CN116284340A - 基于伴侣肽的透皮增强型重组人源三型胶原蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于伴侣肽的透皮增强型重组人源三型胶原蛋白，所述透皮增强型重组人源三型胶原蛋白是将伴侣肽通过Linker序列与重组人三型胶原蛋白连接而得到，其中，所述伴侣肽的序列如SEQ ID NO.1所示，且所述伴侣肽通过Linker序列连接在重组人源三型胶原蛋白的N端或C端。本发明还公开了所述的透皮增强型重组人源三型胶原蛋白的应用，编码所述的透皮增强型重组人源三型胶原蛋白的基因序列，以及表达所述的透皮增强型重组人源三型胶原蛋白的重组毕赤酵母工程菌。本发明所获得的融合蛋白可借助其包含的伴侣肽的输运作用促进胶原蛋白穿过皮肤屏障，提高胶原蛋白的皮肤利用度，为皮肤补充胶原蛋白。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基于伴侣肽的透皮增强型重组人源三型胶原蛋白及其应用。
背景技术
胶原蛋白是动物体内含量最丰富的一类蛋白质物质，是支持和保护机体组织的重要构成成分，主要存在于皮肤、骨骼、肌腱、软组织等中，其对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复起着重要作用。胶原蛋白作为天然的生物高分子材料，具有良好的生物相容性、生物可降解性和吸收性、促进细胞形成及促上皮细胞形成等功能，可广泛应用在医学、美容、化妆品、保健品等领域中，其在皮肤损伤修复、整形美容、增强机体免疫力等方面的作用亦已获得共识。
目前胶原蛋白的来源主要包括动物提取和基因工程来源。动物提取的胶原蛋白因可能存在人畜共患疾病，因此在应用可能存在一定风险；基因工程来源的重组胶原蛋白是目前广泛被认可的一种传统胶原蛋白替代产品。目前重组胶原蛋白的分子量普遍较大，在3万～12万道尔顿不等，加上胶原蛋白是一种线性的水溶性大分子，仅通过皮肤涂抹是无法有效被皮肤利用的，所以限制了胶原蛋白在皮肤护理领域的应用。
皮肤是人体最大的器官，其最外层的角质层形成了致密的皮肤屏障，大分子很难通过皮肤被人体吸收。传统的透皮方法包括化学促透剂，包裹技术和物理导入等，都存在一定的弊端。如化学促透剂对皮肤形成一定的伤害，易引起过敏；包裹技术存在包封率，稳定性等问题；物理导入需要破坏皮肤角质层，使用起来也不方便。生物方法是一种全新的给药方式。
伴侣肽是一种信号肽分子，前期的研究发现它能够与皮肤细胞表面的钠钾ATP酶β亚基相互作用，钠钾ATP酶β亚基可调节细胞间的紧密连接。伴侣肽使得表皮棘细胞层中细胞间的间隙发生可逆性的改变，从而实现大分子物质从细胞间隙穿过皮肤屏障而进入皮肤中。伴侣肽只是一种细胞外结合肽，不会被细胞内吞，因此不会将药物携带进入细胞内而导致遗传毒性等。胶原蛋白是一种线性大分子，若胶原蛋白分子从细胞之间渗透穿过皮肤屏障，其分子的空间位置应与皮肤细胞间隙保持一致，而通常这种状态的概率非常小。因此在一个混合体系中，尽管伴侣肽可以一定程度影响皮肤细胞间隙，但是对于线性分子的空间位阻，不会有显著的影响。
融合蛋白是将两个或多个不同功能的蛋白通过柔性氨基酸连接肽连接形成一个多功能蛋白，伴侣肽可作为一种输运载体与不同蛋白结合，从而促进蛋白药物的经皮输运。对于线性大分子，伴侣肽可将分子的一端精准靶向在皮肤细胞的间隙，从而减小线性大分子穿透皮肤屏障时的空间位阻。然而，对于特定的蛋白，由于可以不同的方式连接伴侣肽，因此所能获得的透皮效果仍具有诸多不确定性。
发明内容
本发明中应用了一种新的策略，将伴侣肽以不同的方式连接在线性蛋白的分子端，分别为蛋白的N端(氨基末端)、C端(羧基末端)、以及同时连接在蛋白的N端和C端，以试图在伴侣肽与ATP1B1相互作用时将胶原蛋白的分子位置调整为末端朝向皮肤间隙，从而降低穿透皮肤屏障时的空间位阻。
理论上，在线性蛋白的N端和C端同时连接伴侣肽，对于提升蛋白透皮吸收效率概率最大。然后，实验结果出乎意料，三种不同的连接方式中，对于提升胶原蛋白的透皮吸收效果以C端连接为最佳，N端连接次之，N端和C端同时连接的效果则较差。这可能是由于N端和C端的伴侣肽与皮肤细胞的ATP1B1结合后使得线性结构的胶原蛋白形成较大的空间位阻。而N端或C端的连接模式，可使得线性分子成舒展形式并一段朝向皮肤间隙，从而降低穿透皮肤屏障的空间位阻。
因此，本发明的第一个方面，提供了一种基于伴侣肽的透皮增强型重组人源三型胶原蛋白，所述透皮增强型重组人源三型胶原蛋白是将伴侣肽通过Linker序列与重组人三型胶原蛋白连接而得到，其中，所述伴侣肽的序列如SEQ ID NO.1所示，且所述伴侣肽通过Linker序列连接在重组人源三型胶原蛋白的N端或C端。
根据本发明的优选实施例，所述重组人三型胶原蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示。
根据本发明，所述Linker序列为(GGGGS)n，其中n为1～5。
更好的，所述伴侣肽通过Linker序列连接在重组人源三型胶原蛋白的C端。
根据本发明，基于伴侣肽的透皮增强型重组人源三型胶原蛋白的序列如SEQ IDNO.3所示。
本发明的第二个方面，提供了所述的透皮增强型重组人源三型胶原蛋白的应用，用于制备用于皮肤修复的药品、化妆品或保健品。
本发明的第三个方面，提供了编码所述的透皮增强型重组人源三型胶原蛋白的基因序列。
优选的，所述基因序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第四个方面，提供了一种表达所述的透皮增强型重组人源三型胶原蛋白的重组毕赤酵母工程菌，所述重组毕赤酵母工程菌转化如SEQ ID NO.4所示的基因序列。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明将重组人三型胶原蛋白的序列与伴侣肽序列通过基因合成的方式连接在一起，再将重组基因导入到毕赤酵母菌中进行诱导表达，所获得融合蛋白可借助其包含的伴侣肽的输运作用促进胶原蛋白穿过皮肤屏障，提高胶原蛋白的皮肤利用度，为皮肤补充胶原蛋白。
2、本发明的重组胶原蛋白拥有更好的皮肤吸收功能，其中在线性蛋白的N端或C端连接伴侣肽所获得的重组蛋白能够通过角质结构完整的表皮层，因而可以更好地应用于美容护肤领域，可以在皮肤损伤修复、整形美容等方面应用，例如制成用于皮肤修复的化妆品或保健品等。
附图说明
图1为多拷贝分子克隆示意图。
图2为SDS-PAGE电泳检测蛋白的结果。
图3显示了重组胶原蛋白Tn-Col、Tc-Col、Tnc-Col和商品化的重组胶原蛋白的促进细胞贴壁能力。
图4显示了n＝1,2,3,4,5的重组胶原蛋白Tc-Col和商品化的重组胶原蛋白的促进细胞贴壁能力。
图5为皮肤切片实验的荧光结果。
具体实施方式
下面结合附图，以具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应理解，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的范围。
以下实施例中所使用的培养基，包括MD培养基、YPD培养基、BMGY培养基、BMMY培养基，均为本领域中用于培养毕赤酵母的常用培养基，配方已知，且均可通过常规市售途径获得。
以下实施例中所涉及的分子克隆操作，如未特别说明的，均为本技术领域中的常规操作，或者按产品的操作说明书操作。
实施例1、分子克隆
伴侣肽的序列：Ala--Cys-Ser-Ser-Ser-Pro-Ser-Lys-His-Cys-Gly(SEQ IDNO.1)。
载体：pPic9k或pPicza(上海生工)。
连接方式：N端、C端、N端和C端。
Linker序列：(GGGGS)n，(n为1～5)。
Collagen序列：GenBank:KAI4037253.1。
通过snapgene软件(下载于https://www.snapgene.com/)将伴侣肽序列、Linker序列(n≤5)以及重组人三型胶原蛋白(序列如SEQ ID NO.2所示)连接起来，我们分别设计了将伴侣肽连接在N端(Tn-Col)、C端的(Tc-Col)、以及同时连接在N端和C端(Tnc-Col)，具体见图1。其中，Tc-Col的序列(Linker序列的n＝1)如SEQ ID NO.3所示，对应的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
然后分别采用以下两种方式得到高表达菌株：
1、通过基因合成的方式获得重组人三型胶原蛋白的融合基因片段，再将融合基因片段插入到酵母载体pPic9k中，从而获得重组质粒；然后使用sglII线性化获得的重组质粒，通过DNA回收试剂盒纯化处线性质粒，通过电转化将线性质粒转入到GS115巴斯德毕赤酵母(购自上海生工)感受态细胞中。通过MD培养板筛选出阳性克隆，再通过不同浓度G418筛选出高拷贝菌株。
2、通过基因合成的方式获得重组人三型胶原蛋白的融合基因片段，再将融合基因片段插入到酵母载体pPicza中，从而获得重组质粒；然后使用sglII线性化获得的重组质粒，通过DNA回收试剂盒纯化处线性质粒，通过电转化将线性质粒转入到GS115巴斯德毕赤酵母(购自上海生工)感受态细胞中。使用含有不同浓度博来霉素的YPD平板筛选高表达菌株。
实施例2、发酵表达和纯化
将实施例1获得的高拷贝菌株接入到YPD培养基中，于28℃、220rpm转速震荡培养过夜。第二天取10ml复苏的种子液，按1:100的体积比转接到1升的BMGY培养基中，于28℃、220rpm转速震荡培养，至OD600＝2时离心收集菌体。使用BMMY培养基重悬菌体，继续在28℃、220rpm转速震荡培养，每24小时补充1％甲醇，并取样检测蛋白的表达量。发酵72小时后，将菌液离心收集上清，将上清液用PB缓冲液透析至电导低于2ms/CM为止。
使用CM阳离子交换树脂纯化蛋白。用Q阴离子交换树脂进一步去除微量细胞残留物。将蛋白透析除盐后冷冻干燥成胶原蛋白海绵。冻干海绵可以迅速完全溶解在水中。
将GGGGS(n＝1)的蛋白冻干粉配置成1mg/mL水溶液，SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度及分子量，结果如图2所示。
图2的结果显示：三种模式的胶原蛋白均能在酵母菌中有效表达，并且以可溶性蛋白分泌在发酵液中，经离子交换后蛋白的纯度高，分子量约110KDa，比设计的分子量约大20KDa，这是由于蛋白的糖基化使得分子量比理论值大。
实施例3、细胞活性
将实施例2获得的纯化的重组胶原蛋白Tn-Col、Tc-Col、Tnc-Col、以及商品化的重组胶原蛋白(购自上海生物工程公司)配制成10μg/ml的溶液，往无多聚赖氨酸包被的96孔板中加入每孔100μl的溶液，37℃孵育30分钟，用PBS洗涤两遍。再加入1％BSA，于37℃封闭30分钟后，加入大鼠成纤维细胞(用无血清培养基培养)；1h后轻轻吸取孔中培养基，用PBS轻轻漂洗未吸附的细胞，用CCK8法(上海生工)检测吸附在孔板底部活细胞的数量，验证重组胶原蛋白促进贴壁的活性，结果如图3所示。
图3的结果显示，融合了伴侣肽的重组胶原蛋白均具有显著的促进细胞贴壁能力，说明蛋白具有其特定的生物学活性。
实施例4、不同GGGGS连接序列对蛋白活性的影响
将实施例2得到的纯化的n＝1,2,3,4,5的重组胶原蛋白Tc-Col和商品化的重组胶原蛋白配制成10μg/ml的溶液，往无多聚赖氨酸包被的96孔板中加入每孔100μl的溶液，37℃孵育30分钟，用PBS洗涤两遍。再加入1％BSA，于37℃封闭30分钟后，加入大鼠成纤维细胞(用无血清培养基培养)，1h后轻轻吸取孔中培养基，用PBS轻轻漂洗未吸附的细胞，用CCK8法检测吸附在孔板底部活细胞的数量，验证重组胶原蛋白促进贴壁的活性，结果如图4所示。
图4的结果显示，含有不同长度连接子的胶原蛋白均具有促进细胞贴壁的能力，说明伴侣肽的结构并没有影响胶原蛋白的功能，这可能是胶原蛋白分子量大，而伴侣肽的分子量较小，不足以影响胶原蛋白的分子功能。
实施例5、透皮实验
本实施例通过体内透皮实验，对胶原蛋白是否影响伴侣肽的功能进行了验证。
将实施例2获得的纯化的重组胶原蛋白Tn-Col、Tc-Col、Tnc-Col(n＝1)和商品化的重组胶原蛋白(购自上海生物工程公司)配制成1mg/ml的溶液，用FITC标记试剂盒(购自invitrogen)将蛋白标记上FITC荧光。通过纯化冻干制备FITC-COLLAGEN冻干粉。再用生理盐水配制1mg/ml的FITC标记胶原蛋白溶液。
将SD大鼠麻醉，用脱毛膏去除腹部毛发，清水洗净皮肤后，去100μl将荧光标记的胶原蛋白涂抹在皮肤上，每10分钟增加一次涂抹，共计涂抹3次，每次100μl。4个小时后，轻轻擦去皮肤表面残留的荧光蛋白。通过心脏取血处死大鼠，然后用刀片将与蛋白接触的皮肤切下。用OCT包埋剂进行冷冻包埋。用冷冻切片机将皮肤切片成8μm的薄片。在皮肤上滴加10μl DAPI染色液(蓝色)，在荧光显微镜下进行观察和拍照，结果如图5所示。
图5的荧光结果显示：对照组仅有部分区域有少数荧光蛋白渗透，且与含有伴侣肽的胶原蛋白均有荧光蛋白显著性渗透，其中Tnc-Col主要集中在表皮层中，Tn-Col不仅可以进入表皮层，同时可以通过毛囊途径渗透，Tc-Col具有更多的皮肤渗透和毛囊渗透能力，在真皮层中具有一定的渗透量。
实施例6、伴侣肽序列突变研究
本实施例通过对伴侣肽序列进行部分氨基酸突变，检测伴侣肽氨基酸突变对胶原蛋白透皮吸收效率的影响。
由于肽伴侣两端的半胱氨酸需要环化形成环，因此中间的7个氨基酸决定了它的功能，我们通过将其中的氨基酸置换成最简单的氨基酸丙氨酸，并将突变的氨基酸序列连接在胶原蛋白N端，再通过实施例5的方法对序列突变的伴侣肽进行透皮实验验证，结果如以下表1所示。
表1：伴侣肽序列突变对透皮效率的影响
表1的结果显示，将伴侣肽的序列突变后，其透皮效率显著降低，说明伴侣肽具有序列特异性。
综上所述，三种不同的连接方式中，对于提升胶原蛋白的透皮吸收效果以C端连接为最佳，N端连接次之，N端和C端同时连接的效果则较差，基本没有应用价值。因此，本发明的以C端连接或N端连接伴侣肽的重组胶原蛋白(Tn-Col和Tc-Col)拥有较好的皮肤吸收功能，能够通过角质结构完整的表皮层，尤其以Tc-Col为最佳，可以很好的应用于美容护肤领域。伴侣肽具有典型的序列特异性，改变其序列结构，都将引起透皮活性的降低。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
序列表信息:
DTD版本:V1_3
文件名:231002序列表.xml
软件名称:WIPO Sequence
软件版本:2.1.1
生成日期:2023-01-06
基本信息:
当前申请/申请人档案名:231002
申请人姓名或名称:美尔健(深圳)生物科技有限公司
申请人姓名或名称/语言:zh
申请人姓名或名称/拉丁名称:MELLGEN
发明名称:基于伴侣肽的透皮增强型重组人源三型胶原蛋白及其应用(zh)
序列总量:4
序列:
序列号(ID):1
长度:11
分子类型:AA
特征位置/限定符:
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>organism,synthetic construct
残基:
ACSSSPSKHC G 11序列号(ID):2
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序列号(ID):4
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分子类型:DNA
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-source,1..3468
>mol_type,other DNA
>organism,synthetic construct残基:
Claims (9)
1.一种基于伴侣肽的透皮增强型重组人源三型胶原蛋白，其特征在于，所述透皮增强型重组人源三型胶原蛋白是将伴侣肽通过Linker序列与重组人三型胶原蛋白连接而得到，其中，所述伴侣肽的序列如SEQ ID NO.1所示，且所述伴侣肽通过Linker序列连接在重组人源三型胶原蛋白的N端或C端。
2.根据权利要求1所述的透皮增强型重组人源三型胶原蛋白，其特征在于，所述重组人三型胶原蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的透皮增强型重组人源三型胶原蛋白，其特征在于，所述Linker序列为(GGGGS)n，其中n为1～5。
4.根据权利要求1所述的透皮增强型重组人源三型胶原蛋白，其特征在于，所述伴侣肽通过Linker序列连接在重组人源三型胶原蛋白的C端。
5.根据权利要求4所述的透皮增强型重组人源三型胶原蛋白，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.3所示。
6.权利要求1～5任一项所述的透皮增强型重组人源三型胶原蛋白的应用，其特征在于，用于制备用于皮肤修复的药品、化妆品或保健品。
7.编码权利要求1～5中任一项所述的透皮增强型重组人源三型胶原蛋白的基因序列。
8.根据权利要求7所述的基因序列，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO.4所示。
9.一种表达权利要求1～5中任一项所述的透皮增强型重组人源三型胶原蛋白的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述重组毕赤酵母工程菌转化有权利要求7或8所述的基因序列。
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