的结合、解离和再生。
结果示于表14中。
[表14]
抗原 解离常数Kd
人CNTN-4蛋白 9.319×10-8M
由此可见，即使当A-01抗体98％人源化时，它对CNTN4蛋白也具有足够高的结合能力。
实施例4：使用人T细胞测试A-01和L1H2抗体的CNTN4中和能力
制备浓度为4mg/mL的最终50mL的a-CD3抗体和浓度为150nM的CNTN4重组蛋白，并将其置于96孔板中并在37℃孵育约16小时。
每个供体50mL血液(包含在用肝素钠处理的采血管中)和PBS以1:1的比例混合，15mL的Ficoll事先容纳于50mL管中，并将30mL稀释的血液小心地置于其上并堆叠，使得Ficoll层和血层分离。在20℃以1800rpm进行离心(加速和减速速度设置为0)25分钟，并除去上清液，使得白色血沉棕黄层不上升。将血沉棕黄层转移至新的50mL管中，并用PBS将管填充至50mL，并在4℃以1800rpm离心5分钟。加入10mL的1×RBC裂解缓冲液，充分溶解，并置于室温5分钟。用PBS填充至50mL后，在4℃以1800rpm进行离心5分钟，除去上清液，并用PBS溶解沉淀，然后通过显微镜观察细胞(PBMC)并计算细胞数。
每2×108个在以上实验中获得的PBMC细胞中加入1000μL的MACS缓冲液，然后重悬。将溶液分成两半，其中一半放入CD4管中，另一半放入CD8管中。将每组每1×108个PBMC的50μL抗体混合物(cocktail)重悬并在室温储存10分钟。将每1×108个PBMC的100μL抗生物素微珠重悬并在室温储存10分钟。同时，对MACS磁场进行消毒并置于洁净的工作台中，并安装两个LS柱(用于CD4和CD8)。使3mL的MACS缓冲液流入每个柱后，弃去通过每个柱的缓冲液。反应完成后，将每组的细胞分别加载至安装在磁场上的两个LS柱上。当没有更多的细胞溶液落下时，允许3mL的MACS缓冲液流入每个柱中。此后，通过显微镜观察从每个柱落下的溶液中的细胞并计算细胞数。
将18μL的DMSO加入50μg的CFSE中并用移液器吸取以产生5mM的浓度并使用细胞。将1mL的MTM介质加入以上实验中获得的CD4细胞和CD8细胞中，加入CFSE至终浓度达到5μM，悬浮，然后在37℃的水浴中储存10分钟。在4℃以1800rpm离心溶液5分钟，并除去上清液。然后，将1mL的MTM介质加入其中并重悬，然后在4℃以1800rpm再次离心5分钟，并除去上清液。最后，用MTM介质重悬细胞以达到每孔2×105个细胞/200μL，以待用于实验。
然后，用200μL的PBS洗涤孵育板两次，将1.5mM和3mM的A-01和L1H2分别制成最终50mL加入CNTN4处理孔中，并放入96孔板中。在37℃进行孵育约4小时。
此后，用200mL的PBS洗涤孵育板两次，每孔加入200mL的T细胞，然后在37℃的5％CO2培养箱中储存3天。3天后，获得T细胞并转移至FACS管中，并使用FACS仪器观察用CFSE染色的细胞分化程度。
结果示于图4中。
如图4所示，确认了CNTN4重组蛋白抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖。观察到已被CNTN4抑制的T细胞的增殖随着A-01和L1H2处理的浓度增大而增加。这显示本发明的A-01和L1H2表现出显著优异的中和CNTN4的能力。
由此，确认了本发明的CNTN4抗体有效中和CNTN4并抑制其T细胞抑制性功能。
序列表
<110> 韩国亿诺生物有限公司
<120> 抗CNTN4抗体及其用途
<130> PCC203024GNC
<150> KR 10-2021-0044840
<151> 2021-04-06
<160> 159
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S1 VL
<400> 1
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys
20 25 30
Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Asp Asn Thr Asn Arg
35 40 45
Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Thr
50 55 60
Asn Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Arg Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr
65 70 75 80
Phe Cys Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Ile Asp Ala Phe Gly Ala Gly Thr
85 90 95
Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 2
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S1,S2,S3,S6,S129,S130,S131,S134,S135,S137,S138,A-01 VH
<400> 2
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Glu Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Asn Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Ala Asp Thr Trp Ser Tyr Gly Ala Ala Thr Ile Asp Ala
100 105 110
Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2,S130,S132 VL
<400> 3
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Gly Trp Tyr
20 25 30
Gln Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Asn Asn
35 40 45
Asn Asn Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Thr Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Arg Ala Glu Asp Glu
65 70 75 80
Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gly Tyr Asp Gly Ser Thr Asp Val Phe Gly
85 90 95
Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 4
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S3 VL
<400> 4
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys
20 25 30
Ala Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr Asp Asn Thr Asn Arg
35 40 45
Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr
50 55 60
Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Arg Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr
65 70 75 80
Phe Cys Gly Gly Tyr Asp Gly Ser Thr Asp Ala Phe Gly Ala Gly Thr
85 90 95
Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 5
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S4 VL
<400> 5
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Ser Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Gly Trp Tyr Gln
20 25 30
Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr Gln Asn Thr
35 40 45
Asn Arg Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
50 55 60
Ser Thr Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Arg Ala Glu Asp Glu Ala
65 70 75 80
Val Tyr Tyr Cys Gly Gly Tyr Asp Gly Ser Thr Asp Val Phe Gly Ala
85 90 95
Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 6
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S4 VH
<400> 6
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Glu Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Asn Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Ser Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Ala Asp Thr Trp Ser Tyr Gly Ala Ala Thr Ile Asp Ala
100 105 110
Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S6 VL
<400> 7
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Gly Asn Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln
20 25 30
Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Asn Gly Asn Asn
35 40 45
Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Asn Thr Leu Ala Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Gly Gly Tyr Asp Gly Thr Ile Asp Ala Phe Gly Ala Gly
85 90 95
Thr Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 8
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S7,S8,S9,S10,S11,S15,S24,S30 VL
<400> 8
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Glu Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln
20 25 30
Lys Ala Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Asp Asn Thr Asn
35 40 45
Arg Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Asp Ser
50 55 60
Thr Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Val
65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Gly Ser Tyr Asp Ser Ile Glu Val Ile Phe Gly Ala Gly
85 90 95
Thr Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 9
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S7,S8,S9,S10,S11,S15,S30,S46,A13WB2,A13WB4,A13WB7,A13WB24,A13WB25
,A13SF7,A13SF8,A13SF20,A13SF21,A35WB1,A35WB27,A35SF5,A35SF8,A35SF
13,A35SF14,A35SF37,A35SF38,A35SF39,A35SF75,A35SF90 VH
<400> 9
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu His Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Thr Ser Ser Gly Ser Ser Ala Gly Tyr Gly Pro Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gly Tyr Ile Tyr Ser Gly Ala Asp Ser Asp Ser Ile Asp
100 105 110
Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S24 VH
<400> 10
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu His Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Thr Ser Ser Gly Ser Ser Ala Gly Tyr Gly Pro Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gly Tyr Ile Tyr Ser Gly Gly Asp Ser Asp Ser Ile Asp
100 105 110
Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S46 VL
<400> 11
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Glu Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln
20 25 30
Lys Ala Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Asp Asn Thr Asn
35 40 45
Arg Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Asp Ser
50 55 60
Thr Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Asp Asp Lys Ala Val
65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Gly Ser Tyr Asp Ser Ile Glu Val Ile Phe Gly Ala Gly
85 90 95
Thr Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 12
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S83 VL
<400> 12
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Gly Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr
20 25 30
Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Pro Ala Gly Ala Pro Asp Thr Val Ile
35 40 45
Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Lys Ser Gly Ser Thr Gly Thr Leu Thr Ile Thr Glu Asp His Ala
65 70 75 80
Glu Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn
85 90 95
Pro Gly Ile Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 13
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S83 VH
<400> 13
Ala Val Thr Leu Asp Lys Ser Gly Gly Gly Leu His Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ile Met Gln Trp Val Leu Gln Ala Pro Gly Lys Val Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Arg Asn Gly Thr Thr Pro Lys Tyr Gly Ala Ala Val Lys
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Gln Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Asp Asp Thr Asp Ala Tyr Tyr Cys Asp
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Arg Gly Asp Asp Gly Asp Cys Ile Cys Gly Gly Cys Ala Ala Ser Ile
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Asp Ile Trp Cys Tyr Ala Thr Glu Val Ile Val Ser Ser
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35 40 45
Asn Lys Arg Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Thr Ser
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35 40 45
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<213> 人工序列
<220>
<223> A13SF74 VL
<400> 43
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Asn Ser Ser Gly Cys Ser Trp Tyr Gly Trp
20 25 30
Phe Gln Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Leu Val Thr Val Ile Tyr Asp
35 40 45
Asn Thr Asn Arg Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg
50 55 60
Ser Gly Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp
65 70 75 80
Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Gly Ile Ala Asp Ser Ser Gly Ala Gly Ile
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 44
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13SF74 VH
<400> 44
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Lys Gly Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Gly Ala Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Thr Thr Asp Ser Asn Cys Cys Ser Ser Asp Ser Ile Asp Ala
100 105 110
Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser
115 120
<210> 45
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35WB1 VL
<400> 45
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln
20 25 30
Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Asn Asn Asp Gln
35 40 45
Arg Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Val Glu Asp Glu Ala Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Gly Gly Trp Asp Ser Asn Ser Gly Ala Ile Phe Gly Ala
85 90 95
Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 46
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35WB27 VL
<400> 46
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Tyr Ser Gly Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln
20 25 30
Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Tyr Asn Asp Lys
35 40 45
Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Arg Ala Glu Asp Glu Ala Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Gly Ser Ala Asp Ser Ser Thr Gly Tyr Val Ala Ile Phe
85 90 95
Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 47
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF3 VL
<400> 47
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Gly Thr Val
1 5 10 15
Glu Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln
20 25 30
Lys Ala Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Asp Asn Thr Asn
35 40 45
Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Thr Ile Phe Gly Ala Gly Thr
85 90 95
Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 48
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF5 VL
<400> 48
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Glu Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Gly Ser Asn Tyr Gly Trp Tyr Gln
20 25 30
Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr Tyr Asn Asp
35 40 45
Asn Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
50 55 60
Ser Thr Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Val Glu Asp Glu Ala
65 70 75 80
Val Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Glu Ser Ser Ser Asn Pro Asp Ile Phe
85 90 95
Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 49
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF8 VL
<400> 49
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Gly Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Gly Trp Phe Gln Gln
20 25 30
Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr Asn Asn Asn Asn
35 40 45
Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Gly Gly Tyr Asp Asp Ser Thr Tyr Val Gly Met Phe Gly
85 90 95
Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 50
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF13 VL
<400> 50
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln
20 25 30
Lys Ser Pro Gly Ser Ala Leu Val Thr Val Ile Tyr Asn Asn Asp Asn
35 40 45
Arg Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Leu Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Arg Ala Glu Asp Glu Ala Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Gly Ser Ala Asp Asn Asn Gly Tyr Ile Ala Ile Phe Gly
85 90 95
Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 51
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF14 VL
<400> 51
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Ile
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln
20 25 30
Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Asn Gly Asn Asn
35 40 45
Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Gly Gly Tyr Asp Ser Gly Thr Tyr Ser Gly Ile Phe Gly
85 90 95
Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 52
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF37 VL
<400> 52
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Gly Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Asn Asn Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln
20 25 30
Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Tyr Asn Asn Lys
35 40 45
Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Ser Asn Ser Asp Val Tyr Gly
85 90 95
Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 53
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF38 VL
<400> 53
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Gly Thr Val
1 5 10 15
Lys Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ser Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln
20 25 30
Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr Asn Asn Asn Asn
35 40 45
Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Arg Ala Glu Asp Glu Ala Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Thr Tyr Val Ala Ile Phe Gly
85 90 95
Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 54
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF39 VL
<400> 54
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Gly Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln
20 25 30
Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Asn Asn Asn Asn
35 40 45
Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Arg Ala Glu Asp Glu Ala Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Gly Gly Tyr Asp Thr Asp Ser Pro Ile Phe Gly Ala Gly
85 90 95
Thr Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 55
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF75 VL
<400> 55
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Val Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln
20 25 30
Lys Ala Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr Asn Asn Thr Asn
35 40 45
Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser
50 55 60
Thr Asn Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Gly Gly Tyr Asp Ser Asn Thr Asp Tyr Val Gly Phe Gly
85 90 95
Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 56
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF90 VL
<400> 56
Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Gly Thr Val
1 5 10 15
Glu Ile Thr Cys Ser Gly Ser Asn Asn Asn Asn Tyr Gly Trp Tyr Gln
20 25 30
Gln Lys Thr Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr Asn Asn Asn
35 40 45
Gln Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
50 55 60
Ser Thr Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Arg Ala Glu Asp Glu Ala
65 70 75 80
Val Tyr Tyr Cys Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Ile Tyr Phe Asp Ile Phe
85 90 95
Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 57
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S1,S3,S137 VL CDR1
<400> 57
Ser Gly Gly Ser Ser
1 5
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S1,S2,S3,S4,S6,S129,S130,S131,S132,S134,S135,S137,S138 VH CDR1
<400> 58
Ser Phe Asn Met Phe
1 5
<210> 59
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2,S130,S132 VL CDR1
<400> 59
Ser Gly Gly Gly Ser Ser Thr Tyr
1 5
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S4, S131 VL CDR1
<400> 60
Ser Gly Gly Gly Ser Ser Tyr
1 5
<210> 61
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S6 VL CDR1
<400> 61
Ser Gly Gly Ser Gly Asn
1 5
<210> 62
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S7,S8,S9,S10,S11,S15,S24,S30,S46,A13SF20,A35 WB1,A35SF39 VL CDR1
<400> 62
Ser Gly Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 63
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S7~11,S15,S24,S30,S46,A13WB2,A13WB4,A13WB7,A13WB24,A13WB25,A13WB7
3,A13SF1,A13SF2,A13SF7,A13SF8,A13SF16,A13SF19,A13S
F20,A13SF21,A35WB1,A35WB27,A35SF3,A35SF5,A35SF8,A35SF13,A35SF14,A
35SF37,A35SF38,A35SF39,A35SF75,A35SF90 VH CDR1
<400> 63
Ser Tyr Gly Met Ala
1 5
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S83 VL CDR1
<400> 64
Ser Gly Gly Gly Gly Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr
1 5 10
<210> 65
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S83 VH CDR1
<400> 65
Arg Tyr Ile Met Gln
1 5
<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S96 VL CDR1
<400> 66
Ser Gly Ser Ser Gly Ser Tyr Gly
1 5
<210> 67
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S96 VH CDR1
<400> 67
Thr Tyr Ser Met Gln
1 5
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S99 VL CDR1
<400> 68
Ser Gly Gly Ala Ser Tyr Ala Gly Asn Tyr Tyr
1 5 10
<210> 69
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S99 VH CDR1
<400> 69
Gly Tyr Gly Met His
1 5
<210> 70
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S129,A13SF21,A35SF3,A35SF38 VL CDR1
<400> 70
Ser Gly Ser Ser Gly Ser
1 5
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S134 VL CDR1
<400> 71
Ser Gly Gly Thr Tyr Ser Tyr Gly Asn Tyr Tyr
1 5 10
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S135 VL CDR1
<400> 72
Gly Gly Gly Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S138 VL CDR1
<400> 73
Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Gly Ser Tyr Tyr
1 5 10
<210> 74
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13WB2,A13WB73,A35WB27 VL CDR1
<400> 74
Ser Gly Gly Tyr Ser Gly
1 5
<210> 75
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13WB4 VL CDR1
<400> 75
Ser Gly Gly Ser Ser Asp Tyr Gly
1 5
<210> 76
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13WB7 VL CDR1
<400> 76
Ser Gly Gly Gly Ser Ser Ser Tyr Tyr Asn
1 5 10
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13WB24 VL CDR1
<400> 77
Ser Gly Gly Gly Asn Asn Asn
1 5
<210> 78
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13WB25,A13SF1,A13SF2,A35SF8,A35SF13,A35SF14,A35SF75 VL CDR1
<400> 78
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 79
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13SF7 VL CDR1
<400> 79
Gly Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 80
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13SF8 VL CDR1
<400> 80
Ser Gly Ser Gly Asn
1 5
<210> 81
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13SF16 VL CDR1
<400> 81
Ser Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13SF19 VL CDR1
<400> 82
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn
1 5
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13SF74 VL CDR1
<400> 83
Ser Gly Asn Ser Ser Gly Cys Ser Trp
1 5
<210> 84
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13SF74 VH CDR1
<400> 84
Ser Tyr Ala Met Gln
1 5
<210> 85
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF5 VL CDR1
<400> 85
Ser Gly Ser Ser Gly Ser Asn
1 5
<210> 86
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF37 VL CDR1
<400> 86
Ser Gly Gly Ser Asn Asn
1 5
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF90 VL CDR1
<400> 87
Ser Gly Ser Asn Asn Asn Asn
1 5
<210> 88
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S1,S3,S7,S8,S9,S10,S11,S15,S24,S30,S46,S129,S137,A13SF7,A13SF74,A
35SF3 VL CDR2
<400> 88
Asp Asn Thr Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 89
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S1,S2,S3,S6,S129,S130,S131,S132,S134,S135,S137,S138 VH CDR2
<400> 89
Glu Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 90
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2,S130,S132,S134,A13SF1,A13SF2,A13SF21,A35SF8,A35SF38,A35SF39VL
CDR2
<400> 90
Asn Asn Asn Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S4,S131 VL CDR2
<400> 91
Gln Asn Thr Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 92
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S4 VH CDR2
<400> 92
Glu Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Ser Ala Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 93
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S6,A35SF14 VL CDR2
<400> 93
Asn Gly Asn Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 94
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S7~11,S15,S24,S30,S46,A13WB2,A13WB4,A13WB7,A13WB24,A13WB25,A13WB7
3,A13SF1,A13SF2,A13SF7,A13SF8,A13SF16,A13SF19,A13SF20,A13SF21,A35
WB1,A35WB27,A35SF3,A35SF5,A35SF8,A35SF13,A35SF14,A35SF37,A35SF38,
A35SF39,A35SF75,A35SF90 VH CDR2
<400> 94
Gly Ile Thr Ser Ser Gly Ser Ser Ala Gly Tyr Gly Pro Ala Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S83 VL CDR2
<400> 95
Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 96
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S83 VH CDR2
<400> 96
Ser Ile Arg Asn Gly Thr Thr Pro Lys Tyr Gly Ala Ala Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 97
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S96 VL CDR2
<400> 97
Glu Ser Asn Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 98
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S96 VH CDR2
<400> 98
Gly Ile Ser Asn Ser Gly Ser Ser Thr Val Tyr Gly Pro Ala Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S99,A35SF90 VL CDR2
<400> 99
Asn Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 100
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S99 VH CDR2
<400> 100
Glu Ile Ser Asn Thr Gly Ser Trp Thr Gly Tyr Gly Ala Ala Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 101
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S135 VL CDR2
<400> 101
Tyr Asn Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 102
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S138 VL CDR2
<400> 102
Asp Ser Thr Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13WB2,A13WB7,A13WB25,A13WB73,A13SF8,A35WB27 VL CDR2
<400> 103
Tyr Asn Asp Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 104
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13WB4 VL CDR2
<400> 104
Tyr Asn Asn Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 105
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13WB24 VL CDR2
<400> 105
Tyr Asn Asp Asn Arg Pro
1 5
<210> 106
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13SF16,A35SF13 VL CDR2
<400> 106
Asn Asn Asp Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 107
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13SF19 VL CDR2
<400> 107
Tyr Asn Asp Glu Arg Pro Ser
1 5
<210> 108
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13SF20 VL CDR2
<400> 108
Asn Ser Asp Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 109
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13SF74 VH CDR2
<400> 109
Gly Ile Ser Lys Gly Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Gly Ala Ala Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35WB1 VL CDR2
<400> 110
Asn Asn Asp Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 111
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF5 VL CDR2
<400> 111
Tyr Asn Asp Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 112
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF37 VL CDR2
<400> 112
Tyr Asn Asn Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF75 VL CDR2
<400> 113
Asn Asn Thr Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S1 VL CDR3
<400> 114
Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Ile Asp Ala
1 5
<210> 115
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S1,S2,S3,S4,S6,S129,S130,S131,S132,S134,S135,S137,S138 VH CDR3
<400> 115
Ser Ala Asp Thr Trp Ser Tyr Gly Ala Ala Thr Ile Asp Ala
1 5 10
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2,S4,S129,S130,S131,S132,S134,S135,S138 VL CDR3
<400> 116
Gly Gly Tyr Asp Gly Ser Thr Asp Val
1 5
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S3,S137 VL CDR3
<400> 117
Gly Gly Tyr Asp Gly Ser Thr Asp Ala
1 5
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S6 VL CDR3
<400> 118
Gly Gly Tyr Asp Gly Thr Ile Asp Ala
1 5
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S7,S8,S9,S10,S11,S15,S24,S30,S46 VL CDR3
<400> 119
Gly Ser Tyr Asp Ser Ile Glu Val Ile
1 5
<210> 120
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S7~11,S15,S30,S46,A13WB2,A13WB4,A13WB7,A13WB24,A13WB25,A13WB73,A1
3SF1,A13SF2,A13SF7,A13SF8,A13SF16,A13SF19,A13SF20,A13SF21,A35WB1,
A35WB27,A35SF3,A35SF5,A35SF8,A35SF13,A35SF14,A35SF37,A35SF38,A35S
F39,A35SF75,A35SF90 VH CDR3
<400> 120
Asp Gly Tyr Ile Tyr Ser Gly Ala Asp Ser Asp Ser Ile Asp Ala
1 5 10 15
<210> 121
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S24 VH CDR3
<400> 121
Asp Gly Tyr Ile Tyr Ser Gly Gly Asp Ser Asp Ser Ile Asp Ala
1 5 10 15
<210> 122
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S83 VL CDR3
<400> 122
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Pro Gly Ile
1 5 10
<210> 123
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S83 VH CDR3
<400> 123
Gly Asp Asp Gly Asp Cys Ile Cys Gly Gly Cys Ala Ala Ser Ile Asp
1 5 10 15
Ile
<210> 124
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S96 VL CDR3
<400> 124
Gly Ser Ala Asp Ser Ser Thr Thr Ile Ala
1 5 10
<210> 125
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S96 VH CDR3
<400> 125
Ser Thr Tyr Gly Gly Ser Trp Tyr Ala Ala Tyr Ser Ile Asp Glu
1 5 10 15
<210> 126
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S99 VL CDR3
<400> 126
Gly Ser Asp Asp Ser Ser Ala Gly Tyr Thr Gly Ile
1 5 10
<210> 127
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S99 VH CDR3
<400> 127
Val Gly Gly Arg Gly Trp Cys Gly Arg Ser Gly Cys Ala Asp Asp Ile
1 5 10 15
Asp Ala
<210> 128
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13WB2 VL CDR3
<400> 128
Gly Ser Arg Asp Ser Ser Thr Tyr Val Asp Ile
1 5 10
<210> 129
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13WB4 VL CDR3
<400> 129
Gly Ser Arg Asp Ser Ser Ser Gly Tyr Val Asp Ile
1 5 10
<210> 130
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13WB7 VL CDR3
<400> 130
Gly Ser Trp Asp Ser Ser Thr Tyr Ser Asp Ile
1 5 10
<210> 131
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13WB24 VL CDR3
<400> 131
Gly Gly Tyr Asp Ile Ser Tyr Val Asp Ile
1 5 10
<210> 132
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13WB25 VL CDR3
<400> 132
Gly Gly Tyr Asp Gly Ser Thr Tyr Ala Gly Ile
1 5 10
<210> 133
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13WB73 VL CDR3
<400> 133
Gly Ser Trp Asp Thr Ser Thr Asn Thr Pro Ile
1 5 10
<210> 134
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13SF1 VL CDR3
<400> 134
Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Thr Tyr Val Gly Thr
1 5 10
<210> 135
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13SF2 VL CDR3
<400> 135
Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Ala Gly Tyr Ala Ala Leu
1 5 10
<210> 136
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13SF7 VL CDR3
<400> 136
Gly Ser Ala Asp Thr Asn Ala Ala Tyr Ala Ala Ile
1 5 10
<210> 137
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13SF8 VL CDR3
<400> 137
Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Ser Phe Ala Ser Ile
1 5 10
<210> 138
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13SF16 VL CDR3
<400> 138
Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Thr Tyr Val Asp Thr
1 5 10
<210> 139
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13SF19 VL CDR3
<400> 139
Gly Gly Tyr Glu Gly Ser Thr Tyr Val Gly Ile
1 5 10
<210> 140
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13SF20 VL CDR3
<400> 140
Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Ala Ile
1 5
<210> 141
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13SF21 VL CDR3
<400> 141
Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Thr Tyr Val Gly Ile
1 5 10
<210> 142
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13SF74 VL CDR3
<400> 142
Gly Ile Ala Asp Ser Ser Gly Ala Gly Ile
1 5 10
<210> 143
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A13SF74 VH CDR3
<400> 143
Thr Thr Asp Ser Asn Cys Cys Ser Ser Asp Ser Ile Asp Ala
1 5 10
<210> 144
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35WB1 VL CDR3
<400> 144
Gly Gly Trp Asp Ser Asn Ser Gly Ala Ile
1 5 10
<210> 145
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35WB27 VL CDR3
<400> 145
Gly Ser Ala Asp Ser Ser Thr Gly Tyr Val Ala Ile
1 5 10
<210> 146
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF3 VL CDR3
<400> 146
Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Thr Ile
1 5
<210> 147
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF5 VL CDR3
<400> 147
Gly Ala Trp Glu Ser Ser Ser Asn Pro Asp Ile
1 5 10
<210> 148
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF8 VL CDR3
<400> 148
Gly Gly Tyr Asp Asp Ser Thr Tyr Val Gly Met
1 5 10
<210> 149
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF13 VL CDR3
<400> 149
Gly Ser Ala Asp Asn Asn Gly Tyr Ile Ala Ile
1 5 10
<210> 150
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF14 VL CDR3
<400> 150
Gly Gly Tyr Asp Ser Gly Thr Tyr Ser Gly Ile
1 5 10
<210> 151
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF37 VL CDR3
<400> 151
Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Ser Asn Ser Asp Val
1 5 10
<210> 152
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF38 VL CDR3
<400> 152
Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Thr Tyr Val Ala Ile
1 5 10
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF39 VL CDR3
<400> 153
Gly Gly Tyr Asp Thr Asp Ser Pro Ile
1 5
<210> 154
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF75 VL CDR3
<400> 154
Gly Gly Tyr Asp Ser Asn Thr Asp Tyr Val Gly
1 5 10
<210> 155
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A35SF90 VL CDR3
<400> 155
Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Ile Tyr Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 156
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体VL1
<400> 156
Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val
1 5 10 15
Arg Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln
20 25 30
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Asp Asn Thr Asn Arg
35 40 45
Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr
50 55 60
Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
65 70 75 80
Tyr Cys Gly Gly Tyr Asp Gly Ser Thr Asp Val Phe Gly Gly Gly Thr
85 90 95
Lys Leu Thr Val Leu
100
<210> 157
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体VH1
<400> 157
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Asn Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Ala Asp Thr Trp Ser Tyr Gly Ala Ala Thr Ile Asp Ala
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 158
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体VL2
<400> 158
Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val
1 5 10 15
Arg Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln
20 25 30
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr Asp Asn Thr Asn Arg
35 40 45
Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ser Thr
50 55 60
Gly Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
65 70 75 80
Tyr Cys Gly Gly Tyr Asp Gly Ser Thr Asp Val Phe Gly Gly Gly Thr
85 90 95
Lys Leu Thr Val Leu
100
<210> 159
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体VH2
<400> 159
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Asn Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Pro Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Ala Asp Thr Trp Ser Tyr Gly Ala Ala Thr Ile Asp Ala
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

Claims (28)

1.一种抗CNTN4抗体或其抗原结合片段，其包含：
轻链CDR1，其包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列；
轻链CDR2，其包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列；
轻链CDR3，其包含SEQ ID NO：116的氨基酸序列；
重链CDR1，其包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列；
重链CDR2，其包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列；和
重链CDR3，其包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列。
2.一种抗CNTN4抗体或其抗原结合片段，其包含：
轻链可变区，其包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列；和
重链可变区，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
3.一种抗CNTN4抗体或其抗原结合片段，其包含：
轻链可变区，其包含SEQ ID NO：156的氨基酸序列；和
重链可变区，其包含SEQ ID NO：159的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段，其与人或小鼠CNTN4蛋白特异性结合。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段，其与人CNTN4蛋白结合的解离常数(Kd)为1×10-7M或更小。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段，其增加T细胞活性。
7.根据权利要求6所述的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段，其中所述T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、单链抗体scFv、(Fab')2片段、单结构域抗体、双体抗体(dAb)和线性抗体。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是多特异性抗体。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体与药物缀合。
12.一种核酸分子，其编码权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
13.一种重组表达载体，其包含权利要求12所述的核酸分子。
14.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述组合物包含权利要求1至3中任一项所述的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述癌症是表达CNTN4的癌症。
16.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述组合物包含权利要求1至3中任一项所述的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段；以及另外的抗癌剂。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述另外的抗癌剂是免疫检查点抑制剂或化学治疗剂。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂选自抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体中的一种或多种。
19.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述抗CNTN4抗体或其抗原结合片段以及另外的抗癌剂作为单一制剂同时施用，或作为分开的制剂同时施用或顺序施用。
20.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至3中任一项所述的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段，并与另外的抗癌疗法组合使用。
21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述另外的抗癌疗法是选自免疫检查点抑制剂、化学治疗剂和放射疗法中的一种或多种。
22.权利要求1至3中任一项所述的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段用于预防或治疗癌症的用途。
23.权利要求1至3中任一项所述的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段用于制备药物的用途，所述药物用于预防或治疗癌症。
24.一种预防或治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的权利要求1至3中任一项所述的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段。
25.一种预防或治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的权利要求1至3中任一项所述的抗CNTN4抗体或其抗原结合片段，以及有效量的另外的抗癌剂。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述另外的抗癌剂是免疫检查点抑制剂或化学治疗剂。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体中的一种或多种。
28.根据权利要求25所述的方法，有效量的所述抗CNTN4抗体或其抗原结合片段以及有效量的所述另外的抗癌剂作为单一制剂同时施用于受试者，或作为分开的制剂同时或顺序施用于受试者。
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