CN117054578A - 一种测定石杉碱甲粗品中偶氮二异丁腈的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种测定石杉碱甲粗品中偶氮二异丁腈的方法，所述方法步骤如下：步骤1，对照品溶液的配制：取偶氮二异丁氰对照品加甲醇溶解，流动相A稀释，再用溶剂稀释；步骤2，供试品溶液的配制：取石杉碱甲粗品加甲醇溶解，用流动相A稀释；步骤3，加标供试品溶液配制：取石杉碱甲粗品加甲醇溶解，加入偶氮二异丁氰储备液用流动相A稀释；步骤4，测定：取对照品溶液，供试品溶液，加标供试品溶液注入HPLC色谱仪，得到色谱图，根据色谱图，计算供试品溶液中各组分的含量。
Description
技术领域
本发明涉及一种药品的检测方法，特别涉及一种测定石杉碱甲粗品中偶氮二异丁腈的方法。
背景技术
石杉碱甲，又名：石杉碱钾A；石杉碱A；-石杉碱甲A,卷柏石松验,哈伯因；石杉碱甲(5R,9R,11E)-5-氨基-11-乙叉基-5,6,9,10-四氢-7-甲基-5,9-甲撑环辛并(B)吡啶-2(1H)酮CAS号102518-79-6，分子式C15H18N2O，分子量242.32，结构式
石杉碱甲是一种可逆性胆碱酯酶抑制剂，对真性胆碱酯酶具有选择性抑制作用。生物活性高，有较高的脂溶性，分子小，易透过血脑屏障，进入中枢后较多地分布于大脑的额叶、颞叶、海马等与学习和记忆有密切联系的脑区，在低剂量下对乙酰胆碱酯酶(AChE)有强大的抑制作用，使分布区内神经突触间隙的乙酰胆碱(ACh)含量明显升高，从而增强神经元兴奋传导，强化学习与记忆脑区的兴奋作用，起到提高认知功能、增强记忆保持和促进记忆再现的作用。
偶氮二异丁腈为石杉碱甲中间产品LE-10→LE-11过程中参与反应，结构式及反应过程如下：
LE-11经过3步反应得到LE-消旋体，再经过手性拆分后浓干得到石杉碱甲粗品，对石杉碱甲进行一步精制即得到石杉碱甲成品。
在上述反应中，偶氮二异丁腈存在未完全反应有部分残留的风险，残留的偶氮二异丁腈会影响成品的质量，甚至可能影响药物的药效和毒性，进入人体后再血液、肝脏、脑等组织内可代谢为剧毒的氢腈酸，因此，有必要建立一种针对石杉碱甲粗品中偶氮二异丁腈的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种石杉碱甲粗品中偶氮二异丁腈的检测方法。
本发明所述方法步骤如下：
步骤1，对照品溶液的配制：取偶氮二异丁氰对照品加甲醇溶解，流动相A稀释后再用溶剂稀释；
步骤2，供试品溶液的配制：取石杉碱甲粗品加甲醇溶解，用流动相A稀释；
步骤3，加标供试品溶液配制：取石杉碱甲粗品加甲醇溶解，加入偶氮二异丁氰储备液，用流动相A稀释；
步骤4，测定：取对照品溶液，供试品溶液，加标供试品溶液注入HPLC色谱仪，得到色谱图，根据色谱图，计算供试品溶液中各组分的含量。
其中，步骤1对照品溶液的配制：步骤如下：
取偶氮二异丁氰对照品20-40mg，置50-200ml量瓶中，加甲醇20-40ml超声溶解，流动相A稀释到刻度，精密量取0.5-2ml置10-100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
其中溶剂为甲醇：流动相A＝30：70。
其中，步骤2供试品溶液的配制：步骤如下：
取石杉碱甲粗品0.2-0.4g，精密称定，置5-20ml量瓶中，加甲醇2-4ml溶解，用流动相A稀释到刻度，摇匀，过滤。
其中，步骤3，加标供试品溶液配制：步骤如下：
取石杉碱甲粗品0.2-0.4g，精密称定，置5-20ml量瓶中，加甲醇2-4ml溶解，加入偶氮二异丁氰储备液0.5-2ml，用流动相A稀释至刻度，摇匀。
其中，偶氮二异丁氰储备液配制方法如下：精密称取偶氮二异丁氰对照品30mg置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml置25ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度。其中溶剂为甲醇：流动相A＝30：70。
其中，测定过程中的色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相(Agilent Poroshell120 PFP，4.6×150mm，2.7μm)，以0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液(磷酸调节pH至4.50)为流动相A，乙腈为流动相B，检测波长345nm，流速0.7ml/min，柱温30℃，进样量100μl。按下表进行梯度洗脱。
最优选的，本发明方法，步骤如下：
步骤1，对照品溶液的配制：取偶氮二异丁氰对照品约30mg，置100ml量瓶中，加甲醇30ml超声溶解，用流动相A稀释到刻度，精密量取1ml置50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
其中溶剂为甲醇：流动相A＝30：70。
步骤2，供试品溶液的配制：取石杉碱甲粗品约0.3g，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇3ml溶解，用流动相A稀释到刻度，摇匀，过滤。
步骤3，加标供试品溶液配制：取石杉碱甲粗品约0.3g，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇3ml溶解，量入偶氮二异丁氰储备液1ml，用流动相A稀释至刻度，摇匀。
其中，偶氮二异丁氰储备液配制方法如下：精密称取偶氮二异丁氰对照品约30mg置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml置25ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度。
其中溶剂为甲醇：流动相A＝30：70。
步骤4，测定：取对照品溶液，供试品溶液，加标供试品溶液注入HPLC色谱仪，得到色谱图，根据色谱图，计算供试品溶液中各组分的含量。
测定过程中的色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相(Agilent Poroshell120 PFP，4.6×150mm，2.7μm)，以0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液(磷酸调节pH至4.50)为流动相A，乙腈为流动相B，检测波长345nm，流速0.7ml/min，柱温30℃，进样量100μl。按下表进行梯度洗脱。
表1、梯度洗脱条件
其中，流动相A配制：0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液(磷酸调节pH至4.50)。
流动相B配制：乙腈。
本发明的方法，和现有技术相比，优点如下：
未检索到石杉碱甲相关产品中偶氮二异丁腈残留的测定方法，关于现有的偶氮二异丁腈定量检测方法，气量法通过测得偶氮二异丁腈分解释放的氮气体积，换算出偶氮二异丁腈含量，该方法操作麻烦并且计算过程复杂；GC-MS法检测方便，但是GC-MS仪器昂贵检测成本过高；专利CN201010238944.4《一种丙烯腈聚合液中偶氮二异丁腈残余的检测方法》中采用液相等度洗脱的方法，方法简便且灵敏度高，但是未排除石杉碱甲对于检测影响，无法适用于石杉碱甲中偶氮二异丁腈的检测。
附图说明
图1线性曲线
图2为实施例1中作为偶氮二异丁腈对照品溶液HPLC图谱。
图3为实施例8中作为供试品溶液HPLC图谱。
图4为实施例8中作为100％回收率溶液HPLC图谱。
图5为实验例1色谱图。
图6，图7、图8、图9、图10为实验例2中不同流动相下的色谱图。
图11、图12为实验例3中不同流动相下的色谱图。
图13、图14为实验例4中不同梯度洗脱程序下的色谱图。
图15为实验例5中梯度洗脱程序下的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实例实施。
实施例1：系统适用性
取对照品溶液，连续进样6针，记录色谱图，以保留时间和峰面积为指标计算RSD值，同时考察偶氮二异丁腈峰理论板数；取加标供试品溶液，进样1针，偶氮二异丁腈峰与相邻峰的分离度。对照品溶液中偶氮二异丁腈峰理论板数为24993，保留时间RSD为0.16％，峰面积RSD为2.03％。加标供试品溶液中偶氮二异丁腈峰与相邻峰的分离度为6.07。系统适用性良好。
表2、系统适用性结果汇总
| 序号 | 保留时间 | 主峰面积 |
| 1 | 7.866 | 3.92 |
| 2 | 7.874 | 4.10 |
| 3 | 7.865 | 4.05 |
| 4 | 7.870 | 4.10 |
| 5 | 7.887 | 4.03 |
| 6 | 7.896 | 4.16 |
| RSD≤1.0％ | 0.16％ | / |
| RSD≤3.0％ | / | 2.03％ |
实施例2：专属性
取加标供试品溶液，进样1针，记录色谱图，与空白溶液图谱对比，在偶氮二异丁腈出峰位置无干扰。
实施例3：重复性实验:
精密称定样品，按照加标供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，连续进样，记录色谱图。以6份供试品溶液的偶氮二异丁腈含量为指标计算RSD值。偶氮二异丁氰的含量RSD为3.16％。实验重复性良好。
表3、重复性结果汇总
实施例4：精密度实验：
3人分别配制2份加标供试品溶液，连续进样，记录色谱图，以三人6份加标供试品溶液的偶氮二异丁腈含量为指标计算RSD值。偶氮二异丁氰的含量RSD为2.03％，实验方法精密度良好。
表4、精密度结果汇总
实施例5：定量限
取空白溶剂，连续进样3针，计算仪器平均噪音水平，按信噪比10:1的要求配制溶液，计算定量限。本方法A定量限为2.384μg/ml，检测限为0.7185μg/ml。
实施例6：线性
精密称取对照品，分别配制成含偶氮二异丁腈2.384μg/ml，2.980μg/ml，5.960μg/ml，8.941μg/ml，11.921μg/ml的溶液。得线性方程为y＝0.7157x+0.0607，R2为0.9996。偶氮二异丁腈在2.384μg/ml～11.921μg/ml范围内线性良好。
表5、线性结果汇总表
线性曲线见图1。
实施例7：稳定性实验
对照品溶液及供试品溶液，于0、4、8、12小时后检测。以峰面积为指标计算峰面积与0小时峰面积的百分比，。对照品溶液12小时主峰面积百分比为97.04％，供试品溶液12小时住峰面积百分比为98.09％。对照品溶液与供试品溶液72小时内均稳定。
实施例8：准确度实验：
采用加样回收。取一份已知各杂质浓度的供试品溶液，加入对照品，配制成80％，100％和120％浓度的加标供试品溶液，每个浓度点平行制备3份，检测偶氮二异丁腈含量。计算回收率及RSD。80％回收率为102.50％～107.17％，100％回收率为102.01％～107.00％，120％回收率为100.42％～106.25％，RSD为2.31％。本方法准确度良好。
表6、准确度结果汇总
实施例9：耐用性
对个色谱参数中的缓冲盐浓度、缓冲液pH、梯度初始比例、检测波长、柱温、流速、色谱柱进行微调，取加标供试品溶液和对照品溶液，在各色谱参数条件下进样1针，已理论板数和分离度为指标，查看方法适用性。各调整后方法理论板数与分离度均符合要求。本方法耐用性良好。
表7、耐用性结果汇总
实施例10
实际生产过程中，其中QSSJJC180701批的石杉碱甲粗品的检测过程和结果如下：
步骤1，对照品溶液的配制：取偶氮二异丁氰对照品约30mg，置100ml量瓶中，加甲醇30ml超声溶解，流动相A稀释到刻度，精密量取1ml置50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
其中溶剂为甲醇：流动相A＝30：70。
步骤2，供试品溶液的配制：取石杉碱甲粗品0.3g，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇3ml溶解，用流动相A稀释到刻度，摇匀，过滤。
步骤3，加标供试品溶液配制：取石杉碱甲粗品约0.3g，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇3ml溶解，量入偶氮二异丁氰储备液1ml，用流动相A稀释至刻度，摇匀。其中，偶氮二异丁氰储备液配制方法如下：精密称取偶氮二异丁氰对照品30mg置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml置25ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度。其中溶剂为甲醇：流动相A＝30：70。
步骤4，测定：取对照品溶液和供试品溶液，注入HPLC色谱仪，得到色谱图，根据色谱图，计算供试品溶液中各组分的含量。
测定过程中的色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相(Agilent Poroshell120 PFP，4.6×150mm，2.7μm)，以0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液(磷酸调节pH至4.50)为流动相A，乙腈为流动相B，检测波长345nm，流速0.7ml/min，柱温30℃，进样量100μl。按下表8进行梯度洗脱。
表8、梯度洗脱条件
其中，流动相A配制：0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液(磷酸调节pH至4.50)。
流动相B配制：乙腈。
结果是：偶氮二异丁氰的含量：未检出。
本发明的方法是经过筛选得到的，筛选过程如下：
实验例1：
以Agilent XDB-C18 150×4.6mm，5μm为色谱柱，以0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH2.5)-甲醇(55:45)为流动相A，以甲醇为流动相B，流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：345nm；进样量50μl。照表9梯度程序洗脱。
表9、梯度洗脱程序
用以上色谱条件进行检测，发现偶氮二异丁腈峰与石杉碱甲峰重合，需对流动相进行调节。详见图5。
实验例2：
以Agilent XDB-C18 150×4.6mm，5μm为色谱柱，照表10参数调整流动相A，以甲醇为流动相B，流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：345nm；进样量50μl。照表9梯度程序洗脱。
表10、流动相A参数调整
| 流动相A |
| 0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH4.5)-甲醇(55:45) |
| 0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH4.5)-甲醇(60:40) |
| 0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH4.5)-甲醇(65:35) |
| 0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH5.5)-甲醇(55:45) |
| 0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH5.5)-甲醇(60:40) |
调整流动相A参数后，偶氮二异丁腈峰与石杉碱甲峰无法有效分离，详见图6、图7、图8、图9、图10。尝试更换有机相。
实验例3：
以Agilent XDB-C18 150×4.6mm，5μm为色谱柱，照表11参数调整流动相A，以乙腈为流动相B，流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：345nm；进样量50μl。照表9梯度程序洗脱。
表11、流动相A参数调整
| 流动相A |
| 0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH4.5)-乙腈(65:35) |
| 0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH4.5)-乙腈(70:30) |
将有机相更换为乙腈后，偶氮二异丁腈峰与石杉碱甲峰分离效果明显，但是其他杂质对偶氮二异丁腈仍有干扰。详见图11、图12。需变更色谱柱并筛选梯度程序。
实验例4：
以Agilent Poroshell120 PFP 150×4.6mm，2.7μm为色谱柱，以0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH4.5)-乙腈(50:50)为流动相A，以乙腈为流动相B，流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：345nm；进样量50μl。照表12、表13梯度程序洗脱。
表12、梯度洗脱程序
表13、梯度洗脱程序
用上述两种梯度程序洗脱，偶氮二异丁腈峰干扰较小，详见图13、图14。方法可继续调整，并调整进样为100μl以提高方法检测限。
实验例5：
以Agilent Poroshell120 PFP 150×4.6mm，2.7μm为色谱柱，以0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH4.5)-乙腈(50:50)为流动相A，以乙腈为流动相B，流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：345nm；进样量100μl。照表14梯度程序洗脱。
表14、梯度洗脱程序
偶氮二异丁腈峰型正常，且无其他杂质干扰，确认最终方法参数。详见图15。
Claims (7)
1.一种测定石杉碱甲粗品中偶氮二异丁腈的方法，所述方法步骤如下：
步骤1，对照品溶液的配制：取偶氮二异丁氰对照品加甲醇溶解，流动相A稀释后再用溶剂稀释；
步骤2，供试品溶液的配制：取石杉碱甲粗品加甲醇溶解，用流动相A稀释；
步骤3，加标供试品溶液配制：取石杉碱甲粗品加甲醇溶解，加入偶氮二异丁氰储备液，用流动相A稀释；
步骤4，测定：取对照品溶液，供试品溶液，加标供试品溶液注入HPLC色谱仪，得到色谱图，根据色谱图，计算供试品溶液中各组分的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1对照品溶液的配制：步骤如下：
取偶氮二异丁氰对照品20-40mg，置50-200ml量瓶中，加甲醇20-40ml超声溶解，流动相A稀释到刻度，精密量取0.5-2ml置10-100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀；
其中溶剂为甲醇：流动相A＝30：70。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤2供试品溶液的配制：步骤如下：
取石杉碱甲粗品0.2-0.4g，精密称定，置5-20ml量瓶中，加甲醇2-4ml溶解，用流动相A稀释到刻度，摇匀，过滤。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤3，加标供试品溶液配制：步骤如下：
取石杉碱甲粗品0.2-0.4g，精密称定，置5-20ml量瓶中，加甲醇2-4ml溶解，加入偶氮二异丁氰储备液0.5-2ml，用流动相A稀释至刻度，摇匀。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，偶氮二异丁氰储备液配制方法如下：精密称取偶氮二异丁氰对照品30mg置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml置25ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度；其中溶剂为甲醇：流动相A＝30：70。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，测定过程中的色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相(Agilent Poroshell120 PFP，4.6×150mm，2.7μm)，以0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液(磷酸调节pH至4.50)为流动相A，乙腈为流动相B，检测波长345nm，流速0.7ml/min，柱温30℃，进样量100μl；按下表进行梯度洗脱；
梯度洗脱条件
7.一种测定石杉碱甲粗品中偶氮二异丁腈的方法，所述方法步骤如下：
步骤1，对照品溶液的配制：取偶氮二异丁氰对照品30mg，置100ml量瓶中，加甲醇30ml超声溶解，流动相A稀释到刻度，精密量取1ml置50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀；其中溶剂为甲醇：流动相A＝30：70；
步骤2，供试品溶液的配制：取石杉碱甲粗品0.3g，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇3ml溶解，用流动相A稀释到刻度，摇匀，过滤；
步骤3，加标供试品溶液配制：取石杉碱甲粗品0.3g，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇3ml溶解，量入偶氮二异丁氰储备液1ml，用流动相A稀释至刻度，摇匀；其中，偶氮二异丁氰储备液配制方法如下：精密称取偶氮二异丁氰对照品30mg置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml置25ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度；
其中溶剂为甲醇：流动相A＝30：70；
步骤4，测定：取对照品溶液，供试品溶液，加标供试品溶液注入HPLC色谱仪，得到色谱图，根据色谱图，计算供试品溶液中各组分的含量；
测定过程中的色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相(Agilent Poroshell120 PFP，4.6×150mm，2.7μm)，以0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液(磷酸调节pH至4.50)为流动相A，乙腈为流动相B，检测波长345nm，流速0.7ml/min，柱温30℃，进样量100μl；按下表进行梯度洗脱；
梯度洗脱条件
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