CN117106717A - 用于cik细胞培养的无血清培养基、培养方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及淋巴细胞培养技术领域的一种用于CIK细胞培养的无血清培养基、培养方法和应用。所述无血清培养基包括基础培养基，且基础培养基中添加有重组人转铁蛋白、重组人胰岛素、重组人白蛋白、乙醇胺、脂质混合物、微量元素、α‑环糊精、非必需氨基酸、碳酸氢钠、烟酰胺单核苷酸和虾青素提取物。本申请所提供的培养基不含人源和动物源成分，所有蛋白成分均为人重组来源，无需搭配人AB血清或动物源血清使用，生物安全性高，且能使CIK细胞在培养基中的增殖倍数、细胞存活率以及阳性率得到显著提升，能够稳定培养出高阳性率（CD3+CD56+）的CIK细胞群，并可以安全用于后续临床治疗等用途，应用前景良好。

Description

用于CIK细胞培养的无血清培养基、培养方法和应用
技术领域
本申请涉及淋巴细胞培养技术领域，尤其是涉及一种用于CIK细胞培养的无血清培养基、培养方法和应用。
背景技术
通常，体外培养的动物细胞的生长均有赖于血清的存在，由于获取的难易程度和数量限制，多使用人AB血清和牛源、马源等动物血清，而人源和动物源血清均存在潜在的外源病毒污染(如HIV-1、HCV、HBV、HCMV、EBV、HPV、HHV-6/7、人细小病毒B19、HTLV1和牛源病毒等)和致病因子感染的风险，此外，由于不同批次血清间的生物活性和因子含量的不一致，导致批次间存在较大差异。
无血清培养基，则是在某种基础培养基的基础上添加了成分明确的血清替代物，如蛋白、脂类、激素和微量元素等物质，替代血清提供给细胞增殖所必需的营养成分，且能够减少血清中不明组分带来的不利因素，稳定细胞培养的条件，缩小批次间差异，也可以简化鉴定各种细胞产物的程序，从源头避免病毒污染造成的危害。
CIK(cytokine-induced killer)细胞即细胞因子诱导的杀伤细胞，由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。因此，应用CIK细胞被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案，而CD3+CD56+的CIK细胞群在正常人外周血和人脐带血中比例较小，仅1％-5％左右，因此有必要对CIK细胞群进行体外培养。
市售的商品化淋巴细胞无血清培养基体外培养的CIK细胞阳性率较低，多不稳定，且增殖较慢，仍需要搭配如人AB血清或胎牛血清等物质来促进细胞增殖，无法实现工业化的大规模稳定培养，更无法排除潜在的病原体污染风险。因此，急需要开发出一款无需额外添加血清的安全性可控、增殖速率和阳性率均佳的无血清培养基用于应对市场需求。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本申请提供一种用于CIK细胞培养的无血清培养基，该培养基不含人源和动物源成分，所有蛋白成分均为人重组来源，无需搭配人AB血清或动物源血清使用，且能够稳定培养出高阳性率(CD3+CD56+)的CIK细胞群，并可以安全用于后续临床治疗等用途。
为此，本申请第一方面提供了一种用于CIK细胞培养的无血清培养基，所述无血清培养基包括基础培养基，且所述基础培养基中添加有重组人转铁蛋白、重组人胰岛素、重组人白蛋白、乙醇胺、脂质混合物、微量元素、α-环糊精、非必需氨基酸、碳酸氢钠、烟酰胺单核苷酸和虾青素提取物。
本申请中，所述无血清培养基中含有的蛋白均为人重组来源，生物安全性高且培养性能稳定。培养基中重组人转铁蛋白、重组人胰岛素和重组人白蛋白的添加，能够提供细胞生长代谢所必须的营养物质；其中，重组人转铁蛋白能与三价铁离子可逆性结合，其在铁离子的转运和代谢中发挥着至关重要的作用，同时也是一种重要的胞外抗氧化剂；重组人胰岛素可以促进糖和氨基酸转运，提高合成代谢降低分解代谢，刺激细胞生长；重组人白蛋白能够维持培养液体系的渗透压和pH值，促进脂质、金属离子、氨基酸和其它因子等重要配体的结合和运输，同时具有抗氧化功能。乙醇胺是一种重要的刺激细胞生长的化合物，是脑磷酸的合成前体；脂质混合物中的脂类是细胞膜的重要组成部分，参与信号转导；微量元素是细胞代谢的主要成分，调节各类酶活反应，对于细胞生长代谢和产物合成都有促进作用；非必需氨基酸是细胞主要的氮源，且可作为细胞生长的能源物质和嘌呤、嘧啶核苷酸的前体；α-环糊精能够增溶脂质，且具有优异的包合特性，有利于保护营养物质的稳定性；碳酸氢钠(NaHCO3)是一种无毒的天然缓冲液，能够稳定培养液体系pH值的变化。
更为重要的是，本申请所述无血清培养基中还包括烟酰胺单核苷酸和虾青素提取物，烟酰胺单核苷酸(β-NMN)是NAD+的前体物质，β-NMN腺苷酸转移酶将β-NMN转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，而NAD+参与线粒体电子传递等多种氧化还原反应，作为多种酶的底物，参与细胞信号传导、DNA损伤修复、表观遗传修饰等生物学过程，能够活化淋巴细胞，促进淋巴细胞增殖；虾青素提取物是一种新型抗氧化剂，具有极强的抗氧化能力，能够从细胞表面和磷脂膜内部清除自由基和促炎因子，减少氧化应激反应并保持线粒体完整性，同时除抗氧化功能外，虾青素还具有免疫调节作用，作用于丝裂原诱导淋巴细胞增殖，增加细胞毒性，提高细胞因子IFN-γ和IL-2分泌量。本申请的发明人通过研究发现，在无血清培养基中添加烟酰胺单核苷酸和虾青素提取物后，能够使CIK细胞在培养基中的增殖倍数、细胞存活率以及阳性率(CD3+CD56+)得到明显提升，获得更佳的CIK细胞培养效果。
本申请对无血清培养基中的基础培养基的具体种类没有明确限定。在一些具体实施方式中，所述基础培养基选自RPMI1640、DMEM、DMEM/F12和IMDM中的任意一种。
本申请中，所述培养基中的重组人转铁蛋白、重组人胰岛素和重组人白蛋白均为市售产品，本领域技术人员可通过常规购买途径获得。
在一些实施方式中，所述基础培养基中包括重组人转铁蛋白1～20mg/L、重组人胰岛素1～20mg/L、重组人白蛋白1～10g/L、乙醇胺0.5～5mg/L、脂质混合物1～5mL/L、微量元素1～10mL/L、α-环糊精0.5～1.5g/L、非必需氨基酸1～5mL/L、碳酸氢钠2～4g/L、烟酰胺单核苷酸1～10mg/L和虾青素提取物5～20mg/L。
本申请通过将基础培养基中各组分的添加量控制在上述范围内，能使制得的无血清培养基对CIK细胞的培养效果更好。
在一些具体实施方式中，所述基础培养基中烟酰胺单核苷酸的含量可以为1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L或10mg/L。在一些优选的实施方式中，所述基础培养基中烟酰胺单核苷酸的含量2～6mg/L。在一些最优选的实施方式中，所述基础培养基中烟酰胺单核苷酸的含量4mg/L。
在一些具体实施方式中，所述基础培养基中虾青素提取物的含量为5mg/L、8mg/L、10mg/L、12mg/L、15mg/L、18mg/L或20mg/L。在一些优选的实施方式中，所述基础培养基中虾青素提取物的含量为8～15mg/L。在一些最优选的实施方式中，所述基础培养基中虾青素提取物的含量为10mg/L。
本申请通过优化培养基中烟酰胺单核苷酸和虾青素提取物的含量，能使制得的无血清培养基具有最佳的CIK细胞培养效果，使CIK细胞在培养基中的增殖倍数、细胞存活率以及阳性率(CD3+CD56+)得到显著提升。
在一些实施方式中，所述脂质混合物选自花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸和生育酚乙酸酯中的一种或多种。
在一些优选的实施方式中，所述脂质混合物为花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸和油酸的混合物，且所述混合物中花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸和油酸的质量比为(1～3):1:1:(1～3)。
在一些更优优选的实施方式中，所述混合物中花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸和油酸的质量比为2:1:1:2。
本申请通过选用上述组成和配比的脂质混合物，能进一提升无血清培养基对CIK细胞的培养效果。
在一些实施方式中，所述微量元素选自亚硒酸钠、柠檬酸铁、偏钒铵酸、氯化锰、硫酸铜和硫酸锌中的一种或多种。
本申请中，上述微量元素中的硒、铁、钒、锰、铜和锌对于细胞生长代谢和产物合成都有促进作用。例如，微量元素中亚硒酸钠中的硒，作为谷胱甘肽过氧化物酶的辅基，具有抗过氧化物能力，参与消除细胞内的脂肪酸过氧化物，提高细胞的生长速率和活性；柠檬酸铁中的铁是铁硫蛋白、过氧化物酶及过氧化氢酶的重要组成部分，在气体运输、生物氧化和酶促反应中发挥重要的作用；硫酸锌中的锌是含锌金属酶的组成成分，它与蛋白的折叠相关，能与蛋白质的二硫键有效结合，影响蛋白的稳定性和活性，在RNA/DNA合成、mRNA稳定及细胞抗凋亡过程中起到不可或缺的作用，锌离子同时还参与了谷胱甘肽和抗氧化酶如超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活化，可保护细胞免受ROS的攻击。
在一些具体的实施方式中，所述微量元素包括亚硒酸钠、偏钒铵酸和氯化锰，且所述基础培养基中亚硒酸钠的含量为20～50ng/L、偏钒铵酸的含量为10～20mg/L，氯化锰的含量为10～20mg/L。
在一些实施方式中，所述非必需氨基酸选自L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甘氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸和L-谷氨酸中的一种或多种。
在一些优选的实施方式中，所述非必需氨基酸为L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甘氨酸、L-丝氨酸和L-脯氨酸的混合物，且所述混合物中L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甘氨酸、L-丝氨酸和L-脯氨酸的质量比为(0.2～1):(1～2):1:(1～2):1:(1～2)。
本申请通过选用上述组成和配比的非必需氨基酸，能进一提升无血清培养基对CIK细胞的培养效果。
在一些实施方式中，所述无血清培养基的的pH值为7.0～7.4。
本申请通过在基础培养基中添加pH调节剂将无血清培养基的pH值控制在7.0～7.4之间，优选控制为7.1。CIK细胞更适合在轻微的碱性条件生长，通过将培养基pH值控制在上述范围内，更利于CIK细胞的培养。本申请中所述pH调节剂可以为氢氧化钠或盐酸等。
本申请中，所述无血清培养基的制备方法为本领域的常规方法。在一些具体实施方式中，配制1L所述的无血清培养基的方法可以包括如下步骤：
S1，将重组人胰岛素溶解在含1mM盐酸的纯化水中，制得重组人胰岛素溶液；
S2，将配制1L基础培养基溶液所需的培养基粉末溶解在在900mL注射用水中，搅拌至溶解，依次添加碳酸氢钠、重组人转铁蛋白、重组人胰岛素溶液、重组人白蛋白、乙醇胺、脂质混合物、微量元素、α-环糊精、非必需氨基酸、烟酰胺单核苷酸和虾青素提取物，并搅拌均匀；
S3，将步骤S2制得的溶液用注射用水定容至1L，并搅拌均匀；
S4，用氢氧化钠或盐酸将步骤S3制得的溶液的pH值调整至7.0～7.4，然后对溶液进行0.22uM过滤除菌，制得所述无血清培养基。
本申请中，制得的无血清培养基可以为在2～8℃的避光环境中进行保存。
本申请第二方面提供了一种CIK细胞的培养方法，所述培养方法包括：将人外周血来源的外周血单个核细胞或脐带血来源的脐血单个核细胞接种至如本申请第一方面所述的无血清培养基中，并添加刺激因子后进行CIK细胞培养；所述刺激因子选自IL-2、IL-15、IL-1α和CD3中的一种或多种。
本申请中，所述CIK细胞培养的条件为本领域常规条件，例如培养条件为：温度为37.0±0.5℃，二氧化碳体积分数为5.0±0.2％。
在一些实施方式中，所述刺激因子同时包括IL-2、IL-15、IL-1α和CD3，且IL-2、IL-15、IL-1α和CD3在培养基中的添加量分别为800～1200IU/mL、15～25ng/mL、5～15ng/mL和40～60ng/mL。
本申请中，所述外周血单个核细胞和脐血单个核细胞在所述无血清培养基中的接种密度可以独立地为(0.5～2)×106个/mL。
本申请将细胞的接种密度控制在上述范围内，更利于CIK细胞的培养。
本申请所述培养方法所采用的培养基为本申请所述的无血清培养基，该培养基不含人源和动物源成分，所有蛋白成分均为人重组来源，无需搭配人AB血清或动物源血清使用，因此该方法培养出的CIK细胞群的生物安全性高；同时所述无血清培养基中含有特定组成，添加有特定浓度的中烟酰胺单核苷酸和虾青素提取物，使得该方法培养CIK细胞时具有较高的增殖倍数、细胞存活率以及阳性率(CD3+CD56+)。
本申请第三方面提供了一种如本申请第二方面所述的培养方法培养的CIK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
由于本申请所述培养方法培养的CIK细胞的生物安全性和细胞阳性率(CD3+CD56+)高，因此培养的CIK细胞能够较好地应用在抗肿瘤药物的制备中，进而安全用于后续临床治疗。
本申请的有益技术效果为：本申请所提供的培养基不含人源和动物源成分，所有蛋白成分均为人重组来源，无需搭配人AB血清或动物源血清使用，生物安全性高且培养性能稳定。同时无血清培养基中含有特定组成，添加有特定浓度的中烟酰胺单核苷酸和虾青素提取物，能够使CIK细胞在培养基中的增殖倍数、细胞存活率以及阳性率(CD3+CD56+)得到显著提升，能够稳定培养出高阳性率(CD3+CD56+)的CIK细胞群，并可以安全用于后续临床治疗等用途，应用前景良好。
具体实施方式
为使本申请更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本申请，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本申请的应用范围。本申请中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
下述实施例中所使用的基础培养基、重组人转铁蛋白、重组人胰岛素、重组人白蛋白、烟酰胺单核苷酸和虾青素提取物均购自SIGMA。
实施例1：无血清培养基的制备组成：本实施例中配制无血清培养基时采用的基础培养基为DMEM，且基础培养基中添加有重组人转铁蛋白5mg/L、重组人胰岛素7mg/L、重组人白蛋白7g/L、乙醇胺2mg/L、脂质混合物3mL/L、微量元素5mL/L、α-环糊精1.5g/L、非必需氨基酸3mL/L、碳酸氢钠3g/L、烟酰胺单核苷酸4mg/L和虾青素提取物10mg/L；其中脂质混合物中含有花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸和油酸，且花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸和油酸的质量比为2:1:1:2；微量元素中含有亚硒酸钠、偏钒铵酸和氯化锰，且三者在培养基中的含量分别为20ng/L、20mg/L和10mg/L；非必需氨基酸中含有L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甘氨酸、L-丝氨酸和L-脯氨酸，且L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甘氨酸、L-丝氨酸和L-脯氨酸在培养基中的含量分别为0.1g/L、0.5g/L、0.5g/L、1.0g/L、0.5g/L和0.5g/L，六者的质量比为0.2:1:1:2:1:1。
配制：
(1)将重组人胰岛素粉末称量后，溶解在50mL含1mM HCl的纯化水中，颠倒混匀，使重组人胰岛素完全溶解，溶液变澄清，制得重组人胰岛素溶液；
(2)称取配制1L DMEM基础培养基所需的粉末13.4g溶解在900mL注射用水中，搅拌至溶解，依次添加重组人转铁蛋白、重组人胰岛素溶液、重组人白蛋白、乙醇胺、脂质混合物、微量元素、α-环糊精、非必需氨基酸、碳酸氢钠、烟酰胺单核苷酸和虾青素提取物，并搅拌均匀；
(3)将步骤(2)中制备的溶液用注射用水定容至1L，并搅拌均匀；
(4)将氢氧化钠或盐酸配制为1M浓度，用1M的氢氧化钠或盐酸将步骤(3)中制备的溶液pH值调整7.1；
(5)将步骤(4)中制备的溶液用0.22uM孔径、PVDF滤膜材质的一次性过滤装置在洁净车间的生物安全柜中进行过滤，制得无血清培养基。将制备好的无血清培养基装入无菌PETG材质容器中，密封保存在4℃的避光环境中。
实施例2：无血清培养基的制备组成：基本同实施例1，不同之处在于，基础培养基中烟酰胺单核苷酸的添加量为1mg/L。
配制：同实施例1。
实施例3：无血清培养基的制备组成：基本同实施例1，不同之处在于，基础培养基中烟酰胺单核苷酸的添加量为6mg/L。
配制：同实施例1。
实施例4：无血清培养基的制备组成：基本同实施例1，不同之处在于，基础培养基中烟酰胺单核苷酸的添加量为10mg/L。
配制：同实施例1。
实施例5：无血清培养基的制备组成：基本同实施例1，不同之处在于，基础培养基中虾青素提取物的含量为虾青素提取物的含量为5mg/L。
配制：同实施例1。
实施例6：无血清培养基的制备组成：基本同实施例1，不同之处在于，基础培养基中虾青素提取物的含量为虾青素提取物的含量为8mg/L。
配制：同实施例1。
实施例7：无血清培养基的制备组成：基本同实施例1，不同之处在于，基础培养基中虾青素提取物的含量为虾青素提取物的含量为20mg/L。
配制：同实施例1。
实施例8：无血清培养基的制备组成：基本同实施例1，不同之处在于，脂质混合物中含有花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸和油酸，且花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸和油酸的质量比为1:1:1:3。
配制：同实施例1。
实施例9：无血清培养基的制备组成：基本同实施例1，不同之处在于，脂质混合物中含有花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸和肉豆蔻酸，且花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸和肉豆蔻酸的质量比为2:1:1:2。
配制：同实施例1。
实施例10：无血清培养基的制备组成：基本同实施例1，不同之处在于，非必需氨基酸中含有L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甘氨酸、L-丝氨酸和L-脯氨酸，且L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甘氨酸、L-丝氨酸和L-脯氨酸在培养基中的含量分别为0.5g/L、1.0g/L、0.5g/L、0.5g/L、0.5g/L和1.0g/L，六者的质量比为1:2:1:1:1:2。
对比例1：无血清培养基的制备组成：基本同实施例1，不同之处在于，基础培养基中不添加烟酰胺单核苷酸。
配制：同实施例1。
对比例2：无血清培养基的制备组成：基本同实施例1，不同之处在于，基础培养基中不添加虾青素提取物。
配制：同实施例1。
对比例3：无血清培养基的制备组成：基本同实施例1，不同之处在于，基础培养基中不添加烟酰胺单核苷酸和虾青素提取物。
配制：同实施例1。
应用例1：CIK细胞的培养
将采集到的人外周血平铺在淋巴细胞分离液上，800g、20min进行离心，获取中间白膜层细胞。将中间白膜层的外周血单个核细胞(PBMCs)用生理盐水洗涤两次，离心条件500g、10min，去掉上清，重悬细胞沉淀，并计数，细胞按照2×106个/mL的密度接种至含实施例1制备的无血清培养基的培养瓶中，并添加1000IU/mL IL-2、20ng/mL IL-15、10ng/mLIL-1α、50ng/mL CD3刺激因子，进行CIK细胞培养，培养条件为：温度为37.0℃，二氧化碳体积分数为5.0％。每隔一天进行一次计数补液，将细胞密度调整为1×106个/mL，持续培养至14天，检测细胞增殖倍数、细胞存活率和细胞阳性率，结果如表1所示。
应用例2-10：CIK细胞的培养
培养过程基本同应用例1，不同之处在于，分别用实施例2-10中制备的无血清培养基替换实施例1中制备的无血清培养基。
对比应用例1-3：CIK细胞的培养
培养过程基本同应用例1，不同之处在于，分别用对比例1-3中制备的无血清培养基替换实施例1中制备的无血清培养基。
对比应用例4：CIK细胞的培养
培养过程基本同应用例1，不同之处在于，用Lonza公司的商品化X-VIVO15培养基(货号04-418Q)替换实施例1中制备的无血清培养基。
表1
从表1的检测结果可知，采用本申请实施例1-10中制备的无血清培养基进行CIK细胞培养时，细胞增殖倍数、细胞存活率和细胞阳性率(CD3+CD56+)均明显优于对比例1-3制备的无血清培养基，且细胞增殖倍数和细胞阳性率(CD3+CD56+)均优于商品化X-VIVO15培养基，表明本申请实施例制备的无血清培养基具有更优的CIK细胞培养效果。
从应用例1和对比应用例1-3的检测结果可知，当无血清培养基中含有烟酰胺单核苷酸和虾青素提取物时，利用该培养基对CIK细胞进行培养时，具有更高的细胞增殖倍数、细胞存活率和细胞阳性率(CD3+CD56+)。从应用例1-7的检测结果可知，当培养基中烟酰胺单核苷酸的添加量为4mg/L、虾青素提取物的添加量为10mg/L时，有助于进一步提升CIK细胞的培养效果。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本申请，并不构成对本申请的任何限制。通过参照典型实施例对本申请进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本申请权利要求的范围内对本申请作出修改，以及在不背离本申请的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本申请涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本申请限于其中公开的特定例，相反，本申请可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (10)

1.一种用于CIK细胞培养的无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基包括基础培养基，且所述基础培养基中添加有重组人转铁蛋白、重组人胰岛素、重组人白蛋白、乙醇胺、脂质混合物、微量元素、α-环糊精、非必需氨基酸、碳酸氢钠、烟酰胺单核苷酸和虾青素提取物。
2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基中包括重组人转铁蛋白1~20mg/L、重组人胰岛素1~20mg/L、重组人白蛋白1~10g/L、乙醇胺0.5~5mg/L、脂质混合物1~5mL/L、微量元素1~10mL/L、α-环糊精0.5~1.5g/L、非必需氨基酸1~5mL/L、碳酸氢钠2~4g/L、烟酰胺单核苷酸1~10mg/L和虾青素提取物5~20mg/L。
3.根据权利要求1或2所述的无血清培养基，其特征在于，所述脂质混合物选自花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸和生育酚乙酸酯中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的无血清培养基，其特征在于，所述脂质混合物为花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸和油酸的混合物，且所述混合物中花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸和油酸的质量比为（1~3）:1:1:（1~3）。
5.根据权利要求1或2所述的无血清培养基，其特征在于，所述微量元素选自亚硒酸钠、柠檬酸铁、偏钒铵酸、氯化锰、硫酸铜和硫酸锌中的一种或多种。
6.根据权利要求1或2所述的无血清培养基，其特征在于，所述非必需氨基酸选自L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甘氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸和L-谷氨酸中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的无血清培养基，其特征在于，所述非必需氨基酸为L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甘氨酸、L-丝氨酸和L-脯氨酸的混合物，且所述混合物中L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甘氨酸、L-丝氨酸和L-脯氨酸的质量比为（0.2~1）:（1~2）:1: （1~2）:1: （1~2）。
8.根据权利要求1或2所述的无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基的pH值为7.0~7.4。
9.一种CIK细胞的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括：将人外周血来源的外周血单个核细胞或脐带血来源的脐血单个核细胞接种至如权利要求1-8中任意一项所述的无血清培养基中，并添加刺激因子后进行CIK细胞培养；所述刺激因子选自IL-2、IL-15、IL-1α和CD3中的一种或多种。
10.一种如权利要求9所述的培养方法培养的CIK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
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