CN117065025A - Glt25d1的表达抑制剂在制备抗肝纤维化药物中的应用 - Google Patents

Glt25d1的表达抑制剂在制备抗肝纤维化药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了GLT25D1的表达抑制剂在制备抗肝纤维化药物中的应用，该药物包括GLT25D1的表达抑制剂作为有效活性成分。本发明证明了抑制GLT25D1介导的胶原肽Glcα1，2Galβ1‑糖基化修饰，即可抑制胶原原纤维的组装及I、III型胶原的分泌，可部分阻断肝纤维化的发生，提示以GLT25D1为抗纤维化药物的靶点具有良好的医学转化前景。本发明还验证了管花苷B可抑制胶原的形成，进而为制备抗纤维化的药物提供了研究基础。

Description

GLT25D1的表达抑制剂在制备抗肝纤维化药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及GLT25D1的表达抑制剂在制备抗肝纤维化药物中的应用。
背景技术
阐明肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)胶原原纤维组装与分泌的质量控制分子机制，尤其是抑制胶原原纤维组装对胶原蛋白代谢及纤维化进程的影响，则是本领域内迫切需要解决的关键科学问题之一。该问题的阐述，也是直接抗纤维化精准靶向药物筛选的关键步骤之一。
消除病因，如慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎的抗病毒治疗，是延缓或逆转肝纤维化的关键。但相当部分慢性肝炎，病因难以根除，如脂肪肝导致的脂肪性肝炎，慢性药物性肝损伤，自身免疫性肝病等，病因难以控制。对这些患者而言，直接延缓纤维化进程，则是改变患者远期预后的关键。
肝纤维化的发生，是各种病因作用下，激活炎症过程，诱导细胞因子网络活性改变，进而在血小板源性生长因子作用下，促进HSC活化增殖；进一步在转化生长因子作用下，HSC分泌胶原蛋白等细胞外基质成分增加，导致肝纤维化及肝硬化的发生。胶原蛋白是人体蛋白质的主要构成成分，约占机体总蛋白质量的1/3，其构成的胶原原纤维，则是人体细胞外基质的主要机械成分，其空间结构为组织细胞提供结构支持，也是其他细胞外基质成分质、量调控的决定性因素。细胞的功能状态决定了胶原原纤维组装的速度、大小、方向，以及空间结构特征。该过程质量控制的异常，则是组织纤维化发生的关键。
胶原蛋白结构上存在糖基化修饰，该糖基化修饰(Glcα1、2Galβ1)对胶原前体的合成、前胶原α链的正确组装，发挥关键调节作用，胶原糖基化修饰主要发生在胶原肽结构中的羟赖氨酸残基上。糖基转移酶GLT25D1催化葡萄糖(Glc)半乳糖(Gal)双糖以β1-O键连接到胶原羟赖氨酸残基上，形成胶原蛋白特有的O-糖基化修饰二糖(Glcα1、2Galβ1)。体外敲除成骨细胞的糖基因GLT25D1，其I、III型胶原分泌显著下降。目前认为，GLT25D1介导的Glcα1、2Galβ1-糖基化修饰是胶原蛋白最重要的翻译后修饰，是控制胶原原纤维组装与分泌质量控制的关键靶点。因此，深入研究基因GLT25D1在胶原生成过程中的调控机制，并在此基础上发展新的抗纤维化的治疗手段，具有重要的现实意义。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了GLT25D1的表达抑制剂在制备抗肝纤维化药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面是提供GLT25D1的表达抑制剂在制备抗肝纤维化药物中的应用，所述药物包括GLT25D1的表达抑制剂作为有效活性成分。
进一步地，上述GLT25D1的表达抑制剂选自以下中的一种或几种：
特异性抑制GLT25D1的小分子化合物；
特异性干扰GLT25D1基因表达的干扰分子；
特异性敲除GLT25D1基因的基因编辑试剂；
特异性与GLT25D1基因编码的蛋白结合的抗体或配体。
进一步地，上述GLT25D1的表达抑制剂通过抑制胶原生成实现抗纤维化作用。
进一步地，上述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂、添加剂；该载体或赋形剂优选选自稀释剂、粘合剂、吸附载体、填充剂和崩解剂中的一种或多种；该添加剂优选选自稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH值控制剂和表面活性剂中的一种或多种。
进一步地，上述药物的给药途径为口服、透皮、肌肉、皮下或静脉注射。
进一步地，所述药物的剂型可以为片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
本发明的第二方面是提供管花苷B在制备抗肝纤维化药物中的应用，该药物包括管花苷B作为有效活性成分。
进一步地，上述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂、添加剂；该载体或赋形剂优选选自稀释剂、粘合剂、吸附载体、填充剂和崩解剂中的一种或多种；该添加剂优选选自稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH值控制剂和表面活性剂中的一种或多种。
进一步地，上述药物的给药途径为口服、透皮、肌肉、皮下或静脉注射。
进一步地，所述药物的剂型可以为片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
本发明的第三方面是提供一种抗肝纤维化的药物，其包括GLT25D1的表达抑制剂。
进一步地，上述GLT25D1的表达抑制剂选自以下中的一种或几种：
特异性抑制GLT25D1的小分子化合物；
特异性干扰GLT25D1基因表达的干扰分子；
特异性敲除GLT25D1基因的基因编辑试剂；
特异性与GLT25D1基因编码的蛋白结合的抗体或配体。
进一步地，上述GLT25D1的表达抑制剂为管花苷B。
进一步地，上述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂、添加剂；该载体或赋形剂优选选自稀释剂、粘合剂、吸附载体、填充剂和崩解剂中的一种或多种；该添加剂优选选自稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH值控制剂和表面活性剂中的一种或多种。
进一步地，上述药物的给药途径为口服、透皮、肌肉、皮下或静脉注射。
进一步地，所述药物的剂型可以为片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明证明了抑制GLT25D1介导的胶原肽Glcα1，2Galβ1-糖基化修饰，即可抑制胶原原纤维的组装及I、III型胶原的分泌，可部分阻断肝纤维化的发生，提示以GLT25D1为抗纤维化药物的靶点具有良好的医学转化前景。本发明还验证了管花苷B可抑制胶原的形成，进而为制备抗纤维化的药物提供了研究基础。
附图说明
图1显示了糖基因GLT25D1的敲除导致小鼠胚胎致死，其中，图A为胚胎大体形态拍照，箭头所指为自溶胚胎；图B为WT，Glt25d1+/-和Glt25d1-/-胚胎在E9.5和E11.5的大体形态拍照；图C为WT，Glt25d1+/-和Glt25d1-/-胚胎在E9.5和E11.5的HE染色；图D为WT和Glt25d1+/-小鼠的体重比较；
图2显示了GLT25D1表达降低可以延缓实验性小鼠肝纤维化的发生；其中，图2A显示了小鼠肝组织Masson染色的图片以及相应的纤维化面积的统计图；
图2B显示了免疫组化检测小鼠肝组织α-SMA、Collagen-I、Collagen-III的表达情况；
图3显示了通过Western blot分析肝组织中的α-SMA、Collagen-I、Collagen-III的表达情况；
图4显示了胆管结扎诱导的肝纤维化模型中发现，GLT25D1基因部分敲除，可以抑制HSC活化及胶原蛋白分泌，其中，图A显示了原代细胞培养1天后油红O染色(×100，×200)结果；图B显示了两组原代肝星状细胞培养至9天时高倍镜下原代肝星状细胞形态(×200，×400)；图C显示了两组原代肝星状细胞培养12天差异表达基因聚类热图(红色代表上调，蓝色代表下调)；图D显示了散点图和差异表达基因的基因组富集分析；图E显示了两组小鼠分离的肝原代星状细胞培养12天激活后Ⅰ型胶原免疫荧光染色(红色为Ⅰ型胶原，蓝色为DAPI)；图F显示了免疫荧光平均密度分析；图G显示了原代星状细胞培养12天后westernblot检测纤维化相关蛋白及GLT25D1蛋白水平；图H显示了小鼠肝原代星状细胞培养12天后qRT-PCR检测纤维化相关基因在转录水平的改变；
图5显示了转化生长因子TGFβ1诱导激活的LX-2细胞系发现，高表达GLT25D1可促进细胞I型胶原、III型胶原，及α-SMA表达，其中，图A显示了OE-NC和OE-GLT25D1两组细胞在被TGF-β1诱导48小时后差异基因聚类热图；图B显示了OE-NC和OE-GLT25D1两组细胞在被TGF-β1诱导48小时后与纤维化相关的功能富集；图C为Western blot结果，显示了TGF-β1诱导激活sh-NC和sh-GLT25D1后，肝纤维化相关的蛋白α-SMA、COL I、COL III和TIMP-1表达均升高，但sh-GLT25D1细胞比sh-NC细胞中表达水平低；图D-G为进一步Western blot条带图灰度分析结果；图H为Westernblot结果，显示了TGF-β1诱导激活后OE-NC和OE-GLT25D1细胞肝纤维化相关的蛋白α-SMA、COL I、COL III和TIMP-1表达均升高，且OE-GLT25D1细胞比OE-NC细胞中表达明显高，图I-L为进一步Western blot条带图灰度分析结果；
图6显示了基因敲除GLT25D1可以显著抑制HSC胶原原纤维的组装及分泌，其中，图A显示了WT小鼠原代星状细胞细胞内含G-Hyl的Col 1ɑ1肽段质谱图(m/z 749.182)；图B通过Western blot显示了细胞裂解液和上清液的COL I条带；图C显示了BDL诱导小鼠肝纤维化组织门脉区扫描电镜结果；图D显示了基于图C测量胶原纤维直径测量结果；图E显示了BDL诱导肝纤维化肝组织不可溶性胶原含量；图F显示了小鼠肝纤维组织SHG/TPEF图像，图像中胶原纤维组织呈现绿色，肝组织呈现红色；图G显示了两组间SHG/TPEF参数的比较；
图7为化合物5与蛋白GLT25D1活性位点结合示意图；
图8显示了管花苷B抑制LX-2胶原蛋白的表达；其中，图A-D分别显示了管花苷B对LX-2细胞上清中III型胶原前体、CIV型胶原、透明质酸、层粘连蛋白表达的影响；
图9显示了不同浓度的管花苷B对LX-2细胞的影响，其中图A的细胞中不加入TGF-β1，图B-D加入人TGF-β1重组蛋白(10ng/mL)预刺激2小时后依此加入(0mg/L、5mg/L、50mg/L)的管花苷B；
图10显示了管花苷B可延缓APAP诱导的HepG2肝损伤；其中图A的细胞中不加入APAP，培养24小时，图B-D加入(0mg/L、5mg/L、50mg/L)的管花苷B预处理2小时，加入10mM对乙酰氨基酚，培养24小时，图E-F显示了收集细胞上清检测ALT、AST的结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1糖基因GLT25D1敲除，导致小鼠胚胎致死
1.1实验动物
前一天约17:00将一只雄鼠与一只雌鼠合笼，第二天8:00分笼，并检测雌鼠阴道栓，若当天早上检测到阴道栓，则记录为孕0.5天(E0.5)，记录小鼠体重。获得WT及Glt25d1+/-孕鼠，于相应的天数牺牲小鼠。取胚胎实验。
1.2组织病理切片制备
胚胎组织固定，脱水，石蜡包埋，切片厚5μm。
胚胎的脱水步骤为：PBS 1h、50％酒精40min、70％酒精30min、90％酒精30min、100％酒精I/II/III分别为20min/20min/30min、二甲苯I/II透明分别为10min/7min、石蜡I/II/III分别为20min/40min/40min。
经脱水透明后，胚胎组织使用包埋机包埋(胚胎的包埋面为左侧面)，切片5μm厚，行H&E染色。
1.3H&E染色
1)脱蜡：二甲苯I和II各10min、100％酒精2min、95％酒精2min、85％酒精2min、75％酒精2min；
2)苏木精染色：染细胞核，时间7min，清水冲洗；
3)分化：在1％盐酸酒精中放置20s，清水冲洗；
4)返蓝：在流水中冲洗20min，使细胞核变成蓝色；
5)伊红：染细胞浆，时间2min；
6)脱水与透明：无水乙醇I、II、III、IV各5min；
7)封片与保存：加滴树胶，仔细覆盖上盖玻片；贴标签，注明材料、染色方法等信息，待树胶凝固后保存。
由图1可以看出，糖基因GLT25D1敲除，导致小鼠胚胎发育异常，引起小鼠胚胎致死。Glt25d1-/-胚胎躯干厚度小于WT胚胎，心肌小梁、肝原基和体节发育异常。而且，Glt25d1+/-小鼠的体重小于WT小鼠。
实施例2GLT25D1表达降低，可以延缓实验性小鼠肝纤维化的发生
2.1慢性肝纤维化动物模型制备
选取Glt25d1+/-小鼠和WT小鼠各16只(C57BL/6J小鼠，雄性，7-8周)。随机分为以下几组：
(1)对照组：Glt25d1+/-和WT小鼠腹腔注射玉米油(10mL/kg，2次/周，共6周)；(2)模型组：Glt25d1+/-和WT小鼠腹腔注射CCl4组(CCl4：玉米油＝1：24，10mL/kg，2次/周，共6周)。打开腹腔，统一剪取小鼠肝尾状叶，固定于10％中性福尔马林溶液24小时，以制作病理切片，剩余肝组织用于后续实验分析。
2.2小鼠肝组织Masson染色
1)70℃烤箱烤片1～2h，二甲苯脱蜡3次，每次10min。依次经过无水乙醇，95％酒精，85％酒精，75％酒精，双蒸水脱蜡水化。
2)用苏木精染液染核5～10min。
3)充分水洗，然后用蒸馏水冲洗。
4)用丽春红酸性染液染色5～10min。
5)用2％冰醋酸水溶液冲洗片刻。
6)1％磷钼酸水溶液分化3～5min。
7)直接用苯胺蓝或光绿液染5min。
8)以0.2％冰醋酸水溶液浸洗片刻。
9)依次经过75％酒精，85％酒精，95％酒精，无水乙醇及二甲苯进行脱水、透明，中性树胶封片。
10)显微镜下观察结果。
根据Knodell HAI评分系统对WT和Glt25d1+/-小鼠肝组织纤维化程度进行评估。采用盲评法根据如下标准进行各组小鼠肝组织纤维化分期。肝纤维化分期标准如下：
S0级：正常肝脏无明显胶原增生；
S1级：胶原增生，中央静脉和门脉区有少量纤维索，但无间隔形成；
S2级：胶原纤维明显增生，中央静脉和门脉区结缔组织变厚，由此向四周伸出纤维，形成不完全间隔；
S3级：胶原纤维大量增生，有个别的假小叶形成；
S4级：假小叶形成较多，分割肝脏；
同时每张Masson染色切片随机选取6-8个视野(×100)，每组7-8张切片。利用Image J分析软件对每张切片灰度进行统计，取平均值。结果如图2A，CCl4造模后WT小鼠和Glt25d1+/-小鼠肝纤维化程度均明显升高。
2.3免疫组化检测小鼠肝组织α-SMA、Collagen-I、Collagen-III表达情况
1)烤片：70℃烤箱中烤片40min。
2)脱蜡水化：步骤同1.2，最后蒸馏水冲洗1min。
3)30％H2O2中封闭10min，1×PBS洗3次，每次1min。
4)抗原修复：将切片放入PH＝6.0或PH＝8.0的柠檬酸盐缓冲液中(具体依照一抗要求)，高压修复2.5min。10min后流水使之冷却，1×PBS冲洗。
5)孵育一抗：用1×PBS稀释α-SMA(1:500)、Collagen-I抗体(1:200)、Collagen-III抗体(1:200)。置湿盒中于4℃孵育过夜。
6)冲洗：1×PBS冲洗3次，每次1min。
7)孵育二抗：吸干残留PBS，采用兔鼠混合二抗，室温下，于湿盒中孵育40min。
8)冲洗：1×PBS冲洗3次，每次1min。
9)显色：DAB显色液按比例A液：B液＝1:25混合后，加到各切片中，显色时间约3～5min，具体于显微镜下观察，出现阳性结果时，1×PBS缓冲液终止显色。
10)苏木素染核5min，流水冲洗。
11)1％盐水酒精分化，水洗，氨水返蓝。
12)脱水：75％酒精2min→85％酒精2min→95％酒精2min→100％乙醇2min→100％乙醇2min→二甲苯5min。
13)中性树胶封片，显微镜下观察。
结果如图2B所示，CCl4造模后，相比于WT小鼠，Glt25d1+/-小鼠I型胶原可见下降趋势，但无统计学差异，Glt25d1+/-小鼠III型胶原显著下降。
2.4肝组织总蛋白的提取及Western blot分析
1)研磨肝组织：称取30～40mg左右的肝组织于1.5mL EP管中，按照1mg：10μL比例加入含磷酸酶抑制剂及PMSF的组织裂解液，超声裂解10min。
2)裂解：冰上静置30min，充分裂解肝组织。
3)离心：4℃，12,000g/s，离心15min；离心结束后吸取上清，至-80℃保存。
4)变性：将提取的肝组织总蛋白从-80℃冰箱拿出后于冰上溶解，用蛋白裂解液稀到适当浓度后，加入相应比例5×SDS Loading Buffer，99℃煮沸10min，冷却至室温。
5)上样：每孔蛋白上样量为80μg，记录上样顺序，两侧加入蛋白Marker5μL，最后用1×SDS Loading Buffer统一调整每孔上样体积。
6)SDS-PAGE电泳：上层浓缩胶80V，30min，下层分离胶120V，1.5h。
7)转膜：甲醇激活PVDF膜，湿转法转印，220mA恒流电转90min，提前冰上预冷转膜液，转膜过程在冰槽进行，以防止转膜过程的散热导致温度升高，影响转膜效率。
8)封闭：转膜结束后用5％脱脂牛奶在室温摇床上封闭PVDF膜1h。
9)一抗孵育：GAPDH抗体(1：1000)、Collagen-I(1：1000)、Collagen-III(1:1000)、α-SMA(1:5000)。
10)洗膜：1×TBST洗膜3次，每次10min。
11)二抗孵育：用二抗稀释液稀释二抗辣根酶标记抗兔IgG浓度为1：10000、抗鼠IgG浓度为1：5000，室温摇床上孵育1h。
12)洗膜：1×TBST洗膜3次，每次10min。
13)显影：在曝光仪中，ECL发光液显影，曝光。
结果如图3所示，在CCl4诱导的肝纤维化模型中，GLT25D1表达降低(Glt25d1+/-)，α-SMA表达增加更为明显，Collagen-I未见明显差异，Collagen-III表达显著降低。
实施例3Glt25d1基因部分敲除，可以抑制HSC活化及胶原蛋白分泌
3.1BDL诱导的小鼠肝纤维化模型
造模前准备：碘伏，灭菌生理盐水，剃须刀，小鼠固定泡沫板和胶带，医用无菌纱布，眼科剪和眼科镊，无菌缝合针、缝合线(6-0)，戊巴比妥钠(8‰)，无菌操作台。
1)6-8周龄雄性实验组和对照组小鼠，使用戊巴比妥钠(08‰)腹腔注射麻醉小鼠(10μl/g)。待小鼠麻醉成功后(掐鼠尾老鼠无疼痛反应)，用胶带将小鼠固定于操作台上。使用剃须刀备皮，范围：上至胸骨柄，下至会阴，左右分别至腋前线。使用碘伏棉签轻柔地消毒手术区域3次。
2)手术实施：在腹正中线、剑突下以眼科剪剪开皮肤，并沿白线切开腹膜长度约1.5cm-2cm暴露肝脏组织。用盐水润湿的2支无菌棉签探入腹腔内，将肝叶、轻轻向右拨开暴露视野。探及十二指肠，可观察到与十二指肠相连接的透明胆总管，继续向上可观察到与胆管相连的胆囊，以再次确认其为胆总管。以眼科镊轻柔钝性游离一小段胆管，埋置2条6-0手术缝线并分别打手术结(胆管双节扎)。手术期间常用盐水棉签湿润手术区，防止手术器官干燥，减少水分蒸发。术后，确认腹腔内无脏器损伤或出血后，用无菌棉签轻轻复位肝叶及肠管，6-0手术缝线逐层关腹。皮肤缝合完毕后以碘伏棉签消毒切口1-2次，注意擦净切口处血渍。
3)手术完成将小鼠置于干燥、温暖的环境中复苏。待苏醒后分笼饲养(5只/笼)，每隔3天观察小鼠的饲养状态。饲养21天后，称体重。牺牲小鼠，留取血样及肝组织同CCl4模型。
3.2培养2天小鼠肝原代星状细胞油红O染色
培养2天原代肝星状细胞弃培养基，PBS洗两遍。加入4％的多聚甲醛500μl固定15分钟，结束后使用PBS洗3遍。加入油红O染液(油红：水＝3：2)400μl，常温60分钟。加入60％异丙醇润洗1s，后用PBS洗3次。加入苏木紫500μl/孔，染色5分钟，PBS洗3次。镜下观察。
3.3原代小鼠肝星状细胞及LX-2细胞全转录组测序
1)样品的收集及准备：小鼠原代肝星状细胞培养至10天时，LX-2细胞诱导激活48h后胰酶消化收集细胞，并用Trizol法提取细胞RNA。
2)数据质控：对测序获得的原始序列数据进行去除接头、含N(N表示无法确定碱基信息)及低质量的数据。同时，对过滤后的数据进行Q20、Q30和GC含量计算。最后获得过滤后的数据(clean datas)用于进一步的分析。
3)序列比对到参考基因组：从NCBI网站下载参考基因组和基因模型注释文件。使用HISAT2(v2.0.5)构建参考基因组的索引，并使用HISAT2(v2.0.5)将配对末端cleanreads与参照基因组比对。
4)基因表达水平定量：feature Counts(1.5.0-p3)用于计算映射到每个基因的读数。然后根据基因的长度计算每个基因的FPKM，并计算映射到该基因的读数。
5)差异表达分析：用DESeq2软件(1.20.0)进行两个比较组合之间的差异表达分析。使用Benjamini和Hochberg的方法来调整所得P值(padj)以控制错误发现率。padj<＝0.05&|log2(foldchange|>＝1)被设定为显着差异表达的阈值。
6)差异基因富集分析：通过clusterProfiler(3.8.1)软件实现差异表达基因的GO及KEGG富集分析，其中padj<0.05作为显著性富集的阈值。
7)基因富集分析(GSEA)：常规的基于超几何分布的富集分析依赖于显著上调或下调的基因，容易遗漏部分差异表达不显著但有重要生物学意义的基因。GSEA不需要指定明确的差异基因阈值，把基因按照在两组样本中的差异表达程度进行排序，然后采用统计学方法检验预先设定的基因集合是否在排序表的顶端或底端富集。
3.4小鼠肝原代星状细胞免疫荧光染色
1)新鲜配置的4％多聚甲醛固定细胞10分钟。随后PBS洗3次，每次5分钟。细胞透膜：用含0.5％TritonX-100的PBS透化细胞1分钟，再用PBS洗3次，每次1分钟。
2)封闭：用PBS配置含5％胎牛血清的封闭缓冲液，小心加至玻片上，在37℃湿盒中孵育30分钟。
3)一抗孵育：用封闭缓冲液稀释一抗(CollangeⅠ1:200)，在37℃湿盒中孵育60分钟，随后用PBS洗3次，每次5分钟。
4)二抗孵育：用封闭缓冲液稀释二抗(1:200)，在37℃湿盒中避光孵育60分钟，随后用PBS洗3次，每次5分钟。
5)DAPI染色：用DAPI溶液(DAPI:PBS＝1:1000)避光孵育5-10分钟，随后PBS洗3次，每次5分钟。
6)封片及图像采集：用中性树脂封片，荧光显微镜观察并用拍照系统采集图形。
7)使用图像分析软件Aipathwell自动圈定组织测量区域。然后自动识别荧光信号。最后软件自动分别计算出测量区域内各通道的阳性面积、阳性累积光密度值IOD以及组织面积。
8)最后计算平均光密度值：阳性累积光密度IOD值/阳性面积，以反映阳性信号的平均深浅。
3.5体外培养细胞总RNA提取
1)培养好的12孔板弃上清，常温PBS洗两次，并用移液枪吸尽PBS。
2)加入350μl的RLT裂解液，吹打混匀后用手震荡20s，将裂解混合物全部加至清除柱中。
3)13000g离心1分钟，保留过滤液。
4)用移液枪精准的测量过滤液体积，加入等体积70％乙醇，立即吹打混匀。
5)立即将混合物转移至吸附柱中，13000g离心30秒。
6)加入700μl的漂洗液1，室温放置1分钟，12000g离心30秒，弃过滤液。
7)加入500μl的漂洗液2，12000g离心30秒，弃过滤液。
8)重复上述操作步骤。
9)将吸附柱放回收集管，13000g离心2分钟，以甩干吸附柱，彻底清除残余乙醇。
10)将吸附柱放入1个RNase-free 1.5ml离心管中，加入30-50μl洗脱液于吸附柱膜中央，静置1分钟，13000g离心1分钟。
11)取2μl用于测定RNA浓度及纯度。
3.6RNA逆转录cDNA
使用TAKRA逆转录试剂盒进行操作，反应体系为10μl，所有反应均在冰上进行操作，具体操作流程如下：
(1)取出-80℃保存的RNA，4℃融化。检测RNA浓度，计算DNA用量.
(2)按照表1中的方案配制反应体系，加入8连管中，混匀，离心。
(3)逆转录程序：37℃，15分钟；85℃，5秒；4℃，+∞；
(4)用无RNA酶水将逆转录好的cDNA稀释10倍，于-80℃长期保存。
表1逆转录反应体系
3.7实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的分析
使用PowerUpTMSYBRTMGreenMasterMix试剂盒进行操作，反应体系为10μl所有反应均在冰上进行操作，具体操作流程如下
(1)将制备好的cDNA取出，冰上融化，及设计好的引物(表4)，按照表2配置反应体系，加入到无RNA酶的96孔板中。
(2)按表3qRT-PCR反应程序设置反应条件。
(3)使用ABI 7500型实时荧光定量PCR仪检测。
表2 qRT-PCR反应体系
表3 qRT-PCR反应程序
表4 qRT-PCR引物序列
3.8Western-blot步骤同2.4
结果如图4A-B所示，提取原代肝星状细胞后，采用油红O染色来鉴定其纯度，其阳性细胞数至少95％，可用于后续实验。培养至9天时脂滴基本消失，较野生型相比，Glt25d1+/-组表现出更大的细胞体积及应力生长表现。图4C-D所示，为了更加深入的了解GLT25D1对小鼠肝原代星状细胞的影响，WT和Glt25d1+/-两组小鼠的mHSC未经传代和额外加入诱导因子，培养至12天时收集mHSC并提取RNA,完成全转录组测序。共鉴定出360个显著下调基因和22个显著上调基因(图4C)。与WT小鼠相比，Glt25d1+/-小鼠mHSCs中纤维化相关基因的表达显著降低，包括Tgfb1，Mmp9，Mmp12,Pdgfb,Tgfb2等。基因组富集分析显示(图4D)，Glt25d1+/-和WT小鼠之间差异表达的基因与细胞活化和相应的下游促纤维化反应相关。图4E-F所示，将Glt25d1+/-和WT小鼠分离的肝原代星状细胞培养12天激活后Ⅰ型胶原免疫荧光染色，显示GLT25D1敲低后COL I蛋白的表达量明显下降。图4G-H显示，原代星状细胞培养12天后，western blot检测纤维化相关蛋白及GLT25D1蛋白水平，结果显示COL I和α-SMA蛋白在GLT25D1敲低后明显下降。qRT-PCR结果显示，与WT组相比，Glt25d1+/-组肝纤维化相关的基因(Acta2、Col1a1、Tgfb1、Mmp9、Mmp12)显著下调。
实施例4高表达GLT25D1可促进细胞I型胶原、III型胶原，及α-SMA表达
4.1TGF-β1诱导LX-2激活
按细胞传代制备好细胞悬液，并按5×105密度接种至6孔板，并加入完全培养基。培养12小时后换无血清培养基。饥饿12小时后换2％完全培养基并加入TGF-β1(10ng/ml)刺激。培养24-48小时后收集细胞用于提取蛋白及RNA。
4.2原代小鼠肝星状细胞及LX-2细胞全转录组测序同3.3。
4.3Western-blot步骤同3.8。
结果如图5A-B所示，OE-NC和OE-GLT25D1两组细胞在被TGF-β1诱导48小时后进行全转录组测序。通过条件筛选和过滤发现，OE-NC组与OE-GLT25D1组间共有679个基因存在有意义的差异，其中512个基因上调、167个基因下调。上调的基因包括星状细胞激活相关的基因ACTA2、COL1A2、COL3A1、COL11A1、TIMP-3以及胶原合成翻译后修饰相关的PLOD2等。为了了解差异基因的功能，进一步对差异基因进行了GO功能富集分析，共显著富集到1235个条目。图中列出了与细胞表型及细胞外基质相关有显著意义的富集，如MF胶原蛋白结合、生长因子结合、细胞外基质相关的显著富集；CC中与胶原结构及形成相关的显著富集；BP中与细胞的增殖、粘附、趋化及收缩相关的富集。图5C-G所示，进一步通过Western blot检验结果显示TGF-β1诱导激活sh-NC和sh-GLT25D1后，肝纤维化相关的蛋白α-SMA、COL I、COL III和TIMP-1表达均升高，但sh-GLT25D1细胞比sh-NC细胞中表达水平低。图H-L所示，TGF-β1诱导激活后OE-NC和OE-GLT25D1细胞肝纤维化相关的蛋白α-SMA、COL I、COL III和TIMP-1表达均升高，且OE-GLT25D1细胞比OE-NC细胞中表达明显高。
实施例5基因敲除GLT25D1可以显著抑制HSC胶原原纤维的组装及分泌
5.1质谱分析
采用HPLC-MS/MS高效液相色谱-质谱联用技术鉴定胶原上糖基化改变。该技术以液相色谱作为分离技术，质谱作为检测系统，将两者优势互补以更好的检测样本。蛋白质组的鉴定过程是先将蛋白质酶解成肽段，用质谱进行肽段的鉴定，而后再推导出可能的蛋白质。
1.脱色酶解脱盐
(1)激活后的细胞样本，进行SDS电泳，用手术刀在相应分子量处(100-150kDa)将胶切成1mm3小块儿，置于1.5ml离心管中；
(2)用200μl质谱水洗2次，每次10分钟；
(3)加脱色液200μl(50mM NH4HCO3与ACN(1:1))，脱色15分钟，质谱水洗，重复3次，直至脱色完全；
(4)加ACN 100μl脱水至胶粒变白，真空抽干10分钟；
(5)加10mM DTT(25mM NH4HCO3溶解)200μl，37℃水浴1h，加ACN 100μl脱水至胶粒变白；
(6)加55mM IAM(25mM NH4HCO3溶解)200μl，置于暗室30分钟，加ACN 100μl脱水至胶粒变白；
(7)依次用下列溶液进行混悬清洗：质谱水(1次)、ACN(1次)、质谱水(1次)、ACN(1次)每次10分钟；
(8)将0.01μg/μl Trypsin工作液(酶液用25mM NH4HCO3稀释)，每管加100μl，稍微离心一下，让酶液与胶粒充分接触，4℃放置30分钟。待酶液被胶粒完全吸收，再加25mMNH4HCO3100μl，37℃过夜；
(9)第二天，离心收集酶解上清液，置于新的离心管中；剩余胶粒加入200μl 100％ACN，涡旋5分钟，收集酶解上清液，置上一离心管中合并；剩余胶粒再加入50μl 0.1％FA，重新吸水后，再加入100％ACN涡旋5分钟，收集酶解上清液，置于上一离心管中合并；
(10)真空冻干，-20℃保存。
2.质谱上机条件
(1)配制流动相A液(100％质谱水、0.1％甲酸)和B液体(80％乙腈、0.1％甲酸)。
(2)用10μLA液溶解冻干粉末，4℃下14000g离心20分钟，取上清1μg样品进样，液质检测。
(3)上样体积10μl，采取夹心法上样，液相色谱糖肽洗脱分离流速600nl/分钟，分离梯度见下表5。
(4)使用Q Exactive HF质谱仪进行质谱鉴定。一级质谱完成后，选取全扫描中离子强度TOP 20的母离子使用高能碰撞裂解(HCD)方法碎裂，进行二级质谱检测，生成质谱原始数据，其中，质谱参数设置如下表6。
表5液相色谱洗脱条件
表6质谱参数设置
3.质谱数据分析：
获得质谱原始文件采用Proteome Discoverer2.4软件搜库(Homo sapiens,Musmusculus)。搜库参数见表7。
表7质谱分析搜库条件
5.2不可溶性胶原检测
本研究使用的SircolTM不溶性胶原检测试剂盒其原理是采用染料结合方法分析不溶性胶原纤维。具体步骤如下：
(1)称取20-30mg肝脏组织放入2ml螺旋盖圆形底部消化管中(试剂盒提供)。按每1mg组织中加入50μl碎裂试剂，并拧紧螺帽，在65℃下孵育2-3小时。每隔约30分钟涡旋管内容物，以帮助组织解体，孵育结束后，12000转，10分钟，取上清于新的1.5ml离心管中。
(2)稀释标准品并设置梯度(0、20、40、60μg/mg)，同时设置空白对照管(100μl去离子水)。
(3)向每管中加入1ml的Sircol染色试剂，将内容物颠倒混匀，并每隔10分钟颠倒混匀1次，共3次。在此期间，胶原-染料复合物将形成并从可溶性未结合染料中析出。
(4)颠倒混匀3次后，12000转，10分钟，弃上清，并小心倒置EP管和吸干残留液体。
(5)轻轻将750μl冰盐洗涤试剂加入EP管将未结合的染料从颗粒表面和微离心管的内部表面去除。12000转，10分钟，弃上清，用棉签小心地将残留液体从管唇处吸出。
(6)然后分别向空白管，标准管，样品管中加入1ml碱性试剂，涡旋混匀。并于10分钟内各取200μl置于96孔板。用酶标仪于550nm测吸光度。
(7)计算浓度，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
5.3透射电镜(TEM)实验步骤
(1)取材固定：组织准备：新鲜干净的肝脏组织，尽快(3分钟内)用手术刀取尾状叶肝组织，约1-2mm3大小，并立即转移至装有新的电镜固定液的EP管内室温继续固定2小时，然后保存至4℃备用。LX-2细胞准备：培养好的细胞不经漂洗，迅速加电镜固定液，用细胞刮沿一个方向刮下并收集至1.5ml离心管(尽量避免刮破细胞)。离心收集细胞(至少绿豆大小细胞团块)，弃固定液，加入新的固定液，室温固定两小时。后放至4℃备用。
(2)后固定：0.1M磷酸缓冲液PB(pH7.4)配制的1％锇酸避光室温固定2小时。0.1M磷酸缓冲液PB(pH7.4)漂洗3次，每次15分钟。
(3)室温脱水：组织依次入30％-50％-70％-80％-95％-100％-100％酒精上行脱水每次20分钟，100％丙酮两次，每次15分钟。
(4)渗透包埋：丙酮︰812包埋剂＝1:1，37℃2-4小时，,丙酮︰812包埋剂＝1︰2，37℃渗透过夜，纯812包埋剂37℃5-8小时。将纯812包埋剂倒入包埋板，将样品插入包埋板后37℃烤箱过夜。
(5)聚合：包埋板放于60℃烤箱聚合48小时，取出树脂块备用。
(6)超薄切片：树脂块于超薄切片机60-80nm超薄切片，150目方华膜铜网捞片。
(7)染色：铜网于2％醋酸铀饱和酒精溶液避光染色8分钟；70％酒精清洗3次；超纯水清洗3次；2.6％枸橼酸铅溶液避二氧化碳染色8分钟；超纯水清洗3次，滤纸稍吸干。铜网切片放入铜网盒内室温干燥过夜。
(8)透射电子显微镜下观察，采集图像分析。
5.4扫描电镜(SEM)实验步骤
(1)取材固定：新鲜干净的肝脏组织，尽快(3分钟内)用手术刀取尾状叶肝组织，约1-2mm3大小。迅速投入电镜固定液室温固定2小时，再转移至4℃保存。贴壁细胞：弃去培养液加入电镜固定液4℃固定2-4小时，细胞低速离心至管底可以看到绿豆大小的细胞团块，1％琼脂糖包裹，0.1M磷酸缓冲液PB(PH7.4)漂洗3次，每次15分钟。
(2)后固定：固定好的样品经0.1M磷酸缓冲液PB(pH7.4)漂洗3次，每次15分钟。0.1M磷酸缓冲液PB(pH7.4)配制1％锇酸室温避光固定1-2小时。
0.1M磷酸缓冲液PB(pH7.4)漂洗3次，每次15分钟。
(3)脱水：组织依次入30％-50％-70％-80％-90％-95％-100％-100％酒精每次15分钟，乙酸异戊酯15分钟。
(4)干燥：将样本放入临界点干燥仪内进行干燥。
(5)样本导电处理：将样本紧贴于导电碳膜双面胶上放入离子溅射仪样品台上进行喷金30s左右。
(6)扫描电子显微镜下观察采图。
(7)胶原纤维直径测量方法：应用Image-Pro Plus 6.0软件(Media Cybernetics,Inc.,Rockville,MD,USA)以30k 500nm标尺为标准，每张图片选取5个完整胶原纤维丝，分别测量其胶原纤维直径(nm)
5.5二次谐波(second harmonicgeneration，SHG)和双光子激发荧光(two photonexcited fluorescence，TPEF)显微成像技术(SHG/TPEF显微成像技术)和胶原的测量
因该技术无需染色处理减少了染色带来的组织改变，同时在检测内容方面能够显示胶原的位置，结构和三维形态，结果客观和可重复。因此，该技术越来越多的应用于肝纤维化的研究和临床诊断，其具体步骤如下：
(1)小鼠肝纤维化模型组织常规石蜡包埋、切片并脱蜡至水。
(2)通过镭射的原始光子，对脱蜡至水后、未染色的组织切片进行扫描，利用SHG采集胶原，TPEF采集肝细胞组织图像。
(3)被采集的图像通过图像量化分析软件HistoHepaTM软件分析。分别对汇管区/中央静脉区/窦周区的胶原蛋白进行检测和量化，量化后可以得到胶原蛋白比例、聚集/离散型胶原蛋白、胶原束的数量等参数进行分析。
结果如图6所示，基因敲除GLT25D1可以显著抑制HSC胶原原纤维的组装及分泌。图6A通过质谱分析来自WT和Glt25d1+/-雄性小鼠肝原代星状细胞培养14天后的细胞内胶原。结果显示WT细胞来源的Col 1α1链上1个Hyl位点被单糖G-Hyl修饰(α1-527)；Glt25d1+/-细胞来源Col 3α1链上一个Hyl位点被双糖GG-Hyl修饰(α1-502)。图6B通过Western blot结果显示细胞裂解液和上清液的COL I条带，结果显示GLT25D1没有影响COL I的分泌。图6C-E通过对BDL诱导的肝纤维化模型的肝脏组织进行了扫描电镜观察，结果显示WT肝纤维化胶原纤维束排列疏松、紊乱，而Glt25d1+/-胶原纤维排列致密、整齐。通过图像分析，对两组间胶原纤维的直径进行了比较，结果显示Glt25d1+/-组比WT组胶原纤维直径更大，不可溶性胶原显示两组之间胶原无明显差异。图6F-G通过对CCl4诱导的小鼠肝纤维组织病理切片进行SHG/TPEF显微成像技术扫描，获得胶原分布和周围肝组织细胞形态信息的组织图像。本研究比较了两组间总胶原的百分比SHG％，两组间无明显差异。进一步分别对两组间门脉区，中央静脉区及肝窦区胶原分布的量进行了分析。三个区域的胶原数量及比例均无显著差异。进一步分析两组间有关胶原形态的参数，结果显示Glt25d1+/-小鼠肝纤维化组织长胶原(NoLongStr)数量明显增多。
实施例6虚拟筛选结果分析
步骤一：应用MOE、Dcovery Studio等专业的小分子药设计及筛选软件，筛选较优的药物分子设计方案，首先共计215200个化合物使用Dock程序对接到GLT25D1蛋白的活性位点中，其中有373个化合物的打分值(S值)低于-9.7。然后考虑化合物在体内的吸收、溶解、透过血脑屏障、酶活性、肝毒性和血浆蛋白结合能力。采用Dcovery Studio 2019(简称“DS2019”)软件的ADMET Descriptors模块对上述化合物进行性质的预测，选取六项指标中较优的化合物，同时考虑候选化合物母核结构的多样性以及商业可购买性，最终选择23个候选化合物，其中化合物18-23来源于天然产物。这23个化合物的S值在-12.1383～-10.0009之间，S值越负，说明配体与受体之间相互作用越强。
步骤二：对接模式分析
如图7所示，化合物5(管花苷B)基本被完全包裹在GLT25D1的活性口袋中。其母核骨架可以和氨基酸残基Arg61、Arg147、Lys133、Asp264形成氢键，除此之外，T8852还与周围的氨基酸形成静电和疏水相关作用，这些都为化合物与蛋白的稳定结合提供了坚实的依据。
实施例7管花苷B抑制LX-2胶原蛋白的表达
步骤一：为研究管花苷B对胶原蛋白的作用，LX-2培养12小时后，更换无血清培养基饥饿12小时，最后更换为2％完全培养基，并加入人TGF-β1重组蛋白(10ng/mL)预刺激2小时后加入不同浓度的管花苷B(5mg/L、50mg/L)，培养24小时。双抗体夹心免疫层析法检测LX-2细胞上清中III型胶原前体、CIV型胶原、透明质酸、层粘连蛋白。如图8所示，与TGF-β1单独刺激相比，5mg/L管花苷B对四种蛋白均无明显作用。与TGF-β1组相比，50mg/L剂量的管花苷B显著抑制细胞上清中的III型胶原前体、IV型胶原前体和层粘连蛋白水平。透明质酸的表达在50mg/L管花苷B组较TGF-β1组有降低趋势，但未达到统计学差异。
步骤二：同时我们观察LX-2细胞的增殖情况：LX-2培养12小时后，更换无血清培养基饥饿12小时，最后更换为2％完全培养基，A：不加入TGF-β1，培养24小时；B-D：加入人TGF-β1重组蛋白(10ng/mL)预刺激2小时后依此加入(0mg/L、5mg/L、50mg/L)的管花苷B，培养24小时。结果显示(图9)，与对照组相比，TGF-β1的使用明显促进LX-2细胞增殖，在此基础上加入管花苷B，尤其是50mg/L剂量时可明显抑制LX-2细胞的生长、增殖。
实施例8管花苷B可延缓APAP诱导的HepG2肝损伤
为进一步观察管花苷B对肝细胞是否有保护作用，我们向HepG2细胞中加入不同浓度的管花苷B预处理2小时，加入10mM对乙酰氨基酚并设置空白对照，每次每种处理至少设置12个副孔。培养24小时后，收集细胞，图10A-D可见加入50mg/L管花苷B后可减轻APAP诱导的细胞凋亡。同时我们收集细胞培养上清，检测上清ALT、AST水平变化，结果显示，与对照组相比，APAP诱导后上清ALT、AST水平显著升高(图10E，F)。更为重要的是，与APAP暴露组相比，管花苷B预处理，尤其是50mg/L组，可显著降低ALT、AST水平。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.GLT25D1的表达抑制剂在制备抗肝纤维化药物中的应用，其特征在于，所述药物包括GLT25D1的表达抑制剂作为有效活性成分。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述GLT25D1的表达抑制剂选自以下中的一种或几种：
特异性抑制GLT25D1的小分子化合物；
特异性干扰GLT25D1基因表达的干扰分子；
特异性敲除GLT25D1基因的基因编辑试剂；
特异性与GLT25D1基因编码的蛋白结合的抗体或配体。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述GLT25D1的表达抑制剂通过抑制胶原生成实现抗纤维化作用。
4.管花苷B在制备抗肝纤维化药物中的应用，其特征在于，所述药物包括管花苷B作为有效活性成分。
5.根据权利要求1或4所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂、添加剂；所述载体或赋形剂优选选自稀释剂、粘合剂、吸附载体、填充剂和崩解剂中的一种或多种；所述添加剂优选选自稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH值控制剂和表面活性剂中的一种或多种。
6.根据权利要求1或4所述的应用，其特征在于，所述药物的给药途径为口服、透皮、肌肉、皮下或静脉注射。
7.根据权利要求1或4所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型可以为片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
8.一种抗肝纤维化的药物，其特征在于，包括GLT25D1的表达抑制剂。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述GLT25D1的表达抑制剂选自以下中的一种或几种：
特异性抑制GLT25D1的小分子化合物；
特异性干扰GLT25D1基因表达的干扰分子；
特异性敲除GLT25D1基因的基因编辑试剂；
特异性与GLT25D1基因编码的蛋白结合的抗体或配体。
10.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述GLT25D1的表达抑制剂为管花苷B。
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