CN117120466A - 治疗用重组ii型胶原 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于人类或动物患者软骨疾病口服疗法的重组II型胶原，特别是非变性重组II型胶原。

Description

治疗用重组II型胶原

技术领域

本发明涉及用于人体或动物体软骨疾病口服疗法的重组II型胶原。

背景技术

胶原是一种哺乳动物、鸟类和鱼类等动物体内的细胞外结构蛋白，一般存在于结缔组织中，特别是作为细胞外基质的组成部分。肌腱、韧带、软骨和骨骼富含胶原。植物和单细胞生物中却非天然存在胶原。

胶原呈现各种结构和功能不同的类型，在结构、功能和来源等方面存在差异。构成胶原的多肽链在细胞中呈较大前体分子的形式在内质网的核糖体上单独合成，并具有大范围的重复(Gly-X-Y)n序列，其中X和Y可以是任何氨基酸，但一般是脯氨酸和4-羟脯氨酸。

这些前体多肽链在内质网中翻译后羟基化为多肽链的脯氨酸残基和赖氨酸残基，形成羟脯氨酸残基和羟赖氨酸残基。羟基化用于稳定细胞中各由三条前体多肽链(前胶原)形成的右旋三螺旋的相邻胶原多肽链。

这样形成的前胶原在细胞内糖基化，由细胞以糖基化三螺旋形式(前胶原)分泌，然后通过肽酶介导的末端残基裂解形成成熟胶原。这种胶原在原纤维形成过程中装配成胶原原纤维，然后共价交联形成胶原纤维。

胶原常以变性形式使用(有时称为明胶)或以其水解物的形式使用。

如果对明胶或胶原进行水解过程(特别是酶解)来获得胶原肽，则可根据所用胶原的类型及其来源以及酶促条件来生产具有多种组成和应用概况的胶原水解物。然而，此类胶原水解物是肽混合物，其分子量分布在一定的大小范围内。这种胶原水解物的用途早已为人所知，例如用作营养补充剂或作为美容辅助剂，包括用于预防和/或治疗骨骼、关节或结缔组织相关病症。

专利文献WO 2012/065782描述了获自猪皮明胶的胶原水解物，用于刺激皮肤细胞的细胞外基质蛋白的生物合成，特别适合美容目的。专利文献WO 2012/117012公开了来自牛裂解物的平均分子量为1500-8000Da的酶解胶原，可以与益生元合用来预防和/或治疗骨质疏松症。

尽管采用获自动物材料的胶原或胶原水解物有益于许多应用和消费者群体，但对于某些消费者群体和应用概况而言，采用这种方式获得的胶原水解物也可能不太理想。某些消费者群体根本对获自动物材料的原材料持批评或消极态度，原因是担心沾染危害健康的微生物或制剂(例如加工添加剂)或不良的免疫反应，或者出于宗教或道德因素。此外，用于获得来自动物材料的胶原水解物的制造过程通常涉及复杂又昂贵的消化、纯化和再加工步骤。

在此背景下，开发出利用重组基因技术通过生物技术手段生产明胶、胶原、胶原水解物和单独胶原肽的工艺也不足为奇。

专利文献WO 2006/052451A2公开了在同样表达人源脯氨酰羟化酶的Pichiapastoris(毕赤酵母)菌株中生产重组III型胶原。专利文献WO 2005/012356A2公开了从人源I型胶原以及单独的50kDa、65kDa和100kDa胶原肽种生产明胶(各呈完全羟基化、部分羟基化和非羟基化形式)。Olsen等人(Protein Expression and Purification，2005年第40期第346-357页)公开了在Pichiapastoris中从人源胶原的α1链重组产生8.5kDa胶原肽种。专利文献WO 01/34646A2还公开了生产由重组生产途径产生、具有高达350kDa的限定分子量的重组明胶个体种，可以呈非羟基化、部分羟基化或完全羟基化的形式。

II型胶原是一种专门存在于软骨组织中的胶原，一般呈α1链同源三聚体的形式。例如，专利文献US 5,593,859描述了重组II型胶原肽的生产、借助脯氨酰-4-羟化酶将其羟基化并将其氢化形成前胶原以及相关的三螺旋形成。

专利文献US5,399,347描述了口服天然来源的高度纯化水溶性II型胶原来治疗关节炎。然而，这种胶原的生产极其困难又耗时，而且容易受到污染，尤其是微生物污染。

专利文献US5,750,144、US5,645,851、US5,529,786和US5,637,321揭示了提供含有II型胶原的含动物组织的组合物，口服施用来治疗类风湿性关节炎。这些文献尤其公开了采用含有获自天然动物来源的软骨组织材料，以便借助各种化学/物理工艺步骤获得含II型胶原的组合物。这样获得的含II型胶原的组合物的特征在于，既存在非变性的II型胶原，又存在若干源自原料和分离工艺的次要组分，特别是蛋白质、抗原和盐。尽管提供此类组合物所需的工艺步骤要比从天然来源生产高度纯化II型胶原所需的工艺步骤更为简单，但由于其来自天然来源，所生产的制剂因原料而异。此外，在整个生产加工过程中必须确保组合物中所含的II型胶原不变性并避免病原体污染。

专利文献US7,083,820和EP1435906公开了采用获得含动物组织的组合物的方法，所述组合物含有非变性的II型胶原，其中通过特殊的工艺步骤消除了微生物污染物，但要同时保留II型胶原的原始非变性形式。

即使考虑到大部分人口(尤其是老年人)对健康、活动和健身的需求日益增长，仍然亟需食品、营养补充剂和药品组合物来改善和/或维持软骨健康和治疗软骨疾病。

发明内容

有鉴于此，本发明面临提供II型胶原的技术问题，克服了前述缺点，特别是能够采取标准、可靠、明确的形式生产，甚至能以更大的高效益工业规模生产，又因其生物有效性而适用于口服治疗人体或动物体软骨疾病和/或维持软骨健康的方法。

为了解决根本技术问题，本发明提出了独立权利要求的教导，特别是说明书和从属权利要求中优选实施方案的教导。

本发明涉及一种用于人类或动物患者软骨疾病口服疗法的重组II型胶原，特别是非变性重组II型胶原。

本发明是基于如下出乎预料的教导：重组生成、尤其是分离形式的II型胶原在口服施用后能够治疗软骨疾病。尽管并未采用或执行现有技术中生产治疗效用的II型胶原组合物所必需的材料和工艺步骤，特别是利用天然动物软骨组织和采用某些工艺步骤来维持该起始组织中所含胶原的天然性，此外，原料中所含的次要组分不会存在于本发明提供的重组生成的II型胶原中，可以证实根据本发明方法重组产生的II型胶原的生物有效性，特别是出乎预料的高生物有效性。出乎预料地，本发明提出的重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽能够表现出生物有效性，特别是与获自天然来源的II型胶原至少相同的生物有效性，尤其是提高了生物有效性。优选实施方案中，由于重组II型胶原、特别是II型胶原肽在极低剂量下(即低浓度II型胶原、特别是II型胶原肽)表现出高生物有效性，本发明能够治疗人类或动物患者的软骨疾病。

特优选实施方案中，本发明提出的重组II型胶原、特别是II型胶原肽能够治疗免疫调节类软骨疾病，特别是自身免疫性疾病，尤其是多发性软骨炎或类风湿性关节炎。

特优选实施方案中，免疫调节类软骨疾病是免疫不耐受特点的疾病。

本发明还涉及用于治疗软骨疾病的重组II型胶原，特别是重组II型胶原肽，上述软骨疾病可能是软骨炎症和/或软骨退变，特别是类风湿性关节炎或关节病。

本发明又涉及用于诱导口服耐受性、特别是诱导内源性胶原(特别是内源性II型胶原，尤其是存在于软骨组织内的内源性II型胶原)口服耐受性的重组II型胶原，特别是重组II型胶原肽。

本发明具体涉及重组II型胶原(特别是重组II型胶原肽)以及包含重组II型胶原(特别是重组II型胶原肽)的组合物，用于治疗性处置或治疗性预防II型胶原免疫不耐受、特别是通过诱导II型胶原免疫耐受性的方法。

本发明还涉及用于II型胶原免疫耐受性诱导方法的重组II型胶原，特别是重组II型胶原肽，尤其是涉及施用导致诱导II型胶原口服耐受性的组合物。

本发明教导有利地提供了一种用于口服治疗软骨疾病的可用生物技术生产的可复制重组II型胶原，这种重组II型胶原能够采取标准化方式生产，能够以工业规模进行生产，不受天然原料的限制，可生产出无污染的高纯度高产量产品，尤其因其高生物有效性而呈现可低剂量使用的特点。

本发明采用的重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽的特征在于，在人体或动物体内口服施用后发挥的生物有效性，特别是调节免疫和/或调节炎症的生物有效性。特优选实施方案中，这种生物有效性尤其发生在呈非变性形式(即天然形式)的全长重组II型胶原上，但优选实施方案中，也发生在呈重组II型胶原肽形式的缩短胶原肽上。

优选地，本发明提出的II型胶原、特别是II型胶原肽能够实现免疫调节和/或诱导口服耐受，特别是在所治疗的人体或动物体中引起免疫应答和/或诱导口服耐受。

本发明提出的重组II型胶原优选地表现出抑制免疫球蛋白合成的生物有效性和/或抗炎生物有效性。因此，根据本发明可以减少促炎细胞因子，刺激抗炎细胞因子。不受理论束缚，本发明提出的重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽口服施用后可在胃肠道中完全或基本无损地存活，在免疫调节细胞、特别是免疫抑制细胞、尤其是派尔斑细胞中触发免疫调节反应和/或细胞因子调节反应和/或信号级联，从而减少或完全防止软骨区域(特别是关节软骨)的不良免疫反应和炎症过程。

众所周知，存在于受损或退变软骨组织之中或之上的内源性II型胶原或其片段可以诱导自身免疫反应，导致软骨中出现炎症、形成免疫球蛋白以及退变和破坏过程，从而造成进一步软骨破坏和退变，最终出现骨关节炎、类风湿性关节炎和类似疾病。本发明提出的口服施用重组II型胶原、特别是II型胶原肽貌似带来了针对引发此类不良反应的内源性II型胶原的口服耐受性，从而能够治疗软骨疾病。

本发明提出的重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽优选地具备与所治疗人或动物患者的细胞、特别是与派尔斑细胞相互作用的能力，尤其是刺激抗炎并抑制促炎细胞因子和抑制免疫球蛋白。

本发明提出的重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽优选地对外周血单核细胞分化成免疫抑制性M2巨噬细胞表现出诱导作用。

更优选实施方案中，本发明提出的重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽会减少炎症细胞因子(特别是TNFα和IFNτ)的合成并且/或者诱导抗炎细胞因子(特别是IL-10)的合成。

根据本发明优选实施方案，本发明提出的重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽会刺激/诱导原初CD4⁺T前体细胞分化成T抑制细胞。特别优选地，刺激/诱导原初CD4⁺T前体细胞分化成T抑制细胞会增强抗炎细胞因子(优选IL-10、IL-4和/或TGF-β)的释放。

本发明优选实施方案中，本发明提出的重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽会减少软骨细胞、特别是关节软骨细胞表达促炎细胞因子(优选IL-1β、TNFα和/或IL-6)。

本发明特优选实施方案中，所述重组II型胶原呈非变性形式，即天然形式。

本发明特优选实施方案中，所述重组II型胶原呈三螺旋形式。

优选实施方案中，本发明提出了一种重组II型胶原，可呈II型胶原肽形式(即单链形式)或例如二链形式或三链形式(又称螺旋形式)等多链形式，特别是II型前胶原或II型成熟胶原形式，尤其是II型α1链同源三聚体形式。

如果根据本发明的重组II型胶原不呈单链II型胶原肽，而是例如呈三螺旋形式，则根据本发明可以体现出构成重组II型胶原三螺旋形式的某个或所有个体胶原肽。具体而言，本发明教导中公开的关于重组II型胶原肽的陈述也适用于具有一条、两条或三条这种单链II型胶原肽的II型胶原，特别是完全由这些单链胶原肽构建的II型胶原，尤其是由根据本发明的重组型II胶原肽组成。

特优选实施方案中，所述重组II型胶原可以是II型牛胶原(IIB型胶原)。

另一特优选实施方案中，所述重组II型胶原可以呈II型前胶原或II型成熟胶原形式。

又一特优选实施方案中，所述重组II型胶原可以呈三螺旋形式，特别是三条II型α1链的同源三聚体形式。

特优选实施方案中，所述重组II型胶原呈非变性形式，又称天然形式，即具有天然存在的蛋白质三级结构和蛋白质四级结构。

特优选实施方案中，所述重组II型胶原可以呈交联或非交联原纤维形式。

特优选实施方案中，所述重组II型胶原、特别是II型胶原肽可以是全长胶原肽，即具有天然存在II型胶原肽的完整氨基酸序列。

另一特优选实施方案中，所述重组II型胶原呈II型胶原肽形式。

特优选实施方案中，所述重组II型胶原、特别是II型胶原肽可以是分子量范围为5-400kDa、特别是10-390kDa、特别是10-350kDa、特别是10-300kDa、特别是10-110kDa、特别是40-110kDa、特别是40-100kDa、特别是11-105kDa、特别是15-100kDa、特别是20-99kDa、特别是25-95kDa、特别是30-95kDa、特别是35-95kDa的II型胶原肽。优选地，所述重组II型胶原、特别是II型胶原肽的分子量范围为40-50kDa，特别是45kDa。

特优选实施方案中，所述重组II型胶原肽可以呈三螺旋形式。

特优选实施方案中，本发明的重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽呈完全或部分羟基化、完全或部分糖基化或者完全或部分羟基化且糖基化。

特优选实施方案中，根据本发明的重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽是非羟基化的II型胶原、特别是II型胶原肽。

更优选实施方案中，根据本发明的重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽是羟基化的II型胶原、特别是II型胶原肽。

优选地，所述重组II型胶原、特别是重组产生的II型胶原肽具有羟基化脯氨酸和/或羟基化赖氨酸。

优选地，所述重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽是非羟基化、部分羟基化或完全羟基化的II型胶原、特别是II型胶原肽。

根据本发明优选实施方案，所述重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽呈糖基化。优选地，所述重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽在至少一个羟基化赖氨酸上糖基化。优选地，所述重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽的每个羟基化赖氨酸呈糖基化。

本发明优选实施方案中，所述重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽无氨基酸修饰，特别是无羟基化。特别优选地，所述重组II型胶原、特别是II型胶原肽不具有任何羟基化和/或糖基化的氨基酸。

优选地，根据本发明的II型胶原、特别是II型胶原肽具有来自脊椎动物(特别是鱼类、两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物，特别是猪、羊、牛、啮齿动物、袋鼠、马)或来自无脊椎动物(特别是水母)的II型胶原中出现的氨基酸序列，特别是来自牛的II型胶原中出现的氨基酸序列。

特别优选地，所述II型胶原、特别是II型胶原肽包含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。优选地，所述II型胶原、特别是II型胶原肽由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成。

本发明更优选实施方案中，所述II型胶原、特别是II型胶原与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少96有％、优选至少97％、优选至少98％、优选至少99％的序列一致性。

根据本发明更优选实施方案，所述II型胶原、特别是II型胶原肽包含SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。优选地，所述II型胶原、特别是II型胶原肽由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成。

本发明更优选实施方案中，所述II型胶原、特别是II型胶原肽与SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列具有至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选至少98％、优选至少99％的序列一致性。

优选地，所述重组II型胶原、特别是II型胶原肽的氨基酸序列是天然存在的II型胶原、特别是II型胶原肽的氨基酸序列。优选地，所述重组II型胶原、特别是II型胶原肽的氨基酸序列是非天然存在的II型胶原、特别是II型胶原肽的氨基酸序列。优选地，所述重组II型胶原、特别是II型胶原肽的氨基酸序列是基因修饰的II型胶原、特别是II型胶原肽的氨基酸序列。

特别优选地，根据本发明的II型胶原、特别是II型胶原肽具有非人胶原，特别是非人II型胶原肽，优选地存在于非人II型胶原的α1链中的氨基酸序列，特别是存在于牛、猪、马、羊、鱼类或禽类胶原中的氨基酸序列，特别是存在于牛胶原中的氨基酸序列。

本发明优选实施方案中，所述重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽抗胶原酶，特别是抗人胶原酶消化。

根据本发明更优选实施方案，所述重组II型胶原、特别是II型胶原肽能够诱导口服耐受性，特别是针对内源性胶原，特别是内源性II型胶原，特别是软骨组织中内源性II型胶原。

根据本发明更优选实施方案，所述重组II型胶原、特别是II型胶原肽能够抑制免疫球蛋白的合成。

根据本发明更优选实施方案，所述重组II型胶原、特别是II型胶原肽能够抑制促炎细胞因子的合成。

根据本发明更优选实施方案，所述重组II型胶原、特别是II型胶原肽能够刺激抗炎细胞因子的合成。

根据本发明更优选实施方案，所述重组II型胶原、特别是II型胶原肽能够抑制免疫球蛋白的合成、抑制促炎细胞因子的合成并抑制抗炎细胞因子的合成。根据本发明优选实施方案，所述用于人类或动物患者软骨疾病口服疗法的重组II型胶原、特别是II型胶原肽的分子量范围为5-400kDa，特别是10-390kDa，特别是10-350kDa，特别是10-300kDa，特别是10-110kDa，特别是40-110kDa，特别是40-100kDa，特别是11-105kDa，特别是15-100kDa，特别是20-99kDa，特别是25-95kDa，特别是30-95kDa，特别是35-95kDa。重组II型胶原的分子量优选为40-50kDa范围内，特别是45kDa。

本发明优选实施方案中，根据本发明的重组II型胶原、特别是II型胶原肽在本发明用途中单独使用，即采取分离形式，即不含其他物质。

本发明优选实施方案中，根据本发明的重组II型胶原、特别是II型胶原肽作为分子量均匀的均质制剂，特别是作为单一重组II型胶原、特别是II型胶原肽的均质制剂。

本发明另一实施方案中，根据本发明的重组II型胶原、特别是II型胶原肽在本发明用途中用作唯一具有生物有效性的物质。

特优选实施方案中，本发明涉及包含至少一种重组II型胶原、特别是至少一种重组II型胶原肽的组合物，该组合物除了至少一种重组II型胶原、特别是至少一种重组II型胶原肽以及任选地可药用和/或可食用的载体之外，不含任何其他物质。

特优选实施方案中，所述包含至少一种重组II型胶原、特别是至少一种重组II型胶原肽的组合物是一种适合人体或动物体内口服施用的剂型。

本发明还涉及一种组合物，包含根据本发明的至少一种重组II型胶原、特别是至少一种重组II型胶原肽和至少一种可药用和/或可食用载体以及任选地至少一种用于软骨疾病口服疗法的添加剂或赋形剂。

有鉴于此，本发明还涉及一种组合物，用于通过诱导II型胶原、特别是内源型II型胶原的口服耐受性来治疗性预防或治疗性处置II型胶原、特别是内源性II型胶原的免疫不耐受反应的方法。

本发明还涉及一种组合物，用于诱导II型胶原、特别是内源性II型胶原的口服耐受性的方法，该组合物促使在人体或动物体内诱导口服耐受性。

本发明还涉及一种包含重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽、特别是药物组合物或营养补充剂或者食品或嗜好品的组合物，用于诱导II型胶原、特别是内源性II型胶原的口服耐受性。

根据本发明用于口服施用的组合物尤其可以是药物组合物、营养补充剂或食品和嗜好品。特别地，根据本发明的组合物是药物组合物。特别地，根据本发明的组合物是营养补充剂。

本发明特别是涉及一种包含根据本发明的II型胶原、特别是II型胶原肽和至少一种可药用载体的药物组合物以及用于治疗性处置人体或动物体软骨疾病的方法的药物组合物。这便提出，根据本发明采取药物组合物形式施用的II型胶原，特别是II型胶原肽。特别有利地，本发明的药物组合物例如采取片剂、含片、咀嚼片、粉末、颗粒、硬胶囊、软胶囊、胶囊、咬胶囊、糖衣丸、锭剂、挤出物、液剂、混悬剂、凝胶或软膏的形式施用。

本发明特优选实施方案中，根据本发明使用的II型胶原、特别是II型胶原肽是能够延缓肠道释放的剂型，特别是缓释胶囊。

特优选实施方案中，根据本发明的组合物呈适合口服施用的形式，特别是按1-60mg/天、特别是5-50mg/天剂量的重组II型胶原。

本发明还涉及一种包含根据本发明的II型胶原、特别是II型胶原肽和至少一种可食用载体的营养补充剂以及用于治疗性处置人体或动物体软骨疾病的方法的营养补充剂。这便提出，根据本发明的II型胶原、特别是II型胶原肽采取营养补充剂的形式施用。特别有利地，根据本发明的营养补充剂作为硬胶囊、软胶囊、胶囊、咬胶囊、片剂、糖衣丸、锭剂、药包、挤出物、溶液、混悬剂或凝胶，例如在安瓿中，作为颗粒或粉末。

本发明还涉及一种包含根据本发明的II型胶原、特别是II型胶原肽的食品或嗜好品以及用于治疗人体或动物体软骨疾病的方法的食品或嗜好品。根据优选实施方案，所述食品或嗜好品是巧克力棒、蛋白棒、谷物棒、用于制备饮品的速溶粉、牛奶、乳制品(例如酸奶、乳清或凝乳)以及代乳品(例如豆奶、米浆、杏仁奶和椰奶)、功能性食品或饮品(例如清凉饮料或健身饮料)。

如果根据本发明优选实施方案的重组II型胶原、特别是II型胶原肽不用作组合物、特别是药物组合物、营养补充剂或者食品或嗜好品的唯一生物有效性成分，它可以与一种或多种其他添加剂或赋形剂组合，特别是那些对一般健康、特别是软骨健康和/或耐力表现具有积极影响的添加剂或赋形剂。根据本发明优选的赋形剂选自下组：维生素C、B、D、E和K系维生素、omega-3脂肪酸、omega-6脂肪酸、共轭亚麻酸、咖啡因及其衍生物、瓜拉那提取物、玫瑰果提取物、绿茶提取物、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechingallate)、肌酸、L-肉碱、α-硫辛酸、N-乙酰半胱氨酸、NADH、D-核糖、天冬氨酸镁、抗氧化剂(如花青素、类胡萝卜素、类黄酮、白藜芦醇、谷胱甘肽和超氧化物歧化酶)、矿物质(如铁、镁、钙、锌、硒和磷)以及其他蛋白质、水解物和肽(如大豆蛋白、小麦蛋白和乳清蛋白)。

特优选实施方案可以提出，根据本发明的组合物、特别是药物组合物、营养补充剂或者食品或嗜好品具有赋形剂，例如软骨素、硫酸软骨素、透明质酸、Aflapin、Univestin、5-Glocsin、葡萄糖胺、硫酸葡萄糖胺和/或甲磺酰甲烷(MSM)。

更优选实施方案可以提出，根据本发明的组合物、特别是药物组合物、营养补充剂或者食品或嗜好品具有添加剂，该添加剂是重组生成的胶原水解物、源自天然来源的胶原水解物、重组生成的I型胶原、天然来源的I型胶原或其组合。

本发明更优选实施方案中，本发明的产品、特别是药物组合物、营养补充剂或者食品或嗜好品除了本发明的II型胶原之外还特别是包含II型胶原肽，不含其他蛋白质或肽，特别是不含其他胶原肽。

本发明还涉及一种治疗、特别是预防和/或处置软骨疾病的方法，根据该方法，向人体或动物体施予足以达到治疗目的用量的至少一种根据本发明的重组II型胶原、特别是II型胶原肽来，必要时与载体和任选的赋形剂或添加剂一起口服施用。

本发明还涉及一种在人体或动物体内诱导II型胶原、特别是内源性II型胶原的口服耐受性的方法，包括施用足以达到治疗目的用量的至少一种根据本发明的重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽，必要时借助载体和任选地赋形剂或添加剂，其中进行口服施用。

本发明还涉及一种用于治疗性处置或治疗性预防II型胶原、特别是II型胶原肽的免疫不耐受的方法，包括口服施用足以达到治疗目的用量的至少一种根据本发明的重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽，必要时借助载体和任选地赋形剂或添加剂。

本发明还涉及重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽在维持人类或动物软骨健康的非治疗性方法中的用途，根据该方法，向人体或动物体口服施用足以维持软骨健康用量的至少一种根据本发明的重组II型胶原、特别是II型胶原肽，必要时借助载体和任选地赋形剂或添加剂。这个本发明特优选实施方案中，人类或动物未患有任何软骨疾病。特优选实施方案中，可以向未患有软骨疾病的人类或动物提供重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽的口服施用，并且通过施用重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽，维持软骨健康。

另外，本发明涉及一种用于生产根据本发明可用的重组II型胶原、特别是II型胶原肽的方法，包括以下方法步骤：

a)提供具有至少一个表达盒的表达系统，该表达盒具有至少一个编码II型胶原、特别是II型胶原肽的核苷酸序列；

b)在能够表达II型胶原、特别是II型胶原肽的条件下培养表达系统；

c)获得根据本发明的II型胶原、特别是II型胶原肽。

本发明提出的用于产生根据本发明可用的重组II型胶原、特别是II型胶原肽的方法，其特征尤其在于：获得了一种精确定义、重组产生的II型胶原，特定是II型胶原肽，尤因其生物有效性而适合用于治疗人体或动物体软骨疾病或维持软骨健康的方法。

相较于从天然来源水解获得的II型胶原、特别是II型胶原肽，本发明提出的II型胶原、特别是II型胶原肽因其重组制法而具有极高的纯度。根据本发明的II型胶原、特别是II型胶原肽可以在各种表达系统中提供，甚至可按工业规模提供，而不会产生不良污染，同时具有生物有效性的优势。

重组II型胶原及其生产例如可参阅专利文献US 5,593,859。该文献公开了获得重组II型胶原肽以及在重组细胞培养物中获得前胶原的羟基化和原纤维形成，本公开内容完全涵盖关于重组II型胶原和重组II型胶原肽(尤其是羟基化和三螺旋形式)的生产过程。

优选实施方案中，根据本发明的方法直接获得的II型胶原、特别是II型胶原肽无需进一步加工步骤，就已有利地赋予根据本发明的II型胶原、特别是II型胶原肽的生物有效性以及与之相关的生物有效性或用于治疗人体或动物体软骨疾病的方法的适用性。根据本发明，优选实施方案中，羟基化和非羟基化II型胶原、特别是II型胶原肽皆具生物有效性，特别是与获自天然来源的II型胶原至少相同的生物有效性，特别优选地与获自天然来源的II型胶原相比更佳的生物有效性。

这里特别有利地，根据本发明的II型胶原、特别是II型胶原肽即使在非羟基化形式下也会出乎预料地具有生物有效性，优选地与获自天然来源的II型胶原相同的生物有效性，特别优选地与获自天然来源的II型胶原相比更佳的生物功效。

根据本发明，羟基化和非羟基化II型胶原、特别是II型胶原肽优选地展现生物有效性，优选地至少与获自天然来源的II型胶原相同的生物有效性，特别优选地与获自天然来源的II型胶原相比更佳的生物有效性。

步骤a)中提供的表达系统优选为宿主细胞，特别是原核或真核细胞。

优选地，表达系统是选自下组的宿主细胞：细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物细胞。

优选地，表达系统、特别是宿主细胞是细菌细胞，特别是Escherichia coli(大肠杆菌)或Bacillus subtilis(枯草芽孢杆菌)种的细菌细胞。

更优选实施方案中，表达系统、特别是宿主细胞是酵母细胞，特别是Saccharomyces cerevisiae(酿酒酵母)、Pichia pastoris(巴斯德毕赤酵母)或Ogataeaangusta(Hansenulapolymorpha)种的酵母细胞，特别是Pichiapastoris(巴斯德毕赤酵母)。

优选地，表达系统、特别是宿主细胞是真菌细胞，特别是Aspergillus niger(黑曲霉)种的真菌细胞。

本发明更优选实施方案中，表达系统、特别是宿主细胞是哺乳动物细胞，特别是CHO细胞、HeLa细胞或HEK293细胞。

优选地，表达系统、特别是宿主细胞是昆虫细胞，特别是Sf-9细胞、Sf-21细胞或Tn-5细胞。

优选地，表达系统、特别是宿主细胞是植物细胞，特别是玉米细胞或烟草细胞。

本发明更优选实施方案中，步骤a)中提供的表达系统是能够使表达胶原肽的脯氨酸、赖氨酸或脯氨酸残基和赖氨酸残基羟基化的宿主细胞。优选地，步骤a)中提供的表达系统是不能使表达胶原肽的脯氨酸、赖氨酸或脯氨酸残基和赖氨酸残基羟基化的宿主细胞。

优选地，步骤a)中提供的表达系统是具有脯氨酰羟化酶活性和/或赖氨酰羟化酶活性的表达系统。优选地，步骤a)中提供的表达系统是具有脯氨酰羟化酶活性和/或赖氨酰羟化酶活性的宿主细胞。

优选实施方案中，步骤a)中提供的表达系统是具有至少一个包含脯氨酰-4-羟化酶编码多核苷酸序列的表达盒的宿主细胞。特别优选地，步骤a)中提供的表达系统是具有至少一个包含脯氨酰-4-羟化酶编码多核苷酸序列的表达盒的宿主细胞，从而步骤c)中获得体内羟基化II型胶原，特别是体内羟基化II型胶原肽。

优选实施方案中，步骤a)中提供的表达系统是具有至少一个包含赖氨酰羟化酶编码多核苷酸序列的表达盒的宿主细胞。特别优选地，步骤a)中提供的表达系统是具有至少一个包含赖氨酰羟化酶编码多核苷酸序列的表达盒的宿主细胞，从而步骤c)中获得体内羟基化的II型胶原，特别是体内羟基化II型胶原肽。

本发明更优选实施方案中，步骤a)中提供的表达系统是宿主细胞，其具有至少一个包含脯氨酰-4-羟化酶编码多核苷酸序列的表达盒和至少一个包含赖氨酰-4-羟化酶编码多核苷酸序列的表达盒。特别优选地，步骤a)中提供的表达系统是宿主细胞，其具有至少一个包含脯氨酰-4-羟化酶编码多核苷酸序列的表达盒和至少一个包含赖氨酰羟化酶编码多核苷酸序列的表达盒，从而步骤c)中获得体内羟基化的II型胶原，特别是体内羟基化II型胶原肽。

本发明优选实施方案中，脯氨酰-4-羟化酶编码多核苷酸序列包含SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。特别优选地，脯氨酰-4-羟化酶编码多核苷酸序列编码单体脯氨酰-4-羟化酶，特别是具有SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的脯氨酰-4-羟化酶，优选地由SEQ ID NO.6所示氨基酸序列组成。

就此，本发明还涉及一种用于生产可根据本发明使用的重组II型胶原、特别是II型胶原肽、特别是体内羟基化II型胶原、特别是体内羟基化II型胶原肽的方法，包括以下方法步骤：

a)提供具有至少一个表达盒的表达系统，该表达盒具有至少一种编码II型胶原、特别是II型胶原肽的核苷酸序列，该表达系统能够使表达胶原肽的脯氨酸、赖氨酸或脯氨酸残基和赖氨酸残基羟基化；

b)在能够表达和羟基化II型胶原、特别是II型胶原肽的条件下培养表达系统；

c)获得根据本发明的II型胶原，特别是II型胶原肽，特别是体内羟基化II型胶原，特别是体内羟基化II型胶原肽。

就此，借助上述方法，能够有利地获得体内羟基化重组产生的II型胶原，特别是II型胶原肽，取决于所用的基于细胞的表达系统，其特征在于特定模式翻译后修饰，特别是羟基化和糖基化。这样就能有利地、特别是直接地(即无需后续修饰)即可获得具有预期生物有效性的II型胶原，特别是重组产生的II型胶原肽，可应用于治疗性处置人体或动物体软骨疾病的方法。

优选实施方案中，根据本发明产生的重组体内羟基化胶原肽具备生物有效性。根据本发明另一实施方案，步骤a)中提供的表达系统是不能引起表达胶原肽的脯氨酸、赖氨酸或脯氨酸残基和赖氨酸残基羟基化的表达系统，特别是步骤a)中提供的表达系统不具有脯氨酰羟化酶活性和赖氨酰羟化酶活性。

就此，本发明包括一种生产可根据本发明使用的重组胶原肽、特别是非羟基化胶原肽的方法，包括以下方法步骤：

a)提供具有至少一个表达盒的表达系统，该表达盒具有至少一种编码II型胶原、特别是II型胶原肽的核苷酸序列，该表达系统不能使所表达II型胶原、特别是II型胶原肽的脯氨酸、赖氨酸或脯氨酸残基和赖氨酸残基羟基化；

b)在能够表达II型胶原、特别是II型胶原肽的条件下培养表达系统；

c)获得根据本发明的II型胶原，特别是II型胶原肽，特别是非羟基化II型胶原，特别是非羟基化II型胶原肽。

根据本发明优选实施方案，所述至少一个表达盒的至少一个核苷酸序列经过密码子优化，即，核苷酸序列中不供所提供表达系统的翻译系统、特别是所提供基于细胞的表达系统的翻译系统、特别是所提供宿主细胞的翻译系统使用或优选使用的那些密码子取代为供所提供表达系统的翻译系统、特别是所提供基于细胞的表达系统的翻译系统、特别是所提供宿主细胞的翻译系统优选使用的那些密码子，而不改变所编码肽或蛋白质的氨基酸序列。

本发明优选实施方案中，由核苷酸序列编码的II型胶原、特别是II型胶原肽是脊椎动物、特别是哺乳动物(例如人类或非人类哺乳动物，例如马、袋鼠、啮齿动物、猪、羊或牛)、鸟类(例如鸡)、鱼类、两栖动物、爬行动物或无脊椎动物(例如水母)的II型胶原、特别是II型胶原肽。

本发明优选实施方案中，步骤a)中提供的表达盒包含至少一种SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

特别优选地，步骤a)中提供的表达盒所含的至少一种核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的序列一致性达至少90％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选至少98％、优选至少99％。

特别优选地，由核苷酸序列编码的II型胶原、特别是II型胶原肽是一种包含SEQID NO.2所示氨基酸序列的II型胶原，特别是II型胶原肽。由核苷酸序列编码的II型胶原、特别是II型胶原肽优选地由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成。

本发明更优选实施方案中，由核苷酸序列编码的II型胶原、特别是II型胶原肽与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的序列一致性达至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少96％，优选至少97％，优选至少98％，优选至少99％。

根据本发明优选实施方案，步骤a)中提供的表达盒包含至少一种SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

特别优选地，步骤a)中提供的表达盒所含的至少一种核苷酸序列与SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的序列一致性达至少90％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选至少98％、优选至少99％。

特别优选地，由核苷酸序列编码的II型胶原、特别是II型胶原肽是一种包含SEQID NO.4所示氨基酸序列的II型胶原，特别是II型胶原肽。由核苷酸序列编码的II型胶原、特别是II型胶原肽优选地由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成。

本发明更优选实施方案中，由核苷酸序列编码的II型胶原、特别是II型胶原肽与SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的序列一致性达至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少96％，优选至少97％，优选至少98％，优选至少99％。

优选地，由核苷酸序列编码的II型胶原、特别是II型胶原肽是天然存在的II型胶原、特别是II型胶原肽。本发明更优选实施方案中，由核苷酸序列编码的II型胶原、特别是II型胶原肽不是天然存在的II型胶原、特别是II型胶原肽。优选地，由核苷酸序列编码的II型胶原、特别是II型胶原肽是基因修饰的胶原肽。

根据本发明优选实施方案，所述至少一种核苷酸序列编码的II型胶原肽的分子量范围为5-400kDa、特别是10-390kDa、特别是10-350kDa、特别是10-300kDa，特别是10-110kDa、特别是40-110kDa、特别是40-100kDa、特别是11-105kDa、特别是15-100kDa、特别是20-99kDa、特别是25-95kDa、特别是30-95kDa、特别是35-95kDa、特别是40-50kDa、特别是45kDa。

本发明特优选实施方案中，本发明方法的特征在于，在步骤b)中，选取能够形成非变性(即天然)II型胶原、特别是II型胶原肽的条件。

本发明特优选实施方案中，本发明方法的特征在于，在步骤b)中，选取能够形成II型胶原、特别是II型胶原肽的三螺旋形式的条件。

特优选实施方案中，根据本发明的方法能够产生分子量均一的特殊II型胶原肽的均质分离制剂。

特优选实施方案中，本发明还提供以此方式制备的II型胶原肽的均质分离制剂混合物，每种制剂的分子量均一。

本发明还提出了通过裂解、特别是水解从根据本发明的方法生产的分子量均一、均质分离的II型胶原肽制备重组的胶原肽水解物。本发明特别是提供了本发明提出的用于口服治疗人体或动物体软骨疾病的分子量均一、均质分离的II型胶原肽、它们的混合物或它们的水解物。

根据本发明，本发明方法的特征在于，继步骤b)或c)之后，在步骤d)中通过裂解、特别是水解所表达的II型胶原、特别是II型胶原肽，获得重组的II型胶原肽水解物。

根据本发明通过步骤d)获得的II型胶原肽水解物可以呈该II型胶原水解物的形式或者在分离一种或多种、优选地均质分离的II型胶原肽，用作根据本发明的重组II型胶原肽。

本发明特优选实施方案中，还可以提出将均质分离的II型胶原肽彼此混合，即代表重组II型胶原肽的混合物。

因此，特优选实施方案中，本发明还涉及一种重组II型胶原肽，其呈均质分离的均一分子量形式或作为重组II型胶原肽存在于与重组或天然、特别是重组的II型胶原肽的混合物中或存在于重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽的水解物中。

编码可根据本发明使用的重组II型胶原肽的核苷酸序列可以通过本领域常规方式获得，例如参阅专利文献WO 93/07889、US2006/0147501、US 5,593,859或US2008/0081353。

本发明优选实施方案中，可根据本发明使用、优选地通过上述本发明方法之一产生的II型胶原，特别是II型胶原肽是非羟基化、部分羟基化或完全羟基化II型胶原肽，优选是非羟基化II型胶原肽，优选是部分羟基化II型胶原肽，优选是完全羟基化II型胶原肽。

本发明优选实施方案中，可根据本发明使用、优选地通过上述方法之一产生的II型胶原、特别是重组II型胶原肽是糖基化胶原肽，用于治疗性处置人体或动物体软骨疾病的方法。所述II型胶原、特别是II型胶原肽优选为体内糖基化，优选为离体糖基化。

本发明更优选实施方案中，可根据本发明使用、优选地通过上述本发明方法之一产生的II型胶原、特别是II型胶原肽是非糖基化II型胶原、特别是II型胶原肽。

根据本发明，术语“生物有效性”优选意指可根据本发明使用的II型胶原、特别是II型胶原肽用于免疫调节、特别是抑制免疫球蛋白(特别是IgE、IgA、IgM和/或IgG)合成的能力。

根据本发明，术语“生物有效性”还优选意指可根据本发明使用的II型胶原、特别是II型胶原肽用于抑制促炎细胞因子(特别是TNFα、IL-6和IFNγ)的形成和活性或者刺激抗炎细胞因子(特别是IL-4、IL-10和TGF-β1)的合成和活性、特别是二者兼备的能力。

根据本发明，术语“生物有效性”优选意指可根据本发明使用的II型胶原、特别是II型胶原肽用于免疫调节、特别是抑制免疫球蛋白(特别是IgE、IgA、IgM和/或IgG)合成、抑制促炎细胞因子(特别是TNFα、IL-6和IFNγ)形成以及刺激抗炎细胞因子(特别是IL-4、IL-10和TGF-β1)合成的能力。

特优选实施方案中，生物有效性特别是通过本领域技术人员关于免疫调节、特别是刺激和抑制物质活性以及抗炎细胞因子和促炎细胞因子活性熟知的检测方法来测定。具体而言，通过根据例2、例3、例4和/或例5的方法来测定本发明意义上的生物有效性。根据本发明，术语“生物有效性”还优选意指可根据本发明使用的II型胶原、特别是II型胶原肽诱导口服耐受性的能力。特优选实施方案中，存在口服耐受性是通过本领域技术人员关于测定物质口服耐受性诱导能力熟知的检测方法、特别是通过根据例2、例3、例4和/或例5的方法来测定。

本发明上下文中，促炎细胞因子特别是TNFα、IL-6和IFN-γ。

本发明上下文中，抗炎细胞因子特别是IL-4、IL-10和TGF-β1。

本发明上下文中，术语“抑制”应意指部分或完全阻止蛋白质合成，可具体表示为减少或抑制蛋白质合成或者减少或抑制蛋白质相关的mRNA合成。

本发明上下文中，术语“胶原”采取广义理解，特别是例如WO 01/34646中的定义。更优选实施方案中，术语“胶原”应意指具有甘氨酸-脯氨酸、甘氨酸-4-羟脯氨酸或甘氨酸-X-4-羟脯氨酸序列，优选地重复基序(Gly-XY)n的胶原蛋白或肽，其中X和Y可以是任何氨基酸，优选为脯氨酸和4-羟基脯氨酸。术语“胶原”特别优选意指具有重复基序(Gly-Pro-Y)n和/或(Gly-X-Hyp)m的肽，其中X和Y可以是任何氨基酸。

根据本发明的“II型胶原”是根据上述内容广义理解的胶原，其中II型胶原具有天然存在的II型胶原的氨基酸序列，特别是脊椎动物(特别是猪、羊、牛、啮齿动物、马、鸟、鱼、爬行动物或两栖动物)或无脊椎动物(特别是水母)的II型胶原的氨基酸序列。

所述II型胶原可以呈单体胶原肽(这里又称单链胶原肽)或者包含至少两个、特别是三个胶原肽、特别是三聚体的二聚体或三聚体，特别是由相同的单链胶原肽组成。特别地，所述II型胶原可以呈三螺旋II型胶原肽、特别是天然II型胶原。

本发明上下文中，术语“II型胶原肽”应意指单链II型胶原肽，其具有如上定义的II型胶原中存在的氨基酸序列，该肽是寡肽或多肽。所述II型胶原肽特别是可呈化学修饰的形式，特别是羟基化和/或糖基化形式，也可以未修饰。

优选地，根据本发明使用的重组II型胶原、特别是II型胶原肽可以具有天然存在的II型胶原、特别是II型胶原肽的序列修饰、特别是功能保留序列修饰。

据此，“II型胶原”也意指天然存在的II型胶原、特别是II型胶原肽的功能保留序列修饰，特别是若在氨基酸水平上，其与天然存在的II型胶原的氨基酸序列的氨基酸序列一致性达至少80％，特别是至少85％，特别是至少90％，特别是至少95％，特别是至少96％，特别是在至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％。根据本发明，II型胶原的存在条件是：重组II型胶原精确地具有天然存在的II型胶原中存在的氨基酸序列，或者存在功能保留序列修饰，与天然存在的II型胶原相比、特别是与来自脊椎动物(特别是猪、羊、牛、啮齿动物、袋鼠、马、鸟、爬行动物、两栖动物或鱼)或无脊椎动物(特别是水母)的天然存在的II型胶原相比的氨基酸序列一致性达至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98、至少99％，特别是该氨基酸一致性与来自牛的天然存在的II型胶原氨基酸序列相比。

本发明上下文中，利用Smith-Waterman算法(SSE2，Michael Farrar，2006，7.2，2010年11月)用参数BL50矩阵(15:-5),Open/ext:-12/-2确定氨基酸序列一致性。

根据本发明，术语“功能保留序列修饰”应意指既定、特别是天然存在的氨基酸序列的修饰，特别是单个或几个氨基酸的交换、添加和/或删除，这会导致氨基酸序列偏离既定的氨基酸序列，修饰的氨基酸序列则保留了既定氨基酸序列的功能特征，特别是其生物有效性。

“功能保留序列修饰”优选意指既定、特别是天然存在的氨基酸序列的修饰，其中作为既定氨基酸序列的特征性功能、特别是生物有效性保留至少50％、优选至少60％、优选至少70％、优选至少80％、优选至少90％、优选至少95％、优选100％。更优选地，根据本发明，“功能保留序列修饰”应意指既定氨基酸序列的修饰，其中修饰的氨基酸序列与既定氨基酸序列的序列一致性达至少50％、优选至少55％、优选至少55％、优选至少60％、优选至少65％、优选至少70％、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少90％。

特别优选地，序列修饰、特别是本发明上下文中的“功能保留序列修饰”是对既定、特别是天然存在的氨基酸序列的修饰，其中一个或多个某些化学物理属性的氨基酸被一种或多种相同或相似化学物理属性的氨基酸取代，例如，一种非极性侧链氨基酸(例如Ala、Val、Met、Leu、Ile、Pro、Trp、Phe)被另一种非极性侧链氨基酸(例如Ala、Val、Met、Leu、Ile、Pro、Trp、Phe)取代，一种极性神经侧链氨基酸(例如Tyr、Thr、Gln、Gly、Ser、Cys、Asn)被另一种极性神经侧链氨基酸(例如Tyr、Thr、Gln、Gly、Ser、Cys、Asn)取代，一种酸性侧链氨基酸(例如，Glu、Asp)被另一种酸性侧链氨基酸(例如，Glu、Asp)取代，且/或碱性侧链氨基酸(例如，Lys、Arg、His)被另一种碱性侧链氨基酸(例如Lys、Arg、His)取代。根据该实施方案，“功能保留序列修饰”中既定氨基酸序列的化学物理属性得以保留或仅轻微改变。

另一实施方案中可以提出，序列修饰、特别是“功能保留序列修饰”包括将既定氨基酸序列、特别是天然存在的氨基酸序列的至少一种氨基酸、优选地既定氨基酸序列、特别是天然存在的氨基酸序列的至少一种非必需氨基酸(特别是Ala、Asn、Asp、Glu、Ser)取代为至少一种极特定的氨基酸，特别是至少一种必需氨基酸，特别是Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Val、His、Cys、Tyr，特别优选Trp，其中，既定氨基酸序列、特别是天然存在的氨基酸序列保留了特征性功能，特别是生物有效性，特别是根据本发明的生物有效性，特别是根据例2、例3、例4和/或例5中所示检定的生物有效性。

根据本发明，序列修饰、特别是“功能保留序列修饰”还应意指对既定氨基酸序列、特别是天然存在的氨基酸序列的修饰，即：既定氨基酸序列、特别是天然存在的氨基酸序列添加有至少一种氨基酸，优选地至少一种必需氨基酸，特别是Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Val、His、Cys、Tyr，特别优选是Trp，其中，既定氨基酸序列、特别是天然存在的氨基酸序列保留特征性功能，特别是本发明的生物有效性，特别是根据例2、例3、例4和/或例5中所示检定的生物有效性。根据本发明可以提出，在N端、C端和/或氨基酸序列内添加至少一种氨基酸，优选地至少一种必需氨基酸，特别是Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Val、His、Cys、Tyr，特别优选是Trp。

本发明上下文中，术语“氨基酸修饰”是指可能发生在重组II型胶原、特别是II型胶原肽的合成之前、之后或期间的一种或多种氨基酸的化学变化，同时保留了II型胶原肽的原始氨基酸骨架，特别是一种或多种蛋白氨基酸。就此，该术语既包括使用化学修饰的氨基酸来合成根据本发明的II型胶原、特别是II型胶原肽，又包括在合成II型胶原、特别是II型胶原肽之后或期间的氨基酸化学变化。胶原肽典型的氨基酸修饰特别是脯氨酸残基和赖氨酸残基的羟基化以及羟基化赖氨酸残基的糖基化。但根据本发明，该术语还包括氨基酸的其他化学变化，例如磷酸化、N-糖基化、乙酰化、甲基化或肉豆蔻酰化。

本发明上下文中，所述重组II型胶原、特别是II型胶原肽或重组产生的II型胶原、特别是II型胶原肽是借助表达系统通过生物技术重组生产获得的II型胶原、特别是II型胶原肽。根据本发明，所述重组II型胶原、特别是II型胶原肽或重组产生的II型胶原、特别是II型胶原肽的共同点是它们不是获自天然来源。

本发明特优选实施方案中，所述重组II型胶原、特别是II型胶原肽呈该II型胶原或II型胶原肽的均质制剂形式，特别是这样的制剂包含至少90wt.％、优选至少95wt.％、特别是至少98wt.％、特别是至少99wt.％、优选100wt.％的II型胶原或II型胶原肽。优选实施方案中，均质制剂中仅存特定大小(即特定分子量，即单一分子种)的II型胶原或II型胶原肽。本发明优选实施方案中，所述重组II型胶原或II型胶原肽呈分离形式。本发明特优选实施方案中，所述重组II型胶原或II型胶原肽不含其他蛋白质或肽，特别是不含其他物质，例如杂质，特别是不含非蛋白质材料、不含盐和/或不含其他蛋白质或肽。

本发明上下文中，术语“明胶”采取广义理解，特别是例如WO01/34646中的定义。

本发明上下文中，术语“重组DNA”意指借助基因工程方法在体外产生的人工产生或操作的DNA分子。优选实施方案中，重组DNA由不同来源生物体的组分组成。

本发明上下文中，术语“表达盒”应意指DNA片段,负责将该片段中编码的信息转录成RNA、特别是转录成mRNA，并含有至少一个启动子和蛋白质编码核苷酸序列，一般含有至少一个启动子、至少一个蛋白质编码核苷酸序列和任选的终止子。

本发明上下文中，“核苷酸序列”应意指核酸、特别是核酸链、特别是DNA链或RNA链的核苷酸序列。因此，“核苷酸序列”应意指信息单元和物理上表现该信息的DNA链或RNA链。

本发明上下文中，“表达系统”应意指可发生靶向和受控的蛋白质生物合成的系统。根据本发明，术语“表达系统”包括无细胞表达系统(其中蛋白质生物合成所需的组分不存在于细胞内，即蛋白质生物合成发生在细胞外)和基于细胞的表达系统(其中蛋白质生物合成发生在活细胞内)。本发明上下文中，无细胞表达系统优选是来自E.coli(大肠杆菌)、昆虫细胞、麦芽、烟草细胞或哺乳动物细胞，特别是来自兔的CHO细胞或网织红细胞的裂解物或提取物，其包含蛋白质生物合成所必需的组分，特别是翻译系统和转录系统。在本发明方法之一使用无细胞表达系统的情况下，术语“培养”与“孵育”同义。

本发明上下文中，“宿主细胞”应意指能够表达外源DNA、特别是重组DNA中编码的肽或蛋白质的活细胞。

根据本发明，根据步骤c)的术语“获得II型胶原、特别是II型胶原肽”是本领域技术人员公知的方法，用于通过公知的分离法，例如离心法(特别是差速离心和/或密度梯度离心)、色谱法(特别是凝胶过滤、离子交换、亲和和/或高效液相色谱)、电泳法、过滤法和/或提取法，从含多种组分的组合物中分离II型胶原或II型胶原肽，其中从含多种组分的组合物中富集和纯化相关组分可以优选地通过连续应用几种分离法来实现。视需要，可以在提取之前、之后或期间裂解C端和/或N端前胶原片段来获得胶原。

在步骤b)的条件背景下，还可以优选地发生原纤维形成、化学修饰和表达II型胶原肽分泌。

根据本发明，“能够表达II型胶原、特别是II型胶原肽的条件”应意指激活或增强II型胶原、特别是II型胶原肽表达的条件，例如特别是温度、压力、时间、光以及是否存在诱导物和/或阻遏物。优选实施方案中，II型胶原、特别是II型胶原肽的表达发生在高细胞密度发酵的背景下，特别是在高压下，优选是在高气压下。能够表达II型胶原、特别是II型胶原肽的具体条件为本领域技术人员公知，取决于所用的表达系统和所用的表达盒，特别是其中所含的启动子。II型胶原、特别是II型胶原肽的表达可以是组成型或诱导型表达，取决于表达盒的结构。

本发明上下文中，“软骨疾病口服疗法”应意指用于预防和/或处置软骨疾病、特别是用于处置软骨疾病的方法，其中重组II型胶原为口服给药。

本发明上下文中，“软骨疾病”特别是炎症性、退变性和/或由自身免疫作用、特别是过度免疫反应引起的软骨疾病，特别是骨关节炎和/或类风湿性关节炎。本发明上下文中，“软骨疾病”特别是关节软骨疾病，特别是脚、膝盖、手指、手腕、臀部和脊柱中关节的软骨疾病。

根据本发明，“软骨疾病口服疗法”还优选意指诱导针对内源性胶原、特别是内源性II型胶原、特别是存在于软骨组织之中或之上的内源性II型胶原的口服耐受性的方法。

本发明上下文中，术语“包含”和“具有”是指除了这些术语明确涵盖的元素外还可能出现未明确提及的其他元素。本发明上下文中，这些术语也可指仅涵盖明确提及的元素而不存在其他元素。在本特定实施方案中，术语“包含”和“具有”与术语“由……组成”同义。另外，术语“包含”和“具有”还涵盖除了明确提及的元素外还包括虽未提及但在功能和定性上从属性的其他元素的组合物。在本实施方案中，术语“包含”和“具有”与术语“基本上由……组成”同义。

本发明上下文中，若数字中指定第一和第二小数位或者第二小数位，则将其设置为零。

本发明上下文中，术语“和/或”是指表示通过术语“和/或”连接的一组所有成员既可互为替代，又可相互之间任意组合。对于表述“A、B和/或C”，这应理解为：(a)A或B或C；或(b)A和B；或(c)A和C；或(d)B和C；或(e)A和B和C。

更多优选实施方案请参阅从属权利要求。

附图说明

下面参照示例性序列、附图及实施例对本发明予以说明，但不限制本发明的总体构思，其中：

SEQ ID NO.1：II型牛胶原(CP90)的编码核苷酸序列(col2 1；3036个碱基对)。

SEQ ID NO.2：II型牛胶原(CP90)的氨基酸序列(1012个氨基酸)。

SEQ ID NO.3：II型牛胶原(col2 1)衍生胶原肽(CP45)的编码核苷酸序列(1500个碱基对)。

SEQ ID NO.4：II型牛胶原衍生胶原肽(CP45)的氨基酸序列(500个氨基酸)。

SEQ ID NO.5：源自mimi病毒的单体脯氨酰-4-羟化酶(P4H)的编码核苷酸序列，具有N端pOst1信号序列、6xHis标签和C端ER保留序列HDEL。

SEQ ID NO.6：源自mimi病毒由SEQ ID NO.5编码的单体脯氨酰-4-羟化酶(P4H)的氨基酸序列(254个氨基酸)。

SEQ ID NO.7：质粒pAOXsec-ColII-1的核苷酸序列。

SEQ ID NO.8：质粒pAOXsec-ColII-1_s.a的核苷酸序列

SEQ ID NO.9：质粒pAOX_Mimi-int 3.0的核苷酸序列。

图1示出了pAOXsec-ColII-1的质粒图谱。

图2示出了pAOXsec-ColII-1_s.a的质粒图谱

图3示出了pAOX_Mimi-int 3.0的质粒图谱。

具体实施方式

例1：重组II型胶原生产

通过在能够羟化脯氨酸残基的Pichia pastoris菌株中重组表达具有SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的表达盒，获得重组生产的具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的羟基化全长II型胶原(CP90)。

此外，通过在能够羟化脯氨酸残基的Pichia pastoris菌株中重组表达具有SEQID NO.3所示核苷酸序列的表达盒，获得基于II型胶原重组生产的具有SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的羟基化胶原肽(CP45)。

用于重组表达CP90和CP45的Pichia pastoris菌株是分别通过借助整合质粒pAOXsec-ColII-1(图1)或pAOXsec-ColII-1_s.a(图2)基因组整合II型牛胶原(CP90)编码核苷酸序列或II型牛胶原col2a1)衍生胶原肽(CP45)编码核苷酸序列以及借助整合质粒pAOX_Mimi-int 3.0(图3)整合源自mimi病毒(PH4)的单体脯氨酰-4-羟化酶的编码核苷酸序列而获得。

例2：有效性检定

A)重组II型胶原调节免疫和细胞因子

根据例1的天然重组产生的II型胶原(重组产生的全长II型胶原)的免疫调节作用是在商用健康小鼠派尔斑M细胞(SCC142M，Sigma Aldrich，德国)中进行测定。

在ITES-ERDF培养基中培养M细胞，促进免疫球蛋白的产生。培养基中补充有10％胎牛血清、10g/mL胰岛素、20μg/mL转铁蛋白、20μM乙醇胺和25nM亚硒酸盐(ITES)。通过针对IgE、IgA、IgM和IgG的特异性酶联免疫吸附检定来测定细胞培养上清液中免疫球蛋白的合成。

此外，与未处理的对照例相比，还检查了胶原肽对形成促炎细胞因子(TNFα、IL-6、IFNγ)和抗炎细胞因子(IL-4、IL-10、TGF-β1)的影响。培养1-5天后测试促炎和抗炎细胞因子的RNA表达。

B)用II型胶原免疫DBA/1小鼠并诱导类风湿性关节炎

将10mg重组II型胶原在2.5mL的0.01N乙酸溶液中稀释至终浓度为4mg/mL胶原(储备液)。将反应容器在4℃下旋转过夜，使胶原完全溶解。

将胶原原液按1:1(v/v)比例溶解于0.01N乙酸中，制备II型胶原工作液。将完全弗氏佐剂(CFA)按1:1(v/v)比例添加到胶原工作液中。

将8周龄雄性DBA/1J小鼠维持在20±2℃、12/12小时明暗循环、55±10％湿度以及标准实验室啮齿动物随意饮食饮水条件下。

在为期两周的干预过程中，每隔一天喂食2mg/mL天然重组产生的II型胶原(100μg溶于0.05N乙酸中)诱导口服耐受性，与等量磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为安慰剂对照例进行比较。在随后诱导类风湿性关节炎之前，小鼠连续注射六次胶原。

通过腹膜内注射磷酸盐缓冲盐水内含100μL氯胺酮-甲苯噻嗪溶液(1:100v/v；62.5mg氯胺酮，0.625mg甲苯噻嗪于10mL PBS中)来麻醉小鼠。每只小鼠尾皮下(距离尾底前方2cm，不穿透血管)注射100μL最终的CFA-胶原溶液来诱导类风湿性关节炎(RA)。

饲养三周后，通过重复注射，增强小鼠对II型胶原的免疫能力。在靠近尾底的部位进行加强注射，增强类风湿性关节炎的发展。

C)评价：

初步免疫后2周半，每周评估关节炎程度3次，持续长达12周。关节炎的严重程度分为0-4级：

0＝无水肿或肿胀；1＝仅限于足部和/或踝部的轻度水肿和红斑；2＝从脚踝到跗骨的轻度水肿和红斑；3＝从脚踝到跗骨的中度水肿和红斑；4＝从脚踝到整条腿的水肿和红斑。

免疫开始后3周、5周和7周从每只小鼠收集的血液样本用于采用ELISA定量试剂盒检查免疫球蛋白浓度。通过测量415nm处的光密度，对IgG、IgE、IgM和IgA的形成进行光度定量。

观察期结束时，处死小鼠，分离派尔斑M细胞并如上所述在ITES-ERDF培养基中进行培养。

如上所述，测定用II型胶原和PBS对照免疫的鼠M细胞中细胞因子的RNA表达和免疫球蛋白的合成。

使用天然重组II型胶原的三螺旋片段和截短的非螺旋片段在DBA/1J小鼠中重复进行细胞培养实验和免疫耐受测试，以研究天然螺旋胶原组织是否为针对内源II型胶原诱导免疫耐受所必需。

D)结果：

所获数据表明，重组产生的II型胶原对小鼠派尔斑细胞表现出有益作用。

在健康的M细胞中，细胞因子的RNA表达谱显示重组产生的II型胶原具有抗炎作用。在健康的M细胞中，免疫球蛋白的合成也受到抑制。

还表明，在免疫的小鼠M细胞中，即在针对类风湿性关节炎进行免疫接种后，促炎细胞因子的合成受到抑制，而抗炎细胞因子的合成又受到刺激。此外，在针对类风湿性关节炎进行免疫接种后，派尔斑细胞中免疫球蛋白的合成受到抑制，如从小鼠肠道组织样本中分离出的派尔斑表明。

与安慰剂对照相比，在用重组II型胶原免疫后，CFA诱导的类风湿性关节炎在体内有所减少，这一点可以从小鼠受RA影响的踝关节关节炎程度降低得到证实。

胶原免疫小鼠的血液样本中Ig浓度降低也证实了这些发现。

在重组天然II型胶原的截短片段上所获数据表明，三螺旋和非螺旋片段都足以诱导对诱导类风湿性关节炎的II型胶原的免疫耐受。

例3：有效性检定

A)II型胶原肽调节免疫和细胞因子

在进一步的实验方法中，测试了根据例1重组产生的II型胶原肽CP90和CP45在免疫调节作用方面的效果。利用3H-Biomedical AB(瑞典)出售的人外周血单核细胞(PBMC)来进行研究。

首先，将PBMC细胞在涂有人纤连蛋白(C-43060，PromoCell，德国)的细胞培养瓶中的巨噬细胞基础培养基DXF(C-28057，PromoCell，德国)中进行培养。向培养基中添加相应的补充混合物(补充C-28055，PromoCell，德国)以及1％两性霉素和1％青霉素/链霉素。添加4μg/mL重组II型胶原可诱导贴壁单核细胞再分化为免疫抑制型2b或2c型巨噬细胞。为此，将细胞与重组胶原肽一起孵育6天。然后，通过添加源自Escherichia coli的1μg/mL脂多糖(LPS，L6529，Merck，德国)对如此激活的巨噬细胞进行极化。然后，基于特定的细胞分化标记物(CD)检查生成的巨噬细胞的分化模式。使用特定标记验证单核细胞分化为炎症诱导的M1巨噬细胞或免疫抑制的M2巨噬细胞。为此，使用ELISA(“酶联免疫吸附检定”)测定M2表面标记CD86、CD14和CD163。完全按照制造商说明书对CD86(850590096Diaclone，Diagnostics，德国)、CD14(850780096Diaclone，/>Diagnostics，德国)和CD163(ELH-CD163RayBiotech，/>Diagnostics)进行相应的检定。为了排除分化为炎症性M1巨噬细胞，还检查了M1巨噬细胞标记CD86(850590096Diaclone，/>Diagnostics，德国)和CD80(EK0707 Boster PicoKine，/>Diagnostics，德国)。

此外，还检查了II型胶原肽对培养物上清液中促炎细胞因子(TNFα、IFNγ)和抗炎细胞因子(IL-10)形成的影响。根据制造商说明书，使用ELISA技术测定TNF(EK0525 BosterPicoKine，Diagnostics，德国)、IL-10(950060096，Diaclone，/>Diagnostics，德国)和IFNγ(EK0373，Boster PicoKine，/>Diagnostics，德国)。

使用特定的分化培养基(C-28055，PromoCell，德国)和某些培养添加剂检查单核细胞分化为M1或M2巨噬细胞。

利用根据例1制备的平均分子量分别为90kDa和45kDa的II型胶原肽CP90和CP45来进行研究。

确定的数据表明，II型胶原肽CP90和CP45对从外周血单核细胞分化为免疫抑制性M2巨噬细胞在统计上具有明显(p<0.05)的有益作用。

基于特定细胞因子的合成谱，所测试的II型胶原肽的整体抗炎作用可以在分化的巨噬细胞中得到证实。炎症细胞因子的合成明显减少(p<0.05)，抗炎IL-10的合成明显诱导(p<0.05)。

例4：刺激原初CD4⁺T前体细胞

通过CP90或CP45诱导M2巨噬细胞中的单核细胞后(例3)，将巨噬细胞基础培养基DXF(C-28057，PromoCell，德国)替换为T细胞培养基(3H800-50-50，3H Biomedical AB，瑞典)。将原初CD4⁺T前体细胞(3H31-k，3H Biomedical AB，瑞典)添加到分化的M2巨噬细胞中。通过原初T前体细胞与分化的M2巨噬细胞及其细胞因子混合物的直接细胞接触，T前体细胞分化为调节性T抑制细胞。

为了显著增加特定T细胞克隆的数量，使用ARTE(抗原反应性T细胞富集)方法富集成熟T抑制细胞。T细胞的规格是通过用细胞表面标记(CD)抗体标记细胞来确定，这些抗体与各种染料(如生物素或藻红蛋白)偶联。为了丰富特定的T细胞克隆类型，再使用抗生物素和抗PE偶联的磁性微珠使之分离。

然后，可以用荧光染料偶联的抗体对T细胞进行染色，并使用流式细胞术进行定量。由叉头框p3(FoxP3)和CD25标识T抑制细胞。

结果表明，补充重组II型胶原肽会显著增加分化T抑制细胞释放的抗炎细胞因子，如IL-10、IL-4和TGF-β(p<0.05)。

所获数据还表明，重组产生的II型胶原肽CP90和CP45对免疫抑制性T抑制细胞的形成具有显著的有益作用。

例5：关节软骨细胞免疫抑制

人体关节软骨细胞在补充有1％两性霉素和1％青霉素/链霉素和10％小牛血清的Hams-F12培养基(HAM-12-A，Capricorn，德国)中进行培养。达到100％细胞汇合后，通过添加1μg/ml脂多糖(Escherichia coli，L6529，Merck，德国)在软骨细胞中诱导炎症情况。通过添加来自T细胞分化实验的25μl/ml细胞上清液(参见例4)，软骨细胞中的炎症有所减轻。

基于软骨细胞中促炎细胞因子(IL-1β、TNFα和IL-6)的表达在统计上明显降低，使用实时PCR可以清楚地证实所检II型胶原肽CP90的抗炎作用。

在另一项实验设置相同的实验中，测试了较短的重组生产的II型胶原肽(CP45)的抗炎作用。与CP90的研究一样，CP45的软骨细胞中促炎细胞因子(IL-1β、TNFα和IL-6)的表达也明显降低(p<0.05)。就此，基于II型胶原的CP45也表现出相应的抗炎作用。

II型胶原肽CP90和CP45之间的比较表明，这两种胶原肽的抗炎作用在统计上没有显著差异。

总之，所获数据表明，重组生产的II型胶原肽CP90和CP45因在统计上显著(p<0.05)增加免疫抑制性T抑制细胞中抗炎细胞因子的形成而产生有益作用。此外，结果支持通过口服II型胶原或II型胶原肽(CP90和CP45)诱导口服耐受性的基本作用原理。

序列表

<110> 嘉利达股份有限公司

<120> 治疗用重组 II 型胶原

<130> 209576

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3036

<212> DNA

<213> 牛（Bos taurus）

<400> 1

atgggaccaa tgggcccaag aggtcctcct ggaccagccg gtgcaccagg tcctcagggt 60

tttcaaggta acccaggtga gcctggtgag ccaggtgttt ctggtcctat gggtcctcgt 120

ggccctcctg gtcctccagg caagcctggt gatgatggtg aagctggaaa gccaggtaag 180

tctggtgaaa gaggcccacc aggtccacaa ggtgctagag gatttccagg tactcctggt 240

ttgcctggtg ttaagggtca tagaggttac ccaggtttgg atggtgctaa aggtgaagcc 300

ggtgctcccg gtgtcaaagg tgaatctggt tctcctggtg aaaacggttc tcccggacct 360

atgggaccta gaggtttacc tggtgagaga ggtagaactg gtccagctgg tgctgctggt 420

gccagaggaa atgatggaca accaggacct gctggtcctc ctggtcctgt tggtccagct 480

ggcggtccag gatttcctgg tgctccaggt gcaaaaggcg aagctggacc tactggtgct 540

aggggtcctg aaggtgctca aggacccaga ggcgaacctg gaacacccgg atctccaggt 600

cctgccggcg ctgctggtaa tcctggtact gatggaatac caggtgctaa gggttctgct 660

ggcgctcctg gaatagctgg tgcccctggt tttccaggac ctaggggtcc tccaggacct 720

caaggtgcta ctggaccatt aggtcctaaa ggtcagactg gcgaaccagg tattgctggt 780

ttcaagggtg aacagggacc aaaaggtgag cccggtccag ccggaccaca gggtgcccca 840

ggaccagctg gcgaagaggg taaacgtggt gcaaggggtg aacccggtgg tgccggtcct 900

gcaggcccac ctggtgaacg tggcgcccca ggtaatagag gattccctgg acaagatggt 960

ttggccggtc ctaagggcgc accaggtgaa aggggtccat ctggtttagc tggtcccaaa 1020

ggtgcaaatg gtgatccagg tagaccaggc gagccaggtt tgccaggtgc tcgtggatta 1080

actggtagac ctggtgacgc tggaccacaa ggtaaagttg gtccatcagg tgcacccggt 1140

gaagatggta gacccggtcc tccaggtcca cagggcgcaa gaggtcaacc tggtgttatg 1200

ggattccccg gacctaaggg tgctaatggc gagcctggaa aagccggtga aaaaggattg 1260

ccaggcgctc caggacttag aggacttcct ggtaaggacg gtgaaacagg tgctgccggt 1320

ccacctggac ctgctggacc cgctggtgaa aggggcgaac aaggtgcacc aggaccttcc 1380

ggatttcaag gtctgcccgg accacctggt cctccaggtg aaggtggtaa accaggtgat 1440

caaggtgtcc ctggtgaggc tggcgcacct ggtctagttg gaccaagggg cgagcgtgga 1500

tttcccggcg aaagaggttc tccaggttct caaggattgc aaggtgccag gggattgccc 1560

ggaactcccg gtacagacgg ccctaaaggt gcagcaggcc ccgcaggacc tcctggcgca 1620

caaggccctc caggattgca gggtatgcca ggcgagagag gtgcagctgg tattgcagga 1680

cccaagggtg atcgtggtga tgttggagaa aaaggcccag aaggcgctcc cggtaaggat 1740

ggtggtagag gtttgactgg tccaattggc ccacctggtc cagccggcgc taatggtgaa 1800

aaaggtgaag ttggcccacc aggacctgcc ggtacagctg gtgctagagg tgccccaggt 1860

gaaagaggtg aaacaggacc tccaggtcca gccggttttg ctggtccacc aggtgctgat 1920

ggtcagcctg gtgccaaggg cgagcagggt gaagcaggtc aaaagggcga cgcaggcgcc 1980

cctggacctc agggtcctag cggagcccca ggtcctcaag gaccaactgg tgttactgga 2040

cctaaaggcg ccagaggtgc acagggtcca ccaggcgcta ctggtttccc aggtgccgct 2100

ggtagagttg gacctcctgg ttctaatggt aatcccggac ctcctggacc acctggtcca 2160

tctggtaaag atggacctaa aggtgctcgt ggtgattctg gtccacctgg cagagctggt 2220

gaccctggat tgcaaggccc tgccggacca ccaggcgaaa agggcgaacc tggtgatgac 2280

ggtccttctg gtccagatgg ccctccagga ccacaaggat tggctggtca aagaggtatc 2340

gttggtttgc caggacaaag aggtgagaga ggattcccag gtttaccagg accatcaggc 2400

gagcccggta aacaaggcgc acccggcgct agcggtgata ggggccctcc tggacctgtg 2460

ggaccaccag gattgacagg acctgcaggc gaaccaggca gagaaggtag tccaggtgcc 2520

gacggtccac caggtagaga tggcgctgct ggtgtaaaag gtgatagggg tgaaactggt 2580

gcagttggag ccccaggcgc tcccggacct ccaggttctc ctggacctgc aggcccaatt 2640

ggtaaacaag gtgatagagg tgaggccggt gcacaaggac caatgggtcc cgccggtcct 2700

gccggtgcaa gaggtatgcc tggtccacag ggtccccgtg gtgacaaagg tgagacaggt 2760

gaagctggcg aaagaggatt gaagggacac agaggtttta ccggtctgca aggattaccc 2820

ggtccacctg gtccaagtgg tgatcaaggt gcttctggtc ctgctggtcc ctctggacca 2880

agaggcccac ctggacctgt cggtccttct ggaaaagatg gtgctaacgg tattccaggt 2940

ccaattggtc caccaggacc tagaggtaga tctggtgaaa ccggacctgc tggacctcca 3000

ggtaaccctg gtcctcctgg tccaccagga cctcca 3036

<210> 2

<211> 1012

<212> PRT

<213> 牛（Bos taurus）

<400> 2

Met Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro

1 5 10 15

Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Asn Pro Gly Glu Pro Gly Glu Pro Gly

20 25 30

Val Ser Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys

35 40 45

Pro Gly Asp Asp Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Lys Ser Gly Glu Arg

50 55 60

Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Phe Pro Gly Thr Pro Gly

65 70 75 80

Leu Pro Gly Val Lys Gly His Arg Gly Tyr Pro Gly Leu Asp Gly Ala

85 90 95

Lys Gly Glu Ala Gly Ala Pro Gly Val Lys Gly Glu Ser Gly Ser Pro

100 105 110

Gly Glu Asn Gly Ser Pro Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly

115 120 125

Glu Arg Gly Arg Thr Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Ala Arg Gly Asn

130 135 140

Asp Gly Gln Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Pro Ala

145 150 155 160

Gly Gly Pro Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Glu Ala Gly

165 170 175

Pro Thr Gly Ala Arg Gly Pro Glu Gly Ala Gln Gly Pro Arg Gly Glu

180 185 190

Pro Gly Thr Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Asn Pro

195 200 205

Gly Thr Asp Gly Ile Pro Gly Ala Lys Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly

210 215 220

Ile Ala Gly Ala Pro Gly Phe Pro Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro

225 230 235 240

Gln Gly Ala Thr Gly Pro Leu Gly Pro Lys Gly Gln Thr Gly Glu Pro

245 250 255

Gly Ile Ala Gly Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly

260 265 270

Pro Ala Gly Pro Gln Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Glu Glu Gly Lys

275 280 285

Arg Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly Gly Ala Gly Pro Ala Gly Pro Pro

290 295 300

Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Asn Arg Gly Phe Pro Gly Gln Asp Gly

305 310 315 320

Leu Ala Gly Pro Lys Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Pro Ser Gly Leu

325 330 335

Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asn Gly Asp Pro Gly Arg Pro Gly Glu Pro

340 345 350

Gly Leu Pro Gly Ala Arg Gly Leu Thr Gly Arg Pro Gly Asp Ala Gly

355 360 365

Pro Gln Gly Lys Val Gly Pro Ser Gly Ala Pro Gly Glu Asp Gly Arg

370 375 380

Pro Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Gln Pro Gly Val Met

385 390 395 400

Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Ala Asn Gly Glu Pro Gly Lys Ala Gly

405 410 415

Glu Lys Gly Leu Pro Gly Ala Pro Gly Leu Arg Gly Leu Pro Gly Lys

420 425 430

Asp Gly Glu Thr Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala

435 440 445

Gly Glu Arg Gly Glu Gln Gly Ala Pro Gly Pro Ser Gly Phe Gln Gly

450 455 460

Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Glu Gly Gly Lys Pro Gly Asp

465 470 475 480

Gln Gly Val Pro Gly Glu Ala Gly Ala Pro Gly Leu Val Gly Pro Arg

485 490 495

Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Ser Pro Gly Ser Gln Gly

500 505 510

Leu Gln Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Thr Pro Gly Thr Asp Gly Pro

515 520 525

Lys Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ala Gln Gly Pro Pro

530 535 540

Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile Ala Gly

545 550 555 560

Pro Lys Gly Asp Arg Gly Asp Val Gly Glu Lys Gly Pro Glu Gly Ala

565 570 575

Pro Gly Lys Asp Gly Gly Arg Gly Leu Thr Gly Pro Ile Gly Pro Pro

580 585 590

Gly Pro Ala Gly Ala Asn Gly Glu Lys Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly

595 600 605

Pro Ala Gly Thr Ala Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Glu

610 615 620

Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro Pro Gly Ala Asp

625 630 635 640

Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Glu Gln Gly Glu Ala Gly Gln Lys Gly

645 650 655

Asp Ala Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Pro Ser Gly Ala Pro Gly Pro

660 665 670

Gln Gly Pro Thr Gly Val Thr Gly Pro Lys Gly Ala Arg Gly Ala Gln

675 680 685

Gly Pro Pro Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly Arg Val Gly

690 695 700

Pro Pro Gly Ser Asn Gly Asn Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro

705 710 715 720

Ser Gly Lys Asp Gly Pro Lys Gly Ala Arg Gly Asp Ser Gly Pro Pro

725 730 735

Gly Arg Ala Gly Asp Pro Gly Leu Gln Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly

740 745 750

Glu Lys Gly Glu Pro Gly Asp Asp Gly Pro Ser Gly Pro Asp Gly Pro

755 760 765

Pro Gly Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Arg Gly Ile Val Gly Leu Pro

770 775 780

Gly Gln Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly

785 790 795 800

Glu Pro Gly Lys Gln Gly Ala Pro Gly Ala Ser Gly Asp Arg Gly Pro

805 810 815

Pro Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Leu Thr Gly Pro Ala Gly Glu Pro

820 825 830

Gly Arg Glu Gly Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly

835 840 845

Ala Ala Gly Val Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Ala Val Gly Ala

850 855 860

Pro Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ile

865 870 875 880

Gly Lys Gln Gly Asp Arg Gly Glu Ala Gly Ala Gln Gly Pro Met Gly

885 890 895

Pro Ala Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Met Pro Gly Pro Gln Gly Pro

900 905 910

Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Ala Gly Glu Arg Gly Leu Lys

915 920 925

Gly His Arg Gly Phe Thr Gly Leu Gln Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly

930 935 940

Pro Ser Gly Asp Gln Gly Ala Ser Gly Pro Ala Gly Pro Ser Gly Pro

945 950 955 960

Arg Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Pro Ser Gly Lys Asp Gly Ala Asn

965 970 975

Gly Ile Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Arg Ser Gly

980 985 990

Glu Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly Pro Pro Gly Pro

995 1000 1005

Pro Gly Pro Pro

1010

<210> 3

<211> 1500

<212> DNA

<213> 牛（Bos taurus）

<400> 3

atgggaccaa tgggcccaag aggtcctcct ggaccagccg gtgcaccagg tcctcagggt 60

tttcaaggta acccaggtga gcctggtgag ccaggtgttt ctggtcctat gggtcctcgt 120

ggccctcctg gtcctccagg caagcctggt gatgatggtg aagctggaaa gccaggtaag 180

tctggtgaaa gaggcccacc aggtccacaa ggtgctagag gatttccagg tactcctggt 240

ttgcctggtg ttaagggtca tagaggttac ccaggtttgg atggtgctaa aggtgaagcc 300

ggtgctcccg gtgtcaaagg tgaatctggt tctcctggtg aaaacggttc tcccggacct 360

atgggaccta gaggtttacc tggtgagaga ggtagaactg gtccagctgg tgctgctggt 420

gccagaggaa atgatggaca accaggacct gctggtcctc ctggtcctgt tggtccagct 480

ggcggtccag gatttcctgg tgctccaggt gcaaaaggcg aagctggacc tactggtgct 540

aggggtcctg aaggtgctca aggacccaga ggcgaacctg gaacacccgg atctccaggt 600

cctgccggcg ctgctggtaa tcctggtact gatggaatac caggtgctaa gggttctgct 660

ggcgctcctg gaatagctgg tgcccctggt tttccaggac ctaggggtcc tccaggacct 720

caaggtgcta ctggaccatt aggtcctaaa ggtcagactg gcgaaccagg tattgctggt 780

ttcaagggtg aacagggacc aaaaggtgag cccggtccag ccggaccaca gggtgcccca 840

ggaccagctg gcgaagaggg taaacgtggt gcaaggggtg aacccggtgg tgccggtcct 900

gcaggcccac ctggtgaacg tggcgcccca ggtaatagag gattccctgg acaagatggt 960

ttggccggtc ctaagggcgc accaggtgaa aggggtccat ctggtttagc tggtcccaaa 1020

ggtgcaaatg gtgatccagg tagaccaggc gagccaggtt tgccaggtgc tcgtggatta 1080

actggtagac ctggtgacgc tggaccacaa ggtaaagttg gtccatcagg tgcacccggt 1140

gaagatggta gacccggtcc tccaggtcca cagggcgcaa gaggtcaacc tggtgttatg 1200

ggattccccg gacctaaggg tgctaatggc gagcctggaa aagccggtga aaaaggattg 1260

ccaggcgctc caggacttag aggacttcct ggtaaggacg gtgaaacagg tgctgccggt 1320

ccacctggac ctgctggacc cgctggtgaa aggggcgaac aaggtgcacc aggaccttcc 1380

ggatttcaag gtctgcccgg accacctggt cctccaggtg aaggtggtaa accaggtgat 1440

caaggtgtcc ctggtgaggc tggcgcacct ggtctagttg gaccaagggg cgagcgtgga 1500

<210> 4

<211> 500

<212> PRT

<213> 牛（Bos taurus）

<400> 4

Met Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro

1 5 10 15

Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Asn Pro Gly Glu Pro Gly Glu Pro Gly

20 25 30

Val Ser Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys

35 40 45

Pro Gly Asp Asp Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Lys Ser Gly Glu Arg

50 55 60

Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Phe Pro Gly Thr Pro Gly

65 70 75 80

Leu Pro Gly Val Lys Gly His Arg Gly Tyr Pro Gly Leu Asp Gly Ala

85 90 95

Lys Gly Glu Ala Gly Ala Pro Gly Val Lys Gly Glu Ser Gly Ser Pro

100 105 110

Gly Glu Asn Gly Ser Pro Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly

115 120 125

Glu Arg Gly Arg Thr Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Ala Arg Gly Asn

130 135 140

Asp Gly Gln Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Pro Ala

145 150 155 160

Gly Gly Pro Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Glu Ala Gly

165 170 175

Pro Thr Gly Ala Arg Gly Pro Glu Gly Ala Gln Gly Pro Arg Gly Glu

180 185 190

Pro Gly Thr Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Asn Pro

195 200 205

Gly Thr Asp Gly Ile Pro Gly Ala Lys Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly

210 215 220

Ile Ala Gly Ala Pro Gly Phe Pro Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro

225 230 235 240

Gln Gly Ala Thr Gly Pro Leu Gly Pro Lys Gly Gln Thr Gly Glu Pro

245 250 255

Gly Ile Ala Gly Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly

260 265 270

Pro Ala Gly Pro Gln Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Glu Glu Gly Lys

275 280 285

Arg Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly Gly Ala Gly Pro Ala Gly Pro Pro

290 295 300

Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Asn Arg Gly Phe Pro Gly Gln Asp Gly

305 310 315 320

Leu Ala Gly Pro Lys Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Pro Ser Gly Leu

325 330 335

Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asn Gly Asp Pro Gly Arg Pro Gly Glu Pro

340 345 350

Gly Leu Pro Gly Ala Arg Gly Leu Thr Gly Arg Pro Gly Asp Ala Gly

355 360 365

Pro Gln Gly Lys Val Gly Pro Ser Gly Ala Pro Gly Glu Asp Gly Arg

370 375 380

Pro Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Gln Pro Gly Val Met

385 390 395 400

Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Ala Asn Gly Glu Pro Gly Lys Ala Gly

405 410 415

Glu Lys Gly Leu Pro Gly Ala Pro Gly Leu Arg Gly Leu Pro Gly Lys

420 425 430

Asp Gly Glu Thr Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala

435 440 445

Gly Glu Arg Gly Glu Gln Gly Ala Pro Gly Pro Ser Gly Phe Gln Gly

450 455 460

Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Glu Gly Gly Lys Pro Gly Asp

465 470 475 480

Gln Gly Val Pro Gly Glu Ala Gly Ala Pro Gly Leu Val Gly Pro Arg

485 490 495

Gly Glu Arg Gly

500

<210> 5

<211> 765

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工核苷酸序列

<400> 5

atgaggcagg tttggttctc ttggattgtg ggattgttcc tatgtttttt caacgtgtct 60

tctgctcatc atcaccacca tcacatggtt ctgtccaaat cctgtgtttc acacttccga 120

aatgtaggtt ctctaaacag tagagatgtt aatcttaaag acgatttcag ctatgccaat 180

attgatgatc cttacaataa gccatttgtg cttaataacc tgattaaccc tactaagtgt 240

caagaaatca tgcaatttgc aaatggcaag ttgtttgatt cacaggtttt gtctgggact 300

gacaagaaca ttagaaactc gcaacaaatg tggattagca agaacaatcc tatggtaaag 360

ccaatctttg agaatatttg cagacagttc aatgttccct ttgacaatgc tgaagatttg 420

caagtcgttc gttatcttcc aaaccagtac tataacgaac accatgactc gtgttgtgac 480

tcttcaaaac aatgcagtga gttcattgag agaggtggtc aaaggatttt gacagtcttg 540

atctacctaa acaatgagtt cagtgatgga cacacttact ttccgaactt aaaccagaaa 600

ttcaagccca aaactggaga tgcattagtc ttttatccat tggccaataa ctctaacaaa 660

tgccatccat actccttaca tgctggtatg cctgtaacat ctggagaaaa gtggattgct 720

aatttgtggt ttagagaacg taaattctcc catgatgaat tgtaa 765

<210> 6

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工氨基酸序列

<400> 6

Met Arg Gln Val Trp Phe Ser Trp Ile Val Gly Leu Phe Leu Cys Phe

1 5 10 15

Phe Asn Val Ser Ser Ala His His His His His His Met Val Leu Ser

20 25 30

Lys Ser Cys Val Ser His Phe Arg Asn Val Gly Ser Leu Asn Ser Arg

35 40 45

Asp Val Asn Leu Lys Asp Asp Phe Ser Tyr Ala Asn Ile Asp Asp Pro

50 55 60

Tyr Asn Lys Pro Phe Val Leu Asn Asn Leu Ile Asn Pro Thr Lys Cys

65 70 75 80

Gln Glu Ile Met Gln Phe Ala Asn Gly Lys Leu Phe Asp Ser Gln Val

85 90 95

Leu Ser Gly Thr Asp Lys Asn Ile Arg Asn Ser Gln Gln Met Trp Ile

100 105 110

Ser Lys Asn Asn Pro Met Val Lys Pro Ile Phe Glu Asn Ile Cys Arg

115 120 125

Gln Phe Asn Val Pro Phe Asp Asn Ala Glu Asp Leu Gln Val Val Arg

130 135 140

Tyr Leu Pro Asn Gln Tyr Tyr Asn Glu His His Asp Ser Cys Cys Asp

145 150 155 160

Ser Ser Lys Gln Cys Ser Glu Phe Ile Glu Arg Gly Gly Gln Arg Ile

165 170 175

Leu Thr Val Leu Ile Tyr Leu Asn Asn Glu Phe Ser Asp Gly His Thr

180 185 190

Tyr Phe Pro Asn Leu Asn Gln Lys Phe Lys Pro Lys Thr Gly Asp Ala

195 200 205

Leu Val Phe Tyr Pro Leu Ala Asn Asn Ser Asn Lys Cys His Pro Tyr

210 215 220

Ser Leu His Ala Gly Met Pro Val Thr Ser Gly Glu Lys Trp Ile Ala

225 230 235 240

Asn Leu Trp Phe Arg Glu Arg Lys Phe Ser His Asp Glu Leu

245 250

<210> 7

<211> 7311

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pAOXsec-ColII-1

<400> 7

ggaggatcct tcagtaatgt cttgtttctt ttgttgcagt ggtgagccat tttgacttcg 60

tgaaagtttc tttagaatag ttgtttccag aggccaaaca ttccacccgt agtaaagtgc 120

aagcgtagga agaccaagac tggcataaat caggtataag tgtcgagcac tggcaggtga 180

tcttctgaaa gtttctacta gcagataaga tccagtagtc atgcatatgg caacaatgta 240

ccgtgtggat ctaagaacgc gtcctactaa ccttcgcatt cgttggtcca gtttgttgtt 300

atcgatcaac gtgacaaggt tgtcgattcc gcgtaagcat gcatacccaa ggacgcctgt 360

tgcaattcca agtgagccag ttccaacaat ctttgtaata ttagagcact tcattgtgtt 420

gcgcttgaaa gtaaaatgcg aacaaattaa gagataatct cgaaaccgcg acttcaaacg 480

ccaatatgat gtgcggcaca caataagcgt tcatatccgc tgggtgactt tctcgcttta 540

aaaaattatc cgaaaaaatt ttctagagtg ttgttacttt atacttccgg ctcgtataat 600

acgacaaggt gtaaggagga ctaaaccatg gctaaactca cctctgctgt tccagtcctg 660

actgctcgtg atgttgctgg tgctgttgag ttctggactg ataggctcgg tttctcccgt 720

gacttcgtag aggacgactt tgccggtgtt gtacgtgacg acgttaccct gttcatctcc 780

gcagttcagg accaggttgt gccagacaac actctggcat gggtatgggt tcgtggtctg 840

gacgaactgt acgctgagtg gtctgaggtc gtgtctacca acttccgtga tgcatctggt 900

ccagctatga ccgagatcgg tgaacagccc tggggtcgtg agtttgcact gcgtgatcca 960

gctggtaact gcgtgcattt cgtcgcagaa gagcaggact aacaattgac accttacgat 1020

tatttagaga gtatttatta gttttattgt atgtatacgg atgttttatt atctatttat 1080

gcccttatat tctgtaacta tccaaaagtc ctatcttatc aagccagcaa tctatgtccg 1140

cgaacgtcaa ctaaaaataa gctttttatg ctcttctctc tttttttccc ttcggtataa 1200

ttataccttg catccacaga ttctcctgcc aaattttgca taatccttta caacatggct 1260

atatgggagc acttagcgcc ctccaaaacc catattgcct acgcatgtat aggtgttttt 1320

tccacaatat tttctctgtg ctctcttttt attaaagaga agctctatat cggagaagct 1380

tctgtggccg ttatattcgg ccttatcgtg ggaccacatt gcctgaattg gtttgccccg 1440

gaagattggg gaaacttgga tctgattacc ttagctgcag ggcgcgccga actgtgagac 1500

tatctcggtt atgacagcag aaatgtcctt cttggagaca gtaaatgaag tcccaccaat 1560

aaagaaatcc ttgttatcag gaacaaactt cttgtttcga actttttcgg tgccttgaac 1620

tataaaatgt agagtggata tgtcgggtag gaatggagcg ggcaaatgct taccttctgg 1680

accttcaaga ggtatgtagg gtttgtagat actgatgcca acttcagtga caacgttgct 1740

atttcgttca aaccattccg aatccagaga aatcaaagtt gtttgtctac tattgatcca 1800

agccagtgcg gtcttgaaac tgacaatagt gtgctcgtgt tttgaggtca tctttgtatg 1860

aataaatcta gtctttgatc taaataatct tgacgagcca gacgataata ccaatctaaa 1920

ctctttaaac gttaaaggac aagtatgtct gcctgtatta aaccccaaat cagctcgtag 1980

tctgatcctc atcaacttga ggggcactat cttgttttag agaaatttgc ggagatgcga 2040

tatcgagaaa aaggtacgct gattttaaac gtgaaattta tctcaagatc tatttaaatg 2100

ggtaccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 2160

ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt 2220

tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga 2280

taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag 2340

caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata 2400

agtcgtgtct taccgggttg gacccaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 2460

gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 2520

gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca 2580

ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa 2640

acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt 2700

tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 2760

ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgtagat ctaacatcca aagacgaaag 2820

gttgaatgaa acctttttgc catccgacat ccacaggtcc attctcacac ataagtgcca 2880

aacgcaacag gaggggatac actagcagca gaccgttgca aacgcaggac ctccactcct 2940

cttctcctca acacccactt ttgccatcga aaaaccagcc cagttattgg gcttgattgg 3000

agctcgctca ttccaattcc ttctattagg ctactaacac catgacttta ttagcctgtc 3060

tatcctggcc cccctggcga ggttcatgtt tgtttatttc cgaatgcaac aagctccgca 3120

ttacacccga acatcactcc agatgagggc tttctgagtg tggggtcaaa tagtttcatg 3180

ttccccaaat ggcccaaaac tgacagttta aacgctgtct tggaacctaa tatgacaaaa 3240

gcgtgatctc atccaagatg aactaagttt ggttcgttga aatgctaacg gccagttggt 3300

caaaaagaaa cttccaaaag tcggcatacc gtttgtcttg tttggtattg attgacgaat 3360

gctcaaaaat aatctcatta atgcttagcg cagtctctct atcgcttctg aaccccggtg 3420

cacctgtgcc gaaacgcaaa tggggaaaca cccgcttttt ggatgattat gcattgtctc 3480

cacattgtat gcttccaaga ttctggtggg aatactgctg atagcctaac gttcatgatc 3540

aaaatttaac tgttctaacc cctacttgac agcaatatat aaacagaagg aagctgccct 3600

gtcttaaacc ttttttttta tcatcattat tagcttactt tcataattgc gactggttcc 3660

aattgacaag cttttgattt taacgacttt taacgacaac ttgagaagat caaaaaacaa 3720

ctaattattc gaaacgatga ggcaggtttg gttctcttgg attgtgggat tgttcctatg 3780

ttttttcaac gtgtcttctg ctcctgttaa cactaccact gaagacgaga ctgctcaaat 3840

tccagctgaa gcagttatcg gttactctga ccttgagggt gatttcgacg tcgctgtttt 3900

gcctttctct aactccacta acaacggttt gttgttcatt aacaccacta tcgcttccat 3960

tgctgctaag gaagagggtg tctctctcga gaagagagag gccgaagcta tgggaccaat 4020

gggcccaaga ggtcctcctg gaccagccgg tgcaccaggt cctcagggtt ttcaaggtaa 4080

cccaggtgag cctggtgagc caggtgtttc tggtcctatg ggtcctcgtg gccctcctgg 4140

tcctccaggc aagcctggtg atgatggtga agctggaaag ccaggtaagt ctggtgaaag 4200

aggcccacca ggtccacaag gtgctagagg atttccaggt actcctggtt tgcctggtgt 4260

taagggtcat agaggttacc caggtttgga tggtgctaaa ggtgaagccg gtgctcccgg 4320

tgtcaaaggt gaatctggtt ctcctggtga aaacggttct cccggaccta tgggacctag 4380

aggtttacct ggtgagagag gtagaactgg tccagctggt gctgctggtg ccagaggaaa 4440

tgatggacaa ccaggacctg ctggtcctcc tggtcctgtt ggtccagctg gcggtccagg 4500

atttcctggt gctccaggtg caaaaggcga agctggacct actggtgcta ggggtcctga 4560

aggtgctcaa ggacccagag gcgaacctgg aacacccgga tctccaggtc ctgccggcgc 4620

tgctggtaat cctggtactg atggaatacc aggtgctaag ggttctgctg gcgctcctgg 4680

aatagctggt gcccctggtt ttccaggacc taggggtcct ccaggacctc aaggtgctac 4740

tggaccatta ggtcctaaag gtcagactgg cgaaccaggt attgctggtt tcaagggtga 4800

acagggacca aaaggtgagc ccggtccagc cggaccacag ggtgccccag gaccagctgg 4860

cgaagagggt aaacgtggtg caaggggtga acccggtggt gccggtcctg caggcccacc 4920

tggtgaacgt ggcgccccag gtaatagagg attccctgga caagatggtt tggccggtcc 4980

taagggcgca ccaggtgaaa ggggtccatc tggtttagct ggtcccaaag gtgcaaatgg 5040

tgatccaggt agaccaggcg agccaggttt gccaggtgct cgtggattaa ctggtagacc 5100

tggtgacgct ggaccacaag gtaaagttgg tccatcaggt gcacccggtg aagatggtag 5160

acccggtcct ccaggtccac agggcgcaag aggtcaacct ggtgttatgg gattccccgg 5220

acctaagggt gctaatggcg agcctggaaa agccggtgaa aaaggattgc caggcgctcc 5280

aggacttaga ggacttcctg gtaaggacgg tgaaacaggt gctgccggtc cacctggacc 5340

tgctggaccc gctggtgaaa ggggcgaaca aggtgcacca ggaccttccg gatttcaagg 5400

tctgcccgga ccacctggtc ctccaggtga aggtggtaaa ccaggtgatc aaggtgtccc 5460

tggtgaggct ggcgcacctg gtctagttgg accaaggggc gagcgtggat ttcccggcga 5520

aagaggttct ccaggttctc aaggattgca aggtgccagg ggattgcccg gaactcccgg 5580

tacagacggc cctaaaggtg cagcaggccc cgcaggacct cctggcgcac aaggccctcc 5640

aggattgcag ggtatgccag gcgagagagg tgcagctggt attgcaggac ccaagggtga 5700

tcgtggtgat gttggagaaa aaggcccaga aggcgctccc ggtaaggatg gtggtagagg 5760

tttgactggt ccaattggcc cacctggtcc agccggcgct aatggtgaaa aaggtgaagt 5820

tggcccacca ggacctgccg gtacagctgg tgctagaggt gccccaggtg aaagaggtga 5880

aacaggacct ccaggtccag ccggttttgc tggtccacca ggtgctgatg gtcagcctgg 5940

tgccaagggc gagcagggtg aagcaggtca aaagggcgac gcaggcgccc ctggacctca 6000

gggtcctagc ggagccccag gtcctcaagg accaactggt gttactggac ctaaaggcgc 6060

cagaggtgca cagggtccac caggcgctac tggtttccca ggtgccgctg gtagagttgg 6120

acctcctggt tctaatggta atcccggacc tcctggacca cctggtccat ctggtaaaga 6180

tggacctaaa ggtgctcgtg gtgattctgg tccacctggc agagctggtg accctggatt 6240

gcaaggccct gccggaccac caggcgaaaa gggcgaacct ggtgatgacg gtccttctgg 6300

tccagatggc cctccaggac cacaaggatt ggctggtcaa agaggtatcg ttggtttgcc 6360

aggacaaaga ggtgagagag gattcccagg tttaccagga ccatcaggcg agcccggtaa 6420

acaaggcgca cccggcgcta gcggtgatag gggccctcct ggacctgtgg gaccaccagg 6480

attgacagga cctgcaggcg aaccaggcag agaaggtagt ccaggtgccg acggtccacc 6540

aggtagagat ggcgctgctg gtgtaaaagg tgataggggt gaaactggtg cagttggagc 6600

cccaggcgct cccggacctc caggttctcc tggacctgca ggcccaattg gtaaacaagg 6660

tgatagaggt gaggccggtg cacaaggacc aatgggtccc gccggtcctg ccggtgcaag 6720

aggtatgcct ggtccacagg gtccccgtgg tgacaaaggt gagacaggtg aagctggcga 6780

aagaggattg aagggacaca gaggttttac cggtctgcaa ggattacccg gtccacctgg 6840

tccaagtggt gatcaaggtg cttctggtcc tgctggtccc tctggaccaa gaggcccacc 6900

tggacctgtc ggtccttctg gaaaagatgg tgctaacggt attccaggtc caattggtcc 6960

accaggacct agaggtagat ctggtgaaac cggacctgct ggacctccag gtaaccctgg 7020

tcctcctggt ccaccaggac ctccataatc aagaggatgt cagaatgcca tttgcctgag 7080

agatgcaggc ttcatttttg atactttttt atttgtaacc tatatagtat aggatttttt 7140

ttgtcatttt gtttcttctc gtacgagctt gctcctgatc agcctatctc gcagctgatg 7200

aatatcttgt ggtaggggtt tgggaaaatc attcgagttt gatgtttttc ttggtatttc 7260

ccactcctct tcagagtaca gaagattaag tgagacgttc gtttgtgctc c 7311

<210> 8

<211> 5154

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pAOXsec-ColII-1 s.a

<400> 8

ggatccttca gtaatgtctt gtttcttttg ttgcagtggt gagccatttt gacttcgtga 60

aagtttcttt agaatagttg tttccagagg ccaaacattc cacccgtagt aaagtgcaag 120

cgtaggaaga ccaagactgg cataaatcag gtataagtgt cgagcactgg caggtgatct 180

tctgaaagtt tctactagca gataagatcc agtagtcatg catatggcaa caatgtaccg 240

tgtggatcta agaacgcgtc ctactaacct tcgcattcgt tggtccagtt tgttgttatc 300

gatcaacgtg acaaggttgt cgattccgcg taagcatgca tacccaagga cgcctgttgc 360

aattccaagt gagccagttc caacaatctt tgtaatatta gagcacttca ttgtgttgcg 420

cttgaaagta aaatgcgaac aaattaagag ataatctcga aaccgcgact tcaaacgcca 480

atatgatgtg cggcacacaa taagcgttca tatccgctgg gtgactttct cgctttaaaa 540

aattatccga aaaaattttc tagagtgttg ttactttata cttccggctc gtataatacg 600

acaaggtgta aggaggacta aaccatggct aaactcacct ctgctgttcc agtcctgact 660

gctcgtgatg ttgctggtgc tgttgagttc tggactgata ggctcggttt ctcccgtgac 720

ttcgtagagg acgactttgc cggtgttgta cgtgacgacg ttaccctgtt catctccgca 780

gttcaggacc aggttgtgcc agacaacact ctggcatggg tatgggttcg tggtctggac 840

gaactgtacg ctgagtggtc tgaggtcgtg tctaccaact tccgtgatgc atctggtcca 900

gctatgaccg agatcggtga acagccctgg ggtcgtgagt ttgcactgcg tgatccagct 960

ggtaactgcg tgcatttcgt cgcagaagag caggactaac aattgacacc ttacgattat 1020

ttagagagta tttattagtt ttattgtatg tatacggatg ttttattatc tatttatgcc 1080

cttatattct gtaactatcc aaaagtccta tcttatcaag ccagcaatct atgtccgcga 1140

acgtcaacta aaaataagct ttttatgctc ttctctcttt ttttcccttc ggtataatta 1200

taccttgcat ccacagattc tcctgccaaa ttttgcataa tcctttacaa catggctata 1260

tgggagcact tagcgccctc caaaacccat attgcctacg catgtatagg tgttttttcc 1320

acaatatttt ctctgtgctc tctttttatt aaagagaagc tctatatcgg agaagcttct 1380

gtggccgtta tattcggcct tatcgtggga ccacattgcc tgaattggtt tgccccggaa 1440

gattggggaa acttggatct gattacctta gctgcaggta ccactgagcg tcagaccccg 1500

tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 1560

aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 1620

tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt 1680

agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 1740

taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggacc 1800

caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 1860

agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 1920

aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 1980

gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg 2040

tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga 2100

gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt 2160

ttgctcacat gtagatctaa catccaaaga cgaaaggttg aatgaaacct ttttgccatc 2220

cgacatccac aggtccattc tcacacataa gtgccaaacg caacaggagg ggatacacta 2280

gcagcagacc gttgcaaacg caggacctcc actcctcttc tcctcaacac ccacttttgc 2340

catcgaaaaa ccagcccagt tattgggctt gattggagct cgctcattcc aattccttct 2400

attaggctac taacaccatg actttattag cctgtctatc ctggcccccc tggcgaggtt 2460

catgtttgtt tatttccgaa tgcaacaagc tccgcattac acccgaacat cactccagat 2520

gagggctttc tgagtgtggg gtcaaatagt ttcatgttcc ccaaatggcc caaaactgac 2580

agtttaaacg ctgtcttgga acctaatatg acaaaagcgt gatctcatcc aagatgaact 2640

aagtttggtt cgttgaaatg ctaacggcca gttggtcaaa aagaaacttc caaaagtcgg 2700

cataccgttt gtcttgtttg gtattgattg acgaatgctc aaaaataatc tcattaatgc 2760

ttagcgcagt ctctctatcg cttctgaacc ccggtgcacc tgtgccgaaa cgcaaatggg 2820

gaaacacccg ctttttggat gattatgcat tgtctccaca ttgtatgctt ccaagattct 2880

ggtgggaata ctgctgatag cctaacgttc atgatcaaaa tttaactgtt ctaaccccta 2940

cttgacagca atatataaac agaaggaagc tgccctgtct taaacctttt tttttatcat 3000

cattattagc ttactttcat aattgcgact ggttccaatt gacaagcttt tgattttaac 3060

gacttttaac gacaacttga gaagatcaaa aaacaactaa ttattcgaaa cgatgaggca 3120

ggtttggttc tcttggattg tgggattgtt cctatgtttt ttcaacgtgt cttctgctcc 3180

tgttaacact accactgaag acgagactgc tcaaattcca gctgaagcag ttatcggtta 3240

ctctgacctt gagggtgatt tcgacgtcgc tgttttgcct ttctctaact ccactaacaa 3300

cggtttgttg ttcattaaca ccactatcgc ttccattgct gctaaggaag agggtgtctc 3360

tctcgagaag agagaggccg aagctatggg accaatgggc ccaagaggtc ctcctggacc 3420

agccggtgca ccaggtcctc agggttttca aggtaaccca ggtgagcctg gtgagccagg 3480

tgtttctggt cctatgggtc ctcgtggccc tcctggtcct ccaggcaagc ctggtgatga 3540

tggtgaagct ggaaagccag gtaagtctgg tgaaagaggc ccaccaggtc cacaaggtgc 3600

tagaggattt ccaggtactc ctggtttgcc tggtgttaag ggtcatagag gttacccagg 3660

tttggatggt gctaaaggtg aagccggtgc tcccggtgtc aaaggtgaat ctggttctcc 3720

tggtgaaaac ggttctcccg gacctatggg acctagaggt ttacctggtg agagaggtag 3780

aactggtcca gctggtgctg ctggtgccag aggaaatgat ggacaaccag gacctgctgg 3840

tcctcctggt cctgttggtc cagctggcgg tccaggattt cctggtgctc caggtgcaaa 3900

aggcgaagct ggacctactg gtgctagggg tcctgaaggt gctcaaggac ccagaggcga 3960

acctggaaca cccggatctc caggtcctgc cggcgctgct ggtaatcctg gtactgatgg 4020

aataccaggt gctaagggtt ctgctggcgc tcctggaata gctggtgccc ctggttttcc 4080

aggacctagg ggtcctccag gacctcaagg tgctactgga ccattaggtc ctaaaggtca 4140

gactggcgaa ccaggtattg ctggtttcaa gggtgaacag ggaccaaaag gtgagcccgg 4200

tccagccgga ccacagggtg ccccaggacc agctggcgaa gagggtaaac gtggtgcaag 4260

gggtgaaccc ggtggtgccg gtcctgcagg cccacctggt gaacgtggcg ccccaggtaa 4320

tagaggattc cctggacaag atggtttggc cggtcctaag ggcgcaccag gtgaaagggg 4380

tccatctggt ttagctggtc ccaaaggtgc aaatggtgat ccaggtagac caggcgagcc 4440

aggtttgcca ggtgctcgtg gattaactgg tagacctggt gacgctggac cacaaggtaa 4500

agttggtcca tcaggtgcac ccggtgaaga tggtagaccc ggtcctccag gtccacaggg 4560

cgcaagaggt caacctggtg ttatgggatt ccccggacct aagggtgcta atggcgagcc 4620

tggaaaagcc ggtgaaaaag gattgccagg cgctccagga cttagaggac ttcctggtaa 4680

ggacggtgaa acaggtgctg ccggtccacc tggacctgct ggacccgctg gtgaaagggg 4740

cgaacaaggt gcaccaggac cttccggatt tcaaggtctg cccggaccac ctggtcctcc 4800

aggtgaaggt ggtaaaccag gtgatcaagg tgtccctggt gaggctggcg cacctggtct 4860

agttggacca aggggcgagc gtggataatc aagaggatgt cagaatgcca tttgcctgag 4920

agatgcaggc ttcatttttg atactttttt atttgtaacc tatatagtat aggatttttt 4980

ttgtcatttt gtttcttctc gtacgagctt gctcctgatc agcctatctc gcagctgatg 5040

aatatcttgt ggtaggggtt tgggaaaatc attcgagttt gatgtttttc ttggtatttc 5100

ccactcctct tcagagtaca gaagattaag tgagacgttc gtttgtgctc cgga 5154

<210> 9

<211> 4348

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pAOX_Mimi-int 3.0

<400> 9

atttaaatag atctaacatc caaagacgaa aggttgaatg aaaccttttt gccatccgac 60

atccacaggt ccattctcac acataagtgc caaacgcaac aggaggggat acactagcag 120

cagaccgttg caaacgcagg acctccactc ctcttctcct caacacccac ttttgccatc 180

gaaaaaccag cccagttatt gggcttgatt ggagctcgct cattccaatt ccttctatta 240

ggctactaac accatgactt tattagcctg tctatcctgg cccccctggc gaggttcatg 300

tttgtttatt tccgaatgca acaagctccg cattacaccc gaacatcact ccagatgagg 360

gctttctgag tgtggggtca aatagtttca tgttccccaa atggcccaaa actgacagtt 420

taaacgctgt cttggaacct aatatgacaa aagcgtgatc tcatccaaga tgaactaagt 480

ttggttcgtt gaaatgctaa cggccagttg gtcaaaaaga aacttccaaa agtcggcata 540

ccgtttgtct tgtttggtat tgattgacga atgctcaaaa ataatctcat taatgcttag 600

cgcagtctct ctatcgcttc tgaaccccgg tgcacctgtg ccgaaacgca aatggggaaa 660

cacccgcttt ttggatgatt atgcattgtc tccacattgt atgcttccaa gattctggtg 720

ggaatactgc tgatagccta acgttcatga tcaaaattta actgttctaa cccctacttg 780

acagcaatat ataaacagaa ggaagctgcc ctgtcttaaa cctttttttt tatcatcatt 840

attagcttac tttcataatt gcgactggtt ccaattgaca agcttttgat tttaacgact 900

tttaacgaca acttgagaag atcaaaaaac aactaattat tcgaaacgat gaggcaggtt 960

tggttctctt ggattgtggg attgttccta tgttttttca acgtgtcttc tgctcatcat 1020

caccaccatc acatggttct gtccaaatcc tgtgtttcac acttccgaaa tgtaggttct 1080

ctaaacagta gagatgttaa tcttaaagac gatttcagct atgccaatat tgatgatcct 1140

tacaataagc catttgtgct taataacctg attaacccta ctaagtgtca agaaatcatg 1200

caatttgcaa atggcaagtt gtttgattca caggttttgt ctgggactga caagaacatt 1260

agaaactcgc aacaaatgtg gattagcaag aacaatccta tggtaaagcc aatctttgag 1320

aatatttgca gacagttcaa tgttcccttt gacaatgctg aagatttgca agtcgttcgt 1380

tatcttccaa accagtacta taacgaacac catgactcgt gttgtgactc ttcaaaacaa 1440

tgcagtgagt tcattgagag aggtggtcaa aggattttga cagtcttgat ctacctaaac 1500

aatgagttca gtgatggaca cacttacttt ccgaacttaa accagaaatt caagcccaaa 1560

actggagatg cattagtctt ttatccattg gccaataact ctaacaaatg ccatccatac 1620

tccttacatg ctggtatgcc tgtaacatct ggagaaaagt ggattgctaa tttgtggttt 1680

agagaacgta aattctccca tgatgaattg taatcaagag gatgtcagaa tgccatttgc 1740

ctgagagatg caggcttcat ttttgatact tttttatttg taacctatat agtataggat 1800

tttttttgtc attttgtttc ttctcgtacg agcttgctcc tgatcagcct atctcgcagc 1860

agatgaatat cttgtggtag gggtttggga aaatcattcg agtttgatgt ttttcttggt 1920

atttcccact cctcttcaga gtacagaaga ttaagtgaga ccttcgtttg tgcggatcct 1980

tcagtaatgt cttgtttctt ttgttgcagt ggtgagccat tttgacttcg tgaaagtttc 2040

tttagaatag ttgtttccag aggccaaaca ttccacccgt agtaaagtgc aagcgtagga 2100

agaccaagac tggcataaat caggtataag tgtcgagcac tggcaggtga tcttctgaaa 2160

gtttctacta gcagataaga tccagtagtc atgcatatgg caacaatgta ccgtgtggat 2220

ctaagaacgc gtcctactaa ccttcgcatt cgttggtcca gtttgttgtt atcgatcaac 2280

gtgacaaggt tgtcgattcc gcgtaagcat gcatacccaa ggacgcctgt tgcaattcca 2340

agtgagccag ttccaacaat ctttgtaata ttagagcact tcattgtgtt gcgcttgaaa 2400

gtaaaatgcg aacaaattaa gagataatct cgaaaccgcg acttcaaacg ccaatatgat 2460

gtgcggcaca caataagcgt tcatatccgc tgggtgactt tctcgcttta aaaaattatc 2520

cgaaaaaatt ttctagagtg ttgttacttt atacttccgg ctcgtataat acgacaaggt 2580

gtaaggagga ctaaaccatg agccatattc aacgggaaac gtcttgctcg aggccgcgat 2640

taaattccaa catggatgct gatttatatg ggtataaatg ggctcgcgat aatgtcgggc 2700

aatcaggtgc gacaatctat cgattgtatg ggaagcccga tgcgccagag ttgtttctga 2760

aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg ttacagatga gatggtcaga ctaaactggc 2820

tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca agcattttat ccgtactcct gatgatgcat 2880

ggttactcac cactgcgatc cccggcaaaa cagcattcca ggtattagaa gaatatcctg 2940

attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg cagtgttcct gcgccggttg cattcgattc 3000

ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc gcgtatttcg tctcgctcag gcgcaatcac 3060

gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga cgagcgtaat ggctggcctg 3120

ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataagc ttttgccatt ctcaccggat tcagtcgtca 3180

ctcatggtga tttctcactt gataacctta tttttgacga ggggaaatta ataggttgta 3240

ttgatgttgg acgagtcgga atcgcagacc gataccagga tcttgccatc ctatggaact 3300

gcctcggtga gttttctcct tcattacaga aacggctttt tcaaaaatat ggtattgata 3360

atcctgatat gaataaattg cagtttcatt tgatgctcga tgagtttttc taatcagtac 3420

tgacaataaa aagattcttg ttttcaagaa cttgtcattt gtatagtttt tttatattgt 3480

agttgttcta ttttaatcaa atgttagcgt gatttatatt ttttttcgcc tcgacatcat 3540

ctgcccagat gcgaagttaa gtgcgcagaa agtaatatca tgcgtcaatc gtatgtgaat 3600

gctggtcgct atactgctgt cgattcgata ctaacgccgc catccagtgt cgagtaccac 3660

tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc 3720

gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat 3780

caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat 3840

actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct 3900

acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt 3960

cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg 4020

gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta 4080

cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg 4140

gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg 4200

tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc 4260

tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg 4320

gccttttgct ggccttttgc tcacatgt 4348

Claims (21)

1.一种用于人类或动物患者软骨疾病口服疗法的重组II型胶原。

2.根据权利要求1所述的重组II型胶原，其中，所述重组II型胶原为II型牛胶原，优选为含SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的II型牛胶原。

3.根据权利要求1或2任一项所述的重组II型胶原，其中，所述重组II型胶原呈II型前胶原或II型成熟胶原形式。

4.根据前述权利要求中任一项所述的重组II型胶原，其中，所述重组II型胶原呈三螺旋形式，特别是II型α1链的同源三聚体形式。

5.根据前述权利要求中任一项所述的重组II型胶原，其中，所述重组II型胶原呈交联或非交联原纤维形式。

6.根据权利要求1或2中任一项所述的重组II型胶原，其中，所述重组II型胶原呈II型胶原肽形式。

7.根据权利要求6所述的重组II型胶原，其中，所述重组II型胶原肽的分子量范围为35-95kDa。

8.根据权利要求1至4中任一项所述的重组II型胶原，其中，所述重组II型胶原为非变性。

9.根据前述权利要求中任一项所述的重组II型胶原，其中，所述重组II型胶原呈完全或部分羟基化、完全或部分糖基化或者完全或部分羟基化且糖基化。

10.根据前述权利要求中任一项所述的重组II型胶原，其中，所述重组II型胶原是通过在真核宿主细胞、特别是酵母细胞、优选是巴斯德毕赤酵母或者原核宿主细胞、特别是大肠杆菌中尤其是呈羟基化形式和/或融合肽形式表达而产生。

11.根据前述权利要求中任一项所述的重组II型胶原，所述重组II型胶原呈分子量均匀、均质、分离的重组II型胶原肽形式存在于II型胶原肽的混合物中或重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽的水解物中。

12.根据前述权利要求中任一项所述的重组II型胶原，其中，所述II型胶原为脊椎动物、特别是猪、羊、牛、啮齿动物、袋鼠、马、鸟、爬行动物、两栖动物或鱼或者无脊椎动物、特别是水母的II型胶原。

13.根据前述权利要求中任一项所述的重组II型胶原，其中，所述软骨疾病为免疫调节类软骨疾病，特别是自身免疫性疾病，尤其是多发性软骨炎或类风湿性关节炎。

14.根据前述权利要求中任一项所述的重组II型胶原，其中，所述软骨疾病为软骨炎症或软骨退变，特别是骨关节炎和/或类风湿性关节炎。

15.一种用于软骨疾病口服疗法的组合物，包含至少一种根据权利要求1至14中任一项所述的重组II型胶原和至少一种可药用或可食用的载体以及任选的至少一种添加剂或至少一种赋形剂。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中，所述至少一种赋形剂为软骨素、硫酸软骨素、透明质酸、Aflapin、Univestin、5-Loxin、葡糖胺、硫酸葡糖胺或甲磺酰甲烷(MSM)。

17.根据权利要求15或15所述的组合物，其中，所述至少一种添加剂为重组生成的胶原水解物、源自天然来源的胶原水解物、重组生成的I型胶原、获自天然来源的I型胶原或上述组合。

18.根据权利要求15至17中任一项所述的组合物，其中，所述组合物呈片剂、含片、咀嚼片、粉末、颗粒、硬胶囊、软胶囊、胶囊、咬胶囊、糖衣丸、锭剂、挤出物、液剂、混悬剂或凝胶形式。

19.根据权利要求15至18中任一项所述的组合，其中，所述组合物适合按1-60毫克/天重组II型胶原的剂量口服。

20.一种用于治疗性处置或治疗性预防II型胶原免疫不耐受、特别是免疫调节类软骨疾病疗法的重组II型胶原，特别是重组II型胶原肽。

21.一种重组II型胶原、特别是重组II型胶原肽在适合口服剂型中维持人类或动物软骨健康的用途。