CN117064059A - 一种五层包埋活性益生菌及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种五层包埋活性益生菌及其制备方法，属于益生菌菌剂领域。该方法包括：(1)乳酸菌经发酵后得到发酵液，将发酵液离心收集菌体；(2)将菌体与第一层包埋剂(磷酸三钙)混合均匀，获取菌体1；(3)菌体1与第二层包埋剂混合后，再添加水调整粘稠浆糊状，冷藏静置，获取菌体2；(4)菌体2与第三层包埋剂(脱水山梨醇单硬脂酸甘油酯)混合均匀，快速冷冻干燥，造粒，获取菌体3；(5)菌体3用第四层包埋剂包衣处理，获取菌体4；(6)菌体4与第五层包埋剂(纤维素凝胶)混合后，然后将混合物高压喷入氯化钙溶液中，获取菌体5，即为五层包埋高活性益生菌。本发明制备的益生菌具有较高稳定性和肠胃耐受性，适宜使用和推广。

Description

一种五层包埋活性益生菌及其制备方法
技术领域
本发明涉及益生菌菌剂领域，特别是涉及一种五层包埋活性益生菌及其制备方法。
背景技术
益生菌主要包括乳杆菌和双歧杆菌等乳酸菌，其对人体健康具有重要的调控作用。随着经济社会的发展，人们生活水平提高，随之而来的还出现了工作压力的增大，亚健康人群比例越来越高。因此近些年人们对于健康越来越关注，也逐渐认识到乳酸菌对于调节肠道平衡和提高免疫力方面等具有很大优势，但是现在市面上的乳酸菌产品繁杂多样，功效层次不齐。
之所以出现乳酸菌产品的效果差异较大，是因为乳酸菌抗逆性差，在常温条件下就很容易死亡，因此，市面上的乳酸菌产品除了如酸奶采用活菌形式加入外，多种产品都是采用包埋技术对乳酸菌进行过加工处理的产品。而目前市场上常见的双层或多层包埋，可以在益生菌表面形成物理屏障，使益生菌与周围环境中的胃酸、胆汁等物质分离，从而使益生菌在消化道的恶劣环境中顺利存活。但是同时可以看到的是，多数的包埋都是根据乳酸菌产品从食用后口腔进入到达小肠这个过程中存在的复杂环境条件设计的包埋层，比如耐唾液、耐胃酸、耐胆汁、耐其他消化液的包埋层，具有这些效果的包埋层的设计固然是可以提高乳酸菌的存活率，但是存活率相对还是普遍较低。乳酸菌能够到达肠胃并且发挥作用的关键因素，一个是营养，一个是抵抗外接环境的能力，而目前多数的包埋益生菌的技术为单纯考虑如何抵抗胃酸、胆汁等破坏，而未考虑保存期间对于营养的需求。另外，即使是设计抵抗外界环境的包埋层，也多为保护细胞膜的组分混合形成一层保护层，和/或通过胶囊或者凝胶方式形成更为坚固的外层，抵抗胃酸的侵蚀，但是，本身环境对于益生菌活性就具有很大影响，而经过包埋之后的益生菌除去食用后受到如胃酸、胆汁等外接环境的影响，它自身也是处在一个小的微环境中，而这个小的微环境也是决定其活性的关键因素，而目前鲜有相关现有技术从益生菌包埋层自身结构与菌体保存和食用后活性的角度考虑，多从包埋层自身构成后如何抵御胃酸、胆汁等破坏考虑构建的。因此，如何为益生菌提供一个较好的结构环境，以提高生存率，进而延长货架期和提高稳定性也是非常关键的。
发明内容
本发明的目的是提供一种五层包埋活性益生菌及其制备方法，以解决上述现有技术存在的问题，该益生菌具有较好的稳定性和较好的肠胃耐受性，适宜作为益生菌菌剂使用和推广。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种五层包埋活性益生菌的制备方法，包括以下步骤：
(1)乳酸菌经发酵后得到发酵液，将所述发酵液离心收集菌体；
(2)将所述菌体与第一层包埋剂混合均匀，获取具有第一层包埋层的菌体1；所述第一层包埋剂为磷酸三钙；
(3)将所述菌体1与第二层包埋剂混合后，再添加水调整粘稠浆糊状，冷藏静置，获取具有第二层包埋层的菌体2；其中，所述第二层包埋剂是由乳清蛋白与精氨酸混合而成；
(4)将所述菌体2与第三层包埋剂混合均匀，快速冷冻干燥，造粒，获取具有第三层包埋层的菌体3；所述第三层包埋剂为脱水山梨醇单硬脂酸甘油酯；
(5)将所述菌体3用第四层包埋剂包衣处理，获取具有第四层包埋层的菌体4；其中，所述第四层包埋剂是由聚谷氨酸、聚乙二醇、酵母菌粉以及水混合而成；
(6)将所述菌体4与第五层包埋剂混合后，然后将混合物高压喷入氯化钙溶液中，低温静置，干燥、粉碎，获取具有第五层包埋剂的菌体5，即为所述五层包埋高活性益生菌；所述第五层包埋剂为纤维素凝胶。
优选的是，所述乳酸菌发酵所用的发酵培养基包括以下重量份组分：蛋白胨10份、酵母浸粉8份、葡萄糖25份、磷酸氢二钾4份、MgSO4·7H2O 0.2份、乙酸钠3份、MnSO4·4H2O0.01份和水1000份。
优选的是，所述菌体和所述磷酸三钙的质量比为1g：15-20μg。
优选的是，所述菌体1和所述第二层包埋剂的质量比为100g：(20-30)mg；
所述第二层包埋层中的乳清蛋白和精氨酸的质量比为3∶(0.05-0.5)。
优选的是，所述菌体2与所述脱水山梨醇单硬脂酸甘油酯的质量比为1∶(1-3)。
优选的是，所述聚谷氨酸、所述聚乙二醇、所述酵母菌粉和所述水的质量比为(7-10)∶1∶(1-2)∶(3-5)。
优选的是，所述菌体4与所述纤维素凝胶的重量比为1∶1；其中，所述纤维素凝胶是将氯化锌溶液和微晶纤维素溶液按照质量比(20-25)∶(1-2)混合，于35℃加热混合均匀后制得。
优选的是，所述混合物与所述氯化钙溶液的体积比为1∶1，所述氯化钙的浓度为1g/mL。
优选的是，所述乳酸菌包括发酵乳杆菌、格氏乳杆菌或植物乳杆菌。
本发明还提供一种五层包埋高活性益生菌，其是由所述的制备方法制得。
本发明公开了以下技术效果：
本发明以乳酸菌为基础，利用不同材料制备包埋层对乳酸菌进行包埋，获取了一种具有五层包埋层高活性益生菌。该益生菌经过实验验证，在室温和37℃，高湿条件下仍然具有较高稳定性，储存2个月的菌体存活率分别最高可达89.3％和79.7％，具有较高存活率，说明该益生菌具有较高的稳定性。同时，体外模拟肠胃实验结果显示，本发明制备的五层包埋高活性益生菌虽然活菌数下降，但是最高的肠胃耐受率仍然能达到82.9％，同样说明大部分菌仍然存活，具有较高菌存活率，相比现有技术中采用的双层和三层等包埋技术，明显更能保证菌体活性。说明本发明经过包埋之后制备的益生菌具有较强的耐酸性、稳定性，可以作为益生菌菌剂使用，对乳酸菌的货架期延长、稳定性和活性的提高具有重要的现实意义。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例操作均是在无菌条件下进行。所用发酵乳杆菌保藏编号为CGMCCNO.14493；格氏乳杆菌保藏编号为CGMCC No.23187，植物乳杆菌保藏编号为CGMCCNo.18205，上述三株菌株均为申请人前期分离鉴定并已经保藏和公开的菌株，公众可以在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心获取。
实施例1
一种五层包埋高活性益生菌的制备方法，包括以下步骤：
(1)发酵乳杆菌活化；
发酵乳杆菌活化培养基为(重量份)：蛋白胨15份、牛肉浸膏8份、酵母浸粉3份、葡萄糖25份、醋酸钠5份、柠檬酸二胺2份、磷酸氢二钾0.2份、硫酸镁0.35份、硫酸锰0.01份、碳酸钙5份和水1000份。活化条件37℃，厌氧活化18h，获得发酵乳杆菌活化菌液。
(2)发酵乳杆菌发酵培养；
将所得的发酵乳杆菌活化菌液接种发酵培养基进行发酵培养，获取发酵乳杆菌发酵液，使发酵液的活菌总数均达到2.5×1010cfu/mL；
发酵培养基为(重量份)：蛋白胨10份、酵母浸粉8份、葡萄糖25份、磷酸氢二钾4份、MgSO4·7H2O 0.2份、乙酸钠3份、MnSO4·4H2O 0.01份和水1000份。
发酵培养条件为：37℃厌氧发酵36h。
(3)将所得的发酵乳杆菌发酵液离心，获取菌体；然后将所得菌体和第一层包埋剂磷酸三钙(食品级)按照质量比1g：15μg搅拌均匀，获取具有第一层包埋层的菌体1；
(4)将菌体1与第二层包埋剂按照质量比为100g：20mg混合，再添加适量的水调成粘稠浆糊状(每100g菌体1约用水5mL)，4℃冷藏静置5h，获取具有第二层包埋层的菌体2。第二层包埋剂是由乳清蛋白与精氨酸按照质量比3∶0.05构成。将菌体1与第二层包埋剂加水调成浆糊状并在低温下静置，主要目的就在于既能通过添加的乳清蛋白与精氨酸为菌体提供营养保证存活率，又能保证不会使得菌体由于营养层的增加而大量的增殖，致使菌体有个体差异出现“弱者”死亡两极分化的现象，反而由于营养层的添加导致对总活菌数产生不利的影响。
(5)将菌体2与第三层包埋剂脱水山梨醇单硬脂酸甘油酯按照质量比为1:1混合均匀，然后进行快速冷冻干燥、造粒，获取具有第三层包埋层的菌体3；其中，脱水山梨醇单硬脂酸甘油酯在使用前先加热溶化冷却至室温再使用。
(6)将菌体3用第四层包埋剂进行包衣，具体为：第四层包埋剂是由聚谷氨酸、聚乙二醇、酵母菌粉以及水按照质量比为7∶1∶1∶3混合而成(混合均匀后恰好手握成团但不滴水也不散团为最佳)，聚乙二醇的分子量为3400；将制备好的第四层包埋剂按照质量百分比为3％的比例与菌体3混合均匀进行包衣，并置于30℃恒温保存1h，获取具有第四层包埋层的菌体4。由于聚谷氨酸和聚乙二醇联合可以形成聚谷氨酸-聚乙二醇-聚谷氨酸的多层结构，这种结合改变了原有分子的特性，可以将酵母菌存储结构由原来的无序状态调整为有序的蜂窝状，赋形于菌体3表面，不仅在储存时起到屏障保护内层的乳酸菌，还能在肠道中释放后通过添加的酵母菌分泌出蛋白酶和脂肪酶，分解基质产生营养物质促进乳酸菌的生长，有利于内层乳酸菌在肠道中的活菌数提高和稳定性增强。
(7)将菌体4与纤维素凝胶混合后，然后快速将混合物高压喷入氯化钙溶液中，4℃低温静置20min，干燥，粉碎成块状或者粉状，得到具有第五层包埋剂的菌体5，即为五层包埋高活性益生菌。上述纤维素凝胶的制备方法为：将氯化锌溶液和微晶纤维素溶液按照质量比20∶1混合，于35℃加热混合均匀，即得纤维素凝胶；氯化锌溶液的浓度为3g/mL，微晶纤维素溶液的浓度为2g/mL，氯化钙溶液的浓度为1g/mL；混合物与氯化钙溶液的体积比为1∶1。
本实施例所制备的五层包埋高活性益生菌的活菌数为8.9×1011cfu/g。
实施例2
一种五层包埋高活性益生菌的制备方法，包括以下步骤：
(1)格氏乳杆菌活化；
格氏乳杆菌活化培养基为(重量份)：蛋白胨10份、葡萄糖20份、酵母浸粉5份、牛肉膏10份、K2HPO4 2份、柠檬酸二铵2份、乙酸钠5份、MgSO4·7H2O 0.58份、MnSO4·4H2O0.25份、吐温80 1份、L-半胱氨酸0.5份和水1000份。活化条件37℃，厌氧活化16h，获得格氏乳杆菌活化菌液。
(2)格氏乳杆菌发酵培养；
将所得的格氏乳杆菌分别接种发酵培养基进行发酵培养，获取格氏乳杆菌发酵液，使发酵液的活菌总数达到2.5×1010cfu/mL
发酵培养基为(重量份)：蛋白胨10份、酵母浸粉8份、葡萄糖25份、磷酸氢二钾4份、MgSO4·7H2O 0.2份、乙酸钠3份、MnSO4·4H2O 0.01份和水1000份。
发酵培养条件为：37℃厌氧发酵36h。
(3)将所得的格氏乳杆菌发酵液离心，获取菌体；然后将所得菌体和第一层包埋剂磷酸三钙(食品级)按照质量比1g：18μg搅拌均匀，获取具有第一层包埋层的菌体1；
(4)将菌体1与第二层包埋剂按照质量比为100g：25mg混合，再添加适量的水调成粘稠浆糊状(每100g菌体1约用水5mL)，4℃冷藏静置6h，获取具有第二层包埋层的菌体2。第二层包埋剂是由乳清蛋白与精氨酸按照质量比3∶0.25构成。将菌体1与第二层包埋剂加水调成浆糊状并在低温下静置，主要目的就在于既能通过添加的乳清蛋白与精氨酸为菌体提供营养保证存活率，又能保证不会使得菌体由于营养层的增加而大量的增殖，致使菌体有个体差异出现“弱者”死亡两极分化的现象，反而由于营养层的添加导致对总活菌数产生不利的影响。
(5)将菌体2与第三层包埋剂脱水山梨醇单硬脂酸甘油酯按照质量比为1:2混合均匀，然后进行快速冷冻干燥、造粒，获取具有第三层包埋层的菌体3；其中，脱水山梨醇单硬脂酸甘油酯在使用前先加热溶化冷却至室温再使用。
(6)将菌体3用第四层包埋剂进行包衣，具体为：第四层包埋剂是由聚谷氨酸、聚乙二醇、酵母菌粉以及水按照质量比为8∶1∶1.5∶4.5混合而成(混合均匀后恰好手握成团但不滴水也不散团为最佳)，聚乙二醇的分子量为3400；将制备好的第四层包埋剂按照质量百分比为5％的比例与菌体3混合均匀进行包衣，并置于30℃恒温保存1.5h，获取具有第四层包埋层的菌体4。由于聚谷氨酸和聚乙二醇联合可以形成聚谷氨酸-聚乙二醇-聚谷氨酸的多层结构，这种结合改变了原有分子的特性，可以将酵母菌存储结构由原来的无序状态调整为有序的蜂窝状，赋形于菌体3表面，不仅在储存时起到屏障保护内层的乳酸菌，还能在肠道中释放后通过添加的酵母菌分泌出蛋白酶和脂肪酶，分解基质产生营养物质促进乳酸菌的生长，有利于内层乳酸菌在肠道中的活菌数提高和稳定性增强。
(7)将菌体4与纤维素凝胶混合后，然后快速将混合物高压喷入氯化钙溶液中，4℃低温静置20-30min，干燥，粉碎成块状或者粉状，得到具有第五层包埋剂的菌体5，即为五层包埋高活性益生菌。上述纤维素凝胶的制备方法为：将氯化锌溶液和微晶纤维素溶液按照质量比22∶1.5混合，于35℃加热混合均匀，即得纤维素凝胶；氯化锌溶液的浓度为3g/mL，微晶纤维素溶液的浓度为2g/mL，氯化钙溶液的浓度为1g/mL；混合物与氯化钙溶液的体积比为1∶1。
本实施例所制备的五层包埋高活性益生菌的活菌数为7.3×1011cfu/g。
实施例3
一种五层包埋高活性益生菌的制备方法，包括以下步骤：
(1)将植物乳杆菌用MRS培养基进行活化。
(2)活化后的植物乳杆菌采用发酵培养基进行发酵，获取植物乳杆菌发酵液；发酵液的活菌总数均达到2.5×1010cfu/mL。
发酵培养基为(重量份)：蛋白胨10份、酵母浸粉8份、葡萄糖25份、磷酸氢二钾4份、MgSO4·7H2O 0.2份、乙酸钠3份、MnSO4·4H2O 0.01份和水1000份。
发酵培养条件为：37℃厌氧发酵30h。
(3)将所得的植物乳杆菌发酵液离心，获取菌体；然后将所得菌体和第一层包埋剂磷酸三钙(食品级)按照质量比1g：20μg搅拌均匀，获取具有第一层包埋层的菌体1；
(4)将菌体1与第二层包埋剂按照质量比为100g：30mg混合，再添加适量的水调成粘稠浆糊状(每100g菌体1约用水5mL)，4℃冷藏静置8h，获取具有第二层包埋层的菌体2。第二层包埋剂是由乳清蛋白与精氨酸按照质量比3∶0.5构成。将菌体1与第二层包埋剂加水调成浆糊状并在低温下静置，主要目的就在于既能通过添加的乳清蛋白与精氨酸为菌体提供营养保证存活率，又能保证不会使得菌体由于营养层的增加而大量的增殖，致使菌体有个体差异出现“弱者”死亡两极分化的现象，反而由于营养层的添加导致对总活菌数产生不利的影响。
(5)将菌体2与第三层包埋剂脱水山梨醇单硬脂酸甘油酯按照质量比为1:3混合均匀，然后进行快速冷冻干燥、造粒，获取具有第三层包埋层的菌体3；其中，脱水山梨醇单硬脂酸甘油酯在使用前先加热溶化冷却至室温再使用。
(6)将菌体3用第四层包埋剂进行包衣，具体为：第四层包埋剂是由聚谷氨酸、聚乙二醇、酵母菌粉以及水按照质量比为10∶1∶2∶5混合而成(混合均匀后恰好手握成团但不滴水也不散团为最佳)，聚乙二醇的分子量为3400；将制备好的第四层包埋剂按照质量百分比为7％的比例与菌体3混合均匀进行包衣，并置于30℃恒温保存2h，获取具有第四层包埋层的菌体4。由于聚谷氨酸和聚乙二醇联合可以形成聚谷氨酸-聚乙二醇-聚谷氨酸的多层结构，这种结合改变了原有分子的特性，可以将酵母菌存储结构由原来的无序状态调整为有序的蜂窝状，赋形于菌体3表面，不仅在储存时起到屏障保护内层的乳酸菌，还能在肠道中释放后通过添加的酵母菌分泌出蛋白酶和脂肪酶，分解基质产生营养物质促进乳酸菌的生长，有利于内层乳酸菌在肠道中的活菌数提高和稳定性增强。
(7)将菌体4与纤维素凝胶按照重量比1∶1混合后，然后快速将混合物高压喷入氯化钙溶液中，4℃低温静置30min，干燥，粉碎成块状或者粉状，得到具有第五层包埋剂的菌体5，即为五层包埋高活性益生菌。上述纤维素凝胶的制备方法为：将氯化锌溶液和微晶纤维素溶液按照质量比25∶2混合，于35℃加热混合均匀，即得纤维素凝胶；氯化锌溶液的浓度为3g/mL，微晶纤维素溶液的浓度为2g/mL，氯化钙溶液的浓度为1g/mL；混合物与氯化钙溶液的体积比为1∶1。
本实施例所制备的五层包埋高活性益生菌的活菌数为7.5×1011cfu/g。
对比例1
与实施例2相比区别仅在于：将菌体1与第二层包埋剂按照质量比为100g：25mg混合，再添加适量的水制成溶液，其他方法步骤均相同。
所制备的五层包埋高活性益生菌的活菌数为3.9×1010cfu/g。
对比例2
与实施例2相比区别仅在于：
(5)将菌体2与第三层包埋剂脱水山梨醇单硬脂酸甘油酯按照质量比为1:2混合均匀，获取具有第三层包埋层的菌体3；其中，脱水山梨醇单硬脂酸甘油酯在使用前先加热溶化冷却是室温再使用。
其他方法步骤均相同。
所制备的五层包埋高活性益生菌的活菌数为4.25×1010cfu/g。
对比例3
与实施例2相比区别仅在于：第四层包埋剂省略酵母菌粉，其他方法步骤均相同。
所制备的五层包埋高活性益生菌的活菌数为2.68×1010cfu/g。
对比例4
与实施例2相比区别仅在于：将纤维素凝胶替换为质量分数为10％的海藻酸钠溶液，其他方法步骤均相同。
所制备的五层包埋高活性益生菌的活菌数为5.17×1010cfu/g。
实验例1
将上述实施例1-3以及对比例1-4制备的五层包埋高活性益生菌在分别在25℃和37℃，相对湿度为80％，储存3个月，利用平板法检测实验结束时菌粉活菌数，然后根据如下公式计算存活率，结果见表1。
存活率(％)＝(实验前的活菌数-实验结束时的活菌数)/实验前的活菌数×100％。
表1
从上述数据可以看出，实施例1-3不论是室温条件还是37℃(模仿人体体内正常温度)条件下，稳定性都高于对比例1-4以及对应的原菌株。
实验例2
1、体外模拟人工肠液实验
(1)方法
人工胃液的制备：取稀盐酸16.4mL，加去离子水800mL，充分搅拌后，调节pH值至2.5，去离子水定容至1L，121℃高压灭菌15min后，冷却至室温，加入胃蛋白酶10g，
人工肠液的制备：取KH2PO4 6.8g，加去离子水500mL，充分搅拌溶解，用0.1mol/LNaOH溶液调节pH为6.8，去离子水定容至1L，121℃高压灭菌15min后，冷却至室温，加入胰蛋白酶10g，猪胆盐3g，混合使其充分溶解，混合使其充分溶解。
(2)体外模拟胃液消化实验：精密称量称取1.000g五层包埋高活性益生菌样品，无菌操作下，置于150mL锥形瓶中，加入20mL人工胃液，同时将瓶子放入恒温振荡摇床，37℃、90r/min培养1h。吸取1mL培养后的菌悬液于9mL PBS缓冲液中做系列稀释，根据样品活菌数含量，稀释到合适的浓度梯度，最后采用平板菌落计数法进行活菌计数，然后计算胃肠道耐受率。每个梯度浓度都有三个重复。
体外模拟胃肠消化实验：精密称取1.000g五层包埋高活性益生菌样品，无菌操作下，置于150mL锥形瓶中，加入20mL人工胃液，同时将瓶子放入恒温振荡摇床，37℃、90r/min培养1h。然后，加入80mL人工肠液，37℃、120r/min继续培养2h，吸取1mL培养后的菌悬液于9mL PBS缓冲液中做系列稀释，根据样品活菌数含量，稀释到合适的浓度梯度，最后采用平板菌落计数法进行活菌计数，然后计算胃肠道耐受率。每个梯度浓度都有三个重复。
胃肠道耐受率(％)＝胃肠模拟耐受之后的活菌数/未经耐受的活菌总数×100％
(3)结果
不同样品体外胃肠道耐受率统计结果见表2。
表2不同样品体外胃肠道耐受率统计结果
从表2数据中，可以看出本发明实施例1-3制备的五层包埋高活性益生菌，相比对比例和原菌株，单纯经过胃液，耐受性均在92％以上，说明经过五层包埋后的益生菌具有较强的耐胃液强酸性的功能，经过胃液并没有导致内部益生菌的过多死亡起到保护作用；而经过胃液以及肠液综合作用的模拟实验后，发现益生菌耐受性明显下降，是因为益生菌经胃到达肠之后，最外层的凝胶溶解，而内部的各层保护层在37℃是可以正常的逐层溶解，进而促使最内层的益生菌释放，虽然活菌数数降低导致耐受率降低，但是仍然有73％以上的菌存活，说明本发明经五层包埋之后的益生菌具有较高活性，有利于在肠道内定值并平衡肠道内的菌群。
上述实施例所得实验结果，经分析，推断是由于经过五层包埋之后，最内部的一层作为分散剂，可以促使菌体更均匀，并且在冷冻时还可以作为填充剂保护菌体不受破坏；第二层经乳清蛋白和精氨酸的添加可以为内部乳杆菌提供营养，并且经过浆糊状的调控可以保证菌体的存活的同时，还不至于因其菌体个体差异在所提供的营养环境中快速增殖，而导致“两极分化”的现象最终反而使得部分弱势菌死亡，降低活菌总数；而第三层的添加由于加热脱水山梨醇单硬脂酸甘油酯冷却后使用可以在外层想成一层油性保护膜，经冷冻后，可以更好的防治内部环境和菌体脱水，更有利于内部益生菌的存活；而第四层由于聚谷氨酸和聚乙二醇联合形成的蜂窝状结构，并且将酵母菌有序的包裹在其内，酵母菌分泌的代谢物还能为内部乳酸菌提供营养促进其生长，这层结构不仅能够提到保护层的功效，还能在该益生菌在实际使用后经裂解后与内部的益生菌起到相辅相成促进益生菌生长的作用；最外面的一层纤维素凝胶可以抵抗强酸环境，能够使得益生菌不至于在进入胃肠后就快速裂解暴露益生菌，起到进一步保护作用。因此，本发明所制备的五层包埋层是层层递进，相互作用，共同完成对于内部益生菌的保护作用，并且还能防止益生菌直接暴露在较强酸性的胃液中，起到缓释的作用，能更好的提高益生菌的活菌数。
另外，从实施例1-实施例3可以看出，经过包埋之后实施例1利用发酵乳杆菌制备的五层包埋高活性益生菌活菌数相对实施例2和实施例3高，但是稳定性和肠胃耐受性却是实施例2利用格氏乳杆菌制备的五层包埋高活性益生菌表现最佳，也就是说，益生菌剂所包含活菌数越高，其益生效果不一定就越好，也就是说，不同菌种之间生物特性差异较大，即使是属于同属但是不同菌种，各项生物性能仍然存在差异。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种五层包埋活性益生菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)乳酸菌经发酵后得到发酵液，将所述发酵液离心收集菌体；
(2)将所述菌体与第一层包埋剂混合均匀，获取具有第一层包埋层的菌体1；所述第一层包埋剂为磷酸三钙；
(3)将所述菌体1与第二层包埋剂混合后，再添加水调整粘稠浆糊状，冷藏静置，获取具有第二层包埋层的菌体2；其中，所述第二层包埋剂是由乳清蛋白与精氨酸混合而成；
(4)将所述菌体2与第三层包埋剂混合均匀，快速冷冻干燥，造粒，获取具有第三层包埋层的菌体3；所述第三层包埋剂为脱水山梨醇单硬脂酸甘油酯；
(5)将所述菌体3用第四层包埋剂包衣处理，获取具有第四层包埋层的菌体4；其中，所述第四层包埋剂是由聚谷氨酸、聚乙二醇、酵母菌粉以及水混合而成；
(6)将所述菌体4与第五层包埋剂混合后，然后将混合物高压喷入氯化钙溶液中，低温静置，干燥、粉碎，获取具有第五层包埋剂的菌体5，即为所述五层包埋高活性益生菌；所述第五层包埋剂为纤维素凝胶。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述乳酸菌发酵所用的发酵培养基包括以下重量份组分：蛋白胨10份、酵母浸粉8份、葡萄糖25份、磷酸氢二钾4份、MgSO4·7H2O0.2份、乙酸钠3份、MnSO4·4H2O 0.01份和水1000份。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述菌体和所述磷酸三钙的质量比为1g：15-20μg。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述菌体1和所述第二层包埋剂的质量比为100g：(20-30)mg；
所述第二层包埋层中的乳清蛋白和精氨酸的质量比为3∶(0.05-0.5)。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述菌体2与所述脱水山梨醇单硬脂酸甘油酯的质量比为1∶(1-3)。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚谷氨酸、所述聚乙二醇、所述酵母菌粉和所述水的质量比为(7-10)∶1∶(1-2)∶(3-5)。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述菌体4与所述纤维素凝胶的重量比为1∶1；其中，所述纤维素凝胶是将氯化锌溶液和微晶纤维素溶液按照质量比(20-25)∶(1-2)混合，于35℃加热混合均匀后制得。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合物与所述氯化钙溶液的体积比为1∶1，所述氯化钙的浓度为1g/mL。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述乳酸菌包括发酵乳杆菌、格氏乳杆菌或植物乳杆菌。
10.一种五层包埋高活性益生菌，其特征在于，其是由如权利要求1-9任一项所述的制备方法制得。
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