CN116966293A - 脑信号蛋白-4d结合分子治疗神经变性疾病的用途 - Google Patents

Abstract

本申请公开了脑信号蛋白‑4D结合分子治疗神经变性疾病的用途。本文提供了减轻患有神经变性疾病的对象中症状的方法，包括向该对象给予有效量的特异性结合脑信号蛋白‑4D(SEMA4D)或其丛蛋白‑B1或丛蛋白‑B2受体的分离的结合分子。还提供与选自VX15/2503或67的参照单克隆抗体特异性结合相同的SEMA4D表位的分离的结合分子。

Description

脑信号蛋白-4D结合分子治疗神经变性疾病的用途

本申请是中国专利申请201480070232.2的分案申请。

相关申请的交叉引用

该国际专利申请要求2014年6月16日提交的美国临时专利申请号62/012,805、2014年4月14日提交的美国临时申请号61/979,384以及2013年10月21日提交的美国临时申请号61/893,814的权益，其内容各自通过引用全文纳入本文。

对提交的序列表的引用

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发明背景

脑信号蛋白4D(SEMA4D)，也称作CD100，是一种属于脑信号蛋白基因家族的跨膜蛋白(例如，SEQ ID NO：1(人)；SEQ ID NO：2(鼠))。SEMA4D在细胞表面上表达为同二聚体，但在细胞激活之后，SEMA4D可通过蛋白水解切割从细胞表面上释放以生成该蛋白质的溶解形式sSEMA4D，这也是有生物活性的。参见Suzuki等，Nature Rev.Immunol.3：159-167(2003)；Kikutani等，Nature Immunol.9：17-23(2008)。

SEMA4D在包括脾脏、胸腺和淋巴结的淋巴器官中以及如脑、心脏和肾脏的非淋巴器官中以高水平表达。在淋巴器官中，SEMA4D在静息T细胞上大量表达，但是仅在静息B细胞和抗原呈递细胞(APC)如树突细胞(DC)上弱表达。然而，在用各种免疫刺激激活之后，其表达在这些细胞中上调。细胞激活也增加了可溶性SEMA4D从免疫细胞的释放。

SEMA4D涉及神经变性疾病、自身免疫疾病、脱髓鞘性疾病、和某些癌症的发展。然而，阻断SEMA4D信号转导对包括大脑和脊髓中枢神经系统(CNS)的功能和组织以及由CNS控制的行为的影响仍有待阐明。这是重要的，因为CNS的变化对对象的行为和生活质量有显著影响。具体地，这种变化可能影响对象的神经精神行为、认知行为和运动技能。因此，仍然需要减轻与神经变性疾病相关的症状的对神经变性疾病的治疗。

发明简述

本文公开了使用脑信号蛋白4D结合分子以减轻患有神经变性疾病的对象中症状的方法。按照本文所示的本发明的方面，提供了用于改善患有神经变性疾病的对象中的症状的方法，包括向该对象给予有效量的特异性结合脑信号蛋白4D(SEMA4D)并抑制、阻止、防止、逆转或延缓SEMA4D效应的分离的结合分子。

按照本文所示的方面，提供了用于治疗患有神经变性疾病的对象的方法，包括向该对象给予有效量的特异性结合脑信号蛋白4D(SEMA4D)的分离的结合分子，其中与SEMA4D结合的作用是改善与该疾病相关的症状。

提供了用于减轻患有神经变性疾病的对象中的症状的方法，包括向该对象给予有效量的特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的分离的结合分子。在这类方法的某些实施方式中，结合分子抑制SEMA4D与其受体或其受体的部分的相互作用。在这类方法的某些实施方式中，受体选自丛蛋白-B1和丛蛋白-B2。在这类方法的某些实施方式中，结合分子抑制SEMA4D-介导的丛蛋白-B1信号转导。在这类方法的某些实施方式中，分离的结合分子与选自VX15/2503或67的参照单克隆抗体特异性结合相同的SEMA4D表位。在这类方法的某些实施方式中，分离的结合分子竞争性抑制选自VX15/2503或67的参照单克隆抗体与SEMA4D的特异性结合。在这类方法的某些实施方式中，分离的结合分子包括抗体或其抗原结合片段。在这类方法的某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体VX15/2503或67。在这类方法的某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段的可变重链(VH)含有VHCDR 1-3且可变轻链(VL)含有VLCDR 1-3，其中VHCDR 1-3分别包含SEQ ID NO：6、7和8，VLCDR 1-3分别包含SEQ ID NO：14、15和16。在这类方法的某些实施方式中，VH和VL分别包含SEQ ID NO：9和SEQID NO：17或SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：18。在任意前述方法的某些实施方式中，神经变性疾病选自下组：阿尔茨海默病、帕金森病、亨延顿氏病、唐氏综合症、共济失调、肌萎缩侧索硬化(ALS)、额颞性痴呆(FTD)、HIV-相关认知障碍、CNS狼疮、轻度认知障碍、或其组合。在前述方法的某些实施方式中，神经变性疾病是阿尔茨海默病或亨延顿氏病。在任意前述方法的某些实施方式中，该症状选自下组：神经精神症状、认知症状、运动功能障碍及其任意组合。在任意前述方法的某些实施方式中，神经精神症状选自下组：减少焦虑状行为、改善空间记忆、增加移动及其任意组合。

提供了减轻患有神经变性疾病的对象中症状的方法，包括向该对象给予有效量的特异性结合SEMA4D的分离的结合分子，其中结合分子竞争性抑制选自VX15/2503或67的参照单克隆抗体与SEMA4D的特异性结合。在这类方法的某些实施方式中，结合分子抑制SEMA4D与其受体或其受体的部分的相互作用。在这类方法的某些实施方式中，受体选自丛蛋白-B1和丛蛋白-B2。在这类方法的某些实施方式中，结合分子抑制SEMA4D-介导的丛蛋白-B1信号转导。在这类方法的某些实施方式中，分离的结合分子包括抗体或其抗原结合片段。在这类方法的某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体VX15/2503或67。在这类方法的某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段的可变重链(VH)含有VHCDR 1-3且可变轻链(VL)含有VLCDR 1-3，其中VHCDR1-3分别包含SEQ ID NO：6、7和8，VLCDR 1-3分别包含SEQ ID NO：14、15和16。在这类方法的某些实施方式中，VH和VL分别包含SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：18。在任意前述方法的某些实施方式中，神经变性疾病选自下组：阿尔茨海默病、帕金森病、亨延顿氏病、唐氏综合症、共济失调、肌萎缩侧索硬化(ALS)、额颞性痴呆(FTD)、HIV-相关认知障碍、CNS狼疮、轻度认知障碍、或其组合。在任意前述方法的某些实施方式中，神经变性疾病是阿尔茨海默病或亨延顿氏病。在任意前述方法的某些实施方式中，该症状选自下组：神经精神症状、认知症状、运动功能障碍及其任意组合。在任意前述方法的某些实施方式中，神经精神症状选自下组：减少焦虑状行为、改善空间记忆、增加移动及其任意组合。

本文提供了治疗患有神经变性或神经炎性疾病的对象，或在患有神经变性或神经炎性疾病的对象中达到所需结果的其他方法。提供了用于治疗患有神经变性疾病的对象的方法，包括向该对象给予有效量的特异性结合脑信号蛋白4D(SEMA4D)的分离的结合分子，其中与SEMA4D的结合作用是减轻与该疾病相关的症状。提供了用于促进患有神经变性疾病的对象中髓鞘形成的方法，包括向该对象给予有效量的特异性结合SEMA4D的分离的结合分子，其中该结合分子调节星形胶质细胞介导的少土胶质细胞-髓鞘功能活性。提供了用于防止患有神经变性疾病的对象中神经细胞死亡的方法，包括向该对象给予有效量的特异性结合SEMA4D的分离的结合分子，其中该结合分子调节星形胶质细胞介导的突触活性。提供了用于防止患有神经炎性或神经变性疾病的对象中血脑屏障损伤的方法，包括向该对象给予有效量的特异性结合SEMA4D的分离的结合分子，其中该结合分子调节星形胶质细胞介导的血脑屏障的完整性维持。提供了用于防止患有、确定患有或疑似患有神经炎性或神经变性疾病的对象中星形胶质细胞活化的方法，包括向该对象给予有效量的特异性结合SEMA4D的分离的结合分子，其中该结合分子调节星形胶质细胞介导的血脑屏障的完整性维持。提供了用于维持或恢复患有、确定患有或疑似患有神经炎性或神经变性疾病的对象中星形胶质细胞介导的少土胶质细胞前体细胞(OPC)营养支持的方法，包括向该对象给予有效量的特异性结合SEMA4D的分离的结合分子，其中该结合分子防止星形胶质细胞过程的回缩以及OPC向损伤区域的趋化性移动。提供了保护抑制性神经元在早期阿尔茨海默病中免于变性的方法，包括向患有、确定患有或疑似患有早期阿尔茨海默病的对象给予有效量的特异性结合SEMA4D的分离的结合分子，其中该结合分子恢复对象中NYP-阳性神经元、生长激素抑制素阳性神经元的数量，或同时恢复两者。在前述方法的某些实施方式中，结合分子抑制SEMA4D与其受体或其受体的部分的相互作用。在前述方法的某些实施方式中，受体选自丛蛋白-B1和丛蛋白-B2。在前述方法的某些实施方式中，结合分子抑制SEMA4D-介导的丛蛋白-B1信号转导。在前述方法的某些实施方式中，分离的结合分子与选自VX15/2503或67的参照单克隆抗体特异性结合相同的SEMA4D表位。在前述方法的某些实施方式中，分离的结合分子竞争性抑制选自VX15/2503或67的参照单克隆抗体与SEMA4D的特异性结合。在前述方法的某些实施方式中，分离的结合分子包括抗体或其抗原结合片段。在前述方法的某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体VX15/2503或67。在前述方法的某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段的可变重链(VH)含有VHCDR 1-3且可变轻链(VL)含有VLCDR1-3，其中VHCDR 1-3分别包含SEQ ID NO：6、7和8，VLCDR 1-3分别包含SEQ ID NO：14、15和16。在前述方法的某些实施方式中，VH和VL分别包含SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：17或SEQ IDNO：10和SEQ ID NO：18。在前述方法的某些实施方式中，神经变性疾病选自下组：阿尔茨海默病、帕金森病、亨延顿氏病、唐氏综合症、共济失调、肌萎缩侧索硬化(ALS)、额颞性痴呆(FTD)、HIV-相关认知障碍、CNS狼疮、轻度认知障碍、或其组合。在前述方法的某些实施方式中，神经变性疾病是阿尔茨海默病或亨延顿氏病。在前述方法的某些实施方式中，由这些方法减轻的对象的症状选自下组：神经精神症状、认知症状、运动功能障碍及其任意组合。在前述方法的某些实施方式中，由这些方法减轻的对象的神经精神症状选自下组：减少焦虑状行为、改善空间记忆、增加移动及其任意组合。在前述方法的某些实施方式中，通过处理来自对象的样品和图像来确定该对象患有神经变性疾病。

附图简述

图1：实施例中所述的实验方案的示意图。

图2：测量用抗-SEMA4D抗体(“MAb 67”)或对照同种型(“MAb 2B8”)治疗的CVN小鼠中焦虑状行为的体内CNV模型。总移动(图2A)和旷场中央的移动(图2B)。

图3：在放射臂水迷宫(图3A)中测量用抗-SEMA4D抗体(“MAb 67”)或对照同种型治疗的CVN小鼠的空间记忆的体内CVN模型(图3B)。

图4：测量用抗-SEMA4D抗体(“MAb 67”)或对照同种型治疗的CVN小鼠中GABA能突触密度和囊泡GABA转运蛋白(VGAT)浓度的体内CVN模型。VGAT阳性囊泡(图4A)和每个囊泡的VGAT染色强度水平(图4B)。

图5：测量用抗-SEMA4D抗体(“MAb 67”)和对照同种型治疗的小鼠中焦虑状行为的体内YAC128模型。进入旷场中央(图5A)和花费的时间(图5B)。

图6：测量用抗-SEMA4D抗体(“MAb 67”)和对照同种型治疗的小鼠的空间记忆的体内YAC128模型。组图A＝试验1(图6A)，并且组图B＝试验2(图6B)。

图7：测量用抗-SEMA4D抗体(“MAb 67”)或对照同种型治疗的小鼠中皮质(图7A)和胼胝体(图7B)体积的体内YAC128模型。

图8：测量用抗-SEMA4D抗体(“MAb 67”)或对照同种型治疗的小鼠的睾丸变性的体内YAC128模型。

图9A-P：对在正常大鼠脊髓中表达SEMA4D、丛蛋白-B1和CD72的细胞类型的免疫组化分析。Nkx2.2(组图B)是少土胶质细胞前体细胞标志物，胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)(组图G)是星形胶质细胞标志物，并且Iba1(组图N)是小胶质细胞标志物。组图A、E、I和M显示合并的图像，并且组图D、H、L和P显示用DAPI染色的相同切片以使细胞核可视化。

图10：正常(顶部三个组图)和CVN(底部三个组图)小鼠中淀粉样病变和神经胶质活化的DAB免疫组化分析。下托切片对淀粉样-β1-42(左组图)、小胶质细胞标志物Iba1(中组图)和星形胶质细胞标志物GFAP染色。

图11A-11B：CVN阿尔茨海默病小鼠模型中丛蛋白-B1和丛蛋白-B2受体的表达特征和表征。图11A显示在正常(顶部组图)和CVN(底部组图)小鼠中对丛蛋白-B1表达的免疫组化分析。就丛蛋白-B1、和GFAP、以及DAPI对大脑切片染色以使细胞核可视化。图11B显示在抑制DEMA4D信号转导之后丛蛋白-B1(左图)和丛蛋白-B2(右图)的表达水平。

图12：在正常(顶部组图)和YAC128(底部组图)小鼠中对丛蛋白-B2表达的免疫组化分析。就丛蛋白-B2、和GFAP、以及DAPI对大脑切片染色以使细胞核可视化。

图13：SEMA4D信号转导可在健康和疾病的星形胶质细胞功能的调节中起到的作用的示意图。左图：丛蛋白+(星形胶质细胞外表面的阴影区域)星形胶质细胞过程在SEMA4D+NIKX2.2+少土胶质细胞前体细胞(OPC)之间交错并且提供营养支持(SEMA4D+，显示为OPC外表面的阴影区域)。在CNS疾病中，活化的星形胶质细胞上调丛蛋白表达并且通过SEMA4D信号转导回缩过程。局部地，这导致降低的营养支持和增加的趋化性驱动的OPC向损伤区域的移动，同时在损伤部位缺少星形胶质细胞的支持阻止了髓鞘再生。中间组图：在CNS疾病中，星形胶质细胞活化导致丛蛋白表达上调(星形胶质细胞外表面的阴影区域)、增加的SEMA4D信号转导和过程回缩，其导致神经元轴突导向丧失、营养支持减少、和/或谷氨酸摄入/释放失调。最终，根据疾病刺激的严重性，可能发生突触损失和之后的兴奋性神经元死亡。右组图：CNS疾病诱导的星形胶质细胞活化通过丛蛋白增加了SEMA4D信号转导(星形胶质细胞外表面的阴影区)，这导致星形胶质细胞足过程(astrocytic foot processes)的回缩，如水通道蛋白-4的再分布所示。这导致了BBB的失调和渗透，从而促进内皮细胞炎症和之后的白细胞进入CNS。

图14：显示在正常大鼠中取向与GFAP+星形胶质细胞过程紧密相关的SEMA4D-表达OPC的免疫组化分析。就SEMA4D(OPC)、和GFAP(星形胶质细胞)、以及DAPI对大脑切片染色以使细胞核可视化。

图15A、B、C、D：分别测量用抗-SEMA4D抗体(“MAb 67”)或对照同种型治疗的CVM小鼠中下托或齿状回内生长激素抑制素-(组图A)、神经肽-Y(NPY)-(组图B)、NPY受体1(NPY1R)(组图C)、或NPY受体2(NPY2R)(组图D)阳性信号转导的体内CVN模型。误差线指出标准差。通过用Bonferroni多重比较检验的单因素ANOVA，“*”＝p＜0.05并且“***”＝p＜0.005。

图16：正常和CVN小鼠中水通道蛋白-4表达特征的免疫组化分析。

图17：测量在加入抗-SEMA4D单克隆抗体VX15/2503之后血脑屏障完整性的体外DIV-BBB模型。

图18A-18B：显示大鼠星形胶质细胞中星形胶质细胞活化的免疫细胞化学分析。图18A显示在单独或在用硫代乙酰胺(TAA)预处理之后用SEMA4D处理的培养大鼠星形胶质细胞中星形胶质细胞活化的免疫细胞化学分析，反映为GFAP阳性面积的相对增加。图18B是单独用SEMA4D或与前列腺素D2组合处理的培养大鼠星形胶质细胞中的星形胶质细胞活化的免疫细胞化学分析，反映为F-肌动蛋白与G-肌动蛋白比率。误差线代表标准差。通过用Bonferroni多重比较检验的单因素ANOVA，“*”＝p＜0.05。

发明详述

I.定义

需要注意，术语“一个”或“一种”实体指一种或多种该实体；例如，一种“抗-SEMA4D抗体”应理解为代表一种或多种抗-SEMA4D抗体。如此，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。

此外，本文使用“和/或”时应视作具体公开了两种特征或组分的每一种，有或没有另一种。因此，本文短语“A和/或B”中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)、和“B”(单独)。同样，短语如“A、B、和/或C”中使用的术语“和/或”旨在包括各种以下实施方式：A、B、和C；A、B、或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

除非另有定义，本文使用的科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。例如，Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology(《生物医药和分子生物学简明词典》)，Juo，Pei-Show，第2版，2002，CRC出版社(CRC Press)；TheDictionary of Cell and Molecular Biology(《细胞和分子生物学词典》)，第3版，1999，学术出版社(Academic Press)；和Oxford Dictionary Of Biochemistry And MolecularBiology(《牛津生物化学和分子生物学辞典》)，修订，2000，牛津大学出版社(OxfordUniversity Press)，向技术人员提供了本发明使用的很多术语的常用词典。

单位、前缀和符号以它们的国际单位制(SI)接受的形式表示。数值范围包括限定该范围的数值。除非另外说明，氨基酸以氨基到羧基的取向从左到右书写。本文提供的标题不是本发明的各种方面的限制，可以参考说明书整体理解本发明的各种方面或实施方式。因此，下面紧接着定义的术语完全参考说明书全文定义。

本文所用术语“非天然产生的”物质、组合物、实体，和/或物质、组合物、实体的任意组合，或其任意语法变体是条件术语，其明确排除，但仅排除本领域普通技术人员熟知的“天然产生的”，或者可以是在任何时间，由法官或行政机关或司法机关确定或理解为“天然产生的”物质、组合物、实体，和/或物质、组合物、实体的任意组合的那些形式。

本文所用术语“神经变性疾病”或“神经变性病症”是指特征为神经元在神经系统的一个或多个区域中死亡并且随后受影响的部分功能损伤的中枢神经系统(CNS)疾病。神经变性疾病的示例包括，但不限于，阿尔茨海默病、帕金森病、亨延顿氏病、唐氏综合症、共济失调、肌萎缩侧索硬化(ALS)、额颞性痴呆(FTD)、HIV-相关认知障碍(HAND，HIV-相关神经变性疾病)、CNS狼疮和轻度认知障碍。神经变性疾病对受影响的个体的生活及其家庭和整个社会有巨大影响。

本文所用术语“阿尔茨海默病”是指初始表现为部分健忘，并且之后表现为烦躁不安、定向障碍、失语症、失认症或失用症(认知减退)、痴呆和有时表现为高兴或抑郁的进行性疾病。该病一般在40至90岁的年龄开始并且主要影响女性。至于其流行情况，估计占65岁以上人群的约13％。

本文所用术语“亨廷顿氏病”是指一种神经变性疾病，其是由于亨廷顿蛋白(由HTT基因表达)的N-末端处聚谷氨酰胺通道的延伸导致，其中该延伸可以是在突变的蛋白质(mHTT)中超过35-40个重复氨基酸谷氨酰胺。该疾病伴随不同大脑区域中的进行性神经细胞死亡而存在，包括纹状体的中等尺寸的多棘神经元中的毒性，其确定出现典型的动作不协调或移动如“亨廷顿舞蹈病”。mHTT的作用机制已经描述为与野生型蛋白相比功能的获得和丧失，并且包括获得或丧失与不同细胞隔室中各种蛋白质的相互作用的能力。

术语“治疗有效量”是指对“治疗”对象或哺乳动物中的疾病或病症而言有效的抗体、多肽、多核苷酸、小有机分子或其他药物的量。在神经变性疾病的情况中，药物的治疗有效量可减轻疾病的症状；减少、降低、延缓或停止症状出现；减少、降低、延缓症状的严重性；抑制，例如，阻止、延缓、防止、停止或逆转症状的表现；一定程度上缓解与该疾病相关的一个或多个症状；降低发病率和死亡率；改善生活质量；或这类效果的组合。

本文术语“症状”是指，例如，1)神经精神症状，2)认知症状，和3)运动功能障碍。神经精神症状的示例包括，例如，焦虑状行为。认知症状的示例包括，例如，学习和记忆缺陷。运动功能障碍的示例包括，例如，移动。

术语，如“治疗”或“处理”或“减轻”或“改善”同时指1)治愈、减缓、减少诊断的病理病症或疾病的症状、逆转和/或终止诊断的病理病症或疾病的进展和2)预防和/或减缓靶向的病理病症或疾病的发展的预防性措施。因此，需要治疗的那些人包括已经患有疾病的那些人；易于患有疾病的那些人；和需要预防疾病的那些人。有益或所需的临床结果包括但不限于可检测或不可检测的缓解症状、减轻疾病程度、疾病状态稳定(即不恶化)、延迟或减缓疾病进展、改善或减轻疾病状态和缓解(部分或完全)。“治疗”也可以指与不接受治疗的期望存活相比延长生存期。需要治疗的人包括已经患有病症或疾病的人，以及倾向于患有病症或疾病的人或需预防病症或疾病的人。

“对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”指需要诊断、预防或治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括人、家养动物、家畜和动物园动物、竞技动物或宠物，如犬、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛、熊等。

本文所用的术语给予“抗-SEMA4D抗体时能够获益的对象”和“需要治疗的动物”包括能够从给予抗-SEMA4D抗体或其它SEMA4D结合分子和/或从用抗-SEMA4D抗体或其它SEMA4D结合分子治疗(即减轻或预防疾病)中获益的对象(如哺乳动物对象)，该抗体或结合分子可用于(例如)检测抗-SEMA4D多肽(如用于诊断方法)。

广义来说，本发明的“结合分子”或“抗原结合分子”指特异性结合抗原决定簇的分子。在一个实施方式中，结合分子特异性结合SEMA4D，例如，约150kDa的跨膜SEMA4D多肽或约120kDa的可溶性SEMA4D多肽(通常称为sSEMA4D)。在另一个实施方式中，本发明的结合分子是抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，本发明的结合分子包括抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一个实施方式中，本发明的结合分子包括来自一种或多种抗体分子的至少2个CDR。在另一个实施方式中，本发明的结合分子包括来自一种或多种抗体分子的至少3个CDR。在另一个实施方式中，本发明的结合分子包括来自一种或多种抗体分子的至少4个CDR。在另一个实施方式中，本发明的结合分子包括来自一种或多种抗体分子的至少5个CDR。在另一个实施方式中，本发明的结合分子包括来自一种或多种抗体分子的至少6个CDR。

本发明涉及减轻患有神经变性疾病的对象中症状的方法，包括向对象给予抗-SEMA4D结合分子，例如抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物。除非特别提到完整大小的抗体如天然产生的抗体，术语“抗-SEMA4D抗体”包括完整大小的抗体以及这种抗体的抗原结合片段、变体、类似物或衍生物，例如天然产生的抗体或免疫球蛋白分子，或以类似于抗体分子的方式结合抗原的经工程改造抗体分子或片段。

本文所用的“人”或“全人”抗体包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，包括分离自人免疫球蛋白文库或不表达内源性免疫球蛋白的一种或多种人免疫球蛋白转基因动物的抗体，如下文所述，例如，Kucherlapati等的美国专利号5,939,598。“人”或“全人”抗体也包括至少含重链可变区或至少重链和轻链可变区的抗体，其中所述可变区具有人免疫球蛋白可变区的氨基酸序列。

“人”或“全人”抗体还包括如上所述包含本文所述抗体分子(如VH区和/或VL区)的变体(包括衍生物)或基本由其组成或由其组成的“人”或“全人”抗体，所述抗体或其片段免疫学特异性结合于SEMA4D多肽或其片段或变体。可利用本领域技术人员已知的标准技术在编码人抗-SEMA4D抗体的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于，引起氨基酸取代的定点诱变和PCR介导的诱变。在一些实施方式中，相对于参照VH区、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VL区、VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3，该变体(包括衍生物)编码少于50个氨基酸取代、少于40个氨基酸取代、少于30个氨基酸取代、少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。

在某些实施方式中，氨基酸取代是保守性氨基酸取代，如下所详述。或者，也可沿所有或一部分编码序列随机引入突变，例如通过饱和诱变引入，可筛选所得突变体的生物学活性以鉴定保持活性(例如，结合SEMA4D多肽，如结合人SEMA4D、鼠SEMA4D或同时结合人和鼠SEMA4D的能力)的突变体。“人”或“全人”抗体的这类变体(或其衍生物)也可称为“优化”或“就抗原结合优化”的人或全人抗体，包括对抗原亲和性提高的抗体。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用。抗体或免疫球蛋白至少包括重链可变区，通常至少包括重链和轻链的可变区。较好地理解了脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构。参见例如，Harlow等(1988)《抗体：实验室手册》(Antibodies：A LaboratoryManual)(第2版；冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))。

本文所用术语“免疫球蛋白”包括可在生物化学上区分的各种类型多肽。本领域技术人员应理解，重链分为伽马、缪、阿尔法、德尔塔或伊普西龙(γ，μ，α，δ，ε)，其中还有一些亚类(如γ1-γ4)。该链的特性决定抗体“类别”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等已被充分表征，且已知赋予功能特化。根据本文公开内容，本领域技术人员不难区分这些类别和同种型的修饰形式，因此，它们涵盖在本发明范围内。所有免疫球蛋白类别明显属于本发明范围，以下讨论通常针对免疫球蛋白分子的IgG类。在IgG中，标准的免疫球蛋白分子包括分子量约为23,000道尔顿的两条相同轻链多肽和分子量为53,000-70,000的两条相同重链多肽。这四条链通常在“Y”构型中由二硫键连接起来，其中轻链从Y的口部开始托起重链，并延续通过可变区。

轻链分类为κ或λ。各重链类可与κ或λ轻链结合。通常，轻链和重链互相共价结合，并且当由杂交瘤、B细胞或遗传工程改造的宿主细胞生成免疫球蛋白时，两条重链的“尾”部分通过共价二硫键或非共价连接结合在一起。在重链中，氨基酸从Y构型的分叉末端处的N-端到各条链的底部处的C-端。

轻链和重链都划分成结构和功能同源性的区域。从功能角度使用术语“恒定”和“可变”。在这方面，应理解轻链(VL或VK)和重链(VH)部分的可变区决定抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链(一般为CH1、CH2或CH3)的恒定区产生重要的生物学特性，例如分泌、跨胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照习惯，恒定区结构域的编号随着远离抗原结合位点或抗体的氨基端而增加。N-端区是可变气并且C-端区是恒定区；CH3和CL结构域一般分别包括重链和轻链的羧基端。

如上所述，可变区允许抗体选择性识别并特异性结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VL和VH结构域、或这些可变区内的互补决定区(CDR)亚组组合形成确定三维抗原结合位点的可变区。这种四联抗体结构形成在Y的每条臂末端存在的抗原结合位点。更具体地，所述抗原结合位点由各VH和VL链上的三个CDR确定。在一些情况下，例如在衍生自羊驼种类或根据羊驼免疫球蛋白工程改造的某些免疫球蛋白分子中，完整的免疫球蛋白分子可仅由重链构成而不含轻链。参见例如，Hamers-Casterman等，Nature 363：446-448(1993)。

在天然产生的抗体中，每个抗原结合结构域上出现的六个“互补决定区”或“CDR”是短的非毗连氨基酸序列，随着抗体在水性情况中确定其三维构型时，它们特别定位以形成抗原结合结构域。抗原结合结构域中的其余氨基酸称为“构架”区，显示较小的分子间差异。构架区主要采用β-片层构象，CDR形成连接β-片层结构和某些情况下形成部分β-片层结构的环。因此，构架区用于通过链间非共价相互作用形成为CDR提供正确方向位置的支架。定位的CDR形成的抗原结合结构域确定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这种互补表面促进了抗体与其互补表位的非共价结合。对于任何给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员能容易地鉴定分别包含CDR和构架区的氨基酸，因为它们已被精确定义(见下文)。

除非明确表述为相反的含义，否则在本领域内所使用和/或接受的某一术语有两种或多种定义的情况下，本文所用的术语定义应包括所有这些含义。具体示例是使用术语“互补决定区”(“CDR”)描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非毗连抗原结合位点。这一特定区域的描述可参见Kabat等(1983)美国健康和公共服务部(U.S.Dept.ofHealth andHuman Services)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest(具有免疫学重要性的蛋白质序列)”以及Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)(上述文献通过引用全文纳入本文)，互相比较时所述定义包括重叠的氨基酸残基或氨基酸残基亚组。尽管如此，应用任一定义指抗体或其变体的CDR均应落入本文所定义和使用的术语范围。合适氨基酸残基包括上文引用的各参考文献中定义的CDR，所述氨基酸残基列于下表1以作比较。包括特定CDR的准确残基编号根据CDR的序列和大小而变化。在抗体的可变区氨基酸序列给定的情况下，本领域技术人员可常规确定哪些残基包含具体CDR。

表1.CDR定义¹

	Kabat	Chothia
			VH CDR1	31-35	26-32
VH CDR2	50-65	52-58
			VH CDR3	95-102	95-102
VL CDR1	24-34	26-32
			VL CDR2	50-56	50-52
VL CDR3	89-97	91-96

¹表1中所有CDR定义的编号均按照Kabat等所述的编号规则(见下文)。

Kabat等还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员能明确地将所述“Kabat编号”系统应用于任何可变区序列，而不依赖序列本身外的任何实验数据。本文所用的“Kabat编号”指Kabat等(1983)美国卫生与公众服务部，“Sequencesof Proteins of Immunological Interest(免疫学上感兴趣的蛋白质序列)中所述的编号系统。”除非另有说明，提到本发明的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中具体氨基酸残基位置的编号时，均按照Kabat编号系统。

本发明的抗体或抗原结合片段、变体、或其衍生物包括但不限于：多克隆、单克隆、多特异性和双特异性(其中至少一个臂对SEMA4D有特异性)、人、人源化、灵长类化或嵌合抗体，单链抗体，表位结合片段如Fab、Fab′和F(ab′)₂、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、Fab表达文库产生的片段和抗独特型(抗-Id)抗体(包括例如，本文所述抗-SEMA4D抗体的抗-Id抗体)。ScFv分子为本领域已知，描述于例如美国专利号5,892,019。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是任何类型(如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2等)或小类的免疫球蛋白分子。

本文所用的术语“重链部分”包括衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。在某些实施方式中，多肽包含包括以下至少一种的重链部分：VH结构域、CH1结构域、铰链(例如，上、中、和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域或其变体或片段。例如，本发明所用的结合多肽可包括含有CH1结构域的多肽链；含有CH1结构域、至少一部分绞链区和CH2结构域的多肽链；含有CH1结构域和CH3结构域的多肽链；含有CH1结构域、至少一部分绞链区和CH3结构域的多肽链，或者含有CH1结构域、至少一部分绞链区、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。在另一实施方式中，本发明的多肽包括含有CH3结构域的多肽链。另外，本发明所用的结合多肽可能缺少CH2结构域的至少一部分(例如，所有或部分CH2结构域)。如上所述，本领域普通技术人员应理解，可修饰这些结构域(例如重链部分)，从而其氨基酸序列不同于天然产生的免疫球蛋白分子。

在本文公开的某些抗-SEMA4D抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物中，多聚体的一条多肽链的重链部分与该多聚体的第二条多肽链相同。或者，本发明的含有重链部分的单体是不同的。例如，各单体可包含不同的靶结合位点，形成例如双特异性抗体。

用于本文所述方法的结合分子的重链部分可衍生自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可包含衍生自IgG1分子的CH1结构域和衍生自IgG3分子的铰链区。在另一个示例中，重链部分可包含部分衍生自IgG1分子、部分衍生自IgG3分子的绞链区。在另一个示例中，重链部分可包含部分衍生自IgG1分子、部分衍生自IgG4分子的嵌合铰链。

本文所用的术语“轻链部分”包括衍生自免疫球蛋白轻链，如κ或λ轻链的氨基酸序列。在一些方面中，轻链部分包含VL或CL结构域中的至少一种。

本文所述的抗-SEMA4D抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可根据它们识别或特异性结合的抗原如本文所述靶标多肽(如SEMA4D)的表位或部分进行描述或说明。靶多肽与抗体的抗原结合结构域特异性相互作用的部分是“表位”或“抗原决定簇”。靶多肽可包含单个表位，但通常包含至少两个表位，并可包括任意数量的表位，这取决于抗原的大小、构象和类型。而且，应该注意到，靶标多肽上的“表位”可以是或可包括非多肽元件，例如表位可包括糖侧链。

认为抗体的肽或多肽表位的最小尺寸是约4至5个氨基酸。肽或多肽表位可含有，例如，至少7个，至少9个，或至少约15至约30个氨基酸。由于CDR能以三联形式识别抗原性肽或多肽，所以包含表位的氨基酸不必定是毗连的，可在分开的肽链上。本发明的抗-SEMA4D抗体识别的肽或多肽表位可含有SEMA4D中至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、或约15-约30个毗连或非毗连的氨基酸。

“特异性结合”通常指该抗体通过其抗原结合结构域结合于表位，并且该结合需要抗原结合结构域和表位之间某种程度的互补。按照这一定义，当抗体通过其抗原结合结构域与表位结合比与随机无关的表位结合更容易时，称该抗体“特异性结合”该表位。本文中使用术语“特异性”定性分析某一抗体与某一表位结合的相对亲和性。例如，抗体“A”可被认为比抗体“B”对给定表位具有更高特异性，或者抗体“A”据说可以比对相关表位“D”的特异性更高的特异性或亲和性结合表位“C”。

“优选结合”指与结合相关、相似、同源或类似的表位相比，该抗体更容易特异性结合某表位。因此，与相关表位相比，“优选结合”给定表位的抗体更可能结合该表位，即便这种抗体可能与相关表位发生交叉反应。

作为非限制性示例，如果抗体与第一表位结合的解离常数(K_D)低于抗体与第二表位的K_D，则可认为抗体优选结合第一表位。在另一个非限制性示例中，如果抗体与第一表位结合的亲和性比抗体与第二表位的K_D低至少一个数量级，则可认为抗体优选结合第一抗原。在另一个非限制性示例中，如果抗体与第一表位结合的亲和性比抗体与第二表位的K_D低至少2个数量级，则可认为抗体优选结合第一表位。

在另一个非限制性示例中，如果抗体与第一表位结合的解离速率(k(off))比抗体与第二表位的k(off)低，则可认为抗体优选结合第一表位。在另一个非限制性示例中，如果抗体与第一表位结合的亲和性比抗体与第二表位的k(off)低至少1个数量级，则可认为抗体优选结合第一表位。在另一个非限制性示例中，如果抗体与第一表位结合的亲和性比抗体与第二表位的k(off)低至少2个数量级，则可认为抗体优选结合第一表位。可以说，本文所述的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物结合本文公开的靶多肽(例如，SEMA4D，例如，人、鼠或者人和鼠SEMA4D)或其片段或变体，其解离速率(k(off))低于或等于5X10^-2s^-1、10^{- 2}s^-1、5X10^-3s^-1或10^-3s^-1。在某些方面中，可以说，本发明的抗体结合本文公开的靶多肽(例如，SEMA4D，例如，人、鼠、或者人和鼠SEMA4D)或其片段或变体，其解离速率(k(off))低于或等于5X10^-4s^-1、10^-4s^-1、5X10^-5s^-1、或10^-5s^-1、5X10^-6s^-1、10^-6s^-1、5X10^-7s^-1或10^-7s^-1。

可以说，本文所述的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物结合本文公开的靶多肽(例如，SEMA4D，例如，人、鼠或者人和鼠SEMA4D)或其片段或变体，其结合速率(k(on))大于或等于10³M^-1 s^-1，5X10³M^-1 s^-1，10⁴M^-1 s^-1或5X10⁴M^-1 s^-1。在一些实施方式中，可以说本发明的抗体结合本文公开的靶多肽(如SEMA4D，如人、鼠或者人和鼠的SEMA4D)或其片段或变体，其结合速率(k(on))大于或等于10⁵M^-1 s^-1、5X10⁵M^-1 s^-1、10⁶M^-1 s^-1或5X10⁶M^-1 s^-1或10⁷M^-1 s^-1。

如果抗体优先结合给定表位以至于在某种程度上阻断参照抗体与该表位的结合，则称该抗体能竞争性抑制参照抗体与该表位的结合。可通过本领域已知的任意方法确定竞争性抑制，例如，竞争ELISA试验。可以说，抗体将参照抗体与给定表位的结合竞争性抑制至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。

本文所用的术语“亲和性”指单独表位与免疫球蛋白分子的CDR结合的强度量度。参见例如，Harlow等(1988)《抗体：实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第2版)，第27-28页。本文所用的术语“亲合力”指免疫球蛋白群体和抗原间复合物的总体稳定性，即免疫球蛋白混合物与抗原的功能性结合强度。参见，例如，Harlow，第29-34页。亲合力既与群体中单独免疫球蛋白分子与特定表位的亲和性相关，也与免疫球蛋白分子和抗原的价态相关。例如，二价单克隆抗体和具有高度重复表位结构的抗原例如多聚体之间的相互作用是具有高亲合力的一个例子。

本发明的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或其衍生物也可就其交叉反应性方面进行描述或说明。本文所用的术语“交叉反应性”指抗体对某一种抗原具有特异性、与第二种抗原发生反应的能力；它是两种不同抗原性物质之间关联性的量度。因此，如果抗体与诱导其形成的表位以外的其他表位结合，则具有交叉反应性。交叉反应性表位通常含有许多与诱导表位相同的互补结构特征，在某些情况下甚至比原始表位更匹配。

例如，某些抗体具有一定程度的交叉反应性，因为它们结合相关但不相同的表位，例如，与参照表位至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％和至少50％相同(按照本领域已知方法和本文所述方法计算)的表位。如果抗体不结合与参照表位少于95％、少于90％、少于85％、少于80％、少于75％、少于70％、少于65％、少于60％、少于55％和少于50％相同性(按照本领域已知方法和本文所述方法计算)的表位，则可以说该抗体的交叉反应性很低或没有交叉反应性。如果某抗体不结合某表位的任何其它类似物、直系同源物或同源物，则可认为该抗体对该表位“高度特异”。

本发明的抗-SEMA4D结合分子如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可根据与本发明多肽的结合亲和性进行描述或说明，所述多肽例如SEMA4D，如人、鼠或者人和鼠的SEMA4D。在某些方面中，结合亲和性包括解离常数或Kd低于5x10^-2M、10^-2M、5x10^-3M、10^-3M、5x10^-4M、10^-4M、5x10^-5M、10^-5M、5x10^-6M、10^-6M、5x10^-7M、10^-7M、5x10^-8M、10^-8M、5x10^-9M、10^-9M、5x10^-10M、10^-10M、5x10^-11M、10^-11M、5x10^-12M、10^-12M、5x10^-13M、10^-13M、5x10^-14M、10^-14M、5x10^-15M或10^-15M的那些。在某些实施方式中，抗-SEMA4D结合分子，例如，本发明的抗体或其抗原结合片段以约5x10^-9至约6x10^-9的Kd结合人SEMA4D。在另一个实施方式中，抗-SEMA4D结合分子，例如，本发明的抗体或其抗原结合片段以约1x10^-9至约2x10^-9的Kd结合鼠SEMA4D。

本文所用的术语“嵌合抗体”指其中免疫反应性区域或位点获自或衍生自第一物种，而恒定区(根据本发明，可能是完整、一部分或修饰的)获自第二物种的任何抗体。在某些实施方式中，靶标结合区或位点将来自非人来源(例如，小鼠或灵长类)并且恒定区是人的。

本文所用的术语“工程改造的抗体”指通过从具有已知特异性的抗体至少部分置换一个或多个CDR和必要时通过部分构架区置换和序列变化，来改变重链或轻链或二者中可变区的抗体。虽然CDR可衍生自与产生构架区的抗体属于同一类或甚至亚类的抗体，但考虑CDR衍生自不同类别的抗体或不同物种的抗体。将来自具有已知特异性的非人抗体的一个或多个“供体”CDR移植到人重链或轻链构架区内形成的工程改造的抗体在本文中称为“人源化抗体”。不必总用来自供体可变区的完整CDR代替所有CDR以将一种可变区的抗原结合能力转移至另一可变区。相反，可仅仅转移维持靶结合位点的活性所需的那些残基。

进一步认识到，人源化抗体的重链或轻链或二者中可变结构域内的构架区可仅包含人来源的残基，在这种情况下人源化抗体的这些构架区称为“全人构架区”(例如，MAb1515/2503或67，在美国专利申请公开号US 2010/0285036A1中为MAb 2503，其全文通过引用纳入本文)。或者，如果需要维持与SEMA4D抗原的适当结合或提高结合，可以在人源化抗体的重链或轻链或二者可变区中人框架区的相应位置内工程改造供体可变区中框架区的一个或多个残基。因此，以此方式工程改造的人构架区包含人和供体构架区残基的混合物，在本文中称为“部分人构架区”。

例如，抗-SEMA4D抗体的人源化过程可基本按照Winter和同事所述方法进行(Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988))，即用啮齿动物或突变型啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗-SEMA4D抗体的相应序列。也参见美国专利号5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,859,205；其通过引用纳入本文。所得的人源化抗-SEMA4D抗体将在人源化抗体的重链和/或轻链可变区的全人框架区内包含至少一个啮齿动物或突变型啮齿动物CDR。在一些情况下，人源化抗-SEMA4D抗体的一个或多个可变区的构架区内残基被相应非人(例如，啮齿动物)残基代替(参见例如，美国专利号5,585,089；5,693,761；5,693,762；和6,180,370)，在这种情况下所得的人源化抗-SEMA4D抗体将在重链和/或轻链的可变区内包含部分人框架区。

而且，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能(例如，获得所需亲和性)。通常，人源化抗体将包含几乎所有的至少一个、通常两个可变区，其中全部或基本上全部的CDR对应于非人免疫球蛋白的CDR，全部或基本上全部的构架区是人免疫球蛋白序列的构架区。人源化抗体还任选包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般是人免疫球蛋白的Fc。更多的细节参见Jones等，Nature，331：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)；其通过引用全文纳入本文。因此，所述“人源化”抗体可包括其中明显小于完整的人可变区被来自非人物种的相应序列所取代的抗体。在实践中，人源化抗体一般是一些CDR残基，可能是一些框架残基被啮齿动物抗体中相似位点的残基所取代的人抗体。参见，例如，美国专利号5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,859,205。也参见美国专利号6,180,370和国际公开号WO 01/27160，其中公开了人源化抗体和用于产生对预定抗原的亲和性提高的人源化抗体的技术。

本文所用术语“医疗提供者”是指直接接触或向活的对象(例如人类患者)给药的个人或机构。医疗提供者的非限制性示例包括医生、护士、技师、治疗师、药师、顾问、替代医学从业者、医学设备、医生办公室、医院、急救室、诊所、急救中心、替代医学诊所/设备、和提供关于患者健康状态的全部或任意部分的一般和/或特殊治疗、评价、维持、疗法、医药和/或建议的任意其他实体，包括但不限于一般医学、特殊医学、手术、和/或任何其他类型治疗、评价、维持、疗法、医药和/或建议。

本文所用术语“医疗福利提供者”包括整体或部分提供、赠予、供应、支付，或者与给予患者一种或多种医疗福利、福利计划、健康保险和/或医疗费用账户计划的渠道的个体部门、组织或集团。

本文所用术语“临床实验室”是指检验或处理来自活对象(例如人)的材料或图像的设施。处理的非限制性示例包括生物学、生物化学、血清学、化学、免疫血液学、血液学、生理学、细胞学、病理学、遗传学，基于图像或对来自人体或任意或全部人体的材料的其他检验，用于提供例如诊断、预防、或治疗活对象例如人的任何疾病或损伤，或评价活对象例如人的健康的信息的目的。这些检验可包括收集或获取图像、样品、制备、确定、测量或描述活对象例如人体内或获自活对象例如人体的样品中是否存在各种物质的过程。

II.靶标多肽描述

本文所用术语“脑信号蛋白4D”、“SEMA4D”和“SEMA4D多肽”可互换使用，如“SEMA4D”和“Sema4D”。在某些实施方式中，SEMA4D表达在细胞表面上或由细胞分泌。在另一个实施方式中，SEMA4D是膜结合的。在另一个实施方式中，SEMA4D是可溶的，例如sSEMA4D。在其他实施方式中，SEMA4D可包括完整大小的SEMA4D或其片段，或SEMA4D变体多肽，其中SEMA4D或SEMA4D变体多肽的片段保留完整大小的SEMA4D的一些或全部功能性质。

完整大小的人SEMA4D蛋白质是由2条150kDa的多肽链组成的同二聚体跨膜蛋白。SEMA4D属于脑信号蛋白家族细胞表面受体并且也称为CD100。人和小鼠SEMA4D/Sema4D从其跨膜形式经蛋白水解切割以形成120-kDa可溶性形式，表明存在2种Sema4D同种型(Kumanogoh等，J.Cell Science116(7)：3464(2003))。脑信号蛋白由可溶性和膜结合蛋白组成，其原始定义为发育期间的轴突引导因子，其在建立神经元与其合适靶标的精确连接中起到重要作用。从结构上考虑，IV类脑信号蛋白，SEMA4D由氨基末端信号序列接着特征性“Sema”结构域组成，其含有17个保守的半胱氨酸残基、Ig-样结构域、富赖氨酸伸长段、疏水性跨膜结构域和胞质尾。

SEMA4D的多肽链可包含约13个氨基酸的信号序列，并且还包含约512个氨基酸的脑信号蛋白结构域，约65个氨基酸的免疫球蛋白样(Ig-样)结构域，104个氨基酸的富赖氨酸伸长段，约19个氨基酸的疏水性跨膜区，和110个氨基酸的胞质尾。胞质尾中酪氨酸磷酸化的共有位点支持SEMA4D与酪氨酸激酶的预测结合(Schlossman等编，(1995)LeucocyteTyping V(《白细胞分型V》)(牛津，牛津大学出版社(Oxford University Press，Oxford)))。

SEMA4D已知具有至少3个功能性受体，丛蛋白-B1、丛蛋白-B2和CD72。受体之一，丛蛋白-B1在非淋巴组织中表达并且已经显示为SEMA4D的高亲和性(1nM)受体(Tamagnone等，Cell 99：71-80(1999))。丛蛋白-B1信号转导的SEMA4D刺激已经显示出诱导神经元的生长锥塌陷，并且诱导少突细胞的过程延伸塌陷(process extension collapse)和凋亡(Giraudon等，J.Immunol.172：1246-1255(2004)；Giraudon等，NeuroMolecular Med.7：207-216(2005))。在与SEMA4D结合之后，丛蛋白-B1信号转导介导R-Ras的失活，导致整联蛋白介导的胞外基质粘附减少，以及RhoA的激活，导致通过重组细胞骨架和细胞迁移。参见Kruger等，Nature Rev.Mol.Cell Biol.6：789-800(2005)；Pasterkamp，TRENDS in CellBiology 15：61-64(2005)。在另一个方面，丛蛋白-B2对SEMA4D有中等亲和性，并且最近的报道表明丛蛋白-B2调节成人室下区中皮层神经元的迁移以及成神经细胞的增殖和迁移(Azzarelli等，Nat Commun 2014年2月27日，5：3405，DOI：10.1038/ncomms4405；和Saha等，J.Neuroscience，2012年11月21日，32(47)：16892-16905)。

在淋巴组织中，CD72用作低亲和性(300nM)SEMA4D受体(Kumanogoh等，Immunity13：621-631(2000))。B细胞和APC表达CD72，并且抗-CD72抗体具有许多与sSEMA4D相同的作用，如增强CD40-诱导的B细胞应答和CD23的B细胞脱落。CD72被认为通过招募酪蛋白磷酸酶SHP-1发挥B细胞应答的负调节物的作用，其可与许多抑制性受体联合。SEMA4D与CD72的相互作用导致SHP-1的解离，以及这种负激活信号的失去。SEMA4D已经报道促进T细胞刺激和B细胞聚集以及体外存活。加入SEMA4D-表达细胞或sSEMA4D在体外增强CD40-诱导的B细胞增殖和免疫球蛋白产生，并且在体内加快抗体应答(Ishida等，Inter.Immunol.15：1027-1034(2003)；Kumanogoh和H.Kukutani，Trends in Immunol.22：670-676(2001))。sSEMA4D增强CD40诱导的树突细胞(DC)成熟，包括共刺激分子上调和增加的IL-12分泌。另外，sSEMA4D可抑制免疫细胞迁移，其可通过加入阻断抗-SEMA4D抗体来逆转(Elhabazi等，J.Immunol.166：4341-4347(2001)；Delaire等，J.Immunol.166：4348-4354(2001))。

Sema4D在包括脾脏、胸腺和淋巴结的淋巴器官中以及如脑、心脏和肾脏的非淋巴器官中以高水平表达。在淋巴器官中，Sema4D在静息T细胞上大量表达，但是仅在静息B细胞和抗原呈递细胞(APC)如DC上弱表达。细胞激活增加了SEMA4D的表面表达以及可溶性SEMA4D(sSEMA4D)的生成。

SEMA4D的表达特性表明其在免疫系统中起到重要的生理和病理作用。SEMA4D已经显示促进B细胞激活、聚集和存活；增强CD40-诱导的增殖和抗体产生；增强对T细胞以来抗原的抗体响应；增加T细胞增殖；增强树突细胞成熟和刺激T细胞的能力；和直接涉及脱髓鞘和轴突变性(Shi等，Immunity 13：633-642(2000)；Kumanogoh等，J Immunol 169：1175-1181(2002)；和Watanabe等，J Immunol 167：4321-4328(2001))。

SEMA4D敲除(SEMA4D-/-)小鼠已经提供其他证据显示SEMA4D在体液和细胞免疫应答中起到重要作用。在SEMA4D-/-小鼠中没有已知的非淋巴组织主要异常。来自SEMA4D-/-小鼠的DC具有弱刺激能力并且在共刺激分子的表达中显示出缺陷，其可通过加入sSEMA4D来拯救。SEMA4D缺陷(SEMA4D-/-)的小鼠无法发生由髓鞘少突细胞糖蛋白肽诱导的实验性自身免疫脊髓炎，因为在缺少SEMA4D的情况下，髓鞘少突细胞糖蛋白特异性T细胞生成微弱(Kumanogoh等，J Immunol 169：1175-1181(2002))。也在自身免疫倾向型MRL/lpr小鼠(全身性自身免疫疾病如SLE的模型)而不是正常小鼠的血清中检测到显著量的可溶性SEMA4D。此外，sSEMA4D的水平与自身抗体的水平相关并且随着年龄增加(Wang等，Blood 97：3498-3504(2001))。可溶性SEMA4D也已经显示在患有脱髓鞘性疾病的患者的脑脊液和血清中累积，并且sSEMA4D诱导人多潜能神经前体(Dev细胞)的凋亡，并且在体外抑制过程扩展并诱导大鼠少突细胞的凋亡(Giraudon等，J Immunol 172(2)：1246-1255(2004))。由抗-SEMA4DMAb封闭这种凋亡。

III.抗-SEMA4D抗体

已经在本领域中描述了结合SEMA4D的抗体。参见，例如，美国专利号8,496,938、美国公开号2008/0219971 A1、US 2010/0285036 A1和US 2006/0233793 A1、国际专利申请WO93/14125、WO 2008/100995和WO 2010/129917，以及Herold等，Int.Immunol.7(1)：1-8(1995)，其各自通过引用全文纳入本文。

本发明一般涉及减轻患有神经炎性或神经变性疾病的对象，例如人患者的症状的方法，包括给予特异性结合SEMA4D的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物。在某些实施方式中，该抗体阻断SEMA4D与其受体中的一种或多种，例如丛蛋白-B1的相互作用。具有这些性质的抗-SEMA4D抗体可用于本文提供的方法。可使用的抗体包括，但不限于MAbs VX15/2503，67和76及其抗原结合片段、变体或衍生物，其全部描述于US 2010/0285036 A1。可用于本文提供的方法的其他抗体包括US 2006/0233793 A1中所述的BD16和BB18抗体及其抗原结合片段、变体或衍生物；或MAb 301、MAb 1893、MAb 657、MAb 1807、MAb 1656、MAb1808、Mab 59、MAb 2191、MAb 2274、MAb 2275、MAb 2276、MAb 2277、MAb 2278、MAb 2279、MAb 2280、MAb 2281、MAb 2282、MAb 2283、MAb 2284和MAb 2285中的任意种，及其任意片段、变体或衍生物，如US 2008/0219971 A1所述。在某些实施方式中，用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗体结合人、鼠、或人和鼠SEMA4D。还可使用与任意前述抗体结合相同表位的抗体和/或竞争性抑制任意前述抗体的抗体。

在某些实施方式中，可用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物具有与参照抗-SEMA4D抗体分子的氨基酸序列具有至少约80％、约85％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％或约95％序列相同性的氨基酸序列，例如上述的那些。在另一个实施方式中，所述结合分子与参照抗体共有至少约96％、约97％、约98％、约99％或100％的序列相同性。

在另一个实施方式中，可用于本发明提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，包含免疫球蛋白重链可变区(VH结构域)、基本由其组成或由其组成，其中所述VH结构域的至少一个CDR具有与SEQ ID NO：9或10的CDR1、CDR2或CDR3至少约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％相同或完全相同的氨基酸序列。

在另一个实施方式中，可用于本发明提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，包含免疫球蛋白重链可变区(VH结构域)、基本由其组成或由其组成，其中所述VH结构域的至少一个CDR具有与SEQID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8至少约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％相同或完全相同的氨基酸序列。

在另一个实施方式中，可用于本发明提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，包含免疫球蛋白重链可变区(VH结构域)、基本由其组成或由其组成，其中除了1、2、3、4或5个保守氨基酸取代以外，所述VH结构域的至少一个CDR具有与SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8相同的氨基酸序列。

在另一个实施方式中，可用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的包含VH结构域、基本由其组成或由其组成，该VH结构域具有与SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：10至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的氨基酸序列，其中抗-SEMA4D抗体包含特异性或优先结合SEMA4D的编码VH结构域。

在另一个实施方式中，可用于本发明提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，包含免疫球蛋白轻链可变区(VL结构域)、基本由其组成或由其组成，其中所述VL结构域的至少一个CDR具有与SEQ ID NO：17或18的CDR1、CDR2或CDR3至少约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％相同或完全相同的氨基酸序列。

在另一个实施方式中，可用于本发明提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，包含免疫球蛋白轻链可变区(VL结构域)、基本由其组成或由其组成，其中所述VL结构域的至少一个CDR具有与SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16至少约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％相同或完全相同的氨基酸序列。

在另一个实施方式中，可用于本发明提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，包含免疫球蛋白轻链可变区(VL结构域)、基本由其组成或由其组成，其中除了1、2、3、4或5个保守氨基酸取代以外，所述VL结构域的至少一个CDR具有与SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16相同的氨基酸序列。

在另一个实施方式中，可用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的包含VL结构域、基本由其组成或由其组成，该VL结构域具有与SEQ IDNO：17或SEQ ID NO：18至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同的氨基酸序列，其中抗-SEMA4D抗体包含特异性或优先结合SEMA4D的编码VL结构域。

本文提供的方法中使用的还包括编码本文所述的抗-SEMA4D抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物的多肽，编码这类多肽的多核苷酸，包含这类多核苷酸的载体，和包含这类载体或多核苷酸的宿主细胞，全部用于产生用于本文所述方法的抗-SEMA4D抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物。

本发明抗-SEMA4D抗体的合适生物活性变体可用于本发明的方法。这种变体将保持母体抗-SEMA4D抗体的所需结合性质。本领域中制备抗体变体的方法通常是可得的。

诱变和改变核苷酸序列的方法本领域中熟知。参见例如，Walker和Gaastra编(1983)，Techniques in Molecular Biology(《分子生物学技术》)(纽约麦克米兰出版公司(MacMillan Publishing Company))；Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492(1985)；Kunkel等，Methods Enzymol.154：367-382(1987)；Sambrook等(1989)《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)(纽约州冷泉港(Cold SpringHarbor，N.Y.))；美国专利号4,873，192；以及其中引用的参考文献；其通过引用纳入本文。有关不影响感兴趣多肽生物学活性的合适氨基酸取代的指南可参见下述文献中的模型：Dayhoff等(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure(《蛋白质序列和结构图册》)(华盛顿特区的国家生物医学研究基金会(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.))，第345-352页，通过引用全文纳入本文。Dayhoff等的模型利用单点可接受突变(Point Accepted Mutation，PAM)氨基酸相似矩阵(PAM 250矩阵)来确定合适的保守性氨基酸取代。在某些实施方式中，可使用保守取代，如用一种氨基酸替换具有类似性质的另一种氨基酸。Dayhoff等模型的PAM 250矩阵中教导的保守性氨基酸取代的示例包括但不限于： 和/>

构建所述抗-SEMA4D结合分子的变体如抗体或其抗原结合片段、感兴趣多肽时，生成修饰，从而变体持续拥有所需属性，如能特异性结合SEMA4D，如人、灵长动物、鼠、或者人和鼠的SEMA4D，例如在表面上表达或由细胞分泌，并具有SEMA4D阻断活性，如本文所述。显然，编码变体多肽的DNA中产生的任何突变一定不能将序列置于阅读框外，并且在某些实施方式中不产生可生成二级mRNA结构的互补区。参见欧洲专利申请公开号75,444。

测定抗-SEMA4D结合分子如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的结合特异性的方法包括但不限于：标准竞争结合实验、T细胞或B细胞的免疫球蛋白分泌的监测试验、T细胞增殖实验、凋亡实验、ELISA实验等。参见例如，WO 93/14125；Shi等，Immunity 13：633-642(2000)；Kumanogoh等，J Immunol 169：1175-1181(2002)；Watanabe等，J Immunol 167：4321-4328(2001)；Wang等，Blood 97：3498-3504(2001)；和Giraudon等，J Immunol 172(2)：1246-1255(2004)公开的实验，其都通过引用纳入本文。

本文在讨论本文公开的任何具体多肽(包括恒定区、CDR、VH结构域或VL结构域)是否与另一多肽至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或者甚至约100％相同时，相同性％可采用本领域已知的方法和计算机程序/软件测定，例如但不限于BESTFIT程序(威斯康星序列分析软件包，用于Unix系统的第8版，遗传学计算机团队(Genetics Computer Group)，威斯康星州麦迪逊科学大道575大学研究园(University Research Park)，53711)。53711).BESTFIT利用Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482-489的局部同源性算法，以找到两条序列之间的最佳同源性区段。使用BESTFIT或任何其它序列比对程序来确定某具体序列是否与本发明所述参照序列(例如)95％相同时，当然要设定参数从而在参照多肽序列的全长上计算相同性百分数，并且在参照序列的氨基酸总数中允许多至5％的同源性缺口。

出于本发明的目的，可采用史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法测定序列相同性百分数，该算法使用仿射缺口搜索，其中缺口开放罚12分，缺口延伸罚2分，BLOSUM矩阵计62分。Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482-489中公开了史密斯-沃特曼同源性搜索算法。变体与参照抗CXCL13抗体(例如，MAb VX15/2503、67或76)可以差异例如，少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个氨基酸残基，如6-10个，少至5个，少至4、3、2、或者甚至1个氨基酸残基。

“序列相同性”百分比也可通过比较对比窗中两种最优比对序列来测定。为了最优比对用于比较的序列，对比窗中多核苷酸或多肽序列的部分可包含称为缺口的添加或缺失，而参考序列保持不变。最优比对是即使有缺口仍在参考和比较序列之间产生最大可能数目的“相同”位置的比对。两种序列之间的“序列相同性”百分比可用程序“BLAST 2序列”版本测定，所述程序2004年9月1日起可获自国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)，包括程序BLASTN(用于核苷酸序列比较)和BLASTP(用于多肽序列比较)，基于Karlin和Altschul的算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(12)：5873-5877，1993)。使用“BLAST 2序列”时，2004年9月1日起的标准参数可用于字长(3)、缺口开放罚分(11)、延伸缺口罚分(1)、缺口降低(50)、期望值(10)和任何其他需要的参数，包括但不限于矩阵选择。

可以多种方式使抗-SEMA4D抗体的恒定区突变从而改变效应物功能。例如，参见美国专利号6,737,056B1和美国专利申请公开号2004/0132101A1，其公开了优化抗体与Fc受体结合的Fc突变。

在可用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其片段、变体或衍生物中，可使用本领域已知的技术突变Fc部分以降低效应物功能。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其它方式)可降低循环的修饰抗体与Fc受体的结合，从而提高肿瘤定位。在其他情况中，与本发明一致的恒定区修饰对互补结合进行调节并因此缩短血清半衰期。可利用恒定区的其它修饰来改变二硫键连接或寡糖部分，能因抗原特异性或抗体灵活性提高而加强定位。无需过多实验，即可容易地利用熟知的免疫学技术测定或定量分析修饰所产生的生理学概况、生物利用度和其它生化作用，如肿瘤定位、生物分布和血清半衰期。用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗体包括修饰的衍生物，例如通过将任何类型的分子共价连接到抗体上，从而该共价连接不会阻碍抗体特异性结合其关联表位。例如但不限于，抗体衍生物包括通过，例如糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、由已知保护/阻断基团衍生、蛋白水解切割、连接于细胞配体或其它蛋白质等方法修饰的抗体。通过已知技术可进行任意多种化学修饰，包括但不限于：特异性化学切割、乙酰化、甲酰化等。此外，衍生物可包含一种或多种非经典氨基酸。

“保守性氨基酸取代”是氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基取代。本领域已定义具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括：具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。或者，突变可沿着编码序列的全部或部分而随机导入，如通过饱和突变，并且可筛选所得的突变体的生物活性以鉴定保持活性(例如，在对象，例如癌症患者中结合抗-SEMA4D多肽，以阻断SEMA4D与其受体的相互作用，或减轻患者中与神经变性疾病相关的症状的能力)的突变体。

例如，可能仅在抗体分子的构架区内或仅在CDR区内引入突变。导入的突变可以是沉默或天然错义突变，即对抗体结合抗原的能力没有或有很少的影响。可使用这些突变类型来优化密码子使用，或提高杂交瘤的抗体生成。或者，非天然错义突变可改变抗体结合抗原的能力。本领域技术人员将能够设计并测试具有所需性质的突变体分子，如没有抗原结合活性或结合活性的变化(例如，改善抗原结合活性或改变抗体特异性)。诱变之后，编码的蛋白质可经常规表达并且能使用本文所述的技术或者通过本领域已知的常规修饰技术来确定编码的蛋白质的功能和/或生物活性(例如，免疫特异性结合SEMA4D多肽的至少一个表位的能力)。

在某些实施方式中，用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗体包含至少一个优化的互补决定区(CDR)。优化的“CDR”指该CDR已经修饰并且经优化以提高包含优化的CDR的抗-SEMA4D抗体的结合亲和性和/或抗-SEMA4D活性。“抗-SEMA4D活性”或“SEMA4D阻断活性”可包括调节下列一种或多种SEMA4D相关活性的活性：B细胞活性、聚集和存活；CD40-诱导的增殖和抗体产生；对T细胞依赖抗原的抗体应答；T细胞或其他免疫细胞增殖；树突细胞成熟；脱髓鞘和轴突变性；多潜能神经前体和/或少突细胞的凋亡；诱导内皮细胞迁移；抑制自发性单核细胞迁移；与细胞表面丛蛋白B1或其他受体结合，或者与可溶性SEMA4D或SEMA4D+细胞表面上表达的SEMA4D相关的任意其他活性。抗-SEMA4D活性也可导致与SEMA4D表达相关的疾病的发病或严重性降低，包括但不限于某些类型的癌症包括淋巴瘤，自身免疫疾病，炎性疾病包括中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)炎性疾病，移植排斥和侵入性血管生成。基于鼠抗-SEMA4D MAb BD16和BB18的优化的抗体的示例描述于美国专利公开号2008/0219971 A1、国际专利申请号WO 93/14125和Herold等，Int.Immunol.7(1)：1-8(1995)，其各自通过引用全文纳入本文。修饰可包括取代CDR内的氨基酸残基，使得抗-SEMA4D抗体保留对SEMA4D抗原的特异性并且具有改善的结合亲和性和/或改善的抗-SEMA4D活性。

IV.星形胶质细胞

星形胶质细胞是特殊的神经胶质细胞，其在健康CNS中发挥许多必要的复杂功能，包括调节血流、流体/离子/pH/神经递质内稳态、突触形成/功能、能量和代谢、和维持血脑屏障(Barres BA(2008)The mystery and magic of glia：a perspective on theirroles in health and disease(神经胶质细胞的谜和魔法：其在健康和疾病中作用的透视).Neuron 60：430-440)。重要的是，星形胶质细胞通过称为活性星形胶质细胞增生的过程响应CNS损伤，其是神经炎性和神经变性疾病的主要病理特点。越来越多的证据指向活性星形胶质细胞在CNS疾病中通过丧失正常星形胶质细胞功能或获得异常活性而起到主要或促进作用的潜力。考虑到它们在许多CNS疾病中的核心作用，明显需要鉴定并严格测试恢复正常星形胶质细胞功能以有效减慢或者甚至逆转疾病进展的新分子靶标。存在几条星形胶质细胞可影响CNS疾病的潜在途径。

星形胶质细胞和OPC支持。发生在神经炎性疾病(如多发性硬化)中的脱髓鞘与包含少土胶质细胞系的细胞明显破坏和丧失相关(Ozawa K等，Patterns ofoligodendroglia pathology in multiple sclerosis(多发性硬化中少土胶质细胞病变特征).Brain.1994；117：1311-1322)。内源性髓鞘再生机制在恢复阶段中失败，部分是由于OPC不能完成分化成成熟的髓鞘性少土胶质细胞(Wolswijk G.Oligodendrocytesurvival，loss and birth in lesions of chronic-stage multiple sclerosis(慢性多发性硬化的损伤中少土胶质细胞的存活、损失和产生).Brain.2000；123：105-115)。获自其他实验性诱导的脱髓鞘模型的数据表明，与存活成熟少土胶质细胞相反，需要新的成熟OPC用于在恢复阶段期间使髓鞘再生(Levine JM，Reynolds R.Activation andproliferation of endogenous oligodendrocyte precursor cells during ethidiumbromide-induced demyelination(内源性少土胶质细胞前体细胞在溴化乙啶诱导的脱髓鞘期间的活化和增殖).Exp Neurol.1999；160：333-347)。星形胶质细胞已经显示在支持少土胶质细胞系的功能和活力中起显著作用。例如，Talbott和同事显示在溴化乙啶诱导的脱髓鞘损伤中，Nkx2.2+/Olig2+OPC需要星形胶质细胞来完全分化成少土胶质细胞并且进行髓鞘再生(Exp Neurol.2005年3月；192(1)：11-24.Endogenous Nkx2.2+/Olig2+oligodendrocyte precursor cells fail to remyelinate the demyelinated adultrat spinal cord in the absence of astrocytes(内源性Nkx2.2+/Olig2+少土胶质细胞前体细胞在没有星形胶质细胞的情况下无法使脱髓鞘的成体大鼠脊髓髓鞘再生).TalbottJF，Loy DN，Liu Y，Qiu MS，Bunge MB，Rao MS，Whittemore SR)。Arai和Lo在体外证明星形胶质细胞向OPC提供可溶营养因子支持，保护这些细胞免受增加的氧化应激(Arai，K.和Lo，E.H.(2010)，Astrocytes protect oligodendrocyte precursor cells via MEK/ERK andPI3K/Akt signaling(星形胶质细胞通过MEK/ERK和PI3K/Akt信号转导保护少土胶质细胞前体细胞).J.Neurosci.Res.，88：758-763.doi：10.1002/inr.22256)。其他已经显示在实验性自身免疫脑脊髓炎、实验性视神经炎、和脊髓损伤情况中抑制星形胶质细胞活化使得髓鞘再生特征和功能性结果测量得到改善(Brambilla R，Persaud T，Hu X，Karmally S，Shestopalov VI，Dvoriantchikova G，Ivanov D，Nathanson L，Barnum SR，BetheaJR.2009.Transgenic inhibition of astroglial NF-kappa B improves functionaloutcome in experimental autoimmune encephalomyelitis by suppressing chroniccentral nervous system inflammation(转基因抑制星形胶质细胞瘤NF-κB通过抑制慢性中枢神经细胞炎症改善实验性自身免疫脑脊髓炎中的功能性结果).J Immunol 182：2628-2640；Brambilla R，Dvoriantchikova G，Barakat D，Ivanov D，Bethea JR，ShestopalovVI.2012.Transgenic inhibition of astroglial NF-kappaB protects from opticnerve damage and retinal ganglion cell loss in experimental optic neuritis(转基因抑制星形胶质细胞瘤NF-κB在实验性视神经炎中保护免受视神经破坏和视网膜神经节细胞损失).J Neuroinflammation 9：213；Brambilla R，Bracchi-Ricard V，Hu WH，FrydelB，Bramwell A，Karmally S，Green EJ，Bethea JR.2005.Inhibition of astroglialnuclear factor kappaB reduces inflammation and improves functional recoveryafter spinal cord injury(抑制星形胶质细胞瘤核因子κB在脊髓损伤后减少炎症并且改善功能恢复).J Exp Med 202：145-156)。

考虑到星形胶质细胞在促进OPC存活和功能中起到的作用，本文鉴定的SEMA4D-表达OPC和SEMA4D受体表达星形胶质细胞的并置表明星形胶质细胞的疾病相关激活和丛蛋白-B受体及SEMA4D信号转导的相关上调对OPC功能有显著影响。

星形胶质细胞和神经元支持。越来越多的证据表明，星形胶质细胞通过调节释放突触活性分子，包括谷氨酸、嘌呤(ATP和腺苷)、GABA、和D-丝氨酸在突触传递中起到直接作用(Halassa MM，Fellin T，Haydon PG的综述(2007)，The tripartite synapse：roles forgliotransmission in health and disease(三联突触：健康和疾病中囊泡胶质传递的作用).Trends Mol Med 13：54-63；Nedergaard M，Ransom B，Goldman SA(2003)New rolesfor astrocytes：redefining the functional architecture of the brain(星形胶质细胞的新作用：重新定义大脑功能结构).Trends Neurosci 26：523-530)。这类囊泡胶质递质的释放响应神经元突触活性发生，涉及由星形胶质细胞钙信号转导增加反映的星形胶质细胞兴奋性，并且可改变神经元兴奋性(Halassa MM，Fellin T，Haydon PG(2007)，Thetripartite synapse：roles for gliotransmission in health and disease(三联突触：健康和疾病中囊泡胶质传递的作用).Trends Mol Med 13：54-63；Nedergaard M，RansomB，Goldman SA(2003)New roles for astrocytes：redefining the functionalarchitecture of the brain(星形胶质细胞的新作用：重新定义大脑功能结构).TrendsNeurosci 26：523-530)。除了通过释放囊泡胶质递质对突触活性有直接影响以外，星形胶质细胞具有通过释放生长因子和相关的分子对突触功能发挥强力和长期影响的潜力(Barres BA(2008)The mystery and magic of glia：a perspective on their roles inhealth and disease(神经胶质细胞的谜和魔法：其在健康和疾病中作用的透视).Neuron60：430-440)。

星形胶质细胞和BBB完整性。星形胶质细胞在形成血脑屏障(BBB)和调节通过BBB的转运(对于合适的神经元功能而言关键的内稳态过程)中起到重要作用。BBB是高度复杂的神经血管系统的大脑内皮结构，其包含周细胞、星形胶质细胞和内皮细胞。BBB损坏已知涉及多种神经变性疾病，包括脑膜炎、脑水肿、癫痫、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、中风、肌萎缩侧索硬化(ALS)、和多发性硬化(MS，Zlokovic BV的综述.Neurovascularpathways to neurodegeneration in Alzheimer′s disease and other disorders(阿尔茨海默病和其他病症中导致神经变性的神经血管通路).Nat Rev Neurosci.2011；12：723-738)。

星形胶质细胞是“极化的”细胞，其中它们延伸特殊的膜过程，包括与特定细胞类型相互作用的膜组分和独特细胞器。例如，靠近脑微血管或软膜的星形胶质细胞过程的特征是高密度的水通道，水通道蛋白4(Aqp4)(Neely JD，Amiry-Moghaddam M，Ottersen OP，Froehner SC，Agre P，Adams ME(2001)Syntrophin-dependent expression andlocalization of Aquaporin-4water channel protein(水通道蛋白4水通道蛋白的肌养蛋白结合蛋白-依赖性表达和定位).Proc Natl Acad Sci U S A 98，14108-14113；Amiry-Moghaddam M，Otsuka T，Hurn PD，Traystman RJ，Haug FM，Froehner SC，Adams ME，NeelyJD，Agre P，Ottersen OP，Bhardwaj A(2003)An alpha-syntrophin-dependent pool ofAQP4 in astroglial end-feet confers bidirectional water flow between bloodand brain(星形胶质细胞瘤末端-足中AQP4的α-肌养蛋白结合蛋白-依赖性集合赋予血液和大脑之间的双向水流).Proc Natl Acad Sci U S A 100，2106-2111)。相反，面对突触区的星形胶质细胞过程在谷氨酸转运蛋白中富集，同时Aqp4的密度较低(Nielsen S，Nagelhus EA，Amiry-Moghaddam M，Bourque C，Agre P，Ottersen OP(1997)Specializedmembrane domains for water transport in glial cells：High-resolutionimmunogold cytochemistry of aquaporin-4 in rat brain(在神经胶质细胞中水转运的特殊膜结构域：大鼠大脑中水通道蛋白-4的高分辨免疫金细胞化学).J Neurosci 17，171-180；Chaudhry FA，Lehre KP，van Lookeren Campagne M，Ottersen OP，Danbolt NC，Storm-Mathisen J(1995)Glutamate transporters in glial plasma membranes：Highlydifferentiated localizations revealed by quantitative ultrastructuralimmunocytochemistry(神经胶质质膜中的谷氨酸转运蛋白：通过定量超结构免疫细胞化学揭示的高度分化的定位).Neuron 15，711-720)。有趣的是，星形胶质细胞极化在经历神经变性的大脑中被破坏。例如，在AD情况中，Aqp4染色强度在有明显淀粉样斑块负担的区域中明显降低。事实上，Yang和同事证明，tg-ArcSwe AD小鼠中的淀粉样病变的积累与星形胶质细胞极化的损失在时间和空间上偶联(J Alzheimer's Dis.2011；27(4)：711-22.doi：10.3233/JAD-2011-110725；Loss ofastrocyte polarizationin the tg-ArcSwe mousemodel of Alzheimer′s disease(在阿尔茨海默病的tg-ArcSwe小鼠模型中星形胶质细胞极化损失).Yang JL，Lunde LK，Nuntagij P，Oguchi T，Camassa LM，Nilsson LN，LannfeltL，Xu Y，Amiry-Moghaddam M，Ottersen OP，Torp R)。

SEMA4D信号转导在促进星形胶质细胞活化中的作用。考虑到SEMA4D受体表达和星形胶质细胞活化标志物GFAP的相关性，存在SEMA4D信号转导可增强星形胶质细胞活化的可能，从而在疾病阶段期间提供“前馈”机制。为了检验SEMA4D对星形胶质细胞活化的影响，生成大鼠星形胶质细胞的原代培养物并单独用SEMA4D或与硫代乙酰胺(TAA)联合处理(下文的实施例6和图18A)，TAA是已经显示在体内诱导丛蛋白-B1表达的熟知的肝毒性和致肝癌试剂(Lim，J.S.，Jeong，S.Y.，Hwang，J.Y.，Park，H.J.，Cho，J.W.和Yoon，S.(2006)，或前列腺素D2(下文的实施例6和图18B)，一种在CNS中由小胶质细胞产生的已知活化因子，Toxicogenomics Analysis on Thioacetamide-induced Hepatotoxicity in Mice(对小鼠中硫代乙酰胺-诱导的肝脏毒性的毒理基因组学分析).MOLECULAR&CELLULARTOXICOLOGY，2(2)，126-133)。

V.使用治疗性抗-SEMA4D抗体的治疗方法

本发明的方法涉及抗-SEMA4D结合分子治疗患有神经变性疾病的对象的用途，所述结合分子例如抗体，包括其抗原结合片段、变体和衍生物。在某些实施方式中，内皮细胞表达SEMA4D受体，在其他实施方式中，神经细胞表达SEMA4D受体，并且在其他实施方式中，内皮细胞和神经细胞都表达SEMA4D受体。在某些实施方式中，受体是丛蛋白-B1。虽然以下说明涉及给予抗-SEMA4D抗体，本文所述的方法也适用于保留本发明抗-SEMA4D抗体的所需性质的这些抗体的抗原结合片段、变体和衍生物或其他生物或小分子，所述性质例如，能够特异性结合SEMA4D，例如，人、小鼠、或人和小鼠SEMA4D，具有SEMA4D中和活性，和/或阻断SEMA4D与其受体，例如丛蛋白-B1的相互作用。在另一个实施方式中，该方法指给予抗-SEMA4D抗体，本文所述的方法也可指给予抗-丛蛋白-B1或抗-丛蛋白-B2结合分子，其能够特异性结合丛蛋白-B1和/或丛蛋白-B2并且阻断SEMA-4D以其丛蛋白受体中的一个或两个，例如，丛蛋白-B1和/或丛蛋白-B2的相互作用。

在一个实施方式中，治疗包括向患者施加或给予本文所述的抗-SEMA4D结合分子，例如结合并中和SEMA4D的抗体或其抗原结合片段或其他生物或小分子，其中该患者患有，或处于发展神经变性疾病的风险中。在另一个实施方式中，治疗也包括向患者施加或给予包含抗-SEMA4D结合分子，例如抗体或其抗原结合片段的组合物，其中该患者患有，或处于发展神经变性疾病的风险中。

本文所述的抗-SEMA4D结合分子，例如抗体或其抗原结合片段可用于治疗各种神经变性疾病。在一些实施方式中，治疗神经变性疾病旨在诱导与该疾病相关症状的改善。在其他实施方式中，治疗神经变性疾病旨在减少、延缓或停止症状表现的增加。在其他实施方式中，治疗神经变性疾病旨在抑制，例如，阻止、延缓、防止、停止、或逆转症状表现。在其他实施方式中，治疗神经变性疾病旨在一定程度上缓解与该疾病相关的一个或多个症状。在这些情况中，症状可以是神经精神症状、认知症状和/或运动功能障碍。在其他实施方式中，治疗神经变性疾病旨在降低发病率和死亡率。在其他实施方式中，治疗神经变性疾病旨在改善生活质量。

在一个实施方式中，本发明涉及抗-SEMA4D结合分子，例如其抗体或抗原结合片段、变体或衍生物作为药物在用于治疗神经变性疾病以改善与该疾病相关的症状中的用途。

按照本发明的方法，对于神经变性疾病，利用至少一种抗-SEMA4D结合分子，例如本文另述的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物或其他生物或小分子提高积极治疗响应。对于神经变性疾病，“积极治疗响应”旨在包括与该疾病相关症状的改善。这种积极治疗响应不仅限于给药途径，可包括给予供体、供体组织(如器官灌注)、宿主、其任何组合等。具体地，本文提供的方法涉及抑制、防止、减少、缓解或减弱患者中神经变性疾病的发展。因此，例如，疾病改善的特征可以是没有临床上可观察到的症状、临床上可观察到的症状的频率降低，或临床上可观察到的症状的变化。

改变与神经变性疾病相关的症状的活性可使用体内小鼠模型检测并测量。在某些实施方式中，可采用CVN小鼠模型。CVN小鼠包括Aβ前体蛋白质的突变(其为3个独立谱系中家族性阿尔茨海默病(AD)的特征)以及复现AD相关大脑炎症的一些病症的突变(Colton等，J Alzheimer's Dis.15：571-587，2008；Van Nostrand等，Stroke 41：S135-S138，2010)。CVN模型显示出与阿尔茨海默病相关的主要病变中的一些：Aβ斑块、导致神经纤维缠结和细胞死亡(神经元损失)的过度磷酸化tau、和一致的空间记忆缺损和神经血管缺陷。与用于对阿尔茨海默病建模的其他小鼠突变体相比，CVN小鼠在更早的年龄显示出更多阿尔茨海默相关病变。在其他实施方式中，可采用亨廷顿氏病(HD)的YAC128小鼠模型。YAC128小鼠表达全长突变人亨廷顿蛋白基因(mHTT)并且准确涵盖了许多HD症状和迹象。应理解，本领域技术人员会认识到在文献中已经描述其他模型并可用于研究神经变性疾病的症状的治疗和疾病机制，并且本发明不用限制于任意特定模型。

抗-SEMA4D结合分子，例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物或其他生物或小分子可与至少一种或多种其他神经变性疾病的治疗联用；其中其他疗法在抗-SEMA4D结合分子，例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物疗法之前、期间或之后给予。因此，在组合疗法包括给予抗-SEMA4D结合分子，例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物与给予另一种治疗的情况中，本发明的方法包括共同给予、使用单独制剂或单一药物制剂，同时或以任意顺序连续给予。

为了应用某些实施方式中本发明的方法和系统，可在向确定患有神经变性疾病的对象，或疑似患有神经变性疾病的对象给予包含有效量的特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的分离的结合分子的治疗之前、或之后、或之前和之后同时从患者获得样品或图像。在一些情况中，可在已经开始治疗之后或已经停止治疗之后、或在治疗之前和之后从患者获得连续样品或图像。样品或图像可以是，例如，由医疗提供者(例如，医生)或医疗益处提供者所需要，由相同或不同医疗提供者(例如，护士，医院)或临床实验室获得和/或处理，并且在处理之后，可将结果转送至另一个提供者、医疗益处提供者或患者。类似地，可由一个或多个医疗提供者、医疗益处提供者和/或临床实验室进行一个或多个分数的测量/确定、分数之间的比较、分数的评价和治疗决定。

在任意前述过程的某些方面中，神经变性疾病选自下组：阿尔茨海默病、帕金森病、亨延顿氏病、唐氏综合症、共济失调、肌萎缩侧索硬化(ALS)、额颞性痴呆(FTD)、HIV-相关认知障碍、CNS狼疮、轻度认知障碍、或其组合。在任意前述过程的某些方面中，神经变性疾病是阿尔茨海默病或亨延顿氏病。

在一些方面中，医疗提供者可给予或指示其他医疗提供者给予包括有效量的特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的分离的结合分子的治疗，其中该对象患有、确定患有、或疑似患有神经变性疾病。医疗提供者可执行或指示其他医疗提供者或患者进行以下动作：获取样品或图像、处理样品或图像、提交样品或图像、接收样品或图像、转移样品或图像、分析或测量样品或图像、定量样品或图像、提供在分析/测量/定量样品或图像之后得到的结果、接收在分析/测量/定量样品或图像之后得到的结果、比较/评分在分析/测量/定量一个或多个样品或图像之后得到的结果、提供来自一个或多个样品的比较/分数、获取来自一个或多个样品或图像的比较/分数、给予治疗(例如，有效量的特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的分离的结合分子)，开始给予治疗、停止给予治疗、继续给予治疗、暂时中断给予治疗、增加给予的治疗剂的量、减少给予的治疗剂的量、继续给予一定量的治疗剂、增加给予治疗剂的频率、降低给予治疗剂的频率、保持治疗剂的相同给药频率、由至少一种其他治疗或治疗剂取代治疗或治疗剂、将治疗或治疗剂与至少一种其他治疗或治疗剂组合。

在一些方面中，医疗提供者可授权或拒绝例如，收集样品、处理样品、提交样品、接收样品、转移样品、分析或测量样品、定量样品、提供在分析/测量/定量样品之后得到的结果、转移在分析/测量/定量样品之后得到的结果、比较/评分在分析/测量/定量一个或多个样品之后得到的结果、转移来自一个或多个样品的比较/分数、给予治疗或治疗剂、开始给予治疗或治疗剂、停止给予治疗或治疗剂、持续给予治疗或治疗剂、暂时中断给予治疗或治疗剂、增加给予的治疗剂的量、减少给予的治疗剂的量、继续给予一定量的治疗剂、增加给予治疗剂的频率、降低给予治疗剂的频率、维持治疗剂的相同给药频率、由至少一种其他治疗或治疗剂取代治疗或治疗剂、或将治疗或治疗剂与至少一种其他治疗或治疗剂组合。

在任意前述过程的某些方面中，神经变性疾病选自下组：阿尔茨海默病、帕金森病、亨延顿氏病、唐氏综合症、共济失调、肌萎缩侧索硬化(ALS)、额颞性痴呆(FTD)、HIV-相关认知障碍、CNS狼疮、轻度认知障碍、或其组合。在任意前述过程的某些方面中，神经变性疾病是阿尔茨海默病或亨延顿氏病。

另外，医疗益处提供者可以，例如授权或拒绝治疗处方，授权或拒绝治疗覆盖范围，授权或拒绝治疗成本的退还，确定或拒绝治疗合格性等。

在一些方面中，临床实验室可以，例如，收集或获取样品、处理样品、提交样品、接收样品、转移样品、分析或测量样品、定量样品、提供在分析/测量/定量样品之后得到的结果、接收在分析/测量/定量样品之后得到的结果、比较/评分在分析/测量/定量一个或多个样品之后得到的结果、提供来自一个或多个样品的比较/分数、获取来自一个或多个样品的比较/分数、或其他相关活动。

在任意前述过程的某些方面中，神经变性疾病选自下组：阿尔茨海默病、帕金森病、亨延顿氏病、唐氏综合症、共济失调、肌萎缩侧索硬化(ALS)、额颞性痴呆(FTD)、HIV-相关认知障碍、CNS狼疮、轻度认知障碍、或其组合。在任意前述过程的某些方面中，神经变性疾病是阿尔茨海默病或亨延顿氏病。

在某些方面中，可使用任意前述过程来确定对象是否患有神经变性疾病。在某些方面中，神经变性疾病选自下组：阿尔茨海默病、帕金森病、亨延顿氏病、唐氏综合症、共济失调、肌萎缩侧索硬化(ALS)、额颞性痴呆(FTD)、HIV-相关认知障碍、CNS狼疮、轻度认知障碍、或其组合。在任意前述过程的某些方面中，神经变性疾病是阿尔茨海默病或亨延顿氏病。

在一些方面中，医疗提供者、临床实验室、或其他实体可以，例如，收集或获取图像、处理图像、提交图像、接收图像、转移图像、分析或测量图像、定量图像、提供在分析/测量/定量图像之后得到的结果、接收在分析/测量/定量图像之后得到的结果、比较/评分在分析/测量/定量一个或多个图像之后得到的结果、提供来自一个或多个图像的比较/分数、获取来自一个或多个图像的比较/分数、或其他相关活动。可用于这些方面的图像包括但不限于通过血管造影、超声、计算机断层扫描(CT)、核磁共振成像(MRI)、正电子发射断层成像(PET)、光学相干断层成像(OCT)、近红外光谱(NIRS)、和NIR荧光获得的图像。在某些实施方式中，可使用已经在文献中描述的成像技术(Tardif等，Circ Cardiovasc Imaging 4：319-333(2011))。

VI.药物组合物和给药方法

本领域技术人员熟知或不难确定制备和给予抗-SEMA4D结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的方法。抗-SEMA4D结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的给药途径可以是，例如，口服、胃肠道外、吸入或外用。本文所用的术语胃肠道外包括例如，静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道给药。虽然所有这些给药形式均明确认为在本发明范围内，但给药形式的例子是注射液，特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注。合适的注射用药物组合物可包含缓冲剂(如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、表面活性剂(如聚山梨酯)，以及任选的稳定剂(如人白蛋白)等。然而，在与本文所教授内容相符的其它方法中，抗-SEMA4D结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可直接递送到不良细胞群的位点，从而提高患病组织与治疗剂的接触。

如本文所述，可以药学有效量给予抗-SEMA4D结合分子，例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物用于体内治疗神经变性疾病。在这方面，应理解，将配制本发明公开的结合分子以利于给药并提高活性物质的稳定性。在某些实施方式中，本发明的药物组合物包含药学上可接受的无毒无菌运载体，如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂等。出于本申请目的，抗-SEMA4D结合分子如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的药学有效量应认为指足以实现有效结合靶标和足以实现某一益处，例如，改善与神经变性疾病相关的症状。

本发明所用的药物组合物包含药学上可接受的运载体，包括例如，离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂，血清蛋白质如人血清白蛋白，缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。

胃肠道外给药制剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬液和乳液。非水性溶剂的示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯如油酸乙酯。水性运载体包括例如，水、醇/水溶液、乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。在本发明中，药学上可接受的运载体包括但不限于：0.01-0.1M，例如，约0.05M的磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其它常见的胃肠道外载剂包括磷酸钠溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格溶液或固定油。静脉内载剂包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格右旋糖的那些物质等。也可存在防腐剂和其它添加剂，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

更具体地，适于注射应用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性时)或分散液，以及用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌粉末。在这种情况下，该组合物必须无菌，并应该是达到存在注射容易性(easy syringability)程度的流体。它应该在制造和储存条件下稳定，并且应该在保存过程中能够抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用。运载体可以是包含如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。可维持合适的流动性，例如通过使用诸如卵磷脂的涂料、分散液情况下通过保持所需粒度以及通过使用表面活性剂。适用于本文所述治疗方法的制剂可参见《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)(马克出版公司(Mack Publishing Co.))第16版(1980)。

也可通过各种抗菌剂和抗真菌剂(如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)实现防止微生物的作用。在许多情况中，可包含等渗剂，例如，糖、多元醇，如甘露醇、山梨醇或氯化钠。可在组合物中包含延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)以延长可注射组合物的吸收。

在任何情况下，制备无菌注射溶液可通过将所需量的活性化合物(如抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，本身或与其它活性剂联合)掺入含有本文所列一种成分或多种成分组合的合适溶剂，然后如需要进行过滤除菌。通常，将活性活化物掺入含有碱性分散介质和上述其它所需成分的无菌载剂中制备分散液。在制备无菌注射液所需的无菌粉末时，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，由之前无菌过滤的溶液产生活性组分和任何其它所需组分的粉末。注射制剂在无菌条件下按照本领域已知方法加工，装入容器(如安瓿、袋、瓶、注射器或小管)中，并密封。此外，可以试剂盒的形式包装并销售制剂。这类制品可具有标签或药品说明书，表明相关组合物可用于治疗患有或倾向于患有疾病或病症的对象。

胃肠道外制剂可以是单次推注剂量，输注或负荷推注剂量，随后是维持剂量。可在具体固定或可变的间隔处给予这些组合物，例如，每天一次或者“按需”基础。

本发明所用的某些药物组合物可以可接受的剂型口服给予，包括例如，胶囊、片剂、水性悬液或溶液。也可通过鼻气溶胶或吸入来给予某些药物组合物。这类组合物可采用苯甲醇或其他合适的防腐剂，吸收促经济以增强生物可及性，和/或其他常规增溶剂或分散剂制备成盐水溶液。

与载体材料组合产生单一剂型的抗-SEMA4D结合分子，如抗体或其片段、变体或衍生物的量可以根据治疗宿主以及具体的给药模式而变化。可以单剂型、多剂型或在确立的时间段内的输注中给予组合物。也可调整给药方案，以提供最优所需响应(例如，治疗或预防性响应)。

在本发明范围内，抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可按照上述治疗方法给予人或其它动物，其给予量足以产生疗效。本发明抗-SEMA4D抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可以常规剂型给予所述人或其它动物，该剂型根据已知技术将本发明抗体与常规的药学上可接受运载体或稀释剂混合来制备。本领域技术人员应认识到，药学上可接受运载体或稀释剂的形式和特点由混合的活性成分含量、给药途径和其它熟知变量决定。本领域技术人员还将理解，可使用包含一种或多种抗-SEMA4D结合分子，如本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的混合物。

“治疗有效剂量或治疗有效量”或者“有效量”指给予时，在患有待治疗疾病患者的治疗方面带来阳性治疗响应的抗-SEMA4D结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的用量。在神经变性疾病的情况中，积极治疗响应可减轻疾病的症状；减少、降低、延缓或停止症状出现；减少、降低、延缓症状的严重性；抑制，例如，阻止、延缓、防止、停止或逆转症状的表现；一定程度上缓解与该疾病相关的一个或多个症状；降低发病率和死亡率；改善生活质量；或这类影响的组合。

用于减少症状发生的本发明的药物制剂的治疗有效的剂量可根据许多不同的因素变化，包括给药方式、目标位点、患者的生理状态、患者是人还是动物、给予的其他药物和治疗是预防性还是治疗性。在某些实施方式中，患者是人，但也可治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。可使用本领域技术人员已知的常规方法对治疗剂量进行滴定以优化安全性和功效。

鉴于本发明的公开内容，本领域普通技术人员无需过多实验即可确定至少一种抗-SEMA4D结合分子如抗体或其结合片段、变体或衍生物的给予量。影响给药方式以及至少一种抗-SEMA4D结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物各自用量的因素包括但不限于：接受治疗的个体的疾病严重程度、病史、年龄、身高、重量、健康和身体状况。类似地，抗-SEMA4D结合分子，如抗体或其片段、变体或衍生物的给予量取决于给药方式、对象是否接受单一剂量或多剂量的此种药剂。

本发明还提供抗-SEMA4D结合分子，例如本发明的抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物在制备用于治疗对象的神经变性疾病的药物中的用途，其中该药物用于已经用至少一种其他治疗预治疗的对象。“预治疗”或“预处理”是指对象在接受包含抗-SEMA4D结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物之前已经接受了一种或多种其他治疗(例如，已经用至少一种其他神经变性治疗进行治疗)。“预治疗”或“预处理”包括在开始用包含抗-SEMA4D结合分子，例如本文公开的单克隆抗体VX15/2503、67或76、或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物治疗开始2年内、18个月内、1年内、6个月内、2个月内、6周内、1个月内、4周内、3周内、2周内、1周内、6天内、5天内、4天内、3天内、2天内、或者甚至1天内已经用至少一种其他治疗进行治疗的对象。对象不必对用之前的一种或多种治疗进行的预治疗有响应。因此，接受包含抗-SEMA4D结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物的对象可能已经响应或可能没有响应用先前治疗的预治疗，或先前治疗中的一种或多种，其中预治疗包括多种治疗。

除非另有说明，本发明的实施将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，它们均在本领域技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。参见例如，Sambrook等编(1989)Molecular Cloning A LaboratoryManual(《分子克隆：实验室手册》)(第2版；冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press))；Sambrook等编(1992)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，(纽约州的冷泉港实验室出版社(Cold Springs HarborLaboratory，NY))；D.N.Glover编，(1985)DNA Cloning(《DNA克隆》)，第I和II卷；Gait编(1984)Oligonucleotide Synthesis(《寡核苷酸合成》)；Mullis等，美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编(1984)Nucleic Acid Hybridization(《核酸杂交》)；Hames和Higgins编(1984)Transcription And Translation(《转录和翻译》)；Freshney(1987)Culture OfAnimal Cells(《动物细胞培养》)(ARL公司(Alan R.Liss，Inc.))；Immobilized Cells AndEnzymes(《固定的细胞和酶》)(IRL出版社)(1986)；Perbal(1984)A Practical Guide ToMolecular Cloning(《分子克隆实践指南》)；论文，Methods In Enzymology(《酶学方法》)(学术出版社公司(Academic Press，Inc.)，纽约州)；Miller和Calos编(1987)GeneTransfer Vectors For Mammalian Cells(《哺乳动物细胞的转基因载体》)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory))；Wu等编，Methods In Enzymology(《酶学方法》)，第154和155卷；Mayer和Walker编(1987)Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology(《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》)(学术出版社(AcademicPress)，伦敦)；Weir和Blackwell编(1986)Handbook Of Experimental Immunology(《实验免疫学手册》)，第1-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo(《小鼠胚胎操作》)，纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)，(1986)；和Ausubel等(1989)Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)(马里兰州巴尔的摩的约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons，Baltimore，Md.))。

抗体工程的一般原理可参见Borrebaeck编(1995)Antibody Engineering(《抗体工程》)(第2版；牛津大学出版社(Oxford Univ.Press))。蛋白质工程的一般原理可参见Rickwood等编(1995)Protein Engineering，A Practical Approach(《蛋白质工程，实践方法》)，(英国牛津的牛津大学出版社的IRL出版公司(IRL Press at Oxford Univ.Press，Oxford，Eng.))。抗体和抗体-半抗原结合的一般原理可参见：Nisonoff(1984)MolecularImmunology(《分子免疫学》)(第2版；马萨诸塞州桑德兰的辛奥尔联合公司(SinauerAssociates，Sunderland，Mass.))；和Steward(1984)Antibodies，Their Structure andFunction(《抗体的结构和功能》)(Chapman和Hall，纽约州纽约市)。此外，本领域已知且没有具体描述的免疫学标准方法通常按照下述文献所述进行：Current Protocols inImmunology(《新编免疫学实验指南》)，纽约州的约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons)；Stites等编(1994)Basic and Clinical Immunology(《基础和临床免疫学》)(第8版；Appleton和Lange，康涅狄格州的诺沃克(Norwalk，Conn.))和Mishell和Shiigi(编)(1980)Selected Methods in Cellular Immunology(《细胞免疫学的选用方法》)(W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Co)，纽约州)。

列出免疫学通用原理的标准参考文献包括：Current Protocols in Immunology(《新编免疫学实验指南》)，约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons)，纽约州；Klein(1982)J.，Immunology：The Science of Self-Nonself Discrimination(《免疫学：自身-非自身区别的科学》)(约翰韦利父子公司，纽约州)；Kennett等编(1980)Monoclonal Antibodies，Hybridoma：A New Dimension in Biological Analyses(《单克隆抗体，杂交瘤：生物学分析的新领域》)(普莱努公司(Plenum Press)，纽约州)；Campbell(1984)″MonoclonalAntibody Technology″in Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology″(《生化和分子生物学实验室技术》中的“单克隆抗体技术”)，Burden等编(的埃尔斯威尔公司(Elsevere)，阿姆斯特丹)；Goldsby等编(2000)Kuby Immunnology(《库比免疫学》)(第4版；H.弗里曼公司(H.Freemand&Co.))；Roitt等(2001)Immunology(《免疫学》)(第6版；伦敦：摩兹比公司(Mosby))；Abbas等(2005)Cellular and Molecular Immunology(《细胞和分子免疫学》)(第5版；埃尔斯威尔健康科学分公司(Elsevier Health SciencesDivision))；Kontermann和Dubel(2001)Antibody Engineering(《抗体工程》)(施普林格公司(Springer Verlan))；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：ALaboratoryManual(《分子克隆：实验室手册》)(冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press))；Lewin(2003)Gene VIII(《基因VIII》)(普伦蒂斯霍尔出版社(Prentice Hall)2003)；Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual(《抗体：实验室手册》)(冷泉港出版社)；Dieffenbach和Dveksler(2003)PCR Primer(《PCR引物》)(冷泉港出版社)。

将上文中引用的所有参考文献以及其中引用的所有参考文献通过引用全文纳入本文。

通过说明的方式，而非限制性方式提供以下实施例。

实施例

实施例1：测试CVN小鼠模型中抗-SEMA4D结合分子，例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，例如VX15/2503、67、或76对阿尔茨海默病(AD)的效果。

实验设计。使用CVN模型来研究抗-SEMA4D抗体(例如，MAb 67)对与AD相关的病变和症状的影响。CVN小鼠包括人Aβ前体蛋白的突变(其是3个独立谱系中家族性阿尔茨海默病(AD)的特征)和促进与AD相关的神经炎性机制的基因删除(一氧化氮合酶-2)(Colton等，J Alzheimer’s Dis.15：571-587，2008；Van Nostrand等，Stroke 41：S135-S138，2010)。

基本实验设计示于图1。使用阿尔茨海默病倾向CVN小鼠(获自查尔斯河公司(Charles River))来测试抗-SEMA4D结合分子对AD的效果。在10周龄时，对小鼠采血以获得基线血清学水平。在10-12周龄之间，小鼠经过行为预测试以确保它们能够参与研究。在随机化之后，从第26周至第38周，每周用抗-SEMA4D(Mab-67)或同种型对照(MAb 2B8)抗体(30mg/kg，静脉内)处理CVN小鼠，期间它们给予几次行为测试。行为测试是旷场测试和放射臂水迷宫。

旷场测试-在10和38周龄时在旷场中研究动物的探索活性，针对可能的治疗诱导的活性过低或活性过高(对照测试)或其他效果。在测试之前，小鼠被带到实验室持续至少30分钟适应实验室条件。活性腔室(佛蒙特州圣奥尔本斯的医学联营公司(Med AssociatesInc，St Albans，VT)；27x27x20.3cm)装备红外光束。小鼠放在腔室中央并且以5-分钟箱(bins)记录它们的行为持续30分钟。在以下5个依赖性测量上进行定量分析：总移动、旷场中央的移动、中央的抬头(rearing)率、总抬头频率和速度。动物在低应激条件下测试，其中光降低至大约10-30lux的红光。

放射臂水迷宫-测试之前，11和39周龄的小鼠被带到实验室持续至少30分钟适应实验室条件。在之前已经详细描述了2天放射臂水迷宫(Alamed等，2006)。简言之，将6臂迷宫浸没在水池中，并且在一个臂的末端放置平台。小鼠每天接受15次试验持续2天，并且每次试验在不同的臂中开始，而含有平台的臂对于各小鼠而言保持相同。平台位置在2天中对给定周龄的各小鼠保持恒定，但是该位置对11和40周龄测试点之间的各小鼠改变。在室周围使用视觉暗号，小鼠学习逃离平台的位置。前十次试验被认为是训练并且在可视和隐藏平台之间交替。第1天的最后试验和第2天的所有试验使用隐藏平台。在1分钟的周期中计算错误(不正确臂进入)数量。对导致2天周期的10个段的3次试验取所述错误的平均。

在行为测试结束之后，处死小鼠，并且对大脑组织进行处理用于甲醛固定的石蜡包埋(FFPE)的免疫组化。鉴于SEMA4D在诱导抑制性GABA能突触中的作用的报告(Kuzirian等，J Neuroscience，33：8961-8973·8961，2013)在处理的CVN小鼠的齿状回中确定囊泡GABA转运蛋白(VGAT)的表达强度和囊泡密度。齿状回是成人CNS中连续神经发生的几个主要中心之一，并且被认为在记忆信息和保存中其作用。对于所有的测试，使用双因素ANOVA检验来进行统计学分析。

抗-SEMA4D减少焦虑状行为。在12只用抗-SEMA4D或同种型对照处理的AD倾向CVN小鼠的组中研究探索活性。在38周龄时针对可能的药物诱导的对移动活性和焦虑状行为的效果给予旷场测试。小鼠放在亮腔室中央并且以5-分钟时间箱记录它们的行为持续30分钟。针对总移动(图2A)和旷场中央的移动(图2B)进行定量分析，这是对焦虑相关行为的测量(如本领域所示)。

结果显示每周用抗-SEMA4D抗体AD倾向的CVN小鼠比用对照MAb2B8处理的小鼠表现出更大的旷场探索和更少的焦虑状行为(侵占场中央)。结果见图2。

抗-SEMA4D改善空间记忆。在39周龄，用抗-SEMA4D或2B8同种型对照(n＝9-13/组)处理的CVN小鼠在放射臂水迷宫中测试2天(Alamed等，2006，示于图3A)。简言之，各小鼠在连续的2天中每天接受15次试验(每段3次试验)。各试验从不同的臂开始，而含有平台的臂对于各试验保持相同。第1天的试验段在可见和隐藏平台之间交替用于训练目的。第2天的所有试验用隐藏平台进行以评价空间记忆。第1天是训练/学习期，并且在第2天，记录发现平台的延迟。

结果显示，给予抗-SEMA4D抗体(MAb 67)产生可测量的延迟减少，表明与对照(MAb2B8-处理)组相比改善的空间记忆。结果示于图3B。

抗-SEMA4D减少GABA能突触。来自Mab-67或MAb-2B8处理的CVN和WT小鼠(n＝9-13/组)的FFPE大脑组织切片用抗-VGAT抗体染色来检测GABA能突触囊泡。VGAT-阳性囊泡信号百分比和每个囊泡的VGAT信号强度在所有动物的齿状回内定量并且标准化至扫描的总齿状回。

结果显示CVN AD小鼠的抗-SEMA4D抗体治疗导致VGAT阳性囊泡的密度降低(图4A)和每个囊泡的VGAT染色强度水平的统计学显著增加(图4B)的趋势，这一发现表明SEMA4D在调节体内GABA能信号转导中的作用并且可提供对MAb 67处理的CVN小鼠中观察到的行为影响的机制的认识。GABA能信号转导与异质类别的抑制性神经元相关。如下文实施例6的图15所示，当分析聚焦于生长激素抑制素-、NPY-、或NPY2R-阳性神经元的亚组时，观察到用抗-SEMA4D抗体治疗对抑制性神经元的更显著影响。

实施例2：测试YAC128小鼠模型中抗-SEMA4D结合分子，例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，例如MAb VX15/2503或67对亨廷顿氏病(HD)的效果。

实验设计。进行采用体内YAC128的第二实验以研究抗-SEMA4D抗体对与HD相关的病变和症状的影响。基本实验设计与上述实施例1，和图1所示的相似，除了该情况中MAb(抗体)剂量是在每组13至22只YAC128或WT小鼠中从第6周至第47周每周进行。YAC128小鼠在英属哥伦比亚大学分子医学和治疗中心培养并维持。

抗-SEMA4D减少了YAC128小鼠模型中的焦虑状行为。为了评价旷场探索期间的焦虑，在由荧光天花板灯照亮的室内，MAb-处理的小鼠置于具有20cm高侧壁的50×50cm开放灰色丙烯盒的左下角内。由固定在天花板上的摄像机记录10分钟的旷场活性。对进入(图5A)和场中心中耗费的时间(图5B)进行评分作为焦虑状行为的测量。

与对照处理的动物(其中YAC128小鼠在旷场探索中显示出比野生型(WT)小鼠更大的焦虑状行为)相反，用抗-SEMA4D抗体(MAb 67)处理的WT和YAC128小鼠之间没有显著差异，表明MAb-67在YAC128小鼠中缓解焦虑状行为。结果见图5。

抗-SEMA4D在YAC128小鼠模型中改善空间记忆。为了评价对新位置上的已知物体的偏好，将2个不同的新物体放在旷场盒的左上角和右上角。将抗-SEMA4D-处理的小鼠在左下角引入盒中并由天花板固定的摄像机记录5分钟(min)，期间对于对2个新物体调查的次数进行评分(试验1，图6A)。小鼠然后从盒中移开5分钟，并且盒的右上角处的物体移至盒的右下角。将小鼠再引入盒中并且另外记录5分钟(试验2，图6B)。计算对目标物体(在新位置上的物体)的调查或鼻子戳(nose pokes)相对于所有鼻子戳的百分比。

与在试验2中优先探索新位置上的物体的对照或Mab 67-处理的野生型(WT)动物相反，对照处理的YAC128小鼠并没有识别或显示出对新位置上物体的偏好。用抗-SEMA4D抗体处理在YAC128小鼠中恢复了正常新物体偏好(p＜0.01)。这表明Mab-67处理改善了YAV128小鼠中的空间记忆，使得它们识别物体在新位置上。结果示于图6。

抗-SEMA4D在YAC128小鼠中防止皮质和胼胝体变性。用抗-NeuN抗体对来自12月龄MAb-处理的YAC128和WT小鼠(n＝13-21/组)的自由漂浮的大脑组织切片进行染色。通过使用StereoInvestigator软件(Microbrightfield公司)在连续切片中追踪预定结构的外周来确定皮质(图7A)和胼胝体(图7B)体积并且使用卡瓦列里(Cavalieri)原理来确定体积。

结果显示，用抗-SEMA4D抗体处理在12月龄的YAC128小鼠中抑制了皮质和胼胝体体积的正常疾病相关减小。结果示于图7。

Mab 67在YAC128小鼠中防止睾丸变性。在男性HD患者中观察到睾丸变性并且在雄性YAC128小鼠中再现。如图8所示，用抗-SEMA4D抗体处理防止12月龄YAC128小鼠中的睾丸变性。疾病和抗-SEMA4D抗体对大脑和睾丸的影响可能反映了这些组织的正常功能共同依赖于胞内肌动蛋白依赖性转运机制。

实施例3：在大鼠CNS中检验SEMA4D、丛蛋白-B1、丛蛋白-B2和CD72的表达特征

为了使得CNS中表达SEMA4D及其受体丛蛋白-B1、丛蛋白-B2和CD72的细胞类型可视化，在来自天然大鼠的冠状脊髓切片上进行共免疫组化(图9A-P)。在来自天然大鼠的脊髓切片上进行对少土胶质细胞前体细胞标志物Nkx2.2、和SEMA4D(图9A-C)、丛蛋白-B1和星形胶质细胞标志物GFAP(图9E-G)、丛蛋白-B1和CD72(图9I-K)、以及丛蛋白-B1和小胶质细胞标志物Iba1(图9M-O)的共染色。另外，所有切片用DAPI染色以使细胞核可视化(图9D、H、L和P)。使用与Olympus Ix50显微镜耦合的EXi-Aqua-14位照相机在60倍放大下对载玻片进行成像。

图9的结果显示在正常CNS内，SEMA4D在Nkx2.2-阳性少土胶质细胞前体上表达，而其受体，丛蛋白-B1、丛蛋白-B2(数据未显示)和CD72在多种细胞类型上表达并且具体主要在胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)-阳性星形胶质细胞上。

实施例4：表征CVN阿尔茨海默病小鼠模型中丛蛋白-B1和丛蛋白-B2受体的表达特征

与周龄匹配的野生型小鼠相比，纯合双源CVN AD小鼠显示出下托中典型的淀粉样病变和神经胶质活化。在阿尔茨海默病的CVN小鼠模型中检验丛蛋白-B1的表达特征。CVN(也称为APPSwDI/NOS2-/-)双源小鼠携带淀粉样前体蛋白Swedish-Dutch-Iowa突变体(APPSwDI)转基因和一氧化氮合酶2(Nos2，或诱导型NOS，iNOS)基因座的靶向“无效”突变。在41周龄时，处死CVN和野生型对照小鼠并处理用于DAB免疫组化。结果示于图10，顶部组图是野生型小鼠切片而底部组图是CVN小鼠切片。就淀粉样β1-42肽(左侧顶部和底部组图)、小胶质细胞标志物Iba1(中间顶部和底部组图)、或星形胶质细胞标志物GFAP(右侧顶部和底部组图)对切片分开染色。使用与Olympus Ix50耦合的Retiga QICAM-12位照相机在20倍放大下对载玻片进行成像。

图10中的结果显示，纯合双源CVN小鼠(APPSwDI/NOS2-/-)发展典型淀粉样病变，小胶质细胞活化以及星形胶质细胞增生(底部组图)。

与周龄匹配的野生型小鼠相比，CVN AD小鼠中活化的星形胶质细胞显示增强的丛蛋白-B1表达。在41周龄时，处死CVN和野生型对照小鼠并处理用于荧光共免疫组化(图11A)。就SEMA4D受体丛蛋白-B1和星形胶质细胞标志物GFAP、以及DAPI将切片分开染色以使细胞核可视化。在最左侧的组图中显示复合图像。使用与Olympus Ix50显微镜耦合的EXi-Aqua-14位照相机在60倍放大下对载玻片进行成像。

如图11A所示，CVN和周龄匹配的野生型小鼠的大脑内丛蛋白-B1(左侧第二组图)和GFAP-阳性星形胶质细胞(左边第三组图)的共免疫组化分析证明，如增加的GFAP标志物染色所示，星形胶质细胞活化与配准(co-registered)的丛蛋白-B1的增强表达正相关，表明SEMA4D/丛蛋白信号转导参与了星形胶质细胞活化的过程。

与周龄匹配的野生型小鼠相比，CVN AD小鼠中对SEMA4D信号转导的抑制恢复了丛蛋白-B2表达。为了确定在CVN AD小鼠中阻断SEMA4D信号转导是否会影响AD病变中早期受影响的大脑区域中丛蛋白-B1和/或其替代性关联受体丛蛋白-B2的表达，每周用30mg/kg抗-SEMA4D单克隆抗体(67-2)或对照IgG(2B8)静脉内注射26周龄的CVN和野生型对照小鼠，持续13周。在41周龄时，处死小鼠并且来自MAb-处理的小鼠的大脑组织切片用抗-丛蛋白-B1或抗-丛蛋白-B2染色以检测抗-SEMA4D处理是否改变了正在进行的AD-相关病变情况中的关联受体表达。在所有动物的下托内定量丛蛋白-B1和丛蛋白-B2-阳性信号的百分比并且标准化至总扫描下托面积。

如图11B所示，对CVN AD小鼠的抗-SEMA4D抗体处理导致丛蛋白-B2(右图)染色强度水平恢复至WT对照小鼠中定量的那些水平，但是丛蛋白-B1水平(左图)相对于周龄匹配的CVN AD对照小鼠没有显著变化。这些结果表明抗体-介导的SEMA4D抑制选择性导致丛蛋白-B2的去稳定化和/或阻止SEMA4D-驱动的前馈机制，其选择性促进丛蛋白-B2表达。

实施例5：表征YAC128亨廷顿氏病小鼠模型中丛蛋白-B2受体的表达特征

YAC128小鼠表达全长突变人亨廷顿蛋白基因(mHTT)并且准确涵盖了许多HD症状和迹象(也参见实施例2)。与周龄匹配的野生型小鼠相比，YAC128亨廷顿氏病小鼠中活化的星形胶质细胞显示增强的丛蛋白-B2表达。在12月龄时，处死YAC128小鼠和野生型对照小鼠并处理用于荧光共免疫组化(图12)。就丛蛋白-B2(丛蛋白-B2，左侧第三组图)、星形胶质细胞GFAP(左侧第二组图)和DAPI对切片共染色以使细胞核可视化。在最左侧的组图中显示复合图像。使用与Olympus Ix50显微镜耦合的EXi-Aqua-14位照相机在60倍放大下对载玻片进行成像。

如图12所示，YAC128和野生型小鼠的大脑内丛蛋白-B2和GFAP-阳性星形胶质细胞的共免疫组化分析证明星形胶质细胞活化，如增加的GFAP标志物染色所示，同样与配准的SEMA4D受体表达正相关。其最佳表征的配体是SEMA4C的丛蛋白-B2也具有对SEMA4D的中等亲和性(Azzarelli R等，An antagonistic interaction between PlexinB2 and Rnd3controls RhoA activity and cortical neuron migration(丛蛋白B2和Rnd3之间的拮抗相互作用控制RheA活性和皮质神经元迁移).Nature Commun.2014；DOI：10.1038/ncomms4405)。

实施例6：检验SEMA4D信号转导可调节星形胶质细胞功能的机制

AD和HD神经变性疾病的情况中增强的SEMA4D受体表达与星形胶质细胞活化之间的关系表明SEMA4D信号转导在星形胶质细胞功能和/或功能障碍中起作用。不希望受到理论限制，该实施例提供了证据证明SEMA4D信号转导可在响应CNS损伤期间参与星形胶质细胞功能调节，无论是来自急性或慢性刺激。得到数据支持的图解模型示于图13，其显示SEMA4D信号转导可潜在调节星形胶质细胞功能的三种机制。下文对这三种机制进行讨论。

星形胶质细胞和OPC支持的作用。丛蛋白+星形胶质细胞过程在SEMA4D+NKX2.2+少土胶质细胞前体细胞(OPC)之间交错并且提供营养支持。在CNS疾病中，活化的星形胶质细胞上调丛蛋白表达并且通过SEMA4D信号转导缩回过程。局部地，这种星形胶质细胞：OPC附近的缺失可导致降低的营养支持和增加的趋化性驱动的OPC向损伤区域的移动，同时在损伤部位缺少星形胶质细胞支持可阻止OPC分化和突触再发生。

为了测试该假设，野生型对照大鼠被处死并且脊髓经处理用于荧光共免疫组化(图14)。就SEMA4D(左侧第二组图)、星形胶质细胞标志物GFAP(左侧第三组图)和DAPI对切片共染色以使细胞核可视化(右组图)。复合图像示于最左侧的组图并且下面是虚线框显示1.67倍放大的插图。使用与Olympus Ix50显微镜耦合的EXi-Aqua-14位照相机在60倍放大下对载玻片进行成像。

如图14所示，SEMA4D-表达OPC取向为紧密靠近GFAP+星形胶质细胞过程。考虑到星形胶质细胞在促进OPC存活和功能中起到的作用，SEMA4D-表达OPC和SEMA4D受体表达星形胶质细胞的并置表明星形胶质细胞的疾病相关激活和丛蛋白-B受体及SEMA4D信号转导的相关上调可影响OPC功能。

星形胶质细胞在神经元支持中的作用。在CNS疾病中，星形胶质细胞活化导致丛蛋白表达上调，增加的SEMA4D信号转导和过程回缩，其导致神经元轴突导向丧失、营养支持减少、和/或谷氨酸摄入/释放失调。最终，根据疾病刺激的严重性，可能发生突触损失和之后的兴奋性神经元死亡。

为了确定在CVN AD小鼠中阻断SEMA4D信号转导是否会影响AD病变中早期受影响的大脑区域中突触标志物的表达，每周用30mg/kg抗-SEMA4D单克隆抗体(67-2)或对照IgG(2B8)静脉内注射26周龄的CVN和野生型对照小鼠，持续13周。在41周龄时，处死小鼠并且来自MAb-处理的小鼠的大脑组织切片用抗-生长激素抑制素抗体、抗-神经肽-Y(NPY)、抗-NPY受体1(NPY1R)、或抗-NPY受体2(NPY2R)来检测在早期AD中变性的抑制性神经元的特定亚组。对于所有动物，生长激素抑制素阳性信号的百分比在下托内定量，并且NPY-、NPY1R-、或NPY2R-阳性信号在齿状回内定量并分别标准化至总扫描的下托或齿状回面积。结果示于图15A-D。

图15A-15D显示对CVN AD小鼠的抗-SEMA4D抗体治疗导致生长激素抑制素阳性(组图A)、NPY(组图B)、和NPY2R(组图D)的染色强度水平恢复至野生型小鼠的特征水平。有趣的是，NPY1R的激动剂经报道减少紧张和焦虑，同时对NPY2R特异的拮抗剂减少紧张和焦虑(Markus Heilig.The NPY system in stress，anxiety and depression(紧张、焦虑和抑郁中的NPY系统).Neuropeptides 38(2004)213-224)。如上述图2所示，用抗-SEMA4D处理的CVN小鼠在旷场测试中显示出降低的焦虑严重性，这些发现与标准化的(较低)NPY2R水平相关，同时通过抗-SEMA4D MAb治疗使得NPY1R水平未发生变化并保持高于野生型小鼠。因此，NPY受体水平的这些变化与在抗-SEMA4D处理的CVN小鼠中观察到的减少的焦虑行为一致，这种发现还支持SEMA4D在调节体内神经传递中起到作用。值得注意的是，已经在患有阿尔茨海默病的患者的大脑皮层中报告CVN AD模型中看到的抑制性NPY神经递质的下调(Beal等，Ann.Neurol.20，282-288(1986))。

星形胶质细胞在维持血脑屏障完整性中的作用。如本文他处所述，靠近脑微血管或软膜的星形胶质细胞过程的特征是高密度的水通道，水通道蛋白4(Aqp4)。面对突触区域的星形胶质细胞过程在谷氨酸转运蛋白中富集，其中Aqp4的密度相对低。CNS疾病诱导的星形胶质细胞活化通过丛蛋白增加了SEMA4D信号转导，这导致星形胶质细胞足过程的回缩，如水通道蛋白-4的再分布所示。这导致了BBB的失调和渗透，从而促进内皮细胞炎症和之后的白细胞进入CNS。在AD情况中，Aqp4染色强度在有明显淀粉样斑块负担的区域中明显降低。

为了测量与周龄匹配的野生型小鼠比较的CVN AD小鼠中水通道蛋白-4表达特征，CVN和野生型对照小鼠在41周龄时处死并且处理用于荧光共免疫组化。结果示于图16，野生型小鼠在顶部组图并且CVN小鼠在下部组图。就水通道蛋白-4(左侧第二组图)、星形胶质细胞标志物GFAP(左侧第三组图)和DAPI对切片共染色以使细胞核可视化。在最左侧的组图中显示复合图像。使用与Olympus Ix50显微镜耦合的EXi-Aqua-14位照相机在60倍放大下对载玻片进行成像。

如图16所示，周龄匹配的CVN小鼠中的Aqp4染色揭示向弥散特征的明显偏移。这与在野生型小鼠的大脑内Aqp4和GFAP-阳性星形胶质细胞的共免疫组化分子相反，其证明下托中的Aqp4染色特征限于微血管附近的区域。Aqp4分布的变化，或极性丧失，与高星形胶质细胞活化相关，如GFAP染色中增加的强度所示。考虑到活化的星形胶质细胞中丛蛋白-B1染色中的强配准(图11)以及SEMA4D/丛蛋白-B1信号转导在细胞过程回缩中的作用，这些数据表明SEMA4D信号转导可能在疾病期间BBB界面处的星形胶质细胞极性变化中起到作用。

为了分析SEMA4D对BBB的影响，采用动态体外血脑屏障(DIV-BBB)模型。简言之，模型由含有2-4μm直径孔的毛细管的中空聚丙烯纤维组成。该纤维与脉冲泵连接，其促进介质的连续流动和实验化合物通过纤维以及内皮流动受体的正常刺激。人脑内皮细胞接种至管腔室中并且允许粘附至并包被纤维内壁，同时人星形胶质细胞接种至纤维的外表面浸泡的近腔室中。内皮细胞和星形胶质细胞穿过膜相互作用以诱导形成具有内皮细胞之间紧密连接的屏障。可通过测量跨内皮电阻(TEER)来连续监测该屏障的完整性。人脑内皮细胞接种至管腔室并使其粘附至聚丙烯纤维，并且人星形胶质细胞分开接种至纤维的近腔室表面。在峰值TEER(体外大约14天)处，以12小时间隔依次加入0.5、5、和50μg/ml的重组SEMA4D。在初始SEMA4D接触之后36小时时，加入250μg/ml对照IgG(MAb 2955；1DIV-BBB单位)或抗-SEMA4D(VX15/2503；2DIV-BBB单位)并且再测量TEER持续132小时。结果示于图17。误差线代表标准差。显示的数据代表3个独立实验，其各自证明SEMA4D和抗体对DIV-BBB完整性的类似效果。

如图17所示，BBB的破坏在加入抗-SEMA4D抗体(VX15/2503)24小时内逆转。引入对照重组蛋白质并不导致TEER的降低(数据未显示)。此外，引入对照IgG抗体(MAb 2955)并不影响SEMA4D-诱导的BBB损害。

这些数据表明CNS疾病诱导的星形胶质细胞活化通过丛蛋白-B1和/或丛蛋白-B2上调增加了SEMA4D信号转导，这导致星形胶质细胞足过程的回缩，如水通道蛋白-4的再分布所示。这导致了BBB的失调和渗透，从而促进内皮细胞炎症和之后的白细胞进入CNS。

SEMA4D信号转导在促进星形胶质细胞活化中的作用。考虑到SEMA4D受体表达和星形胶质细胞活化标志物GFAP的相关性，存在SEMA4D信号转导可增强星形胶质细胞活化的可能，从而在疾病阶段期间提供“前馈”机制。为了检验SEMA4D对星形胶质细胞活化的效果，生成大鼠胶质细胞的原代培养物并单独用SEMA4D处理或与硫代乙酰胺(TAA)预处理联用，TAA是已经显示在体内诱导丛蛋白-B1表达的熟知的肝毒性和致肝癌试剂(Lim，J.S.等，(2006).Mol.Cell.Tox.，2(2)，126-133)。大鼠原代星形胶质细胞用TAA预处理4小时，之后用可溶SEMA4D处理24小时。然后细胞固定并针对GFAP染色并以20倍放大扫描。误差线代表标准差。通过用Bonferroni多重比较检验的单因素ANOVA，“*”＝p＜0.05。

如图18A所示，在向用TAA预处理的细胞加入SEMA4D之后观察到星形胶质细胞的活化标志物GFAP的显著增强，表明SEMA4D信号转导增强了星形胶质细胞活化。

在第二组体外研究中，原代大鼠星形胶质细胞经培养并用或不用已知由CNS中的小胶质细胞产生的活化因子前列腺素D2处理，之后接触重组SEMA4D蛋白8小时或24小时。细胞经固定、处理用于鬼笔环肽(F-肌动蛋白)和DNA酶(G-肌动蛋白)组化，并且计算各处理条件的F-肌动蛋白/G-肌动蛋白面积比。误差线代表标准差。“**”＝p＜0.01，通过用Bonferroni多重比较检验的双因素ANOVA。

如图18B所示，接触重组SEMA4D的PGD2-活化的星形胶质细胞经历其肌动蛋白细胞骨架中球形向丝状转化，表明SEMA4D/丛蛋白-介导的信号转导以及升高的星形胶质细胞活化状态。

通过以上描述和相关图所示内容中呈现的教导的益处，本发明相关领域技术人员可以想到本发明的许多改良和其它实施方式。因此，应当理解本发明不仅限于所公开的具体实施方式，所述改良和其它实施方式也包括在所附权利要求书和所列实施方式的范围之内。尽管在本发明中使用了具体的术语，但是这些术语仅以通用和描述性意义使用，而不用于对本发明构成限制。

Claims (11)

1.一种药物组合物，其包含有效量的特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的分离的抗体或其抗原结合片段，用于预防或减轻有需要的对象中活性星形胶质细胞增生。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段抑制SEMA4D与SEMA4D受体或其部分的相互作用。

3.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述受体选自丛蛋白-B1、丛蛋白-B2和CD72。

4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述抗体或其片段抑制SEMA4D-介导的丛蛋白-B1信号转导。

5.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述抗体或其片段包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，可变重链(VH)含有VHCDR 1-3且可变轻链(VL)含有VLCDR 1-3，其中VHCDR1-3分别包含SEQ ID NO：6、7和8，VLCDR 1-3分别包含SEQ ID NO：14、15和16。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述VH和VL氨基酸序列分别包含SEQID NO：9和SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：18。

7.如权利要求1-6中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述分离的抗体或其抗原结合片段与参照单克隆抗体结合相同的SEMA4D表位，所述参照单克隆抗体包含重链可变区(VH)氨基酸序列SEQ ID NO：9和轻链可变区(VL)氨基酸序列SEQ ID NO：17。

8.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述分离的抗体或其片段竞争性抑制参照单克隆抗体与SEMA4D的结合，所述参照单克隆抗体包含重链可变区(VH)氨基酸序列SEQ ID NO：9和轻链可变区(VL)氨基酸序列SEQ ID NO：17。

9.如权利要求1-9中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述对象是人。

10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述对象患有阿尔茨海默病或早期阿尔茨海默病。

11.如权利要求1-10中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述抗体调节星形胶质细胞介导的突触活性，从而防止神经细胞死亡。