CN117126263A - 一种重组人源iii型胶原蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种重组人源III型胶原蛋白及其制备方法和用途。本发明的重组人源III型胶原蛋白，所述重组人源III型胶原蛋白包含如下特征的一种或多种：1)所述重组人源III型胶原蛋白包含氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的多肽；2)如SEQ ID No.1具有90％及以上的序列一致性，以及具有1)限定的氨基酸序列的功能的多肽片段。本发明的重组人源III型胶原蛋白在胞外的高水平表达，其培养易于放大，并可利用高密度发酵方式高产目的蛋白，分泌表达有利于表达产物的分离纯化，降低生产成本，且其对所表达的外源蛋白有一定的翻译后修饰功能，如糖基化等。

Description

一种重组人源III型胶原蛋白及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种重组人源III型胶原蛋白及其制备方法和用途。
背景技术
胶原(collagen)是哺乳动物体内含量最多的一类蛋白质，占蛋白质总量的25％～30％，广泛存在于从低等脊椎动物的体表面到哺乳动物机体的一切组织中。
胶原蛋白作为一种重要的天然生物蛋白，具有良好的生物相容性、生物活性和可降解性等独特功能特征，可广泛应用于化工、医药、食品、化妆品等众多领域，尤其适合制备多种生物器械，是最为理想的生物材料来源，具有广阔的应用前景。胶原蛋白的获得主要有两种途径，包括来源于动物组织的传统方法和异源蛋白表达。
传统方法主要通过酸、碱或酶解法来处理动物来源的组织，这些方法获得的均为长度不等的混合胶原肽段，给纯化带来不便；且异源胶原蛋白在临床上表现出的排异反应，限制了其作为生物医学材料和药物载体方面的应用。
目前，异源蛋白表达采用的宿主主要包括哺乳动物细胞、动物体、植物和微生物，微生物表达相比其他技术有着产量高、生产周期短、培养简单、成本低、易获取高密度发酵等优点。目前用于重组表达人胶原蛋白的宿主菌主要有毕赤酵母、酿酒酵母、汉逊酵母、大肠杆菌与等。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是一种外源蛋白表达系统，既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点，还具有原核生物表达系统不具有的对外源蛋白的修饰如糖基化、蛋白磷酸化等特点。在过去的20年中已有200多种不同蛋白在毕赤酵母中实现了成功表达，其中许多产品已被广泛应用于临床的诊断治疗和科研工作中。在毕赤酵母表达系统中外源基因不是存在于自主复制的表达载体中，而是和表达载体一起通过同源重组整合在酵母染色体上，随染色体一起复制和遗传，不会发生外源基因的丢失现象；毕赤酵母具有强烈的好氧生长偏爱性，可实现细胞高密度培养，利于大规模工业化生产；毕赤酵母可高水平分泌表达外源蛋白，发酵产物的累积不会对其产生毒副作用，并且毕赤酵母自身分泌到培养基中的蛋白很少，便于纯化。毕赤酵母发酵表达产率高、培养基简单、表达蛋白稳定且易于纯化，蛋白具有后修饰如糖基化等能力。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种重组人源III型胶原蛋白及其制备方法和用途，用于解决现有技术的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种重组人源III型胶原蛋白，所述重组人源III型胶原蛋白包含如下特征的一种或多种：
1)所述重组人源III型胶原蛋白包含氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的多肽；
2)如SEQ ID No.1具有90％及以上的序列一致性，以及具有1)限定的氨基酸序列的功能的多肽片段。
优选地，所述重组人源III型胶原蛋白包含2-6段氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的肽段。
本发明还提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码前述重组人源III型胶原蛋白。
本发明还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包含前述多核苷酸和骨架质粒。
本发明还提供一种细胞，所述宿主细胞含有前述核酸构建体或前述多核苷酸。
本发明还提供前述重组人源III型胶原蛋白的制备方法，所述制备方法包含如下步骤的一种或多种：
1)培养前述细胞；
2)诱导步骤1)中细胞目的基因表达，以获得重组人源III型胶原蛋白；
3)分离、纯化步骤2)中的重组人源III型胶原蛋白。
本发明还提供前述重组人源III型胶原蛋白、前述核酸构建体、前述重组人源III型胶原蛋白表达载体或前述细胞在制备在护肤品或组织材料中的用途。
如上所述，本发明的重组人源III型胶原蛋白及其制备方法和用途，具有以下有益效果：
(1)重组人源III型胶原蛋白基因同时包含天然人胶原蛋白基因的特征，其表达的蛋白将具有天然人胶原蛋白的优良特征；(2)在人源胶原蛋白的分子长度方面，通过制备不同重复数同向串联基因重组质粒，可在进一步的酵母表达研究中实现接近较大的分子量的天然人胶原蛋白的重组人源胶原蛋白的表达生产；(3)该种不同重复数同向串联基因重组质粒的制备方法，仅仅通过简单的PCR和同源重组转化和筛选，实现了任意重复数的目的基因(重组人源胶原蛋白基因)的串联连接；(4)可诱导表达的毕赤酵母工程菌能实现重组人源胶原蛋白在胞外的高水平表达，其培养易于放大，并可利用高密度发酵方式高产目的蛋白，分泌表达有利于表达产物的分离纯化，降低生产成本，且其对所表达的外源蛋白有一定的翻译后修饰功能，如糖基化等。
附图说明
图1显示为本发明的重组人源III型胶原蛋白PCR串联核酸电泳检测胶图，Line1:Marker、Line2～Line8:pPIC9K-C为模板、Line9：pPIC9K为模板。
图2显示为本发明的重组人源III型胶原蛋白SDS-PAGE检测胶图，Line1:Marker，Line3：GS115-pPIC9K诱导72h、Line4:GS115-pPIC9K-C诱导72h，Line 6：GS115-pPIC9K诱导96h、Line 7:GS115-pPIC9K-C诱导96h。
图3显示为本发明的重组人源III型胶原蛋白SDS-PAGE检测胶图，Line1:Marker、Line2:GS115诱导96h，Line 5:GS115-pPIC9K-6*C诱导96h，Line 8:GS115-pPIC9K-6*C诱导72h、Line 9:GS115-pPIC9K-6*C诱导48h。
图4显示为本发明的重组人源III型胶原蛋白液相色谱图。
图5显示为本发明的重组人源III型胶原蛋白序列和其他III型胶原蛋白序列亲疏水性分析结果。
具体实施方式
本发明提供一种重组人源III型胶原蛋白，所述重组人源III型胶原蛋白包含如下特征的一种或多种：
1)所述重组人源III型胶原蛋白包含氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的多肽；
2)如SEQ ID No.1具有90％及以上的序列一致性，以及具有1)限定的氨基酸序列的功能的多肽片段。
进一步地，1)中的多肽片段具体指：如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体为1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个或1-3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体为1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个或1-3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的多肽片段的功能的多肽片段，所述b)中的氨基酸序列可与SEQ ID No.1具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的序列一致性。
在一些具体实施方式中，所述重组人源III型胶原蛋白包含一个或多个氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的多肽串联而成的多肽。更具体地，所述重组人源III型胶原蛋白包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的多肽串联而成的多肽。优选地，所述重组人源III型胶原蛋白包含1-6个氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的多肽串联而成的多肽。
在一些具体实施方式中，所述重组人源III型胶原蛋白包含2-6段氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示的肽段。
在一些具体实施方式中，所述重组人源III型胶原蛋白还包含含有分泌标签的氨基酸序列。分泌标签将胶原蛋白导向宿主细胞的周质空间。在特定实施方案中，信号肽衍生自DsbA、PelB、OmpA、TolB、MalE、lpp、TorA或HylA或杂交分泌标签，该杂交分泌标签包含与第二分泌标签的一部分融合的一个分泌标签的一部分。在一方面，分泌标签附接至胶原蛋白。在另一方面，将分泌标签从胶原蛋白切割。
在一些具体实施方式中，，所述重组人源III型胶原蛋白所述包含组氨酸标签。组氨酸标签或多组氨酸标签是附接至胶原蛋白的2至20个组氨酸残基的序列。组氨酸标签包含2至20个组氨酸残基、5至15个组氨酸残基、5至18个组氨酸残基、5至16个组氨酸残基、5至15个组氨酸残基、5至14个组氨酸残基、5至13个组氨酸残基、5至12个组氨酸残基、5至11个组氨酸残基、5至10个组氨酸残基、6至12个组氨酸残基、6至11个组氨酸残基或7至10个组氨酸残基。组氨酸标签可用于通过使用基于镍的色谱介质的色谱方法来纯化蛋白质。示例性的荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(RFP)。荧光蛋白是本领域众所周知的。在一个实施方案中，胶原蛋白包含GFP和/或RFP。在一个实施方案中，超折叠GFP与胶原蛋白融合。超折叠GFP是即使与弱折叠多肽融合也能正确折叠的GFP。在一方面，组氨酸标签附接至胶原蛋白。在另一方面，将组氨酸标签从胶原蛋白切割。
在一些具体实施方式中，所述重组人源III型胶原蛋白还包含蛋白酶切割位点。蛋白酶切割位点可用于切割重组产生的胶原蛋白以去除多肽的部分。多肽的可被去除的部分包括分泌标签、组氨酸标签、荧光蛋白标签和/或β-内酰胺酶。蛋白酶包括内切蛋白酶、外切蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。示例性的蛋白酶切割位点包括被凝血酶、TEV蛋白酶、因子Xa、肠肽酶和鼻病毒3C蛋白酶切割的氨基酸。在一方面，切割标签附接至胶原蛋白。在另一方面，通过适当的蛋白酶从胶原蛋白或去除切割标签。
所述SEQ ID No.1氨基酸序列对应的多核苷酸即编码如氨基酸序列SEQ ID No.1所示的衣壳蛋白的多核苷酸包括1种或多种即编码前述重组人源III型胶原蛋白的多核苷酸包括1种或多种。在一种具体实施方案中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码前述重组人源III型胶原蛋白。
在一些具体实施方式中，所述多核苷酸还包含如下特征中的一种或多种：
a)所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
b)如SEQ ID No.2具有90％及以上的序列一致性，以及具有a)限定的核苷酸序列的功能的多核苷酸。
进一步地，2)中的多核苷酸具体指：如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体为1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个或1-3个)核苷酸而得到的，或者在5’端和/或3’端添加一个或多个(具体为1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个或1-3个)核苷酸而得到的，且具有核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的多核苷酸的功能的多核苷酸片段，所述b)中的核苷酸序列可与SEQ ID No.2具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的序列一致性。
在一些具体实施方式中，所述多核苷酸包含一个或多个核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示的多核苷酸串联而成的多核苷酸。更具体地，所述核酸构建体包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的多核苷酸串联而成的多核苷酸。优选地，所述多核苷酸包含1-6个核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的多核苷酸串联而成的多核苷酸。
本申请中“多核苷酸”指有脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合形成的多核苷酸，本申请中“核酸”也指代“多核苷酸”。
本发明还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包含前述多核苷酸和骨架质粒。
在一些具体实施方式中，所述骨架质粒选自pET表达载体、pCW表达载体、pUC表达载体、pAO815、pPIC9、pPIC9K、pPIC3.5、pPIC3.5K、pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pGAPZαA、pGAPZαB、pGAPZαC、pPICZ A、pPICZ B、pPICZ C、pGAPZ A、pGAPZ B或pGAPZ C。优选地，所述骨架质粒选自pPIC9K、pPICZα或pGAPZαC。
本申请中骨架质粒也可以称为“质粒骨架”，其为一种环状DNA分子或线性DNA分子，可以在细胞内自主复制和表达插入的目的基因。所述骨架质粒上可以含有调节序列，如启动子、复制子、转录和翻译起始和终止密码子。骨架质粒通常与目的基因连接形成完整的可于细胞中表达特定产出的表达载体。
本发明还提供一种细胞，所述细胞含有前述核酸构建体或前述多核苷酸。
在一些具体实施方式中，所述细胞选自细菌或酵母细胞。更具体地，所述细菌选自大肠杆菌、乳酸杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或链霉菌；所述酵母细胞选自酿酒酵母、假丝酵母、球拟酵母、红酵母、汉逊酵母、毕赤酵母或克鲁维酵母。优选地，所述细胞选自巴氏毕赤酵母。
本发明还提供前述重组人源III型胶原蛋白的制备方法，所述制备方法包含如下步骤的一种或多种：
1)培养前述细胞；
2)诱导步骤1)中细胞目的基因表达，以获得重组人源III型胶原蛋白；
3)分离、纯化步骤2)中的重组人源III型胶原蛋白。
在一些具体实施方式中，步骤1)培养的过程包含以下特征的一种或多种：
1)培养的温度为20-35℃；更具体地，所述培养的温度为20-22℃、22-25℃、25-27℃、27-30℃、30-33℃或33-35℃；优选地，所述培养的温度为25-30℃；
2)培养的pH为3-8；更具体地，所述培养的pH为3-4、4-5、5-6、6-7或7-8；优选地，所述培养的pH为5-6；
3)培养的培养基包含如下成分中的一种或多种：磷酸盐、钙盐、钾盐、镁盐、无机碱、甘油和微量元素。
在一些具体方式中，步骤2)诱导的过程包含以下特征的一种或多种：
1)诱发宿主细胞目的基因表达的物质包含甲醇；
2)诱导的时间为72-144h；更具体地，所述诱导的时间为72-84h、84-96h、96-108h、108-120h、120-132h或132-144h；优选地，所述诱导的时间为96-120h。
在一些具体实施方式中，步骤3)分离、纯化的过程包含如下特征的一种或多种：
1)分离、纯化的温度为0-15℃；更具体地，所述分离、纯化的温度为0-2℃、2-4℃、4-6℃、6-8℃、8-10℃、10-12℃或12-15℃；优选地，所述分离、纯化的温度为4-10℃；
2)分离、纯化的过程包含超滤膜浓缩；更具体地，所述超滤膜过滤的分子大小为20-25kDa、25-30kDa、30-35kDa或35-40kDa；优选地，所述超滤膜过滤的分子大小为25-35kDa；
3)分离、纯化的过程包含层析过程；更具体地，所述层析过程选自吸附层析、分配层析、亲和层析、凝胶层析或离子交换层析。
本发明提供前述重组人源III型胶原蛋白、前述核酸构建体、前述重组人源III型胶原蛋白表达载体或前述宿主细胞在制备在护肤品或组织材料中的用途。
在一些具体实施方式中，所述护肤品为个人护理产品。具体地，所述个人护理产品选自面膜、皮肤清洁剂如肥皂、清洁膏、清洁乳液、清洁乳、洁面扑、洁面乳、洗发水、护发素或沐浴露。
在一些具体实施方式中，所述组织材料选自水凝胶或胶原蛋白海绵。
本发明还提供一种组合物，所述组合物包含前述前述重组人源III型胶原蛋白和至少一种其他成分，所述其他成分包括局部用载体或防腐剂。
在一些具体实施方式中，所述局部用载体包括选自脂质体、可生物降解的微胶囊、乳液、喷雾、气溶胶、粉剂、可生物降解的聚合物、矿物油、甘油三酯油、硅油、甘油、单硬脂酸甘油酯、醇、乳化剂、液体石油、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、蜡、山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚山梨酯、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇、环甲基硅油、环戊硅氧烷和水的局部用载体。防腐剂包括选自生育酚、二碘甲基对甲苯基砜、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、顺式异构体1-(3-氯烯丙基)-3,5,7-三氮杂-1-氮鎓金刚烷氯化物、戊二醛、4,4-二甲基噁唑烷、7-乙基二环噁唑烷、羟苯甲酯、山梨酸、GermabenII、迷迭香提取物和EDTA的防腐剂。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
本发明中所用序列信息如下：
SEQ ID No.1
GLRGGAGPPGPEGGKGAAGPPGPPGAAGERGGLGSPGPKGDKGEPGGPGADGVPGKDGP
RGPTGPIGPPGPAGQPGDKGEGGAPGPRGSPGERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGER
GAPGEKGEGGPPGVAGPPGGSGPAGPPGPQGVKGERGSPGGPGARGLPGPPGSNGNPGPP
GPSGSPGKDGPPGPAGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGMPGPRGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGERGPPGPQ*
SEQ ID No.2
GGTTTGAGAGGTGGAGCTGGACCACCTGGTCCAGAAGGTGGAAAGGGTGCAGCTGGTC
CACCTGGACCTCCAGGTGCTGCTGGTGAACGTGGTGGTTTAGGTTCCCCTGGACCTAAA
GGTGACAAAGGTGAACCAGGCGGACCAGGCGCTGATGGTGTGCCTGGTAAAGACGGT
CCACGTGGTCCAACTGGTCCAATCGGTCCACCTGGACCAGCAGGTCAACCAGGTGATA
AGGGTGAAGGTGGTGCTCCAGGTCCAAGAGGTAGTCCAGGCGAAAGAGGTGAAACCG
GTCCACCAGGTCCAGCTGGTTTCCCTGGTGCACCTGGTCAGAATGGTGAACCTGGTGGT
AAGGGAGAAAGAGGCGCACCAGGTGAGAAAGGTGAAGGCGGACCTCCAGGCGTTGCC
GGACCACCAGGCGGTTCTGGACCTGCTGGACCACCTGGACCACAAGGTGTAAAGGGTG
AGAGAGGTTCACCTGGCGGTCCAGGCGCAAGAGGTTTGCCTGGTCCACCAGGCTCTAA
CGGCAATCCAGGTCCACCAGGTCCATCTGGTTCTCCAGGTAAAGATGGTCCACCTGGTC
CAGCCGGTAATACCGGAGCACCTGGATCACCTGGAGTTTCTGGTCCAAAGGGTGATGC
TGGTCAACCTGGTGAGAAGGGATCTCCAGGCGCTCAAGGTCCACCTGGCGCTCCAGGT
ATGCCTGGACCAAGAGGCTCACCTGGACCTCAAGGTGTTAAAGGCGAATCTGGTAAAC
CAGGTGCTAATGGCTTGTCTGGAGAGAGAGGTCCACCAGGTCCACAASEQ ID NO.5
AGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAATGAAACCTTTTTGCCATCCGACATCC
ACAGGTCCATTCTCACACATAAGTGCCAAACGCAACAGGAGGGGATACACTAGCAGCA
GACCGTTGCAAACGCAGGACCTCCACTCCTCTTCTCCTCAACACCCACTTTTGCCATCG
AAAAACCAGCCCAGTTATTGGGCTTGATTGGAGCTCGCTCATTCCAATTCCTTCTATTA
GGCTACTAACACCATGACTTTATTAGCCTGTCTATCCTGGCCCCCCTGGCGAGGTTCAT
GTTTGTTTATTTCCGAATGCAACAAGCTCCGCATTACACCCGAACATCACTCCAGATGA
GGGCTTTCTGAGTGTGGGGTCAAATAGTTTCATGTTCCCCAAATGGCCCAAAACTGACA
GTTTAAACGCTGTCTTGGAACCTAATATGACAAAAGCGTGATCTCATCCAAGATGAAC
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实施例1单体胶原蛋白菌株的构建与摇瓶发酵
基因筛选：
从NCBI数据库筛选天然人Ⅲ型胶原蛋白氨基酸序列Nature(GenBank:AGL34959.1)进行疏水性分析，选择水溶性、稳定性强的氨基酸序列，整合的新蛋白即为发明的重组Ⅲ型胶原菌株的单体基因C，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
构建表达胶原蛋白宿主菌：
将整合的单体基因C的编码基因送江苏赛索飞生物科技有限公司合成，并克隆到质粒pPIC9K(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)上构成重组载体(昱菘生物部实验室制备)，重组载体通过SacI酶切线性化后分别转化GS115宿主，通过抗生素筛选后得到相应的工程菌。具体操作步骤如下：
(1)电转毕赤酵母细胞GS115
冰浴电转杯，将10μL线性化质粒加入到装有80μL毕赤酵母感受态细胞的1.5mL EP管内，混匀转移至直径为0.2cm电转化杯中，然后把电转杯冰浴5min。电击条件为：电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω，电击时间为4～10msec。电击完成后，将650μL冰上预冷的浓度为1M山梨醇溶液加入到电击转化杯里，用枪头轻轻地吹打溶液均匀。把电转杯中的全部液体转移到新的2ml EP管中，30℃静置培养2h。低速离心收集菌体，全部涂布于MD平板上，30℃恒温培养3～4d。
(2)抗生素筛选
待平板长出菌落，用接种环挑取平板上生长的单菌，影印到含0.5g/L～4g/L G418的YPD固体平板上，30℃恒温培养3～4d
(3)小试表达鉴定
诱导表达：取能耐受4g/L G418的单菌落接种到含有5mLYPD培养基中30℃，220rpm过夜培养，以0.01％的接种量转接到有10ml BMGY的锥形瓶中，30℃，220rpm过夜培养，摇至OD600＝2～6(对数生长，大约16～18h)；室温离心5000rpm离心5min，收集细胞，去除上清，用BMMY重悬细胞至OD600～1，进行诱导表达；每24h加甲醇至终浓度1％继续诱导，诱导总时长为96h，能高产胶原蛋白，SDS-PAGE见图1；
生长培养基：BMGY
物料 浓度 来源
Yeast Extract 10g/L Oxoid
Tryptone 20g/L Oxoid
Glycerol 20g/L 国药
pH 6.0磷酸盐 100mM 分装
YNB 13.4g/L Lab
生物素 4X10-5％ Adamas
诱导培养基：BMMY
物料 浓度 来源
Yeast Extract 10g/L Oxoid
Tryptone 20g/L Oxoid
pH 6.0磷酸盐 100mM 国药
YNB 13.4g/L Lab
生物素 4X10-5％ Adamas
甲醇 0.5％ 国药
实施例2同向串联片段及菌株的构建
将重组质粒pPIC9K-C采用CaC12法转化大肠杆菌DH5α，经过含Kan的LB平板筛选得到含有质粒pPIC9K-C的重组大肠杆菌，命名为DH5α/pPIC9K-C，液体LB培养基过夜培养DH5α/pPIC9K-C提取质粒，得到大量的DH5α/pPIC9K-C,使用含有载体片段的引物(C-F+C-R,核苷酸序列如SEQ ID No.3、4所示)进行PCR核酸电泳图见图2，切胶回收得到2个重复和3个重复的片段；
SEQ ID No.3:C-F GAGAGGCTGAAGCTTACGTAGAATTCGGTTTGAGAGGTGG
SEQ ID No.4:C-R CAGCTCCACCTCTCAAACCTTGTGGACCTGGTGGACCTC
将3个重复的片段重组到线性化的pPIC9K(EcoR I)，得到pPIC9K-3*C的菌株，提质粒得到pPIC9K-3*C。
将PCR得到的2个重复的片段再与线性化的pPIC9K-3*C，得到pPIC9K-5*C的质粒；
将PCR得到的3个重复的片段再与线性化的pPIC9K-3*C重组，得到pPIC9K-6*C，涂到含Kan的LB平板筛选阳性克隆，经过提取筛选到的阳性克隆的质粒并进行酶切电泳检验含有质粒的长度，判断得到的重组大肠杆菌所含有的质粒中包含类人胶原蛋白基因单体的重复数。
将构建好的适当重复数的串联基因克隆到选定的表达质粒中，获得可以转化宿主细胞用于表达的重组质粒，提取质粒即得到大量可用于转化毕赤酵母(Pichia Pastoris)的质粒
转化巴氏毕赤酵母
将上述成功构建的pPIC9K-6*C质粒用Sacl对其进行线性化，转化GS115之后，在MD平板上得到甲醇利用快型(Mut+)重组酵母。通过菌落PCR，可以初步确定，线性化的pPIC9K-6*C己经转化进毕赤酵母GS115，并同源重组入GS115的染色体。
MD平板：
物料 浓度 来源
葡萄糖 20g/L 西王
YNB 13.4g/L Lab
生物素 0.0004g/L Adamas
琼脂粉 20g/L 海博
电转化涂布MD，影印到含不同浓度G418的YPD平板，得到抗G418浓度为4.00g/L的多拷贝重组酵母株。选用其中一株进行表达实验SDS-PAGE见图3。
YPD平板：
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实施例3胶原蛋白菌株的发酵与后处理流程
(1)基因工程菌的发酵培养条件及重组人源III型胶原蛋白诱导表达条件为：
将种子培养基培养的巴氏毕赤酵母按10％接种量加入含分批发酵培养基发酵罐中开始培养，调节搅拌转速为100rpm～600rpm、罐压为0.03～0.07MPa、空气流量为0.2m3/h～0.6m3/h,使溶氧>30％。
其中种子培养基配方为：100mLpH6.0的磷酸缓冲液，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％v/v甘油。
其中发酵罐基础培养基配方为：85％H3PO4 26.7ml/L；CaSO4 0.93g/L；K2SO418.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L,灭菌后再加入PTMI微量元素；其中PTMI微量元素为：CuSO4·5H2O 6.0g/L；NaI 0.08g/L；MnSO4·H2O 3.0g/L；Na2MoO4·2H2O0.2g/L；H3BO3 0.02g/L；CoCl 0.5g/L；ZnC12 20.0g/L；FeSO4·7H2O 65.0g/L；生物素0.2g/L；H2SO4 5.0m1/L，用0.2μm的滤膜过滤除菌，-4℃保存。
当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加补料生长培养基，流加速率为维持溶氧>20％，至菌体湿重达180～220g/L，停止补加甘油，其中补料生长培养基配方为：50％w/v甘油，每升含12mL的PTMI微量元素；
甘油耗尽后补入发酵诱导培养基进行诱导表达，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧>20％，诱导发酵96～120h后，结束发酵，收集发酵液，其中发酵诱导培养基配方为：100％甲醇，每升含12mL的PTMI微量元素。
(2)重组人源胶原蛋白的提取纯化如下
对发酵液进行离心分离，收集上清液，上清液经滤膜过滤后，用凝胶柱层析分离纯化，再经冷冻干燥得到成品。上述人源重组胶原蛋白的具体纯化步骤如下：
对发酵液进行离心分离，转速6500rpm，离心时间20min，收集上清液，
上清液用30kDa超滤膜浓缩洗涤，除盐除色素，最终胶原蛋白溶液电导1.77ms/cm。
取适量上述胶原蛋白溶液用纳微公司的UniGel-80SP树脂柱层析分离纯化，收集含有胶原蛋白的洗脱液，洗脱液用10K分子量超滤膜洗涤脱盐浓缩，最终电导0.48ms/cm。
经冻干机冷冻干燥收集目的蛋白，纯度为98％，胶原蛋白产量为17g/L。HPLC检测谱图见图4。
实施例4重组人源III型胶原蛋白与天然III型胶原蛋白地亲水性比较
分别将重组和天然人源胶原的氨基酸序列提交至ProtScale服务器(https://web.expasy.org/protscale/)进行疏水性计算，计算参数采用默认的Hphob./Kyte&Doolittle，滑窗大小为9，线性加权模型，对重组人源胶原蛋白和天然人源三型α链胶原的氨基酸序列(GenBank accession number：AGL34959.1)进行疏水性分析，评价结果如图5所示，蓝色柱状图为天然胶原，红色折线分别为人工组合设计的重组C胶原片段。亲水用负值表示，疏水用正值表示，亲疏水性评价分值越低，说明其亲水性越好即红色折线所表示的重组C胶原蛋白其亲水性明显好于天然胶原蛋白。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (11)

1.一种重组人源III型胶原蛋白，其特征在于，所述重组人源III型胶原蛋白包含如下特征的一种或多种：
1)所述重组人源III型胶原蛋白包含氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的多肽；
2)与SEQ ID No.1具有90％及以上的序列一致性，以及具有1)限定的氨基酸序列的功能的多肽片段。
2.根据权利要求1所述的重组人源III型胶原蛋白，其特征在于，所述重组人源III型胶原蛋白包含2-6段氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的肽段。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1或2所述的重组人源III型胶原蛋白。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸还包含如下特征中的一种或多种：
a)所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
b)与SEQ ID No.2具有90％及以上的序列一致性，以及具有a)限定的核苷酸序列的功能的多核苷酸。
5.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包含权利要求3或4所述的多核苷酸和骨架质粒。
6.根据权利要求5所述的核酸构建体，其特征在于，所述骨架质粒选自pET表达载体、pCW表达载体、pUC表达载体、pAO815、pPIC9、pPIC9K、pPIC3.5、pPIC3.5K、pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pGAPZαA、pGAPZαB、pGAPZαC、pPICZ A、pPICZ B、pPICZ C、pGAPZ A、pGAPZ B或pGAPZ C。
7.一种细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求3或4所述的多核苷酸或权利要求5或6所述的核酸构建体。
8.根据权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述细胞选自细菌或酵母细胞。
9.根据权利要求8所述的细胞，其特征在于，所述细菌选自大肠杆菌、乳酸杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或链霉菌；和/或，所述酵母细胞选自酿酒酵母、假丝酵母、球拟酵母、红酵母、汉逊酵母、毕赤酵母或克鲁维酵母。
10.权利要求1或2所述的重组人源III型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包含如下步骤的一种或多种：
1)培养权利要求7-9任一所述的细胞；
2)诱导步骤1)中细胞目的基因表达，以获得重组人源III型胶原蛋白；
3)分离、纯化步骤2)中的重组人源III型胶原蛋白。
11.权利要求1或2所述的重组人源III型胶原蛋白、权利要求3或4所述的多核苷酸、权利要求5或6所述的核酸构建体或权利要求7-9任一所述的细胞在制备在护肤品或组织材料中的用途。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001004138A1 (en) * 1999-07-09 2001-01-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Dsra protein and polynucleotides encoding the same
CN111087463A (zh) * 2019-12-28 2020-05-01 河北纳科生物科技有限公司 一种重组人源iii型胶原蛋白及其原核表达方法
CN111363029A (zh) * 2018-12-25 2020-07-03 江苏江山聚源生物技术有限公司 重组人源ⅲ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法
CN112194720A (zh) * 2020-09-16 2021-01-08 叶华 一种重组人源iii型胶原蛋白及其生产方法
CN114276435A (zh) * 2021-12-29 2022-04-05 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种重组人源ⅲ型胶原蛋白及其应用
CN115558612A (zh) * 2021-07-01 2023-01-03 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 重组全长ⅲ型人源化胶原蛋白酵母工程菌株及构建方法
CN116284340A (zh) * 2023-02-01 2023-06-23 美尔健（深圳）生物科技有限公司 基于伴侣肽的透皮增强型重组人源三型胶原蛋白及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001004138A1 (en) * 1999-07-09 2001-01-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Dsra protein and polynucleotides encoding the same
CN111363029A (zh) * 2018-12-25 2020-07-03 江苏江山聚源生物技术有限公司 重组人源ⅲ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法
CN111087463A (zh) * 2019-12-28 2020-05-01 河北纳科生物科技有限公司 一种重组人源iii型胶原蛋白及其原核表达方法
CN112194720A (zh) * 2020-09-16 2021-01-08 叶华 一种重组人源iii型胶原蛋白及其生产方法
CN115558612A (zh) * 2021-07-01 2023-01-03 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 重组全长ⅲ型人源化胶原蛋白酵母工程菌株及构建方法
CN114276435A (zh) * 2021-12-29 2022-04-05 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种重组人源ⅲ型胶原蛋白及其应用
CN116284340A (zh) * 2023-02-01 2023-06-23 美尔健（深圳）生物科技有限公司 基于伴侣肽的透皮增强型重组人源三型胶原蛋白及其应用

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