CN116987719A - H9n2 aiv多表位重组杆状病毒及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了H9N2AIV多表位重组杆状病毒及其制备方法和用途，属于基因工程技术领域。所述H9N2AIV多表位重组杆状病毒整合了表达H9N2AIV B细胞和T细胞多表位的表达盒AIV B/T，所述表达盒AIV B/T的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；还整合了VSVG基因和CMV基因。本发明成功构建的重组杆状病毒rBV‑AIV B/T，将其与灭活疫苗InV配合使用后，与单独使用灭活疫苗InV相比，能增强机体的体液免疫和细胞免疫应答反应，减少病毒载量，缩短排毒时间。本发明为AIV表位疫苗的开发和验证提供参考以及为AIV防控提供新思路。

Description

H9N2 AIV多表位重组杆状病毒及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及H9N2 AIV多表位重组杆状病毒及其制备方法和用途。
背景技术
流感病毒(influenza virus，IV)是一种属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，流感病毒属的分节段病毒。根据流感病毒核蛋白NP和基质蛋白M1抗原性的差异，流感病毒可分为A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒四种类型。禽流感病毒(Avianinfluenza virus，AIV)是A型流感病毒的主要成员之一，能够引起各种家禽及野禽全身或呼吸系统疾病。禽类在感染禽流感病毒后可表现为不同程度的呼吸道症状、产蛋下降、生长发育不良等症状，严重的可导致高死亡率的急性败血症。通过分析禽流感病毒中由赖氨酸(K)和精氨酸(R)组成多碱性氨基酸裂解位点的存在，禽流感病毒又可分为高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)与低致病性禽流感病毒(Lowpathogenic avian influenza virus,LPAIV)。H9N2亚型AIV虽为低致病性禽流感病毒，但自从在我国首次报告以来，发展至今已成为我国AIV主要的流行亚型之一。
目前关于H9N2 AIV的防控主要依靠灭活疫苗(Inactivate vaccine，InV)，然而此类疫苗只能以激活机体体液免疫应答为主，诱导细胞免疫应答能力差，并且，接种过InV的鸡群仍然检测发现有H9N2 AIV排毒，迫切需要可以同时驱动体液免疫和细胞免疫应答的新型疫苗如重组表位疫苗来弥补InV的不足。目前对于AIV疫苗免疫效果评估主要是通过检测其引起的血清中抗体滴度水平，缺少对所引起的细胞免疫效果评估。因此，研发诱导机体产生良好适应性免疫应答反应的表位疫苗，以及检测其所诱导机体适应性免疫应答水平对于解决现有技术存在的问题非常重要。
发明内容
本发明的目的是提供H9N2 AIV多表位重组杆状病毒及其制备方法和用途，以解决上述现有技术存在的问题，本发明成功构建的重组杆状病毒rBV-AIV B/T，将其与灭活疫苗InV配合使用后，与单独使用灭活疫苗InV相比，能增强机体的体液免疫和细胞免疫应答反应，减少病毒载量，缩短排毒时间。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供H9N2 AIV多表位重组杆状病毒，其整合了表达H9N2 AIV B细胞和T细胞多表位的表达盒AIV B/T，所述表达盒AIV B/T的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选的是，所述H9N2 AIV多表位重组杆状病毒还整合了VSVG基因和CMV基因。
本发明还提供了宿主细胞，其通过所述的H9N2 AIV多表位重组杆状病毒感染昆虫细胞而得到。
本发明还提供了一种所述的H9N2 AIV多表位重组杆状病毒的构建方法，包括以下步骤：
(1)将VSVG基因、CMV基因和表达盒AIV B/T依次连接至转移质粒，构建重组转移质粒；
(2)将所述重组转移质粒转化感受态细胞，获得重组杆状病毒质粒；
(3)将所述重组杆状病毒质粒转染昆虫细胞，培养后收集上清液，获得H9N2 AIV多表位重组杆状病毒。
优选的是，所述转移质粒包括pFastBac Dual，所述感受态细胞包括DH10Bac，所述昆虫细胞包括Sf9细胞。
本发明还提供了一种检测禽类诱导机体适应性免疫应答水平的试剂盒，其包括所述的重组杆状病毒，以及与所述H9N2 AIV多表位重组杆状病毒联合使用的H9N2禽流感灭活疫苗InV。
本发明还提供了一种诱导禽类机体产生良好适应性免疫应答反应的表位疫苗，包含所述的H9N2 AIV多表位重组杆状病毒，以及与所述H9N2 AIV多表位重组杆状病毒联合使用的H9N2禽流感灭活疫苗InV。
本发明还提供了一种防控H9N2禽流感的表位疫苗，包含所述的H9N2 AIV多表位重组杆状病毒，以及与所述H9N2 AIV多表位重组杆状病毒联合使用的H9N2禽流感灭活疫苗InV。
优选的是，所述H9N2 AIV多表位重组杆状病毒和所述H9N2禽流感灭活疫苗InV的体积比为1:1，浓度均为109pfu/mL。
本发明还提供了一种所述的H9N2 AIV多表位重组杆状病毒联合H9N2禽流感灭活疫苗InV的用途，所述用途包括如下任一项：
(1)在制备检测禽类诱导机体适应性免疫应答水平的试剂盒中的用途；
(2)在制备诱导禽类机体产生良好适应性免疫应答反应的表位疫苗的用途；
(3)在制备防控H9N2禽流感的表位疫苗中的用途。
本发明公开了以下技术效果：
本发明制备了与H9N2 AIV InV联合使用可增强机体的适应性免疫应答的重组杆状病毒表位疫苗rBV-AIV B/T，并检测了其所诱导机体适应性免疫应答水平，试验结果发现：本发明成功构建的重组杆状病毒rBV-AIV B/T，将其与灭活疫苗InV配合使用后，与单独使用灭活疫苗InV相比，能增强机体的体液免疫和细胞免疫应答反应，减少病毒载量，缩短排毒时间。本发明为AIV表位疫苗的开发和验证提供参考以及为AIV防控提供新思路。
附图说明
图1为表位表达盒以及pFBD-VSVG-CMV-AIV B/T质粒的设计；a：表位表达盒设计；b：pFBD-VSVG-CMV-AIV B/T质粒的设计；
图2为VSVG基因菌液PCR扩增结果，M：DL2000 DNA Marker；1、2：VSVG基因PCR扩增产物；3：阴性对照；
图3为CMV基因菌液PCR扩增结果；M：DL2000 DNA Marker；1、2、3：CMV基因PCR扩增产物；4：阴性对照；
图4为重组杆状病毒质粒蓝白斑筛选结果；a：第一轮蓝白斑筛选结果图；b：第二轮蓝白斑筛选结果图；
图5为重组杆状病毒质粒rBacmid-AIV B/T的鉴定(通用引物M13 PCR结果)；M：DL10000DNA Marker；1-6：重组质粒rBacmid-AIV B/T的菌液；7：阴性对照；
图6为转染后出现病变的Sf9细胞和正常Sf9细胞(100×)；a：转染rBacmid-AIV B/T质粒的Sf9细胞图；b：转染Bacmid-WT质粒的Sf9细胞图；c：正常的Sf9细胞图；比例尺为100μm；
图7为多表位表达盒cDNA RT-PCR扩增结果；M：DL2000 DNA Marker；1、2：P2代和P3代多表位表达盒cDNA PCR扩增产物；3：杆状病毒野毒BV-WT PCR扩增产物；
图8为间接免疫荧光检测多表位蛋白表达(100×)；a：转导BV-WT的DF-1细胞；b：转导BV-AIV B/T的DF-1细胞；比例尺为100μm；
图9为Western Blot检测多表位蛋白表达；M：预染蛋白分子量标准(180kDa)；P2：P2代rBV-AIV B/T转导的DF-1细胞沉淀；P3代rBV-AIV B/T转导的DF-1细胞沉淀；WT：BV-WT转导的DF-1细胞沉淀；
图10为加强免疫后HI抗体检测结果；运用unpaired-t test进行统计学分析，n＝10，*：P<0.05，差异显著；***：P<0.001，差异极显著；
图11为加强免疫后血清中IgG抗体含量检测结果；运用unpaired-t test进行统计学分析，n＝9，*：P<0.05，差异显著；***：P<0.001，差异极显著；
图12为加强免疫后血清中IgM抗体含量检测结果；运用unpaired-t test进行统计学分析，n＝9，*：P<0.05，差异显著；***：P<0.001，差异极显著；
图13为加强免疫后血清中IgA抗体含量检测结果；运用unpaired-t test进行统计学分析，n＝9，ns：P>0.05，无差异显著；
图14为加强免疫后气管粘膜中sIgA抗体含量检测结果；运用unpaired-t test进行统计学分析，n＝3，ns：P>0.05，无差异显著；
图15为T细胞流式染色的圈门策略；a：淋巴细胞圈门；b：单个细胞圈门；c：CD3+T细胞圈门；图d：CD4+、CD8+和CD4+CD8+T细胞圈门；
图16为B细胞流式染色的圈门策略；a：淋巴细胞圈门；b：单个细胞圈门；c：B细胞圈门；
图17为加强免疫后外周血中CD4+T细胞的比例；运用unpaired-t test进行统计学分析，n＝6，**：P<0.01，差异极显著；
图18为加强免疫后外周血中CD8+T细胞的比例；运用unpaired-t test进行统计学分析，n＝6，**：P<0.01，差异极显著；
图19为加强免疫后外周血中CD4+CD8+T细胞的比例；运用unpaired-t test进行统计学分析，n＝6，**：P<0.01，差异极显著；
图20为加强免疫后外周血中B细胞的比例；运用unpaired-t test进行统计学分析，n＝3，*：P<0.05，差异显著；**：P<0.01，差异极显著；
图21为加强免疫后鸡PBMC中天然免疫相关基因表达情况；运用paired t-test进行统计学分析，数据代表三次独立实验，*：P<0.05，差异显著；
图22为加强免疫后鸡PBMC中CTLs相关基因表达情况；运用paired t-test进行统计学分析，数据代表三次独立实验，*：P<0.05，差异显著；
图23为加强免疫后鸡PBMC中炎症及趋化因子相关基因表达情况；运用paired t-test进行统计学分析，数据代表三次独立实验，*：P<0.05，差异显著；
图24为加强免疫后鸡PBMC中Th2相关基因表达情况；运用paired t-test进行统计学分析，数据代表三次独立实验，*：P<0.05，差异显著；
图25为InV+rBV-AIV B/T组、InV+BV-WT组和InV组鸡ELISpot部分斑点展示；
图26为InV+rBV-AIV B/T组鸡脾脏淋巴细胞IFN-γ的分泌水平；a：#1鸡脾脏淋巴细胞IFN-γ的分泌水平；b：#2鸡脾脏淋巴细胞IFN-γ的分泌水平；c：#3鸡脾脏淋巴细胞IFN-γ的分泌水平；运用unpaired t-test进行统计学分析，每条肽三个技术重复，*：P<0.05，差异显著；
图27为InV+BV-WT组鸡脾脏淋巴细胞IFN-γ的分泌水平；a：#21鸡脾脏淋巴细胞IFN-γ的分泌水平；b：#22鸡脾脏淋巴细胞IFN-γ的分泌水平；c：#23鸡脾脏淋巴细胞IFN-γ的分泌水平；运用unpaired t-test进行统计学分析，每条肽三个技术重复；
图28为InV组鸡脾脏淋巴细胞IFN-γ的分泌水平；a：#41鸡脾脏淋巴细胞IFN-γ的分泌水平；b：#42鸡脾脏淋巴细胞IFN-γ的分泌水平；c：#43鸡脾脏淋巴细胞IFN-γ的分泌水平；运用unpaired t-test进行统计学分析，每条肽三个技术重复；
图29为H9N2 AIV感染后3DPI鸡脏器病毒载量；运用unpaired t-test进行统计学分析，n＝3，*：P<0.05，差异显著；
图30为H9N2 AIV感染后鸡咽喉病毒滴度；运用unpaired t-test进行统计学分析，n＝9，*：P<0.05，差异显著；**：P<0.01，差异极显著；***：P<0.001，差异极显著；
图31为H9N2 AIV感染后鸡泄殖腔病毒滴度；运用unpaired t-test进行统计学分析，n＝9，**：P<0.01，差异极显著；
图32为H9N2 AIV感染后PBMC中CD4+T细胞比例变化；运用unpaired t-test进行统计学分析，n＝5，*：P<0.05，差异显著；
图33为H9N2 AIV感染后PBMC中CD8+T细胞比例变化；运用unpaired t-test进行统计学分析，n＝5，*：P<0.05，差异显著。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
术语解释：
AIV：Avain influenza virus，禽流感病毒；
BEVS：Baculovirus expression vector system，杆状病毒表达系统；
CMV：Cytomegalovirus，巨细胞病毒；
ELISpot：Enzyme-linked immunospot assay，酶联免疫斑点试验；
EID50：50％Embryo infective dose，鸡胚半数感染量；
FBS：Fetal bovine serum，胎牛血清；
HA：Haemagglutinin，血凝素；
IFN-γ：Interferon-γ，γ干扰素；
IgA：Immunoglobulin A，免疫球蛋白A；
IgM：Immunoglobulin M，免疫球蛋白M；
IgG：Immunoglobulin G，免疫球蛋白G；
NA：Neuraminidase，神经氨酸酶；
NP：Nucleoprotein，核蛋白；
PBMC：Peripheral blood mononuclear cells，外周血单个核细胞；
SPF：Specific Pathogen Free，无特定病原体；
Th：Helper T，辅助性T细胞；
VSV：Vesicular stomatitis virus，水疱性口炎病毒。
以下实施例所用的主要试验材料和试验试剂：
1、试验材料
(1)病毒、质粒、细胞、菌株及疫苗来源
H9N2 AIV A/Chicken/Hunan/HN/2015以及由其制备的阳性血清、pFastBacTMDual质粒、Sf9细胞均由华南农业大学人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室保存。
TOP10、DH10Bac感受态细胞为北京博迈德生物科技有限公司产品。
SS株H9N2灭活疫苗为广州市华南农大生物药品有限公司产品。
(2)鸡胚与实验动物
2周龄无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)鸡以及9～11日龄SPF鸡胚购自广东省新兴大华农禽蛋有限公司。
2、试验试剂
SmaⅠ、NheⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ、NotⅠ、HindⅢ限制性内切酶购自美国New EnglandBiolabs公司；T4 DNA Ligase Enzymes购自日本TaKaRa公司；鸡外周血淋巴细胞分离试剂盒、鸡脾脏淋巴细胞分离试剂盒购自天津灏洋生物制品科技有限公司；PMA+Ionomycin购自达科为生物技术股份有限公司；Sf-900TM III SFM培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血清、CellfectinTM II Reagent购自Thermo Fisher Scientific；Chicken IFN-γELISpotBASICKit购自Mabtech公司；Mouse Anti-Chicken CD3-APC、Mouse Anti-Chicken CD4-FITC、Mouse Anti-Chicken CD8α-PE、Mouse Anti-Chicken BU 1-FITC购自Southern Biotech公司；Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody、FITC标记的山羊抗小鼠IgG购自英国Abcam公司；Goat anti-Rabbit IgG购自北京全氏金生物公司；Plasmid Mini Kit II Kit、E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini KitⅠ、HiPure Gel Pure Micro Kit购自美国Omega Bio-Tek公司；鸡免疫球蛋白M(IgM)检测试剂盒、鸡免疫球蛋白G(IgG)检测试剂盒购自武汉USCN公司；鸡免疫球蛋白A(IgA)检测试剂盒、鸡分泌型免疫球蛋白A(sIgA)检测试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。
3、主要试剂制备
(1)LB固体培养基：配制250mL的固体培养基，先在锥形瓶中加入适量双蒸水，然后加入如下试剂：2.50g胰蛋白胨、2.50g酵母提取物、1.0g NaCl及3.0g琼脂粉。搅拌使所有成分溶解后，用5M的NaOH溶液调整pH至7.0，加双蒸水定容至250mL，高压灭菌，室温备用。
(2)LB液体培养基：大量表达前，先往5L大锥形瓶中加入1L双蒸水，随后加入20.00g胰蛋白胨、20.00g酵母提取物和5.00g氯化钠，搅拌使所有组分溶解后，调pH至7.0，最后加双蒸水定容至2L，高压灭菌，室温备用。
(3)IPTG溶液(40mg/mL)：称取0.16g IPTG，加入纯水2mL使其溶解，然后定容到4mL，过滤除菌，无菌分装，-20℃保存备用。
(4)X-gal溶液(20mg/mL)：称取0.1g X-gal，加入3mL二甲基甲酰氨(DMF)使其溶解，然后定容到5mL，过滤除菌，无菌分装，-20℃保存备用。
(5)蓝白斑三抗筛选固体LB平板：将200mL的固体LB加热融化，冷却至55℃左右，加入1mL X-gal溶液(20mg/ml)、200μL IPTG溶液(40mg/mL)、1mL卡那霉素(10mg/mL)、200μL四环素(10mg/mL)、280μL庆大霉素(5mg/mL)，摇匀后，倒平板。待平板凝固后，用报纸包裹，4℃避光保存。
(6)1640完全培养基：50mL离心管中加45mL RPMI-1640培养基，5mL的灭活FBS及500μL青链霉素(100×)，混匀后4℃备用。
(7)流式Buffer：50mL离心管中加49mL RPMI-1640培养基，1mL的灭活FBS，混匀后4℃备用。
(8)细胞冻存液：50mL离心管中加45mL灭活FBS，5mL的DMSO，混匀后4℃备用。
(9)1％鸡红细胞：采集鸡外周血后分离得到红细胞，用注射器缓慢取1mL鸡红细胞，沿着锥形瓶壁缓慢加入99mL灭菌PBS中，顺时针方向轻轻摇晃形成均匀红细胞液，放置于4℃冰箱中备用。
实施例1
1、多表位基因表达盒的设计与合成
参考NCBI登录的VSVG基因和CMV基因的序列，在基因序列两端加上相应的限制性酶切位点，设计了VSVG基因和CMV基因的合成序列，并且设计VSVG基因和CMV基因的特异性扩增引物，引物如表1所示。
本发明将本实验室前期研究中筛选出的4条T细胞表位的基础上，与搜集已发表的保守B细胞和T细胞表位，表位序列做相应的多次重复，共同构建使用柔性接头(GGGGS)串联的多表位表达盒AIV B/T，表达盒元件见表1，表达盒核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示。在表达盒上游序列依次加入NotⅠ酶切位点和启动子，在下游一次加入His标签、终止子和HindⅢ酶切位点，如图1所示。根据设计的表位盒，并参考杆状病毒优势密码子进行优化。并且设计表达盒特异性扩增引物，引物如表2所示。
以上基因序列均由通用生物(安徽)股份有限公司合成，合成的序列均插入在pUC57质粒中。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表1表达盒元件
表2扩增VSVG基因、CMV基因以及AIV B/T-F基因的引物
注：斜体为酶切位点。
表达盒核苷酸序列(SEQ ID NO:1):
atgggcggtggcggctccggcggtggtggttccggtggtggaggttcccgtctgaacatgatcaacaacaagatcgacgaccagatccaggacatctgggcttacaacgctgaactgctggtcctgctggagaaccagaagactctggacgaacacgacgctaacgtcaacaacctgtacaacaaggtgaagcgcgccctgggcagcaacgccggaggaggtggaagcggtggtggtggtagcggtggcggtggttcccgcctgaacatgattaacaacaagattgacgaccagattcaggacatctgggcctacaacgctgagctgctggtgctgctggaaaaccagaagaccctggacgaacatgacgctaacgtgaacaacctgtataacaaggtcaagcgtgctctgggttccaacgccggtggcggcggtagcggtggaggtggttccggaggcggcggaagctccctgctgactgaggtcgaaacccccacccgtactggctgggagtgcaactgctccggttcctccgacggtggtggtggaagcggaggtggtggttcaggcggtggcggttccagcctgctgactgaagtcgaaacccctactcgtactggttgggaatgcaactgctctggcagcagcgacggcggtggcggatccggtggaggtggatccggtggtggcggttctagcctgctgaccgaagtcgaaactcctactcgcaccggctgggaatgcaattgcagcggctcctccgacggcggtggtggatctggtggcggcggatccggcggaggaggatcaagcctgctgacagaagtggaaactcccacccgtaccggttgggagtgcaattgctccggttctagcgacggtggcggtggctccggtggtggtggctcaggaggtggtggcagcgccgtgaagggcatcggcactatggtgggcggtggcggcagcgacgtgagcttccagggtcgtggtgtcggcggcggcggttcaatgtcccgtgactggctgatgctgatcggtggcggcggcagctggatcatccgtaactgggaaaccgtgggcggtggtggctctgaactgcgctcccgctactgggctatccgtactcgttccggtggtggtggtggttctgaccgtctgttcttcaagtgcatctaccgtggcggcggcggctctgtgatggagctgatccgcatgatcggtggcggtggaagcgaagacctgcgcgtgtccagcttcatcggcggcggcggatctgccgagatcgaggacctgatcttcctgggtggcggcggttccgctgtcaagggtatcggcaccatggtcggcggtggcggttcagacgtgagctttcagggccgtggtgtcggaggcggtggctcaatgagccgtgactggctcatgctgatcggcggtggtggctcctggatcatccgcaactgggaaactgtcggtggtggtggtagtgaactgcgtagccgttactgggctattcgcacccgtagcggcggtggtggtggcagtgaccgtctgtttttcaagtgcatctatcgcggcggtggtggctcggtcatggaactgatccgtatgatcggcggtggaggtagcgaagacctccgtgtgtccagctttatcggcggtggcggtagcgccgaaatcgaggacctcatcttcctgggcggcggtggctctcaccaccaccaccatcac；
表达盒氨基酸序列(SEQ ID NO:2):
GGGGSGGGGSGGGGSRLNMINNKIDDQIQDIWAYNAELLVLLENQKTLDEHDANVNNLYNKVKRALGSNAGGGGSGGGGSGGGGSRLNMINNKIDDQIQDIWAYNAELLVLLENQKTLDEHDANVNNLYNKVKRALGSNAGGGGSGGGGSGGGGSSLLTEVETPTRTGWECNCSGSSDGGGGSGGGGSGGGGSSLLTEVETPTRTGWECNCSGSSDGGGGSGGGGSGGGGSSLLTEVETPTRTGWECNCSGSSDGGGGSGGGGSGGGGSSLLTEVETPTRTGWECNCSGSSDGGGGSGGGGSGGGGSAVKGIGTMVGGGGSDVSFQGRGVGGGGSMSRDWLMLIGGGGSWIIRNWETVGGGGSELRSRYWAIRTRSGGGGGSDRLFFKCIYRGGGGSVMELIRMIGGGGSEDLRVSSFIGGGGSAEIEDLIFLGGGGSAVKGIGTMVGGGGSDVSFQGRGVGGGGSMSRDWLMLIGGGGSWIIRNWETVGGGGSELRSRYWAIRTRSGGGGGSDRLFFKCIYRGGGGSVMELIRMIGGGGSEDLRVSSFIGGGGSAEIEDLIFLGGGGSHHHHHH。
2、重组杆状病毒rBV-AIV B/T的获得及传代
首先利用双酶切再连接的方法将VSVG基因、CMV基因以及AIV B/T-F基因依次连接至转移质粒pFastBac Dual；获得重组转移质粒pFBD-VSVG-CMV-AIV B/T后转化DH10Bac感受态细胞，在经两轮蓝白斑三抗筛选并用穿梭质粒Bacmid的通用引物M13(表3)测序验证无误后获得穿梭质粒rBacmid-AIV B/T。
重组杆状病毒质粒rBacmid-AIV B/T和杆状病毒野毒质粒Bacmid-WT配合阳离子脂质体Cellfectin II转染Sf9细胞，将细胞在27℃下培养72～96小时，或直到出现明显的病毒感染病变迹象。收集细胞上清，即为P1代重组杆状病毒rBV-AIV B/T和P1代杆状病毒野毒BV-WT。
将P1代病毒以接毒量为MOI＝0.1接种处于对数生长期的SF9细胞，接种密度为1×106cells/mL；置于27℃摇床中以110r/min转速培养；每24h观察细胞状态和细胞密度，直到细胞出现明显的病毒感染病变迹象，收集细胞上清，即为P2代病毒。
表3穿梭质粒Bacmid的通用引物
上述VSVG基因序列(SEQ ID NO：3)：:
atgaagtgccttttgtacttagcctttttattcattggggtgaattgcaagttcaccatagtttttccacacaaccaaaaaggaaactggaaaaatgttccttctaattaccattattgcccgtcaagctcagatttaaattggcataatgacttaataggcacagccttacaagtcaaaatgcccaagagtcacaaggctattcaagcagacggttggatgtgtcatgcttccaaatgggtcactacttgtgatttccgctggtatggaccgaagtatataacacattccatccgatccttcactccatctgtagaacaatgcaaggaaagcattgaacaaacgaaacaaggaacttggctgaatccaggcttccctcctcaaagttgtggatatgcaactgtgacggatgccgaagcagtgattgtccaggtgactcctcaccatgtgctggttgatgaatacacaggagaatgggttgattcacagttcatcaacggaaaatgcagcaattacatatgccccactgtccataactctacaacctggcattctgactataaggtcaaagggctatgtgattctaacctcatttccatggacatcaccttcttctcagaggacggagagctatcatccctgggaaaggagggcacagggttcagaagtaactactttgcttatgaaactggaggcaaggcctgcaaaatgcaatactgcaagcattggggagtcagactcccatcaggtgtctggttcgagatggctgataaggatctctttgctgcagccagattccctgaatgcccagaagggtcaagtatctctgctccatctcagacctcagtggatgtaagtctaattcaggacgttgagaggatcttggattattccctctgccaagaaacctggagcaaaatcagagcgggtcttccaatctctccagtggatctcagctatcttgctcctaaaaacccaggaaccggtcctgctttcaccataatcaatggtaccctaaaatactttgagaccagatacatcagagtcgatattgctgctccaatcctctcaagaatggtcggaatgatcagtggaactaccacagaaagggaactgtgggatgactgggcaccatatgaagacgtggaaattggacccaatggagttctgaggaccagttcaggatataagtttcctttatacatgattggacatggtatgttggactccgatcttcatcttagctcaaaggctcaggtgttcgaacatcctcacattcaagacgctgcttcgcaacttcctgatgatgagagtttattttttggtgatactgggctatccaaaaatccaatcgagcttgtagaaggttggttcagtagttggaaaagctctattgcctcttttttctttatcatagggttaatcattggactattcttggttctccgagttggtatccatctttgcattaaattaaagcacaccaagaaaagacagatttatacagacatagagatgaaccgacttggaaagtga；
CMV基因序列(SEQ ID No：4)：
gacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagct。
3、多表位蛋白的鉴定
将rBV-AIV B/T以MOI＝50的量接至生长状态良好，密度为70％～80％的DF-1细胞，37℃培养6h后弃去感染液，并用PBS洗一遍，加入含2％胎牛血清的DMEM培养基，培养48h后，进行RT-PCR检测、间接免疫荧光鉴定和Western Blot鉴定。
3.1RT-PCR检测多表位蛋白的表达
提取培养48h后的DF-1细胞RNA，反转为cDNA后，以cDNA为模板，上述的AIV B/T-F、AIV B/T-R为引物进行PCR，进行琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统检测PCR结果。
3.2间接免疫荧光鉴定多表位蛋白的表达
培养48h后的DF-1细胞，弃去培养基，贴壁加入无菌PBS洗涤3次；每孔加入500μL4％的多聚甲醛固定细胞，室温固定30min；弃掉固定液，加入500μL PBS洗3遍，随后加入500μL 0.25％的Triton X-100，室温作用30min；弃掉Triton X-100，加入500μL PBS洗3遍，加入500μL 0.5％的BSA室温封闭1h；封闭结束后孵育稀释好的鼠源抗His标签单抗，室温孵育1h，PBST洗三遍；孵育稀释好的FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体，室温避光孵育1h；PBST洗三遍，每次5min，随后用荧光显微镜拍照保存。
3.3Western Blot鉴定多表位蛋白的表达
培养48h后的DF-1细胞，弃去培养基，贴壁加入无菌PBS洗涤3次；加入200μL细胞裂解液，吹打后放于冰上裂解15min。将裂解液收集至1.5mL离心管中，12000×g，4℃离心5min，吸80μL细胞裂解液，加入20μL 5×SDS-PAGE loading buffer，混匀后煮沸10min。
将配制好的蛋白胶固定于电泳槽内，加入电泳缓冲液，在加样孔中加入蛋白Maker和待测样品。80V电泳30min，120V电泳约90min，观察到蛋白条带跑至蛋白胶的最低端后停止电泳。按照目的蛋白条带大小切下大小适合的PAGE凝胶和PVDF膜，200mA恒流条件下进行转膜，电转30min。转膜结束后，将PVDF膜转移至封闭液中置于摇床上室温封闭1h。用TBST洗4次，每次5min。将PVDF膜转移到稀释后的鼠源抗His标签单抗中，4℃孵育过夜。TBST洗涤4次，每次5min。将PVDF膜转移到稀释后的HRP偶联的羊抗鼠IgG抗体中，室温摇床孵育约1h。TBST洗涤4次，每次5min。最后，在双色红外激光成像分析系统观察结果。
4、重组杆状病毒的纯化和毒价测定
分别将P3代rBV-AIV B/T和BV-WT在4℃，以35000r/min超速离心2h后用1mL的PBS悬浮沉淀。最后用BD BacPAK杆状病毒滴度快速检测试剂盒检测超速离心后的重组杆状病毒滴度，将超速离心后的rBV-AIV B/T和BV-WT调整病毒滴度为109pfu/mL。
5、免疫原性分析
5.1实验动物的分组及免疫程序
将60只2周龄SPF鸡随机分为4组，每组15只，第1组肌肉注射免疫0.5mL禽流感(H9亚型)灭活疫苗InV，并在两周后肌肉注射加强免疫0.5mL(109pfu/mL)重组杆状病毒(rBV-AIV B/T)；第2组肌肉注射免疫0.5mL禽流感(H9亚型)InV，并在两周后肌肉注射0.5mL(109pfu/mL)杆状病毒野毒(BV-WT)；第3组肌肉注射免疫0.5mL禽流感(H9亚型)InV，并在两周后肌肉注射0.5mL PBS；第4组肌肉注射免疫0.5mL PBS。
5.2血清抗体检测
加强免疫后第2周收集血清检测血清的HI效价。
5.3鸡血清中IgG、IgM、IgA抗体含量的检测
加强免疫后第2周收集血清采用ELISA试剂盒检测鸡血清中IgG、IgA、IgM抗体含量。
5.4鸡气管粘膜上sIgA抗体含量的检测
加强免疫后第2周收集SPF鸡气管样本，切碎，称重，转移到含有蛋白酶抑制剂的PBS混合物的2mL试管中。将试管在室温下孵育一夜，之后将气管样本研磨90s，然后将组织匀浆在12000×g，4℃下离心5min，收集上清液，采用ELISA试剂盒检测鸡气管粘膜上sIgA抗体含量。
5.5鸡外周血中T淋巴细胞亚型和B淋巴细胞的检测
加强免疫后第2周采集抗凝血，分离外周血淋巴细胞，并用流式细胞仪对鸡外周血中T淋巴细胞亚型进行检测。
取1×106个细胞，按照推荐浓度用流式Buffer稀释CD3-APC、CD4-FITC和CD8α-PE流式抗体，每个样本用100μL稀释后抗体液重悬细胞，4℃避光孵育30min。随后加入800μL流式Buffer终止，400×g离心5min，加入100μL流式Buffer重悬细胞，流式细胞仪上机检测。用FlowJo软件进行T淋巴细胞亚型结果分析
同样取1×106个细胞，按照推荐浓度用流式Buffer稀释Bu-1-FITC流式抗体进行染色后流式细胞仪上机检测。用FlowJo软件进行B淋巴细胞结果分析。
5.6荧光定量PCR检测鸡PBMC免疫相关基因表达
将5.5分离的PBMC提取总RNA反转成cDNA后进行荧光定量PCR，以GAPDH基因为内参，ΔΔCt法分析结果。荧光引物如表4所示。
表4荧光引物
5.7表位刺激脾脏T淋巴细胞应答实验
加强免疫14天后收集SPF鸡脾脏样本，分离脾脏淋巴细胞，ELISpot实验检测表位刺激脾脏T细胞分泌INF-γ的情况。实验操作参照Chicken IFN-γELISpotBASIC Kit说明书。
6、攻毒保护实验
4组实验动物采用滴鼻点眼的方式攻毒，107EID50/200μL/只。在攻毒后第3天每组随机杀3只鸡，检测脏器病毒载量；第3、5、7天采集动物咽喉拭子和泄殖腔拭子检测排毒情况，采集抗凝血流式检测PBMC中T细胞亚型变化。
6.1病毒感染鸡组织脏器的复制能力
攻毒后第3天每组随机杀3只鸡，采集脑、气管、肺脏、脾脏、肾、肝脏、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠，称取0.1g组织样品研磨后取上清，倍比稀释接种于9～11日龄的鸡胚，37℃孵育72h后，每个鸡胚收取25μL尿囊液测定血凝效价，按Spearman-Karber法计算EID50。
6.2感染鸡排毒情况检测
将采集的拭子充分涡旋，取上清倍比稀释接种于9～11日龄的鸡胚，37℃孵育72h后，每个鸡胚收取25μL尿囊液测定血凝效价，按Spearman-Karber法计算EID50。
6.3流式检测PBMC中T细胞亚型变化
将采集的抗凝血分离PBMC，孵育CD3-APC、CD4-FITC和CD8α-PE流式抗体。流式细胞仪上机检测，检测结果用FlowJo软件进行分析。
7、结果与分析
7.1重组杆状病毒rBV-AIV B/T的获得
7.1.1重组转移质粒pFastBac Dual-VSVG的鉴定
将扩增纯化后的VSVG基因克隆至pFastBac Dual载体上，用引物VSVG-F/R对重组质粒pFastBac Dual-VSVG的菌液进行菌液PCR鉴定，在1536bp左右出现了特异性条带，与VSVG基因大小相符(图2)。
7.1.2重组转移质粒pFastBac Dual-VSVG-CMV的鉴定
将扩增纯化后的CMV片段克隆至pFastBac Dual-VSVG载体上，用引物CMV-F/R对重组质粒pFastBac Dual-VSVG-CMV的菌液进行菌液PCR鉴定，在584bp左右出现了特异性条带，与CMV基因大小相符(图3)。
7.1.3重组穿梭质粒rBacmid-AIV B/T的鉴定
将AIV B/T片段克隆至重组质粒pFastBac Dual-VSVG-CMV后转化DH10Bac感受态细胞，经过两轮蓝白斑筛选后(图4)。用通用引物M13对白色菌落进行PCR鉴定。PCR扩增，电泳后在6634bp左右出现特异性条带(图5)；特异性条带大小均符合预期，表明重组杆状病毒质粒rBacmid-AIV B/T构建成功。
7.1.4rBV-AIV B/T的获得
用rBacmid-AIV B/T质粒转染对数生长期且状态良好的Sf9昆虫细胞。转染后84h，在显微镜下可观察到未转染的Sf9细胞贴壁良好，细胞形状规则多数呈圆形，呈拉网式生长，胞体透亮，细胞轮廓清晰；而转染后的Sf9细胞开始出现脱落，细胞数量较正常Sf9细胞少，细胞体积明显增大，细胞边界变得模糊，细胞内出现囊泡且颗粒物增多，细胞核膨胀，折光性变低，部分细胞出现破裂、死亡现象(图6)。结果表明，重组杆状病毒质粒转染Sf9细胞后成功获得了重组杆状病毒rBV-AIV B/T。
7.2多表位蛋白表达的鉴定
7.2.1RT-PCR检测多表位蛋白的表达
将P2代和P3代重组杆状病毒rBV-AIV B/T和P3代杆状病毒野毒BV-WT转导DF-1细胞48h后，提取RNA反转后以cDNA为模板用AIV B/T-F/R特异性引物进行PCR扩增，验证多表位基因的转录。电泳后在1728bp左右出现特异性条带(图7)；特异性条带大小均符合预期，将产物进行测序。采用DNASTAR软件分析测序结果无误，表明重组杆状病毒rBV-AIV B/T在DF-1细胞中成功转录。
7.2.2间接免疫荧光法检测多表位蛋白的表达
将P3代杆状病毒野毒BV-WT和P3代重组杆状病毒rBV-AIV B/T转导DF-1细胞48h后，进行间接免疫荧光检测多表位蛋白的表达，一抗用鼠源抗His标签单抗，二抗用FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体。结果如图8所示：BV-WT组中未观察到荧光，而转导rBV-AIV B/T的DF-1细胞可观察到特异性的绿色荧光，表明rBV-AIV B/T转导DF-1细胞后能成功表达多表位蛋白。
7.2.3Western Blot检测多表位蛋白的表达
将P2代和P3代重组杆状病毒rBV-AIV B/T以及P3代杆状病毒野毒BV-WT转导DF-1细胞48h后，收集细胞沉淀，细胞沉淀用细胞裂解液进行裂解，鼠源抗His标签单抗作为一抗，山羊抗小鼠IgG抗体作为二抗进行Western Blot检测多表位蛋白的表达。结果如图9所示：杆状病毒野毒BV-WT组细胞沉淀中无特异性蛋白条带，而P2代和P3代重组杆状病毒rBV-AIV B/T组细胞沉淀蛋白条带清晰，大小约为56kDa，表明重组杆状病毒rBV-AIV B/T转导DF-1细胞后能成功表达多表位蛋白。
7.3重组杆状病毒滴度的测定
将P3代重组杆状病毒rBV-AIV B/T和P3代杆状病毒野毒BV-WT通过BD BacPAK杆状病毒滴度快速检测试剂盒测定病毒滴度，结果显示：P3代重组杆状病毒rBV-AIV B/T和P3代杆状病毒野毒BV-WT滴度分别为1.054×108pfu/mL和6.486×107pfu/mL。将超速离心后的重组杆状病毒rBV-AIV B/T和杆状病毒野毒BV-WT调整滴度为1×109pfu/mL。
7.4免疫原性检测
3.4.1HI抗体的检测
加强免疫两周后，采集全血并分离血清，进行H9N2禽流感病毒特异性HI抗体检测，如图10所示。结果显示：InV+rBV-AIV B/T组HI特异性抗体水平达到29～212，InV+BV-WT组HI特异性抗体水平达到26～29，InV组HI特异性抗体水平达到28～29。InV+rBV-AIV B/T组结果显著高于InV+BV-WT组和InV组(P＜0.05)。说明InV与rBV-AIV B/T配合使用可以更好的让机体产生更高的HI抗体效价。
7.4.2血清中IgG、IgM和IgA含量检测
在加强免疫后第14天采集抗凝血，分离血清，用鸡IgG、IgM和IgA ELISA试剂盒检测血清中IgG、IgM、IgA的含量。由图11可见，在加强免疫14天后，与InV组和InV+BV-WT组相比，InV+rBV-AIV B/T组血清中的IgG含量较高，差异显著(P<0.05)，并且各免疫组(InV组、nV+BV-WT组和InV+rBV-AIV B/T组)血清中的IgG含量均高于PBS对照组，差异极显著(P<0.001)。由图12可见，在加强免疫14天后，与InV和InV+BV-WT组相比，InV+rBV-AIV B/T组血清中的IgM含量较高，差异显著(P<0.05)，并且各免疫组血清中的IgM含量均高于PBS对照组，差异极显著(P<0.001)。由图13可见，在加强免疫14天后，与InV组和InV+BV-WT组相比，InV+rBV-AIV B/T组血清中的IgA含量无统计学差异(P>0.05)。说明在免疫InV后，rBV-AIVB/T能促进机体产生IgM和IgG。
7.4.3气管粘膜sIgA含量检测
将加强免疫14天后收集的气管匀浆上清液采用ELISA试剂盒检测鸡气管粘膜上sIgA抗体含量。由图14可见，在加强免疫14天后，与InV组和InV+BV-WT组相比，InV+rBV-AIVB/T组气管粘膜中的sIgA含量无统计学差异(P>0.05)。
7.4.4鸡外周血中T细胞亚型和B细胞的变化
在加强免疫后第14天采集试验鸡的外周血液，分离外周血淋巴细胞，取部分细胞进行鸡CD4+、CD8α+以及Bu-1抗体染色，并用流式细胞仪对鸡外周血中T淋巴细胞和B淋巴细胞比例的变化进行检测。按照图15中的圈门策略对流式数据进行分析，分析外周血中T细胞的比例。按照图16中的圈门策略对流式数据进行分析，分析外周血中B细胞的比例。
图17、图18、图19和图20的结果显示，与InV+BV-WT组、InV组和PBS组相比，InV+rBV-AIV B/T组CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD8+T细胞以及B细胞比例明显升高，且差异极显著(P<0.01)。
实验结果说明rBV-AIV B/T能促进CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD8+T细胞和B细胞比例增殖分化，促进机体的体液免疫和细胞免疫应答反应，产生更高比例的CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD8+T细胞和B细胞。
7.4.5鸡PBMC免疫相关基因检测
为进一步验证加强免疫后所引起SPF鸡细胞免疫应答反应变化，荧光定量PCR检测体内加强免疫14天后PBMC中重要免疫基因mRNA表达量的变化，其中检测主要包括四部分：天然免疫相关基因、CTLs相关基因、炎症及趋化因子相关基因和Th2相关基因。
天然免疫相关基因部分(图21)，与InV组相比，InV+rBV-AIV B/T组和InV+BV-WT组IFN-α基因表达量显著上升(P<0.05)；CTLs相关基因部分(图22)，与InV+BV-WT组和InV组相比，InV+rBV-AIV B/T组IFN-γ、IL-2基因表达量显著上升(P<0.05)；炎症和趋化因子基因部分(图23)，与InV+BV-WT组和InV组相比，InV+rBV-AIV B/T组IL-6、CXCLi1基因表达量显著上升(P<0.05)；Th2基因部分(图24)，与InV+BV-WT组和InV组相比，InV+rBV-AIV B/T组IL-4、IL-5、IL-10、IL-13基因表达量显著上升(P<0.05)。
实验结果说明rBV-AIV B/T引起较为明显的Th2细胞免疫应答，活化的Th2细胞可通过分泌大量细胞因子介导细胞免疫与天然免疫。
7.4.6表位刺激脾脏T淋巴细胞应答检测
如图25～图28所示，使用具有免疫原性的单一T细胞表位刺激加强免疫后14天的SPF鸡脾脏淋巴细胞。如图26所示，在InV+rBV-AIV B/T组，与阴性对照孔相比，保守T表位NP182-190、NP 455-463、NS1 98-106、NP 380-393可刺激脾淋巴细胞IFN-γ的分泌水平显著提高(P<0.05)并符合上述标准，可认为保守T表位NP 182-190、NP 455-463、NS1 98-106、NP380-393在刺激InV+rBV-AIV B/T组鸡脾淋巴细胞产生IFN-γ方面有明显效果。而在InV+BV-WT组(图27)和InV组(图28)，表位刺激孔与阴性对照孔相比无明显差异。
实验验证3条分布在NP蛋白上的T细胞表位NP 182-190、NP 455-463、NP 380-393以及1条分布在NS1蛋白上的T细胞表位NS1 98-106在体内表达后可刺激SPF鸡脾脏淋巴细胞产生效应应答。
7.5攻毒保护及应答检测
7.5.1H9N2病毒感染鸡组织脏器的复制情况
如图29所示，在3DPI时，每组随机杀3只鸡，检测SPF鸡感染后各组织脏器中的病毒载量。与InV+BV-WT组、InV组和PBS组相比，InV+rBV-AIV B/T组肺脏、脾脏、肝脏、回肠病毒载量显著降低(P<0.05)。
7.5.2感染鸡排毒情况检测
如图30所示为咽喉排毒情况，鸡咽喉排毒高峰为3DPI。在3DPI时，InV+rBV-AIV B/T组咽喉病毒载量(2.1±0.5)显著低于InV+BV-WT组(2.7±0.4)和InV组(3.1±0.4)，差异显著(P<0.05)。在5DPI和7DPI时，各免疫组(InV+rBV-AIV B/T组、InV+rBV-AIV WT组和InV组)咽喉病毒载量均低于PBS对照组，差异极显著(P<0.01)。
如图31所示为泄殖腔排毒情况。在3DPI和5DPI时，各免疫组(InV+rBV-AIV B/T组、InV+rBV-AIV WT组和InV组)泄殖腔病毒载量均低于PBS对照组，差异极显著(P<0.01)。
如表5所示为攻毒后SPF鸡不同DPI咽喉拭子和泄殖腔拭子病毒分离比例和排毒阳性率。在5DPI时，InV+rBV-AIV B/T组咽喉排毒阳性率(44.4％)小于InV+BV-WT组(55.5％)和InV组(77.7％)。在7DPI时，InV+rBV-AIV B/T组泄殖腔已检不出排毒，InV+BV-WT组和InV组仍然各有1只鸡排毒。
表5H9N2 AIV感染后不同DPI咽喉拭子和泄殖腔拭子分离比例
注：/前的数字表示检测到排毒的鸡只数量，/后的数字表示鸡只总数；括号中的百分比为排毒阳性率。
7.5.3流式检测攻毒后PBMC中CD4+和CD8+T细胞亚型变化情况
如图32所示，在3DPI时，与InV+BV-WT组、InV组和PBS组相比，InV+rBV-AIV B/T组CD4+T细胞显著上调(P<0.05)。如图33所示，在3DPI时，与InV+BV-WT组、InV组和PBS组相比，InV+rBV-AIV B/T组CD8+T细胞显著上调(P<0.05)；在5DPI时，与PBS组相比，InV+rBV-AIVB/T组CD8+T细胞显著上调(P<0.05)。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.H9N2 AIV多表位重组杆状病毒，其特征在于，其整合了表达H9N2 AIV B细胞和T细胞多表位的表达盒AIV B/T，所述表达盒AIV B/T的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.如权利要求1所述的H9N2 AIV多表位重组杆状病毒，其特征在于，所述H9N2 AIV多表位重组杆状病毒还整合了VSVG基因和CMV基因。
3.宿主细胞，其特征在于，其通过权利要求1或2所述的H9N2 AIV多表位重组杆状病毒感染昆虫细胞而得到。
4.一种如权利要求1或2所述的H9N2 AIV多表位重组杆状病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将VSVG基因、CMV基因和表达盒AIV B/T依次连接至转移质粒，构建重组转移质粒；
(2)将所述重组转移质粒转化感受态细胞，获得重组杆状病毒质粒；
(3)将所述重组杆状病毒质粒转染昆虫细胞，培养后收集上清液，获得H9N2 AIV多表位重组杆状病毒。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述转移质粒包括pFastBac Dual，所述感受态细胞包括DH10Bac，所述昆虫细胞包括Sf9细胞。
6.一种检测禽类诱导机体适应性免疫应答水平的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1或2所述的重组杆状病毒，以及与所述H9N2 AIV多表位重组杆状病毒联合使用的H9N2禽流感灭活疫苗InV。
7.一种诱导禽类机体产生良好适应性免疫应答反应的表位疫苗，其特征在于，包含权利要求1或2所述的H9N2 AIV多表位重组杆状病毒，以及与所述H9N2 AIV多表位重组杆状病毒联合使用的H9N2禽流感灭活疫苗InV。
8.一种防控H9N2禽流感的表位疫苗，其特征在于，包含权利要求1或2所述的H9N2 AIV多表位重组杆状病毒，以及与所述H9N2 AIV多表位重组杆状病毒联合使用的H9N2禽流感灭活疫苗InV。
9.如权利要求7或8所述的表位疫苗，其特征在于，所述H9N2 AIV多表位重组杆状病毒和所述H9N2禽流感灭活疫苗InV的体积比为1:1，浓度均为109pfu/mL。
10.一种如权利要求1或2所述的H9N2 AIV多表位重组杆状病毒联合H9N2禽流感灭活疫苗InV的用途，其特征在于，所述用途包括如下任一项：
(1)在制备检测禽类诱导机体适应性免疫应答水平的试剂盒中的用途；
(2)在制备诱导禽类机体产生良好适应性免疫应答反应的表位疫苗的用途；
(3)在制备防控H9N2禽流感的表位疫苗中的用途。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106421771A (zh) * 2016-07-21 2017-02-22 华南农业大学 一种以杆状病毒为载体的h7n9亚型禽流感基因工程疫苗及其制备方法与应用
RU2701953C1 (ru) * 2018-12-28 2019-10-02 Общество с ограниченной ответственностью "Нанолек" Способ получения поливалентной вакцины от гриппа
CN114213548A (zh) * 2020-12-24 2022-03-22 上海市公共卫生临床中心 同时诱导抗多种病毒的免疫应答的方法
CN114555077A (zh) * 2019-08-26 2022-05-27 香港浸会大学 作为抗病毒剂的Patentiflorin A类似物

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106421771A (zh) * 2016-07-21 2017-02-22 华南农业大学 一种以杆状病毒为载体的h7n9亚型禽流感基因工程疫苗及其制备方法与应用
RU2701953C1 (ru) * 2018-12-28 2019-10-02 Общество с ограниченной ответственностью "Нанолек" Способ получения поливалентной вакцины от гриппа
CN114555077A (zh) * 2019-08-26 2022-05-27 香港浸会大学 作为抗病毒剂的Patentiflorin A类似物
CN114213548A (zh) * 2020-12-24 2022-03-22 上海市公共卫生临床中心 同时诱导抗多种病毒的免疫应答的方法
WO2022135563A1 (zh) * 2020-12-24 2022-06-30 上海市公共卫生临床中心 同时诱导抗多种病毒的免疫应答的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JINZE DONG 等: "Status and Challenges for Vaccination against Avian H9N2 Influenza Virus in China", 《LIFE》, vol. 12, pages 1 - 19 *
ZHENJIE ZHANG 等: "Construction of recombinant Marek’s disease virus (MDV) lacking the meq oncogene and co-expressing AIV-H9N2 HA and NA genes under control of exogenous promoters", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》, vol. 181, pages 45 *

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