CN111727199A - 针对中东呼吸综合征-冠状病毒具有中和活性的结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有针对中东呼吸综合征‑冠状病毒(MERS‑CoV)的中和活性的结合分子。更特别地，本发明涉及具有结合至MERS‑CoV的S蛋白的强大能力和针对MERS‑CoV的中和活性的结合分子，因此在MERS‑CoV感染的预防、治疗或诊断中非常有用。

Description

针对中东呼吸综合征-冠状病毒具有中和活性的结合分子
技术领域
本发明涉及针对中东呼吸综合征-冠状病毒(MERS-CoV)具有中和活性的结合分子。更特别地，本发明涉及具有结合至MERS-CoV的表面上的刺突蛋白(S蛋白)的强大能力和针对MERS-CoV的中和活性的结合分子，并且因此在MERS-CoV感染的预防、治疗或诊断中非常有用。
背景技术
中东呼吸综合征-冠状病毒(MERS-CoV)是由属于乙型冠状病毒属(Betacoronavirus)的冠状病毒引起的传染病，并且第一致病病毒在2012年中东的无法解释的肺炎患者中发现。MERS-CoV被认为是起源于蝙蝠，并且迄今已知是通过骆驼引入人类的。尽管其传播途径还未完全地表征，但似乎病毒已在中东从骆驼反复地传播给人类，并且发生了有限的且非持续的人际传播。
迄今为止，MERS-CoV已经在27个国家中发生，从2012年9月至2017年9月29日有2,078名患者。在这些患者中，有730人死亡，指示35.1％的致死率(WHO)。还没有特定的治疗剂或预防剂，但抗病毒药物的作用还没有明确地证实。考虑到MERS-CoV的高死亡率和高发病率，在疾病的早期阶段推荐使用抗病毒药物的积极治疗，如与利巴韦林(ribavirin)、干扰素α-2α和洛匹那韦(lopinavir)/利托那韦(ritonavir)联合疗法，但由于其副作用是有问题的。
同时，作为用于MERS-CoV结合抗体的常规技术，韩国专利号10-1593641公开了识别MERS-CoV核壳体的抗体、包括其的诊断组合物、使用其检测MERS-CoV的试剂盒和方法。该文件涉及使用特异性结合至MERS-CoV的核壳体的抗体确定MERS-CoV感染，但是针对MERS-CoV的抗体的中和活性是未知的，因此持续需要对具有MERS-CoV治疗作用的抗体。
公开内容
技术问题
因此，本发明人已经开发了具有结合至MERS-CoV的S蛋白的能力的结合分子以便解决相关技术中遇到的问题，并且已经确定了结合分子具有针对MERS-CoV的中和功效，从而完成本发明。
本发明的目的是提供结合至MERS-CoV的S蛋白并因此针对MERS-CoV具有中和活性的结合分子。
本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗MERS-CoV的包括结合分子的组合物。
本发明的仍另一个目的是提供用于诊断MERS-CoV的包括结合分子的试剂盒。
技术方案
为了实现以上目的，本发明的实施方式提供了中和结合分子，其结合至MERS-CoV(中东呼吸综合征-冠状病毒)的表面上的刺突蛋白(S蛋白)。
本发明的另一个实施方式提供了用于预防或治疗MERS-CoV的包括结合分子的组合物。
本发明的仍另一个实施方式提供了用于诊断MERS-CoV的包括结合分子的试剂盒。
在下文中，将给出本发明的详细描述。
本发明的实施方式涉及中和结合分子，其结合至MERS-CoV的S蛋白。
本发明的实施方式涉及中和结合分子，其为选自由以下结合分子i)至vi)组成的组中的任何一种。
i)结合分子，其包括a)包括SEQ ID NO:1的CDR1区、SEQ ID NO:2的CDR2区和SEQID NO:3的CDR3区的重链可变区，以及b)包括SEQ ID NO:4的CDR1区、SEQ ID NO:5的CDR2区和SEQ ID NO:6的CDR3区的轻链可变区。
ii)结合分子，其包括a)包括SEQ ID NO:7的CDR1区、SEQ ID NO:8的CDR2区和SEQID NO:9的CDR3区的重链可变区，以及b)包括SEQ ID NO:10的CDR1区、SEQ ID NO:11的CDR2区和SEQ ID NO:12的CDR3区的轻链可变区。
iii)结合分子，其包括a)包括SEQ ID NO:13的CDR1区、SEQ ID NO:14的CDR2区和SEQ ID NO:15的CDR3区的重链可变区，以及b)包括SEQ ID NO:16的CDR1区、SEQ ID NO:17的CDR2区和SEQ ID NO:18的CDR3区的轻链可变区。
iv)结合分子，其包括a)包括SEQ ID NO:19的CDR1区、SEQ ID NO:20的CDR2区和SEQ ID NO:21的CDR3区的重链可变区，以及b)包括SEQ ID NO:22的CDR1区、SEQ ID NO:23的CDR2区和SEQ ID NO:24的CDR3区的轻链可变区。
v)结合分子，其包括a)包括SEQ ID NO:25的CDR1区、SEQ ID NO:26的CDR2区和SEQID NO:27的CDR3区的重链可变区，以及b)包括SEQ ID NO:28的CDR1区、SEQ ID NO:29的CDR2区和SEQ ID NO:30的CDR3区的轻链可变区。
vi)结合分子，其包括a)包括SEQ ID NO:31的CDR1区、SEQ ID NO:32的CDR2区和SEQ ID NO:33的CDR3区的重链可变区，以及b)包括SEQ ID NO:34的CDR1区、SEQ ID NO:35的CDR2区和SEQ ID NO:36的CDR3区的轻链可变区。
在本发明的实施方式中，结合分子包括抗体1至抗体36，如在以下表1中示出。
[表1]
分类 重链CDR1 重链CDR2 重链CDR3 轻链CDR1 轻链CDR2 轻链CDR3
抗体1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6
抗体2 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12
抗体3 SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:18
抗体4 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:24
抗体5 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:30
抗体6 SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:36
在本发明中，可变区的CDR通过典型的方法使用由Kabat等设计的系统(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版)，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))确定。本发明中使用的CDR编号使用Kabat方法确定，但是本发明还涵盖了包括通过其他方法如IMGT方法、Chothia方法、AbM方法等确定的CDR的结合分子。
本发明的实施方式涉及中和结合分子，其为选自由以下结合分子i)至vi)组成的组中的任何一种。
i)结合分子，其包括a)与SEQ ID NO:37的多肽序列的重链可变区具有95％或更多的序列同一性的重链可变区，以及b)与SEQ ID NO:38的的多肽序列的轻链可变区具有95％或更多的序列同一性的轻链可变区。
ii)结合分子，其包括a)与SEQ ID NO:39的多肽序列的重链可变区具有95％或更多的序列同一性的重链可变区，以及b)与SEQ ID NO:40的多肽序列的轻链可变区具有95％或更多的序列同一性的轻链可变区
iii)结合分子，其包括a)与SEQ ID NO:41的多肽序列的重链可变区具有95％或更多的序列同一性的重链可变区以及b)与SEQ ID NO:42的的多肽序列的轻链可变区具有95％或更多的序列同一性的轻链可变区。
iv)结合分子，其包括a)与SEQ ID NO:43的多肽序列的重链可变区具有95％或更多的序列同一性的重链可变区，以及b)与SEQ ID NO:44的多肽序列的轻链可变区具有95％或更多的序列同一性的轻链可变区。
v)结合分子，其包括a)与SEQ ID NO:45的多肽序列的重链可变区具有95％或更多的序列同一性的重链可变区，以及b)与SEQ ID NO:46的多肽序列的轻链可变区具有95％或更多的序列同一性的轻链可变区。
vi)结合分子，其包括a)与SEQ ID NO:47的多肽序列的重链可变区具有95％或更多的序列同一性的重链可变区，以及b)与SEQ ID NO:48的多肽序列的轻链可变区具有95％或更多的序列同一性的轻链可变区。
在本发明的实施方式中，结合分子包括抗体1至抗体6，如在以下表2中示出。
[表2]
Figure BDA0002610116990000051
Figure BDA0002610116990000061
本发明的实施方式中，结合分子可以为Fab片段、Fv片段、双抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，但是不限于此。本发明的实施方式提供了结合至S蛋白的全人抗体。如本文使用的，术语“抗体”被用于具有尽可能广泛的含义，并且特别地包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由两个或更多个完整的抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和示出所需生物活性的抗体片段。抗体是由能够识别特异性抗原并与其结合的免疫系统产生的蛋白质。典型地，将抗体配置为具有包括四个氨基酸链(两个重链和两个轻链)的Y形蛋白质。每种抗体具有包括可变区和恒定区的两个区。位于Y的臂的末端的可变区结合至靶抗原并且与其相互作用。可变区包括识别特异性抗原上的特异性结合位点并且与其结合的互补决定区(CDR)。位于Y尾部的恒定区被免疫系统识别并与其相互作用。靶抗原具有由抗体上的CDR识别的多个称为表位的结合位点。特异地结合至不同的表位的相应抗体具有不同的结构。因此，单个抗原可具有至少一个与其相对应的抗体。
此外，本发明包括结合分子的功能变体。这种结合分子被认为是本发明的结合分子的功能变体，只要变体能够与本发明的结合分子竞争以便特异地结合至MERS-CoV或其S蛋白，并且也具有针对MERS-CoV的中和活性。这种功能变体包括但不限于衍生物(其一级构象序列基本上相似，并且其实例包括体外或体内修饰)、化学物质和/或生化物质，并且它们未在本发明的亲本单克隆抗体中发现。这种修饰的实例可包括乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合、脂质或脂质衍生物的共结合、交联、二硫键键合、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白质水解和磷酸化。与亲本抗体的氨基酸序列相比，功能变体可选择性地为包括由至少一个氨基酸进行取代、插入、缺失或其组合获得的氨基酸序列的抗体。此外，功能变体可包括在氨基末端和羧基末端之一或两者中的截短形式的氨基酸序列。本发明的功能变体可具有与本发明的亲本抗体相同或不同的结合亲和力，即大于或小于本发明的亲本抗体的结合亲和力，但仍可结合至MERS-CoV或其S蛋白。例如，可修饰可变区的氨基酸序列，包括但不限于框架结构或高变区，尤其是轻链或重链的CDR(互补决定区)。典型地，轻链区或重链区包括包含三个CDR的三个高变区和更多保守区，即框架区(FR)。高变区包括来自CDR的氨基酸残基和来自高变环的氨基酸残基。落入本发明的范围内的功能变体可与本发明的亲本抗体具有约50％至99％、约60％至99％、约80％至99％、约90％至99％、约95％至99％、约97％至99％的氨基酸序列同源性。为了最佳排列待比较的氨基酸序列，并且还为了定义相似或相同的氨基酸残基，在计算机算法中，可以使用本领域技术人员已知的Gap或Best-fit。功能变体可通过使亲本抗体或其部分经历已知的分子生物学过程(包括使用寡聚核苷酸的PCR或诱变/部分诱变)或有机合成过程来获得，但是本发明不限于此。
而且，药物可以另外地附着于结合分子。具体地，根据本发明的结合分子可以以包含偶联其中的药物的抗体-药物偶联物的形式使用。当抗体-药物偶联物(ADC)，即免疫偶联物用于局部地递送药物时，将药物部分靶向递送至感染的细胞成为可能。当施用没有被偶联的药物试剂时，可导致对正常细胞的不可接受的毒性水平。通过不仅增加药物偶联和药物释放性，而且增加多克隆抗体和单克隆抗体(mAb)的选择性，可以获得ADC的最大功效和最小毒性。
用于使药物部分附着至抗体的典型手段，例如共价结合的使用，可导致异质分子混合物的产生，其中药物部分附着于抗体上的许多位点。例如，细胞毒素药物通过抗体的许多赖氨酸残基偶联至抗体，从而产生异质抗体-药物偶联物混合物。取决于反应条件，这种异质混合物典型地具有分布，由此附着于药物部分的抗体的数量范围为从0至约8或更多。此外，以特定整数比包括药物部分和抗体的偶联物的每个亚组是潜在的异质混合物，其中药物部分附着至抗体上的各个位点。抗体是大的、复杂的且结构多样的生物分子，并且通常具有许多反应性官能团。连接体试剂和药物连接体中间体的反应性取决于如pH、浓度、盐浓度和助溶剂的因素。
此外，本发明的实施方式提供了编码结合分子的核酸分子。
本发明的核酸分子包括其中本发明提供的抗体的氨基酸序列转化为本领域技术人员已知的多核苷酸序列的任何核酸分子。因此，各种多核苷酸序列可以使用ORF(开放阅读框)来制备，并且还可被并入本发明的核酸分子中。
另外，本发明的实施方式提供了其中插入核酸分子的表达载体。
表达载体可包括但不限于选自由从Celltrion获得的表达载体如MarEx载体(韩国专利号10-1076602)，和商业上广泛使用的pCDNA载体、F、R1、RP1、Co1、pBR322、ToL和Ti载体；粘粒；噬菌体，如λ、λ类(lambdoid)、M13、Mu、p1、P22、Qμ、T-偶数、T2、T3，T7等；和植物病毒组成的组中的任何一种；对本领域技术人员已知的任何表达载体可以在本发明中使用，并且表达载体可根据关注的宿主细胞的性质选择。将载体引入宿主细胞可通过磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔进行，但本发明不限于此，本领域技术人员可采用适用于表达载体和宿主细胞的引入过程。例如，表达载体可包含至少一种选择标志物，但不限于此，并且选择可能根据是否能够使用不包含选择标志物的载体获得产物。选择标志物的选择取决于关注的宿主细胞，并且使用本领域技术人员已知的任何方法来进行，因此本发明不限于与此相关。
为了容易地纯化本发明的结合分子，可将标签序列插入表达载体中并因此与之融合。标签可包括但不限于六个组氨酸标签、血凝素标签、myc标签或标志标签，并且任何标签可用于本发明中，只要它促进纯化，如本领域技术人员已知的。
另外，本发明的实施方式提供了细胞系，其中将表达载体转化至宿主细胞中以产生结合至MERS-CoV并且因此具有中和活性的结合分子。
在本发明中，细胞系可包括但不限于哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细胞起源的细胞。可以使用选自由哺乳动物细胞如CHO细胞、F2N细胞、COS细胞、BHK细胞、Bowes黑色素瘤细胞、HeLa细胞、911细胞、HT1080细胞、A549细胞、HEK293细胞和HEK293T细胞组成的组中的任何一种作为宿主细胞，但是本发明不限于此，并且可以使用任何细胞，只要它们可用作哺乳动物的宿主细胞，如本领域技术人员已知的。
另外，本发明的实施方式涉及用于MERS-CoV感染的预防或治疗的包括结合分子的组合物。除了结合分子以外，本发明的组合物可包括药学上可接受的赋形剂。这种药学上可接受的赋形剂对本领域技术人员是众所周知的。
本发明的组合物可进一步包括至少一种其他治疗剂或诊断剂。例如，除了结合分子以外，本发明的组合物可进一步包括干扰素、抗S蛋白单克隆抗体、抗S蛋白多克隆抗体、核苷类似物、DNA聚合酶抑制剂、siRNA制剂或治疗性疫苗作为抗病毒药物。
包括结合分子的本发明的组合物可以以制剂的形式提供，如通过各自的典型工艺的无菌可注射溶液、冻干制剂、预填充注射器溶液、口服制剂、外用制剂或栓剂，但本发明不限于此。
另外，包括结合分子的本发明的组合物可以以口服或肠胃外的方式施用。例如，施用途径可为静脉内施用，但不限于此。
将本发明的组合物施用至包括人的哺乳动物，从而预防或治疗MERS-CoV感染和由MERS-CoV感染引起的疾病。在此，施用的结合分子(例如抗体)的量取决于治疗受试者、疾病或状况的严重程度、施用速率和医生的处方。
另外，本发明的实施方式涉及包括结合分子的诊断试剂盒。诊断试剂盒中使用的本发明的结合分子可以被可检测地标记。可以用于标记生物分子的各种方法对本领域技术人员是众所周知的，并且被认为落入本发明的范围内。可用于本发明的标记的实例可包括酶、放射性同位素，胶态金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物。常用的标记包括荧光物质(例如，荧光素、若丹明、德克萨斯红等)、酶(如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶)、放射性同位素(例如32P或125I)、生物素、地高辛配基、胶态金属或化学发光或生物发光化合物(如二氧环乙烷、鲁米诺或吖啶)。酶或生物素基团的标记方法如共价结合、碘化、磷酸化、生物素化等是本领域众所周知的。检测方法包括但不限于放射自显影法、荧光显微法、直接和间接酶反应等。常用的检测测定法是放射性同位素法或非放射性同位素法。特别地有用的是免疫印迹、叠置分析、RIA(放射免疫测定)、IRMA(免疫放射免疫测定)、EIA(酶免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、FIA(荧光免疫测定)和CLIA(化学发光免疫测定)。
通过使样品与结合分子接触并观察反应，本发明的诊断试剂盒可用于检测MERS-CoV的存在或不存在。
样品可以是但不限于选自由受试者的痰、涎、血液、汗液、肺细胞、肺组织粘液、呼吸组织和唾液组成的组中的任何一种，并且样品可使用对本领域技术人员通常已知的过程制备。
另外，本发明的实施方式提供了用于诊断、预防或治疗由MERS-CoV引起的疾病的试剂盒，其包括：
a)结合分子；以及
b)容器。
在根据本发明的用于诊断、预防或治疗的试剂盒中，固体载体可以被包括在其容器中。本发明的抗体可以附着至固体载体，并且固体载体可以为多孔的或无孔的，或者可为平坦的或非平坦的。
另外，本发明提供了诊断、预防或治疗由MERS-CoV感染引起的疾病的方法，该方法包括将治疗有效量的以上组合物施用给具有由MERS-CoV感染引起的疾病的受试者。
在本发明的实施方式中，诊断、预防或治疗方法可进一步包括施用抗病毒药物、病毒进入抑制剂或病毒粘附抑制剂。
本发明中使用的术语如以下定义。
如本文使用的，术语“结合分子”指的是完整的免疫球蛋白，其包括单克隆抗体如嵌合、人源化或人单克隆抗体；或抗原结合片段，其为结合至抗原的免疫球蛋白。例如，它指示可变区、酶、受体或蛋白质，其包含与完整的免疫球蛋白竞争以便结合至MERS-CoV的刺突蛋白的免疫球蛋白片段。不论结构如何，抗原结合片段与由完整的免疫球蛋白识别的相同抗原结合。抗原结合片段可包括肽或多肽，其包括由以下组成的抗体氨基酸序列：2个或更多个连续的氨基酸残基、20个或更多个连续的氨基酸残基、25个或更多个连续的氨基酸残基、30个或更多个连续的氨基酸残基、35个或更多个连续的氨基酸残基、40个或更多个连续的氨基酸残基、50个或更多个连续的氨基酸残基、60个或更多个连续的氨基酸残基、70个或更多个连续的氨基酸残基、80个或更多个连续的氨基酸残基、90个或更多个连续的氨基酸残基、100个或更多个连续的氨基酸残基、125个或更多个连续的氨基酸残基、150个或更多个连续的氨基酸残基、175个或更多个连续的氨基酸残基、200个或更多个连续的氨基酸残基或250或更多个连续的氨基酸残基。
如本文使用的，术语“抗原结合片段”表明Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、dAb、Fd、互补性决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双抗体、三抗体、四抗体、多肽等等，该多肽包含足够给予特异性抗原结合至多肽的免疫球蛋白的至少一个片段。以上片段可合成地产生或通过完整的免疫球蛋白的酶的或化学裂解来产生，或它们可为通过重组DNA技术进行基因改造。这种产生方法是本领域众所周知的。
如本文使用的，术语“药学上可接受的赋形剂”意味着与活性分子如药物、试剂或抗体组合以制备可接受的或方便的剂型的任何惰性物质。药学上可接受的赋形剂是在典型的使用剂量和浓度下对接受者无毒或至少降低毒性的赋形剂，并且其与包括药物、试剂或结合分子的制剂的其他成分相容。
如本文使用的，术语“治疗有效量”指的是在暴露于MERS-CoV之前或之后对于预防或治疗有效的本发明的结合分子的量。
有利的效果
根据本发明，结合分子具有结合至MERS-CoV的S蛋白的强大能力，从而展现出中和活性，并且因此在MERS-CoV感染的预防、治疗或诊断中是非常有用的。
附图的简要说明
图1示出通过用两种最终选择的抗体进行噬菌斑测定的针对韩国分离物MERS-CoV(MERS-CoV/Korea/KNIH/002_05_2015)的依赖于抗体浓度的中和活性；
图2示出通过用韩国分离物MERS-CoV和抗体感染人肺组织，在组织培养后通过噬菌斑测定的病毒滴度以便使用人肺组织感染模型(离体)评估抗体的中和活性；
图3a示出使用能够MERS-CoV感染和增殖的动物模型(hDPP4(人二肽基肽酶4)受体-过表达的小鼠)和结合至病毒的抗体用于动物治疗功效评估的定量PCR结果；
图3b示出使用能够MERS-CoV感染和增殖的动物模型(hDPP4(人二肽基肽酶4)受体-过表达的小鼠)和结合至病毒的抗体用于动物治疗功效评估的噬菌斑测定结果；
图4a示出使用能够MERS-CoV感染和增殖的动物模型(hDPP4(人二肽基肽酶4)受体-过表达的小鼠)用于针对MERS-CoV的抗体的预防功效评估的定量PCR结果(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)；
图4b示出使用能够MERS-CoV感染和增殖的动物模型(hDPP4(人二肽基肽酶4)受体-过表达的小鼠)用于针对MERS-CoV的抗体的预防功效评估的噬菌斑测定结果(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)；
图5示出使用能够MERS-CoV感染和增殖的动物模型(hDPP4(人二肽基肽酶4)受体-过表达的小鼠)用于针对MERS-CoV的抗体的预防功效评估的小鼠肺中的组织变化；
图6a示出使用能够MERS-CoV感染和增殖的动物模型(hDPP4(人二肽基肽酶4)受体-过表达的小鼠)用于针对MERS-CoV的抗体的治疗功效评估的小鼠体重减轻(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)；
图6b示出使用能够MERS-CoV感染和增殖的动物模型(hDPP4(人二肽基肽酶4)受体-过表达的小鼠)用于针对MERS-CoV的抗体的治疗功效评估的小鼠存活率(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)；
图6c示出使用能够MERS-CoV感染和增殖的动物模型(hDPP4(人二肽基肽酶4)受体-过表达的小鼠)用于针对MERS-CoV的抗体的治疗功效评估的定量PCR结果(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)；和
图6d示出使用能够MERS-CoV感染和增殖的动物模型(hDPP4(人二肽基肽酶4)受体-过表达的小鼠)用于针对MERS-CoV的抗体的治疗功效评估的噬菌斑测定结果(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。
发明的模式
通过以下实施例可获得本发明的更好的理解，提出实施例是用来阐明而不应解释为限制本发明的范围。本文引用的文件通过引用并入该申请中。
实施例1：从MERS-CoV康复的患者的血液中分离PBMC
血液供体是那些在2015年被确认已感染了MERS-CoV并且由于治疗不再具备病毒的血液供体，并且在机构审查委员会(Institutional Review Board)(IRB)的批准下进行供体选择和血液收集过程。在供体选择后，收集约30ml的全血，并且使用Ficoll-PaqueTMPLUS(GE Healthcare)方法分离PBMC(外周血单核细胞)。分离的PBMC用磷酸盐缓冲溶液洗涤两次，然后在冷冻培养基(RPMI:FBS:DMSO＝5:4:1)中以1x107个细胞/ml的浓度存储在液氮罐中。
实施例2：抗体-展示的噬菌体文库的产生
使用TRIzol试剂(Invitrogen)从在实施例1中分离的PBMC中提取总RNA，然后使用SuperScript TM III第一链cDNA合成系统(Invitrogen,USA)合成cDNA。
参考相关文献(Barbas C.等Phage Display:A Laboratory Manual.2001.CSHLPress)进行来自合成的cDNA的抗体文库的产生。简言之，从使用高保真的Taq聚合酶(Roche)和退化引物集(IDT)通过PCR(聚合酶链反应)方法从合成的cDNA中扩增抗体的轻链和重链可变区。通过重叠PCR方法将分离的轻链和重链可变区片段制成scFv基因，以便以随机组合连接为一个序列，然后进行扩增，用限制酶切割，并且使用1％琼脂糖凝胶电泳和凝胶提取试剂盒(Qiagen)分离scFv。噬菌体载体用相同的限制酶切割，分离，与scFv基因混合，添加T4 DNA连接酶(New England Biolabs)，然后允许在16℃反应12小时或更长。将所得反应溶液与ER2738感受态细胞混合，然后通过电穿孔过程转化。将转化的ER2738进行震荡培养，添加VCSM13辅助噬菌体(Agilent Technologies)并且培养12小时或更长。
实施例3：使用噬菌体酶免疫测定选择
将实施例2中制备的噬菌体文库培养溶液离心分离，从而除去宿主细胞，添加4％PEG和0.5M NaCl，且离心分离，因此噬菌体沉淀并且除去上清液。将沉淀的噬菌体用1％BSA/TBS稀释以提供噬菌体文库，此后通过结合至各种MERS-CoV刺突蛋白(S蛋白)和从各种MERS-CoV刺突蛋白(S蛋白)解离独立地进行淘选(panning)，从而分离具有结合至MERS-CoVS蛋白的能力的scFv-噬菌体。例如，将噬菌体文库添加至ELISA平板，该平板上附着了作为MERS-CoV S蛋白的部分的RBD区(S1糖蛋白上的残基367至588)，然后在室温反应2小时。除去反应溶液，然后ELISA板用包含0.05％Tween 20的PBS洗涤，然后添加60μl的0.1M甘氨酸-HCl(pH 2.2)，因此scFv-噬菌体与抗原分离，并且使用2M Tris(pH 9.1)中和。这样中和的scFv噬菌体用ER2738感染，用辅助噬菌体培养并且用于随后的淘选。在添加辅助噬菌体之前，将部分感染的ER2738铺在LB平板上，并且在第二天获得菌落。
进行每次淘选形成的总共1,200个菌落被添加至96孔深孔板(Axygen)中的培养基，进行震荡培养，并且在OD600达到0.7或更高时添加辅助噬菌体，然后在37℃震荡培养12个小时或更长。培养溶液离心分离，以除去宿主细胞，并且制备含有scFv噬菌体的上清液。
将如此制备的scFv噬菌体上清液用6％BSA/PBS以1：1稀释，放置于96孔微量滴定板的吸附了MERS-CoV S蛋白的每个孔中，然后封闭，并允许在37℃放置2小时。每个孔用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤三次，添加用HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗M13抗体，并允许在37℃放置1小时。每个孔用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤三次，然后添加ABTS(2,2’-叠氮基双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐)，然后在405nm处测量吸光度，从而选择了具有结合至MERS-CoV S蛋白的能力的444种scFv噬菌体。
实施例4:抗体片段(scFv-Fc)的结合能力的评估
对于在实施例3中选择的444个scFv噬菌体，通过菌落的震荡培养获得DNA，然后分析抗体可变区的序列。在这些之中，通过排除具有重叠氨基酸序列的克隆选择的118个scFv噬菌体被克隆到含有Fc区的载体中，并且以抗体片段(scFv-Fc)的形式转化，以便评估在候选抗体动物细胞系中的表达能力和中和活性。在使用转染试剂在F2N细胞(韩国专利号10-1005967，专利权所有人：Celltrion Inc.)中转染和表达后，使用其培养溶液，并且通过ELISA测量抗体片段(scFv-Fc)结合至三种MERS-CoV的S蛋白的能力。简言之，将MERS-CoV S蛋白附着至ELISA板，并且向其中添加表达的抗体片段。用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤未结合的抗体后，使用与HRP(辣根过氧化物酶)连接的抗人Fc抗体选择结合至抗原的抗体片段。因此，证实了111种抗体片段特异性结合至MERS-CoV的S蛋白。
实施例5：针对MERS-CoV的抗体片段的中和活性的评估(第一次在体外的中和活性 评估)
1)针对沙特分离病毒(Saudi isolate virus)的中和活性的测量
将通过实施例4的方法表达的111种抗体片段培养溶液顺序稀释2倍，从而制备12种浓度的样品。对于沙特分离病毒(MERS/HCoV/KSA/EMC/2012)，将病毒原种(virus stock)溶解，稀释至25TCID50/孔的浓度，与以上制备的12种浓度中的每种抗体片段培养溶液混合，允许在37℃放置2小时，转移至含有培养的Vero细胞的96孔板中，并且允许在37℃放置1小时以因此诱导感染。除去病毒和抗体片段培养溶液的混合溶液，将培养基放置在每个孔中，并且在5％CO2培养箱中在37℃进行培养3天，之后使用显微镜观察在每个孔中细胞病变效果，并计算病毒中和活性(观察到50％中和活性时的孔的抗体浓度)(Reed&Muench方法)。通过反算法确定每孔使用的病毒量(25TCID50/孔)。示出50％病毒中和效果的抗体浓度越低，中和活性越好。
如以下表3中示出，证实了36种抗体片段具有优于阳性对照抗体1和2(结合至MERS-CoV S蛋白且具有已知的中和效果)的中和活性。
[表3]
Figure BDA0002610116990000171
Figure BDA0002610116990000181
2)针对韩国分离病毒的中和活性的测量
将以上1)中确认的具有针对沙特病毒的中和活性的36种抗体片段与韩国分离病毒(MERS-CoV/Korea/KNIH/002_05_2015)进行PRNT(噬菌斑减少中和测试)。
对于PRNT，将抗体样品稀释，与等量的100PFU病毒混合，允许其在在37℃反应1小时，用于感染细胞系，并且进行噬菌斑测定。在5％CO2培养箱中在37℃培养3天，然后使用结晶紫染色，比较地分析形成的噬菌斑的数量，并且评估抗体样品的中和活性。
基于比较分析的结果，证实了与两种阳性对照抗体相比，选择的抗体片段减少了噬菌斑形成，表明本发明的36种抗体片段具有优于两种阳性对照抗体的中和活性(结果未显示)。
实施例6：在转化为全人抗体后抗体表达率和抗体结合特异性的评估
使用其遗传信息将选择的抗体片段转化为全人抗体，通过实施例4的方法制备抗体培养溶液，并且在全人抗体中确认抗原结合位点、抗体表达率等。基于包括以上病毒中和活性的评估结果的综合结果，从36种全人抗体中选出18种全人抗体。
实施例7：针对MERS-CoV的全人抗体的中和活性的评估(第二次在体外的中和活性 评估)
1)针对沙特分离病毒的中和活性的评估
将实施例6中选择的18种抗体转变为全人抗体，然后以与实施例5的1)相同的方式评估其针对沙特分离病毒的病毒中和活性。如以下表4中示出，证实了18种抗体中的16种具有优于阳性对照抗体1(结合至MERS-CoV S蛋白且具有已知的中和效果)的病毒中和活性。
[表4]
Figure BDA0002610116990000191
Figure BDA0002610116990000201
2)针对韩国分离病毒的全人抗体的中和活性的评估
将实施例6中选择的18种抗体转变为全人抗体，然后以与实施例5的2)中相同的方式评估其针对韩国分离病毒的病毒中和活性。
基于PRNT的结果，如以下表5中示出，关于第一次评估时(7种抗体)和第二次评估时(11种抗体)的18种抗体，证实了所有18种抗体展现出低数值，因此与阳性对照抗体1和2(结合至MERS-CoV S蛋白且具有已知的中和效果)相比展示出优异的病毒中和活性。
[表5]
Figure BDA0002610116990000202
Figure BDA0002610116990000211
实施例8：用于细胞系开发的克隆的选择
为了选择用于细胞系开发的抗体，除了中和活性的评估之外，进一步进行了性质评价。对抗体靶位点、抗体表达率和耐热性进行性质评估。为了评估耐热性，简言之，将抗体和Sypro Orange(Thermo Fisher Scientific)稀释至适当的浓度并且混合，然后将制备的样品放置于PCR 96孔板中，并且通过使用7500实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific)设置从25℃到99℃的熔点曲线来测量荧光值。基于以上中和活性评估和以下表6中示出的性质评估的综合结果，选择表5中示出的6种抗体，并且克隆至适合于细胞系开发的载体。
[表6]
Figure BDA0002610116990000212
Figure BDA0002610116990000221
实施例9：针对沙特和约旦病毒的中和活性的评估(第三次在体外的中和活性评 估)
对于在实施例8中选择的6种抗体，以与实施例5的1)中相同的方式评估其针对沙特分离病毒和约旦分离病毒(MERS-HCoV/Jordan/01)的中和活性。如以下表7中示出，其病毒中和活性优于四种阳性对照抗体(结合至MERS-CoV S蛋白且具有已知的中和效果)。
[表7]
Figure BDA0002610116990000222
实施例10：针对韩国分离病毒的中和活性的评估(第三次在体外的中和活性评估)
对于实施例9中选择的两种抗体，以与实施例5的2)中相同的方式进行噬菌斑测定，并且评估不同浓度的抗体针对韩国分离物MERS-CoV(MERS-CoV/Korea/KNIH/002_05_2015)的中和活性。因此，证实了与阳性对照抗体4(结合至MERS-CoV S蛋白且具有已知的中和效果)相比，这两种抗体具有优异的病毒中和活性(图1)。
实施例11：病毒中和活性(离体)的评估
使用人肺组织感染模型(离体)评估了用于细胞系开发的抗体的中和活性(表8)。简言之，基于IC50值制备韩国分离物MERS-CoV(MERS-CoV/Korea/KNIH/002_05_2015)和用于评估的抗体样品，并且允许反应1小时，然后人肺组织用病毒和抗体的反应产物感染并且进行组织培养。然后，进行培养3天，在此期间以24小时的间隔收集培养上清液，并且通过噬菌斑测定测量病毒滴度。如以下表8中示出，当100ng具有在实施例10中证实的功效的两种抗体的每种允许与MERS-CoV反应并且然后用其感染人肺组织时，证实了与未用抗体处理的阴性和阳性对照抗体相比，在24小时、48小时和72小时，上清液中抑制了MERS-CoV的生长(图2)。
[表8]
Figure BDA0002610116990000231
实施例12.抗体性质和结合特征的评估
基于如病毒中和活性等的抗体性质的测量结果，选择了用于细胞系开发的两种最终抗体，并且评估其性质。作为评估项目，测量了聚集物形成评估、序列分析、二硫键维持分析、信号肽裂解评估以及重链和轻链正常结合。如以下表9中示出，抗体性质中没有特殊问题。
[表9]
Figure BDA0002610116990000241
而且，评估了对MERS-CoV表面蛋白(RBD)的抗原结合能力(SPR，表面等离子体共振)。如以下表10中示出，综合地判断了抗体的中和活性和抗体性质，并且与阳性对照抗体4相比，评估了两种最终选择的抗体的结合特征。证实了与阳性对照抗体4相比，抗体5具有优异的结合特征。
[表10]
Figure BDA0002610116990000242
实施例13：病毒中和活性(体内)的评估
使用动物模型评估用于针对MERS-CoV的细胞系开发的两种抗体的中和活性。具体地，将抗体施用给病毒感染人体需要的hDPP4(人二肽基肽酶4)受体-过表达小鼠(TG小鼠)，并且进行用韩国分离物MERS-CoV(MERS-CoV/Korea/KNIH/002_05_2015)感染，因此评估了两种最终选择的抗体的预防和治疗功效。
具体地，使用抗体3和抗体5以及阴性对照抗体来确定以MERS-CoV感染hDPP4 TG小鼠的条件和阳性对照抗体4的效果(图3)。为此，用病毒感染动物，并且在第二天以相应剂量腹膜内地注射其中每种抗体。在感染后某些天数，提取小鼠的肺组织，并且通过定量PCR(图3a)和噬菌斑测定(图3b)对病毒定量。预先证实了动物感染实验已适当地进行，并且还证实了与阳性对照抗体4相比，抗体3和抗体5能够具有优异的或相似的治疗功效。
为了评估预防效果，将抗体5、阳性对照抗体4和阴性对照抗体的每种腹膜内地注入至MERS-CoV感染人体需要的hDPP4(人二肽基肽酶4)受体-过表达小鼠(hDPP4 TG小鼠)，并且在第二天进行用韩国分离物MERS-CoV(MERS-CoV/Korea/KNIH/002_05_2015)的感染。在感染后某些天数，提取小鼠的肺组织，并且对病毒定量(图4)。基于通过定量PCR(图4a)和噬菌斑测定(图4b)的MERS-CoV定量结果，证实了与阳性对照抗体4相比，抗体5具有优异的预防功效。
此外，在感染的第7天提取小鼠肺，然后通过H&E染色直接地观察组织中的变化(图5)。因此，在用阴性对照抗体处理的组中，气道隔膜增厚，并且引入了许多炎性细胞，指示严重的组织病理学改变(图5的a和d)。尽管用阳性对照抗体处理的组没有像用阴性对照抗体处理的组受到严重的影响，但是证实了炎性细胞的引入和增厚的气道隔膜(图5的b和e)。相反地，在用抗体5处理的组中，证实了与其他处理的组相比，存在较少的组织病理学改变(图5的c和f)。
此外，为了治疗功效的评估，用以上病毒感染动物，并且在第二天，将抗体5、阳性对照抗体4和阴性对照抗体的每种腹膜内地注入其中。在感染后一定天数，观察小鼠体重减少和小鼠存活率，并且，提取小鼠肺组织，因此定量病毒(图6)。基于小鼠体重减少(图6a)和小鼠存活率(图6b)的评估结果，仅在最低剂量(2μg)的阴性对照抗体和抗体5观察到体重减轻和死亡率。而且，基于通过定量PCR(图6c)和噬菌斑测定(图6d)的MERS-CoV定量的结果，证实了与阳性对照抗体4相比，抗体5具有优异的或相似的治疗功效。
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体4重链CDR1
<400> 19
Gly Gly Ser Ile Asn Ser Arg Ser Tyr Tyr Trp Gly
1 5 10
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体4重链CDR2
<400> 20
Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 21
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体4重链CDR3
<400> 21
Ala Asp Arg Glu Tyr Val Trp Gly Ser Tyr Asp Gly Pro Gly Ser Pro
1 5 10 15
Phe Asp Tyr
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体4轻链CDR1
<400> 22
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Asn
1 5 10
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体4轻链CDR2
<400> 23
Gly Asp His Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体4轻链CDR3
<400> 24
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Val Val
1 5 10
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5重链CDR1
<400> 25
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5 10
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5重链CDR2
<400> 26
Arg Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5重链CDR3
<400> 27
Arg Ser Gly Asp Tyr Ser Gly Ser Ser Gly Leu Ala Phe Asp Ile
1 5 10 15
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5轻链CDR1
<400> 28
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5轻链CDR2
<400> 29
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5轻链CDR3
<400> 30
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体6重链CDR1
<400> 31
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His
1 5 10
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体6重链CDR2
<400> 32
Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 33
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体6重链CDR3
<400> 33
Asp Trp Ser Ser Gly Trp Ser Ser Pro Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体6轻链CDR1
<400> 34
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
1 5 10
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体6轻链CDR2
<400> 35
Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体6轻链CDR3
<400> 36
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Val Val
1 5 10
<210> 37
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体1重链可变区
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Val Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Pro Gly Asp Ser Arg Asp Gly Tyr Asn Tyr Asp Ala
100 105 110
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Leu Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Thr Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
145 150 155 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
180 185 190
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
195 200 205
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
210 215 220
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
225 230 235 240
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
275 280 285
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
290 295 300
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
305 310 315 320
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
355 360 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
370 375 380
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
385 390 395 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455 460
Gly Lys
465
<210> 38
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体1轻链可变区
<400> 38
Gly Glu Leu Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly
1 5 10 15
Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Asn Ala Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 39
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体2重链可变区
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Pro Gly Asp Ser Arg Asp Gly Tyr Asn Tyr Asp Ala
100 105 110
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Thr Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
145 150 155 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
180 185 190
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
195 200 205
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
210 215 220
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
225 230 235 240
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
275 280 285
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
290 295 300
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
305 310 315 320
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
355 360 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
370 375 380
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
385 390 395 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455 460
Gly Lys
465
<210> 40
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体2轻链可变区
<400> 40
Gly Glu Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly
1 5 10 15
Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn
20 25 30
Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Asn Asp Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Arg Ser
85 90 95
Leu Ser Val Glu Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 41
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体3重链可变区
<400> 41
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Arg
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ala Asp Arg Glu His Val Trp Gly Ser Tyr Asp Gly Pro
100 105 110
Gly Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Thr Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
340 345 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
<210> 42
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体3轻链可变区
<400> 42
Gly Glu Leu Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ser Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ser Gln Asp Glu Ala Asp Tyr His Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser
85 90 95
Leu Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 43
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体4重链可变区
<400> 43
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Arg
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ala Asp Arg Glu Tyr Val Trp Gly Ser Tyr Asp Gly Pro
100 105 110
Gly Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Thr Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
340 345 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
<210> 44
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体4轻链可变区
<400> 44
Gly Glu Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Ala Pro Arg
1 5 10 15
Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn
20 25 30
Asn Ala Val Asn Trp Tyr Leu Gln Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asp His Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ser Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser
85 90 95
Leu Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 45
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5重链可变区
<400> 45
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Thr Arg Ser Gly Asp Tyr Ser Gly Ser Ser Gly Leu Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Thr Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
130 135 140
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
145 150 155 160
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
165 170 175
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
180 185 190
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
210 215 220
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
225 230 235 240
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
245 250 255
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
260 265 270
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
275 280 285
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
290 295 300
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
305 310 315 320
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
325 330 335
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
340 345 350
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
355 360 365
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
370 375 380
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
385 390 395 400
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
405 410 415
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
420 425 430
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
435 440 445
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 46
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体5轻链可变区
<400> 46
Gly Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro
1 5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu
65 70 75 80
Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser
85 90 95
Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 47
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体6重链可变区
<400> 47
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Leu Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Trp Ser Ser Gly Trp Ser Ser Pro Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
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130 135 140
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
180 185 190
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Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
210 215 220
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
225 230 235 240
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
245 250 255
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
260 265 270
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
275 280 285
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
290 295 300
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
305 310 315 320
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
325 330 335
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
340 345 350
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
355 360 365
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
370 375 380
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Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
405 410 415
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
420 425 430
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
435 440 445
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体6轻链可变区
<400> 48
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Val Val
1 5 10

Claims (13)

1.一种中和结合分子，其结合至中东呼吸综合征-冠状病毒(MERS-CoV)的表面上的刺突蛋白(S蛋白)。
2.根据权利要求1所述的结合分子，其中所述结合分子为选自由以下结合分子i)至vi)组成的组中的任何一种：
i)结合分子，其包括a)包括SEQ ID NO:1的CDR1区、SEQ ID NO:2的CDR2区和SEQ IDNO:3的CDR3区的重链可变区，以及b)包括SEQ ID NO:4的CDR1区、SEQ ID NO:5的CDR2区和SEQ ID NO:6的CDR3区的轻链可变区；
ii)结合分子，其包括a)包括SEQ ID NO:7的CDR1区、SEQ ID NO:8的CDR2区和SEQ IDNO:9的CDR3区的重链可变区，以及b)包括SEQ ID NO:10的CDR1区、SEQ ID NO:11的CDR2区和SEQ ID NO:12的CDR3区的轻链可变区；
iii)结合分子，其包括a)包括SEQ ID NO:13的CDR1区、SEQ ID NO:14的CDR2区和SEQID NO:15的CDR3区的重链可变区，以及b)包括SEQ ID NO:16的CDR1区、SEQ ID NO:17的CDR2区和SEQ ID NO:18的CDR3区的轻链可变区；
iv)结合分子，其包括a)包括SEQ ID NO:19的CDR1区、SEQ ID NO:20的CDR2区和SEQ IDNO:21的CDR3区的重链可变区，以及b)包括SEQ ID NO:22的CDR1区、SEQ ID NO:23的CDR2区和SEQ ID NO:24的CDR3区的轻链可变区；
v)结合分子，其包括a)包括SEQ ID NO:25的CDR1区、SEQ ID NO:26的CDR2区和SEQ IDNO:27的CDR3区的重链可变区，以及b)包括SEQ ID NO:28的CDR1区、SEQ ID NO:29的CDR2区和SEQ ID NO:30的CDR3区的轻链可变区；以及
vi)结合分子，其包括a)包括SEQ ID NO:31的CDR1区、SEQ ID NO:32的CDR2区和SEQ IDNO:33的CDR3区的重链可变区，以及b)包括SEQ ID NO:34的CDR1区、SEQ ID NO:35的CDR2区和SEQ ID NO:36的CDR3区的轻链可变区。
3.根据权利要求1所述的结合分子，其中所述结合分子为选自由以下结合分子i)至vi)组成的组中的任何一种：
i)结合分子，其包括a)与SEQ ID NO:37的多肽序列的重链可变区具有95％或更多的序列同一性的重链可变区，以及b)与SEQ ID NO:38的多肽序列的轻链可变区具有95％或更多的序列同一性的轻链可变区；
ii)结合分子，其包括a)与SEQ ID NO:39的多肽序列的重链可变区具有95％或更多的序列同一性的重链可变区，以及b)与SEQ ID NO:40的多肽序列的轻链可变区具有95％或更多的序列同一性的轻链可变区；
iii)结合分子，其包括a)与SEQ ID NO:41的多肽序列的重链可变区具有95％或更多的序列同一性的重链可变区以及b)与SEQ ID NO:42的多肽序列的轻链可变区具有95％或更多的序列同一性的轻链可变区；
iv)结合分子，其包括a)与SEQ ID NO:43的多肽序列的重链可变区具有95％或更多的序列同一性的重链可变区，以及b)与SEQ ID NO:44的多肽序列的轻链可变区具有95％或更多的序列同一性的轻链可变区；
v)结合分子，其包括a)与SEQ ID NO:45的多肽序列的重链可变区具有95％或更多的序列同一性的重链可变区，以及b)与SEQ ID NO:46的多肽序列的轻链可变区具有95％或更多的序列同一性的轻链可变区；以及
vi)结合分子，其包括a)与SEQ ID NO:47的多肽序列的重链可变区具有95％或更多的序列同一性的重链可变区，以及b)与SEQ ID NO:48的多肽序列的轻链可变区具有95％或更多的序列同一性的轻链可变区。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的结合分子，其中所述结合分子为Fab片段、Fv片段、双抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
5.一种免疫偶联物，其中至少一个标签另外地结合至权利要求1至3中任一项所述的结合分子。
6.一种核酸分子，其编码权利要求1至3中任一项所述的结合分子。
7.一种表达载体，其中插入了权利要求6所述的核酸分子。
8.一种细胞系，其中权利要求7所述的表达载体转化至宿主细胞内以产生结合至MERS-CoV并因此具有中和活性的结合分子。
9.根据权利要求8所述的细胞系，其中所述宿主细胞为选自由CHO细胞、F2N细胞、COS细胞、BHK细胞、Bowes黑色素瘤细胞、HeLa细胞、911细胞、HT1080细胞、A549细胞、HEK 293细胞和HEK293T细胞组成的组中的任何一种。
10.一种用于预防或治疗MERS-CoV感染的组合物，其包括权利要求1至3中任一项所述的结合分子。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述组合物为无菌可注射溶液、冻干制剂、预填充注射器溶液、口服制剂、外用制剂或栓剂。
12.一种诊断、预防或治疗由MERS-CoV感染引起的疾病的方法，其包括将治疗有效量权利要求10或11所述的组合物施用至具有由MERS-CoV感染引起的疾病的受试者。
13.一种用于诊断MERS-CoV的试剂盒，其包括权利要求1至3中任一项所述的结合分子。
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