BR112016009047B1

BR112016009047B1 - Uso de uma quantidade eficaz de um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à semaforina-4d para aliviar os sintomas em um indivíduo que possui doença de huntington

Info

Publication number: BR112016009047B1
Application number: BR112016009047-0A
Authority: BR
Inventors: Ernest S. Smith; Maurice Zauderer; William J. Bowers; Alan Jonason
Original assignee: Vaccinex, Inc
Priority date: 2013-10-21
Filing date: 2014-10-21
Publication date: 2024-02-06
Also published as: CA2927841A1; JP2019059786A; PL3060252T3; IL295045B2; US20170198053A1; CN106029093A; EP3060252A1; BR112016009047A2; US20150110800A1; IL295045B1; KR20160065981A; AU2014340210B2; JP2017502920A; JP6461944B2; PT3060252T; DK3060252T3; SG11201603167YA; IL245089B; US20150353641A1; KR20210118246A

Abstract

uso de moléculas de ligação à semaforina-4d para tratar transtornos neurodegenerativos. métodos para aliviar sintomas em um sujeito que apresenta um transtorno neurodegenerativo, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação isolada que se liga especificamente à semaforina-4d (sema4d) ou aos seus receptores de plexina-b1 ou plexina-b2, são fornecidos neste relatório.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001]Este Pedido de Patente Internacional reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. No 62/012.805, depositado em 16 de Junho de 2014, Pedido Provisório U.S. No 61/979.384, depositado em 14 de Abril de 2014 e Pedido Provisório U.S. No 61/893.814, depositado em 21 de Outubro de 2013, os conteúdos dos quais são integralmente incorporados como referência neste relatório.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS ELETRONICAMENTE APRESENTADA

[002]O conteúdo da listagem de sequências eletronicamente apresentada no arquivo de texto ASCII (Nome 58008 - 137466seq-lstg.txt; Tamanho: 32.256 bytes; e Data da Criação: 20 de Outubro de 2014) depositado com o pedido é integralmente incorporado como referência neste relatório.

FUNDAMENTOS DA DIVULGAÇÃO

[003]Semaforina 4D (SEMA4D), também conhecida como CD100, é uma pro-teína transmembrana (por exemplo, SEQ ID NO: 1 (humana); SEQ ID NO: 2 (murino)) que pertence à família do gene da semaforina. SEMA4D é expressa na superfície celular como um homodímero, mas, após a ativação celular, SEMA4D pode ser libe-rada a partir da superfície celular por intermédio de clivagem proteolítica para gerar sSEMA4D, uma forma solúvel da proteína, que também é biologicamente ativa. Veja Suzuki et al., Nature Rev. Immunol. 3:159 - 167 (2003); Kikutani et al., Nature Immunol. 9:17 - 23 (2008).

[004]SEMA4D é expressa em altos níveis em órgãos linfoides, incluindo o baço, timo e linfonodos e em órgãos não linfoides, tais como o cérebro, coração e rim.Em órgãos linfoides, SEMA4D é abundantemente expressada em células T em re-pouso, mas apenas fracamente expressada em células B em repouso e células apre-sentadoras de antígeno (CAAs), tais como células dendríticas (CDs). Sua expressão, entretanto, é suprarregulada nestas células após a ativação através de vários estímu-los imunológicos. A liberação de SEMA4D solúvel a partir de células imunes também é aumentada através de ativação celular.

[005]SEMA4D foi implicada no desenvolvimento de transtornos neurodegene- rativos, doenças autoimunes, doenças desmielinizantes e certos cânceres. Entretanto, o efeito do bloqueio da sinalização de SEMA4D sobre a organização e função do sistema nervoso central (SNC), incluindo cérebro e medula espinhal e sobre comportamentos controlados pelo SNC ainda não foi elucidado. Isto é importante pelo fato de que mudanças no SNC apresentam uma profunda influência sobre um comportamento e qualidade de vida do sujeito. Em particular, tais mudanças podem impactar um comportamento neuropsiquiátrico, comportamento cognitivo e habilidades motoras do sujeito. Portanto existe uma necessidade quanto a tratamentos para transtornos neurodegenerativos que possam aliviar os sintomas associados com o transtorno.

BREVE SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO

[006]Métodos para usar moléculas de ligação à semaforina 4D para aliviar os sintomas em um sujeito que apresenta transtornos neurodegenerativos são divulga-dos neste relatório. De acordo com os aspectos da divulgação ilustrada neste relatório, é fornecido um método para melhorar os sintomas em um sujeito com um transtorno neurodegenerativo, incluindo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação isolada que se liga especificamente à semaforina 4D (SEMA4D) e inibe, suprime, previne, reverte ou reduz o efeito de SEMA4D.

[007]De acordo com os aspectos ilustrados neste relatório, é fornecido um método para tratar um sujeito com um transtorno neurodegenerativo, incluindo admi-nistrar ao sujeito uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação isolada que se liga especificamente à semaforina 4D (SEMA4D) em que a ligação à SEMA4D atua para melhorar os sintomas associados com o transtorno.

[008]Métodos para aliviar os sintomas em um sujeito que apresenta um trans-torno neurodegenerativo são fornecidos, compreendendo administrar a tal sujeito uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação isolada que se liga especificamente à semaforina-4D (SEMA4D). Em certas formas de realização dos métodos, a molécula de ligação inibe a interação de SEMA4D com seu receptor ou com uma porção de seu receptor. Em certas formas de realização dos métodos, o receptor é selecionado a partir do grupo que consiste em Plexina-B1 e Plexina-B2. Em certas formas de realização dos métodos, a molécula de ligação inibe a transdução de sinal de Plexina-B1 mediada por SEMA4D. Em certas formas de realização dos métodos, a molécula de ligação isolada se liga especificamente ao mesmo epítopo de SEMA4D como um anticorpo monoclonal de referência selecionado a partir do grupo que consiste de VX15/2503 ou 67. Em certas formas de realização dos métodos, a molécula de ligação isolada inibe competitivamente um anticorpo monoclonal de referência selecionado a partir do grupo que consiste de VX15/2503 ou 67 a partir da ligação específica à SEMA4D. Em certas formas de realização dos métodos, a molécula de ligação isolada compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em certas formas de realização dos métodos, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é o anticorpo monoclonal VX15/2503 ou 67. Em certas formas de realização dos métodos, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada variável (VH) compreendendo VHCDRs 1 a 3 compreendendo a SEQ ID NOs 6, 7 e 8, respectivamente e uma cadeia leve variável (VL) compreendendo VLCDRs 1 a 3 compreendendo a SEQ ID NOs 14, 15 e 16, respectivamente. Em certas formas de realização dos métodos, a VH e a VL compreendem, respectivamente, a SEQ ID NO: 9 e a SEQ ID NO: 17 ou a SEQ ID NO: 10 e a SEQ ID NO: 18. Em certas formas de realização de qualquer um entre os métodos anteriormente mencionados, o transtorno neurodegenerativo é selecionado a partir de um grupo que consiste de doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, síndrome de Down, ataxia, esclerose lateral amiotrófica (ELA), demência frontotemporal (DFT), disfunção cognitiva relacionada ao HIV, Lúpus do SNC, perda cognitiva leve ou uma combinação dos mesmos. Em certas formas de realização de qualquer um entre os métodos anteriormente mencionados, o transtorno neurodege- nerativo é doença de Alzheimer ou doença de Huntington. Em certas formas de reali-zação de qualquer um entre os métodos anteriormente mencionados, os sintomas são selecionados a partir de um grupo que consiste em sintomas neuropsiquiátricos, sintomas cognitivos, disfunção motora e qualquer combinação dos mesmos. Em certas formas de realização de qualquer um entre os métodos anteriormente mencionados, os sintomas neuropsiquiátricos são selecionados a partir de um grupo que consiste em redução do comportamento do tipo ansiedade, melhora da memória espacial, aumento da locomoção e qualquer combinação dos mesmos.

[009]Os métodos para aliviar os sintomas em um sujeito que apresenta um transtorno neurodegenerativo são fornecidos, compreendendo administrar a tal sujeito uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação isolada que se liga especificamente à SEMA4D em que a molécula de ligação inibe competitivamente um anticorpo monoclonal de referência selecionado a partir do grupo que consiste de VX15/2503 ou 67 a partir da ligação específica à SEMA4D. Em certas formas de realização dos métodos, a molécula de ligação inibe a interação de SEMA4D com seu receptor ou com uma porção de seu receptor. Em certas formas de realização dos métodos, o receptor é selecionado a partir do grupo que consiste em Plexina-B1 e Plexina-B2. Em certas formas de realização dos métodos, a molécula de ligação inibe a transdução de sinal de Plexina-B1 mediada por SEMA4D. Em certas formas de realização dos métodos, a molécula de ligação isolada compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em certas formas de realização dos métodos, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é o anticorpo monoclonal VX15/2503 ou 67. Em certas formas de realização dos métodos, o anticorpo ou frag-mento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada variável (VH) compreendendo VHCDRs 1 a 3 compreendendo a SEQ ID NOs 6, 7 e 8, respec-tivamente e uma cadeia leve variável (VL) compreendendo VLCDRs 1 a 3 compreen-dendo a SEQ ID NOs 14, 15 e 16, respectivamente. Em certas formas de realização dos métodos, a VH e a VL compreendem, respectivamente, a SEQ ID NO: 9 e a SEQ ID NO: 17 ou a SEQ ID NO: 10 e a SEQ ID NO: 18. Em certas formas de realização de qualquer um entre os métodos anteriormente mencionados, o transtorno neurode- generativo é selecionado a partir de um grupo que consiste de doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, síndrome de Down, ataxia, esclerose lateral amiotrófica (ELA), demência frontotemporal (DFT), disfunção cognitiva relacio-nada ao HIV, Lúpus do SNC, perda cognitiva leve ou uma combinação dos mesmos. Em certas formas de realização de qualquer um entre os métodos anteriormente mencionados, o transtorno neurodegenerativo é doença de Alzheimer ou doença de Huntington. Em certas formas de realização de qualquer um entre os métodos anteriormente mencionados, os sintomas são selecionados a partir de um grupo que consiste em sintomas neuropsiquiátricos, sintomas cognitivos, disfunção motora e qualquer combinação dos mesmos. Em certas formas de realização de qualquer um entre os métodos anteriormente mencionados, os sintomas neuropsiquiátricos são selecionados a partir de um grupo que consiste em redução do comportamento do tipo ansiedade, melhora da memória espacial, aumento da locomoção e qualquer combinação dos mesmos

[010]Métodos adicionais para tratar um sujeito que apresenta um transtorno neurodegenerativo ou neuroinflamatório ou para efetuar um resultado desejável em um sujeito que apresenta um transtorno neurodegenerativo ou neuroinflamatório são fornecidos neste relatório. Métodos para tratar um sujeito que apresenta um transtorno neurodegenerativo são fornecidos, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação isolada que se liga especificamente à se- maforina-4D (SEMA4D) em que a ligação à SEMA4D atua para aliviar os sintomas associados com o transtorno. Métodos para promover a mielinação em um sujeito que apresenta um transtorno neurodegenerativo são fornecidos, compreendendo administrar a tal sujeito uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação isolada que se liga especificamente à SEMA4D em que a molécula de ligação modula a atividade mediada por astrócitos da função oligodendrócitos-mielina. Métodos para prevenir a morte celular neural em um sujeito que apresenta um transtorno neurodegenerativo são fornecidos, compreendendo administrar a tal sujeito uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação isolada que se liga especificamente à SEMA4D em que a molécula de ligação modula a atividade sináptica mediada por astrócitos. Métodos para prevenir a lesão à barreira sangue-cérebro em um sujeito que apresenta um transtorno neuroinflamatório ou neurodegenerativo são fornecidos, compreendendo administrar a tal sujeito uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação isolada que se liga especificamente à SEMA4D em que a molécula de ligação modula a manutenção mediada por astrócitos da integridade da barreira sangue-cérebro. Métodos para prevenir a ativação de astrócitos em um sujeito que apresenta, determinado a apresentar ou suspeito de apresentar um transtorno neuroinflamatório ou neurodege- nerativo são fornecidos, compreendendo administrar a tal sujeito uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação isolada que se liga especificamente à SEMA4D em que a molécula de ligação modula a manutenção mediada por astrócitos da integridade da barreira sangue-cérebro. Métodos para manter ou restaurar o suporte trófico mediado por astrócitos de células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) em um sujeito que apresenta, determinado a apresentar ou suspeito de apresentar um transtorno neuroinflamatório ou neurodegenerativo são fornecidos, compreendendo administrar a tal sujeito uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação isolada que se liga especificamente à SEMA4D em que a molécula de ligação previne a retração de processos de astrócitos e movimento quimiotático de OPCs em direção às regiões de dano. Métodos para proteger os neurônios inibitórios da degeneração em doença de Alzheimer precoce são fornecidos, compreendendo administrar a um sujeito que apresenta, determinado a apresentar ou suspeito de apresentar doença de Alzheimer precoce uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação isolada que se liga especificamente à SEMA4D em que a molécula de ligação restaura o número de neurônios positivos para somatostatina, neurônios NYP-positivos ou ambos no sujeito. Em certas formas de realização dos métodos anteriormente mencionados, a molécula de ligação inibe a interação de SEMA4D com seu receptor ou com uma porção de seu receptor. Em certas formas de realização dos métodos anteriormente mencionados, o receptor é selecionado a partir do grupo que consiste em Plexina-B1 e Plexina-B2. Em certas formas de realização dos métodos anteriormente mencionados, a molécula de ligação inibe a transdução de sinal de Plexina-B1 mediada por SEMA4D. Em certas formas de realização dos métodos anteriormente mencionados, a molécula de ligação isolada se liga especificamente ao mesmo epítopo de SEMA4D como um anticorpo monoclonal de referência selecionado a partir do grupo que consiste de VX15/2503 ou 67. Em certas formas de realização dos métodos anteriormente mencionados, a molécula de ligação isolada inibe competitivamente um anticorpo monoclonal de referência selecionado a partir do grupo que consiste de VX15/2503 ou 67 a partir da ligação específica à SEMA4D. Em certas formas de realização dos métodos anteriormente mencionados, a molécula de ligação isolada compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em certas formas de realização dos métodos anteriormente mencionados, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é o anticorpo monoclonal VX15/2503 ou 67. Em certas formas de realização dos métodos anteriormente mencionados, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada variável (VH) compreendendo VHCDRs 1 a 3 compreendendo a SEQ ID NOs 6, 7 e 8, respectivamente e uma cadeia leve variável (VL) compreendendo VLCDRs 1 a 3 compreendendo a SEQ ID NOs 14, 15 e 16, respectivamente. Em certas formas de realização dos métodos anteriormente mencionados, a VH e a VL compreendem, respectivamente, a SEQ ID NO: 9 e a SEQ ID NO: 17 ou a SEQ ID NO: 10 e a SEQ ID NO: 18. Em certas formas de realização dos métodos anteriormente mencionados, o transtorno neurodegenerativo é selecionado a partir de um grupo que consiste de doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, síndrome de Down, ataxia, esclerose lateral amiotrófica (ELA), demência frontotemporal (DFT), disfunção cognitiva relacionada ao HIV, Lúpus do SNC, perda cognitiva leve ou uma combinação dos mesmos. Em certas formas de realização dos métodos anteriormente mencionados, o transtorno neurodegenerativo é doença de Alzheimer ou doença de Huntington. Em certas formas de realização dos métodos anteriormente mencionados, sintomas do sujeito que são aliviados pelos métodos são selecionados a partir de um grupo que consiste em sintomas neuropsiquiá- tricos, sintomas cognitivos, disfunção motora e qualquer combinação dos mesmos. Em certas formas de realização dos métodos anteriormente mencionados, os sintomas neuropsiquiátricos do sujeito que são aliviados pelos métodos são selecionados a partir de um grupo que consiste em redução do comportamento do tipo ansiedade, melhora da memória espacial, aumento da locomoção e qualquer combinação dos mesmos. Em certas formas de realização dos métodos anteriormente mencionados, o sujeito é determinado a apresentar o transtorno neurodegenerativo através do processamento de uma amostra ou imagem a partir do sujeito.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS/FIGURAS

[011]FIGURA 1: Esquema do protocolo experimental descrito nos Exemplos.

[012]FIGURAS 2: Modelo de CVN in vivo medindo o comportamento do tipo ansiedade em camundongos CVN tratados com anticorpo anti-SEMA4D (“MAb 67”) ou isotipo controle (“MAb 2B8”). Locomoção total (FIG. 2A) e locomoção no centro do campo aberto (FIG. 2B).

[013]FIGURA 3: Modelo de CVN in vivo medindo a memória espacial em um labirinto radial aquático (FIG. 3A), camundongos CVN tratados com anticorpo anti- SEMA4D (“MAb 67”) ou isotipo controle (FIG. 3B).

[014]FIGURA 4: Modelo de CVN in vivo medindo a densidade de sinapses GABAérgicas e concentração de transportador de GABA vesicular (VGAT) em camundongos CVN tratados com anticorpo anti-SEMA4D (“MAb 67”) ou isotipo controle. Vesículas VGAT positivas (FIG. 4A) e nível de intensidade de pigmentação de VGAT por vesícula (FIG. 4B).

[015]FIGURA 5: Modelo de YAC128 in vivo medindo o comportamento do tipo ansiedade em camundongos tratados com anticorpo anti-SEMA4D (“MAb 67”) e iso- tipo controle. Entradas (FIG. 5A) e tempo gasto no centro do campo (FIG. 5B).

[016]FIGURA 6: Modelo de YAC128 in vivo medindo a memória espacial em camundongos tratados com anticorpo anti-SEMA4D (“MAb 67”) e isotipo controle. Painel A = Experimento 1 (FIG. 6A) e Painel B = Experimento 2 (FIG. 6B).

[017]FIGURA 7: Modelo de YAC128 in vivo medindo volume cortical (FIG. 7A) e de corpo caloso (FIG. 7B) em camundongos tratados com anticorpo anti-SEMA4D (“MAb 67”) ou isotipo controle.

[018]FIGURA 8: Modelo de YAC128 in vivo medindo a degeneração testicular em camundongos tratados com anticorpo anti-SEMA4D (“MAb 67”) ou isotipo controle.

[019]FIGURA 9A-P: Análise imuno-histoquímica de tipos celulares expres-sando SEMA4D, plexina-B1 e CD72 em medula espinhal normal de rato. Nkx2.2 (painel B) é um marcador de células precursoras de oligodendrócitos, proteína de ácido fibrilar glial (GFAP) (painel G) é um marcador celular astrocítico e Iba1 (painel N) é um marcador celular microglial. Os painéis A e, I e M mostram imagens fundidas e os painéis D, H, L e P mostram as mesmas seções pigmentadas com DAPI para visualizar núcleos celulares.

[020]FIGURA 10: Análise imuno-histoquímica de DAB de patologia amiloide e ativação glial em camundongos normais (três painéis superiores) e CVN (três painéis inferiores). As seções de subículo foram pigmentadas para amiloide-beta 1 a 42 (painéis esquerdos), marcador celular microglial Iba1 (painéis centrais) e marcador celular astrocítico GFAP.

[021]FIGURAS 11A-11B: Caracterização e padrões de expressão de recepto-res de plexina-B1 e plexina-B2 no modelo de camundongo CVN doença de Alzheimer. A FIG. 11A mostra a análise imuno-histoquímica da expressão de plexina-B1 em camundongos normais (painéis superiores) e CVN (painéis inferiores). Seções do cérebro foram pigmentadas para plexina-B1 e GFAP, assim como DAPI para visualizar núcleos celulares. A FIG. 11B mostra os níveis de expressão de plexina-B1 (gráfico esquerdo) e plexina-B2 (gráfico direito) após a inibição da sinalização de SEMA4D.

[022]FIGURA 12: Análise imuno-histoquímica da expressão de plexina-B2 em camundongos normais (painéis superiores) e YAC128 (painéis inferiores). Seções do cérebro foram pigmentadas para plexina-B2 e GFAP, assim como DAPI para visualizar núcleos celulares.

[023]FIGURA 13: Representação esquemática que os papéis da sinalização de SEMA4D podem desempenhar na regulação da função de astrócitos na saúde e doença. Painel Esquerdo: Processos astrocíticos de plexina+ (região sombreada da superfície exterior do astrócito) se adequam entre células precursoras de oligodendró- citos (OPCs) de SEMA4D+ NIKX2.2+ e fornecem suporte trófico (SEMA4D+ mostrada como região sombreada da superfície exterior de OPC). Na doença do SNC, astrócitos ativados suprarregulam a expressão de Plexina e retraem os processos por intermédio da sinalização de SEMA4D. Localmente, isto resulta em suporte trófico diminuído e movimento de OPC acionado por quimiotaxia aumentado em direção às regiões de dano enquanto a falta de suporte astrocítico no sítio da lesão impede a remielinação. Painel Central: Na doença do SNC, a ativação astrocítica leva à suprarregulação da expressão de Plexina (região sombreada da superfície exterior do astrócito), sinaliza-ção de SEMA4D aumentada e retração de processo, o que resulta em uma perda de orientação de axônio neuronal, suporte trófico diminuído e/ou absorção/liberação de glutamato desregulada. Em última análise, dependendo da severidade do estímulo da doença, perda de sinapse e subsequente morte de neurônio excitotóxico podem ocorrer. Painel Direito: Ativação de astrócitos induzida por doença do SNC aumenta a sinalização de SEMA4D através de Plexina (região sombreada da superfície exterior do astrócito), o que leva a uma retração de processos de raiz astrocítica, conforme evidenciado pela redistribuição de aquaporina-4. Isto resulta na desregulação e permeabilidade da BSC, desse modo, facilitando inflamação endotelial e entrada de leucócitos subsequente no SNC.

[024]FIGURA 14: Análise imuno-histoquímica mostrando OPCs expressando SEMA4D orientadas em associação próxima com processos astrocíticos de GFAP+ em ratos normais. Seções do cérebro foram pigmentadas para SEMA4D (OPCs) e GFAP (astrócitos), assim como DAPI para visualizar núcleos celulares.

[025]FIGURA 15 A, B, C, D: Modelo de CVN in vivo medindo a sinalização positiva de somatostatina-(painel A), neuropeptídeo-Y (NPY)-(painel B), receptor 1 de NPY (NPY1R) (painel C) ou receptor 2 de NPY (NPY2R) (painel D) dentro do subículo ou giro denteado, respectivamente em camundongos CVM tratados com anticorpo anti-SEMA4D (“MAb 67”) ou isotipo controle. Barras de erro indicam erro padrão. “*” = p<0,05 e “***” = p<0,005 através de ANOVA unilateral com Teste de Comparação Múltipla de Bonferroni.

[026]FIGURA 16: Análise imuno-histoquímica dos padrões de expressão de aquaporina-4 em camundongos normais e CVN.

[027]FIGURA 17: Modelo de DIV-BSC in vitro medindo a integridade da bar-reira sangue-cérebro após a adição do anticorpo monoclonal anti-SEMA4D VX15/2503.

[028]FIGURAS 18A-18B: análise imunocitoquímica mostrando a ativação de astrócitos em astrócitos de rato. A FIG. 18A mostra a análise imunocitoquímica da ativação de astrócitos, conforme refletido no aumento relativo na área GFAP positiva em astrócitos de rato cultivados tratados com SEMA4D em isolamento ou após o pré- tratamento com tioacetamida (TAA). A FIG. 18B mostra a análise imunocitoquímica da ativação de astrócitos, conforme refletido na razão de F-actina para G-actina em astrócitos de rato cultivados tratados com SEMA4D em isolamento ou em combinação com prostaglandina D2. Barras de erro representam o desvio padrão. “*” = P<0,05 através de ANOVA unilateral com Teste de Comparação Múltipla de Bonferroni.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA DIVULGAÇÃO I. DEFINIÇÕES

[029]Deve ser observado que o termo “um” ou “uma” entidade se refere a uma ou mais de tal entidade; por exemplo, “um anticorpo anti-SEMA4D” é entendido representar um ou mais anticorpos anti-SEMA4D. Como tal, os termos “um” (ou “uma”), “um ou mais” e “pelo menos um” podes ser permutavelmente usados neste relatório.

[030]Além disso, “e/ou”, onde usados neste relatório, devem ser entendidos como divulgação específica de cada uma entre as duas características ou componentes especificados com ou sem o outro. Assim, o termo e/ou”, conforme usado em uma frase, tal como “A e/ou B” neste relatório é intencionado a incluir “A e B”, “A ou B”, “A” (sozinho) e “B” (sozinho). Do mesmo modo, o termo “e/ou”, conforme usado em uma frase, tal como “A, B e/ou C” é intencionado a abranger cada uma entre as seguintes formas de realização: A, B e C; A, B ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (sozinho); B (sozinho); e C (sozinho).

[031]A menos que de outro modo definido, termos técnicos e científicos usa-dos neste relatório apresentam o mesmo significado daquele comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica a qual esta divulgação está relacio-nada. Por exemplo, o Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2a ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3o ed., 1999, Academic Press; e o Oxford Dictionary Of Biochemistry and Molecular Bio-logy, Revisado, 2000, Oxford University Press, fornecem a uma pessoa de habilidade na técnica um dicionário geral de muitos entre estes termos usados nesta divulgação.

[032]Unidades, prefixos e símbolos são denotados em sua forma aceita no Système International de Unites (SI). Faixas numéricas são inclusivas dos números que definem a faixa. A menos que de outro modo indicado, sequências de aminoáci- dos são escritas da esquerda para a direita na orientação amino a carbóxi. Os títulos fornecidos neste relatório não são limitações dos vários aspectos da divulgação, que podem ser feitos como referência ao relatório descritivo como um todo. Consequente-mente, os termos imediatamente definidos abaixo são mais completamente definidos como referência integral ao relatório descritivo.

[033]Conforme usado neste relatório, o termo substância, composição enti-dade “de ocorrência não natural” e/ou qualquer combinação de substâncias, compo-sições ou entidades ou quaisquer variantes gramaticais das mesmas, é um termo condicional que explicitamente exclui, mas apenas exclui, aquelas formas da substância, composição entidade e/ou qualquer combinação de substâncias, composições ou entidades que são bem entendidas por pessoas de habilidade comum na técnica como de “ocorrência natural” ou que são ou podem ser em qualquer momento determinadas ou interpretadas por um técnico ou um corpo administrativo ou técnico como aquelas de “ocorrência natural”.

[034]Conforme usado neste relatório, o termo “transtorno neurodegenerativo” ou “doença neurodegenerativa” se refere a um transtorno do sistema nervoso central (SNC) que é caracterizado pela morte de neurônios em uma ou mais regiões do sis-tema nervoso e o dano funcional subsequente das partes afetadas. Exemplos de transtornos neurodegenerativos incluem, sem limitação, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, síndrome de Down, ataxia, esclerose lateral amiotrófica (ELA), demência frontotemporal (DFT), disfunção cognitiva relacionada ao HIV (HAND, Transtorno Neurocognitivo Associado ao HIV), Lúpus do SNC e perda cognitiva leve. Doenças neurodegenerativas apresentam um enorme impacto sobre as vidas de indivíduos afetados e suas famílias, assim como sobre a sociedade como um todo.

[035]Conforme usado neste relatório, o termo “doença de Alzheimer” se refere a uma doença progressiva que inicialmente se manifesta por si só com amnésia parcial e, mais tarde, inquietação, desorientação, afasia, agnosia ou apraxia (declínio cognitivo), demência e, algumas vezes, euforia ou depressões. A doença, tipicamente, inicia entre 40 a 90 anos de idade e, predominantemente, afeta fêmeas. Quanto à sua prevalência, as estimativas são de cerca de 13 % da população acima de 65 anos de idade.

[036]Conforme usado neste relatório, o termo “Doença de Huntington” se re-fere a uma doença neurodegenerativa que ocorre devido à expansão de um trato de poli-glutamina no N-terminal da proteína huntingtin (expressada pelo gene HTT) onde a expansão pode ser maior do que 35 a 40 repetições do aminoácido glutamina na proteína mutante (mHTT). A doença se apresenta com morte neuronal progressiva em áreas diferentes do cérebro, incluindo toxicidade nos neurônios espinhosos mé-dios do estriado que determina o aparecimento da falta de coordenação e movimentos motores clássicos, tais como “Coreia”. O mecanismo de ação de mHTT foi descrito como ganho e perda de função em comparação com a proteína do tipo selvagem e envolve a aquisição ou perda de competência para interagir com várias proteínas em compartimentos celulares diferentes.

[037]O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere a uma quanti-dade de um anticorpo, polipeptídeo, polinucleotídeo, molécula orgânica pequena ou outro fármaco eficaz para “tratar” uma doença ou transtorno em um sujeito ou mamí-fero. No caso de um transtorno neurodegenerativo, a quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco pode aliviar os sintomas do transtorno; diminuir, reduzir, retardar ou interromper a incidência dos sintomas; diminuir, reduzir, retardar a severidade dos sintomas; inibir, por exemplo, suprimir, retardar, prevenir, interromper ou reverter a manifestação dos sintomas; aliviar, em algum grau, um ou mais entre os sintomas associados com o transtorno; reduzir morbidez e mortalidade; melhorar a qualidade de vida; ou uma combinação de tais efeitos.

[038]O termo “sintomas”, conforme referido neste relatório, se refere, por exemplo, aos 1) sintomas neuropsiquiátricos, 2) sintomas cognitivos e 3) disfunção motora. Exemplos de sintomas neuropsiquiátricos incluem, por exemplo, comporta-mento do tipo ansiedade. Exemplos de sintomas cognitivos incluem, por exemplo, déficits de aprendizagem e memória. Exemplos de disfunção motora incluem, por exemplo, locomoção.

[039]Termos, tais como “tratar” ou “tratamento” ou “para tratar” ou “aliviar” ou “para aliviar” ou “melhorar” ou “para melhorar” se referem às 1) medidas terapêuticas que curam, diminuem, reduzem os sintomas de, revertem e/ou interrompem a pro-gressão de uma condição ou transtorno patológico diagnosticado e 2) medidas profi-láticas ou preventivas que previnem e/ou reduzem o desenvolvimento de uma condi-ção ou transtorno patológico alvejado. Assim, aqueles em necessidade de tratamento incluem aqueles que já apresentam o transtorno; aqueles propensos a apresentar o transtorno; e aqueles nos quais o transtorno deve ser prevenido. Resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não são limitados ao alívio dos sintomas, dimi-nuição do grau da doença, estabilização (isto é, não piora) do estado da doença, re-tardo ou redução da progressão da doença, melhora ou paliação do estado e remissão da doença (se parcial ou total), se detectável ou não detectável. “Tratamento” também pode significar prolongamento da sobrevivência em comparação à sobrevivência esperada sem o tratamento. Aqueles em necessidade de tratamento incluem aqueles que já apresentam a condição ou transtorno, assim como aqueles propensos a apresentar a condição ou transtorno ou aqueles nos quais a condição ou transtorno deve ser prevenido.

[040]“Sujeito” ou “indivíduo” ou “animal” ou “paciente” ou “mamífero” significa qualquer sujeito, particularmente, um mamífero, para quem o diagnóstico, prognóstico ou terapia é desejado. Mamíferos incluem seres humanos, animais domésticos, animais de criação e zoológico, animais de esportes ou estimação, tais como cães, ga- tos,porquinhos da índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, bois, vacas, ursos e assim por diante.

[041]Conforme usado neste relatório, as frases, tais como “um sujeito que se beneficiaria da administração de um anticorpo anti-SEMA4D” e “um animal em necessidade de tratamento” inclui sujeitos, tais como mamíferos, que se beneficiariam da administração de um anticorpo anti-SEMA4D ou outra molécula de ligação à SEMA4D usada, por exemplo, para a detecção de um polipeptídeo de SEMA4D (por exemplo, para um procedimento de diagnóstico) e/ou a partir do tratamento, isto é, paliação ou prevenção de uma doença, com um anticorpo anti-SEMA4D ou outra molécula de ligação à SEMA4D.

[042]A “molécula de ligação” ou “molécula de ligação ao antígeno” da presente divulgação se refere em seu sentido mais amplo a uma molécula que se liga especificamente a um determinante antigênico. Em uma forma de realização, a molécula de ligação se liga especificamente à SEMA4D, por exemplo, a um polipeptídeo de SEMA4D transmembrana de cerca de 150 kDa ou um polipeptídeo de SEMA4D solúvel de cerca de 120 kDa (comumente referido como sSEMA4D). Em uma outra forma de realização, uma molécula de ligação da divulgação é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em uma outra forma de realização, uma molécula de ligação da divulgação compreende pelo menos uma CDR de cadeia pesada ou leve de uma molécula de anticorpo. Em uma outra forma de realização, uma molécula de ligação da divulgação compreende pelo menos duas CDRs a partir de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em uma outra forma de realização, uma molé-cula de ligação da divulgação compreende pelo menos três CDRs a partir de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em uma outra forma de realização, uma molécula de ligação da divulgação compreende pelo menos quatro CDRs a partir de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em uma outra forma de realização, uma molécula de ligação da divulgação compreende pelo menos cinco CDRs a partir de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em uma outra forma de realização, uma molécula de ligação da divulgação compreende pelo menos seis CDRs a partir de uma ou mais moléculas de anticorpo.

[043]A presente divulgação é dirigida a um método para aliviar os sintomas em um sujeito que apresenta um transtorno neurodegenerativo, compreendendo ad-ministrar ao sujeito uma molécula de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo. A menos que referência específica seja feita aos anticorpos de comprimento total, tais como anticorpos de ocorrência natural, o termo “anticorpo anti-SEMA4D” abrange anticorpos de comprimento total, assim como fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, análogos ou derivados de tais anticorpos, por exemplo, anticorpo de ocorrência natural ou moléculas de imunoglobulina ou moléculas de anticorpo construídas ou fragmentos que se ligam ao antígeno em uma maneira similar às moléculas de anticorpo.

[044]Conforme usado neste relatório, anticorpos “humanos” ou “completa-mente humanos” incluem anticorpos que apresentam a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados a partir de bibliotecas de imunoglobulina humana ou a partir de animais transgênicos para uma ou mais imuno- globulinas humanas e que não expressam imunoglobulinas endógenas, conforme descrito abaixo e, por exemplo na Patente U.S. No 5.939.598 por Kucherlapati et al. Anticorpos “humanos” ou “completamente humanos” também incluem anticorpos compreendendo pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada ou pelo menos os domínios variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve, onde os domínios vari-áveis apresentam a sequência de aminoácidos de domínios variáveis de imunoglobu- lina humana.

[045]Anticorpos “humanos” ou “completamente humanos” também incluem anticorpos “humanos” ou “completamente humanos”, conforme descrito acima, que compreendem, consistem essencialmente de ou consistem de variantes (incluindo derivados) de moléculas de anticorpo (por exemplo, as regiões VH e/ou regiões VL) descritas neste relatório, em que os anticorpos ou fragmentos do mesmo se ligam imuno- especificamente a um polipeptídeo de SEMA4D ou fragmento ou variante do mesmo. Técnicas padrão conhecidas àqueles de habilidade na técnica podem ser usadas para introduzir mutações na sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo anti- SEMA4D humano, incluindo, mas não limitadas à mutagênese sítio-dirigida e muta- gênese mediada por PCR que resultam em substituições de aminoácidos. Em algumas formas de realização, as variantes (incluindo derivados) codificam menos do que 50 substituições de aminoácidos, menos do que 40 substituições de aminoácidos, menos do que 30 substituições de aminoácidos, menos do que 25 substituições de ami- noácidos, menos do que 20 substituições de aminoácidos, menos do que 15 substituições de aminoácidos, menos do que 10 substituições de aminoácidos, menos do que 5 substituições de aminoácidos, menos do que 4 substituições de aminoácidos, menos do que 3 substituições de aminoácidos ou menos do que 2 substituições de aminoácidos em relação à região VH de referência, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, região VL, VLCDR1, VLCDR2 ou VLCDR3.

[046]Em certas formas de realização, as substituições de aminoácidos são substituições de aminoácidos conservativas debatidas abaixo. Alternativamente, as mutações podem ser aleatoriamente introduzidas ao longo de toda ou parte da se-quência codificante, tal como através de mutagênese por saturação e os mutantes resultantes podem ser triados quanto à atividade biológica para identificar mutantes que conservam a atividade (por exemplo, a capacidade de se ligar a um polipeptídeo de SEMA4D, por exemplo, SEMA4D humana, de murino ou humana e de murino). Tais variantes (ou derivados das mesmas) de anticorpos “humanos” ou “completa-mente humanos” também podem ser referidas como anticorpos humanos ou comple-tamente humanos que são “otimizados” ou “otimizado para ligação ao antígeno” e in-cluem anticorpos que apresentam afinidade melhorada ao antígeno.

[047]Os termos “anticorpo” e “imunoglobulina” são permutavelmente usados neste relatório. Um anticorpo ou imunoglobulina compreende pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada e normalmente compreende pelo menos os domínios variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve. Estruturas de imunoglobulina básicas em sistemas vertebrados são relativamente bem entendidas. Veja, por exemplo, Harlow et al. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (2a ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press).

[048]Conforme usado neste relatório, o termo “imunoglobulina” compreende várias classes amplas de polipeptídeos que podem ser bioquimicamente distinguidas. Aqueles habilitados na técnica avaliarão que cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou epsilon, (Y, μ, α, δ, ε) com algumas subclasses entre as mesmas (por exemplo, Y1 a Y4). É a natureza desta cadeia que determina a “classe” do anticorpo como IgG, IgM, IgA IgG ou IgE, respectivamente. As subclasses de imuno- globulina (isotipos) por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 etc. são bem caracterizadas e são conhecidas para conferir especialização funcional. Versões modificadas de cada uma destas classes e isotipos são facilmente discerníveis ao técnico habilitado em vista da presente divulgação e, consequentemente, estão no escopo da presente divulgação. Todos as classes de imunoglobulina estão claramente no escopo da presente divulgação, o seguinte debate, em geral, será dirigido à classe IgG de moléculas de imunoglobulina. Com respeito à IgG, uma molécula de imunoglobulina padrão compreende dois polipeptídeos de cadeia leve idênticos de peso molecular de aproximadamente 23.000 Daltons e dois polipeptídeos de cadeia pesada idênticos de peso molecular 53.000 a 70.000. As quatro cadeias são tipicamente unidas por liga-ções dissulfeto em uma configuração “Y” em que as cadeias leves incluem as cadeias pesadas iniciando na boca do “Y” e continuando através da região variável.

[049]Cadeias leves são classificadas como capa ou lambda (K, À). Cada ca-deia pesada classe pode ser ligada com uma cadeia leve capa ou lambda. Em geral, as cadeias leves e pesadas são covalentemente ligadas e as porções da “cauda” das duas cadeias pesadas são ligadas por ligações dissulfeto covalentes ou ligações não covalentes quando as imunoglobulinas são geradas por hibridomas, células B ou células hospedeiras geneticamente construídas. Na cadeia pesada, as sequências de aminoácidos são conduzidas a partir de um N-terminal nas extremidades ramificadas da configuração Y ao C-terminal no fundo de cada cadeia.

[050]As cadeias leves e pesadas são divididas em regiões de homologia es-trutural e funcional. Os termos “constante” e “variável” são funcionalmente usados. Neste respeito, será avaliado que os domínios variáveis das porções de cadeia leve (VL ou VK) e pesada (VH) determinam o reconhecimento e especificidade do antí- geno. Reciprocamente, os domínios constantes da cadeia leve (CL) e da cadeia pe-sada (tipicamente, CH1, CH2 ou CH3) conferem propriedades biológicas importantes, tais como secreção, mobilidade transplacentária, ligação ao receptor Fc, ligação ao complemento e semelhantes. Por convenção, a numeração dos domínios de região constante é aumentada conforme ela se torna mais distal do sítio de ligação ao antí- geno ou terminal amino do anticorpo. A porção N-terminal é uma região variável e a porção C-terminal é uma região constante; os domínios CH3 e CL tipicamente compreendem o terminal carbóxi da cadeia pesada e leve, respectivamente.

[051]Conforme indicado acima, a região variável permite que o anticorpo re-conheça seletivamente e se ligue especificamente aos epítopos sobre os antígenos. Isto é, o domínio VL e domínio VH ou subconjunto das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) dentro destes domínios variáveis de um anticorpo se combinam para formar a região variável que define um sítio de ligação ao antígeno tridimensional. Esta estrutura de anticorpo quaternário forma o sítio de ligação ao an- tígeno presente na extremidade de cada ramo do Y. Mais especificamente, o sítio de ligação ao antígeno é definido por três CDRs em cada uma das cadeias VH e VL. Em alguns exemplos, por exemplo, certas moléculas de imunoglobulina derivadas de es-pécie de camelídeos ou construídas com base em imunoglobulinas de camelídeo, uma molécula de imunoglobulina completa pode consistir apenas de cadeias pesadas, sem cadeias leves. Veja, por exemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446 - 448 (1993).

[052]Em anticorpos de ocorrência natural, as seis “regiões determinantes de complementaridade” ou “CDRs” presentes em cada domínio de ligação ao antígeno são sequências curtas, não contíguas de aminoácidos que são especificamente posicionados para formar o domínio de ligação ao antígeno, conforme o anticorpo assume sua configuração tridimensional em um meio aquoso. O restante dos aminoácidos nos domínios de ligação ao antígeno, referidos como regiões de “estrutura”, mostra menos variabilidade intermolecular. As regiões de estrutura adotam amplamente uma conformação de folha β e as CDRs formam alças que conectam a, e, em alguns casos, formam parte da estrutura de folha β. Assim, regiões de estrutura atuam para formar um andaime que fornece posicionamento das CDRs em orientação correta através de interações entre cadeias e não covalentes. O domínio de ligação ao antígeno formado pelas CDRs posicionadas define uma superfície complementar ao epítopo no antígeno imunorreativo. Esta superfície complementar promove a ligação não covalente do anticorpo ao seu epítopo cognato. Os aminoácidos que compreendem as CDRs e as regiões de estrutura, respectivamente, podem ser facilmente identificados para qualquer domínio variável de cadeia pesada ou leve fornecido por uma pessoa de habilidade comum na técnica, visto que foram precisamente definidos (veja abaixo).

[053]No caso onde existem duas ou mais definições de um termo que é usado e/ou aceito na técnica, a definição do termo, conforme usado neste relatório, é intencionada a incluir todos os tais significados, a menos que explicitamente estabelecido ao contrário. Um exemplo específico é o uso do termo “região determinante de complementaridade” (“CDR”) para descrever os sítios de combinação ao antígeno não contíguos encontrados na região variável dos polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Esta região particular foi descrita por Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” e por Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 - 917 (1987), que são incorporados neste relatório como referência, onde as definições incluem sobreposições ou subconjuntos de resíduos de aminoácido quando comparados entre si. Não obstante, a aplicação de qualquer definição para se referir a uma CDR de um anticorpo ou variantes do mesmo é intencionada a estar no escopo do termo definido e usado neste relatório. Os resíduos de aminoácidos apropriados que abrangem as CDRs definidas por cada uma das referências citadas acima são apresentados abaixo na Tabela 1 como uma comparação. Os números de resíduo exatos que abrangem uma CDR particular variarão dependendo da sequência e tamanho da CDR. Aqueles habilitados na técnica podem determinar rotineiramente que os resíduos compreendem uma CDR particular dada a sequência de aminoácidos de região variável do anticorpo.Tabela 1. Definições de CDR11Anumeração de todas as definições de CDR na Tabela 1 está de acordo com as convenções de numeração apresentadas por Kabat et al. (veja abaixo).

[054]Kabat et al. também definiram um sistema de numeração para sequên-cias de domínio variável que é aplicável a qualquer anticorpo. Uma pessoa de habili-dade comum na técnica pode determinar precisamente este sistema de “numeração de Kabat” a qualquer sequência de domínio variável, sem dependência de quaisquer dados experimentais além da sequência por si só. Conforme usado neste relatório, a “numeração de Kabat” se refere ao sistema de numeração apresentado por Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immu-nological Interest”. A menos que de outro modo especificado, referências à numeração de posições de resíduos de aminoácidos específicas em um anticorpo anti-SEMA4D ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo da presente divulgação estão de acordo com o sistema de numeração de Kabat.

[055]Anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos da divulgação incluem, mas não são limitados a policlonais, monoclo- nais, multiespecíficos e biespecíficos, em que pelo menos um ramo é específico para SEMA4D, anticorpos humanos, humanizados, primatizados ou quiméricos, anticorpos de cadeia única, fragmentos de ligação ao epítopo, por exemplo, Fab, Fab’ e F(ab’)2, Fd, Fvs, Fvs de cadeia única (scFv), Fvs ligados a dissulfeto (sdFv), fragmentos compreendendo um domínio VL ou VH, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab e anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id para anticorpos anti-SEMA4D divulgados neste relatório). As moléculas de ScFv são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, na Patente U.S. No 5.892.019. Moléculas de imunoglobulina ou anticorpo da divulgação podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2 etc.) ou subclasse de molécula de imunoglobulina.

[056]Conforme usado neste relatório, o termo “porção de cadeia pesada” inclui sequências de aminoácidos derivadas de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Em certas formas de realização, um polipeptídeo que compreende uma porção de cadeia pesada compreende pelo menos um entre: um domínio VH, um domínio CH1, um domínio de dobradiça (por exemplo, região de dobradiça superior, central e/ou inferior), um domínio CH2, um domínio CH3 ou uma variante ou fragmento da mesma. Por exemplo, um polipeptídeo de ligação para o uso na divulgação pode compreender uma cadeia de polipeptídeos compreendendo um domínio CH1; uma cadeia de poli- peptídeos compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça e um domínio CH2; uma cadeia de polipeptídeos que compreende um domínio CH1 e um domínio CH3; uma cadeia de polipeptídeos que compreende um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça e um domínio CH3 ou uma cadeia de polipeptídeos que compreende um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3. Em uma outra forma de realização, um polipeptídeo da divulgação compreende uma cadeia de polipeptídeos que compreende um domínio CH3. Além disso, um polipeptídeo de ligação para o uso na divulgação pode ser desprovido de pelo menos uma porção de um domínio CH2 (por exemplo, todo ou parte de um domínio CH2). Conforme apresentado acima, será entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica que estes domínios (por exemplo, as porções de cadeia pesada) podem ser modificados, tal que eles possam variar na sequência de aminoácidos a partir da molécula de imu- noglobulina de ocorrência natural.

[057]Em certos anticorpos anti-SEMA4D ou fragmentos de ligação ao antí- geno, variantes ou derivados dos mesmos divulgados neste relatório, as porções de cadeia pesada de uma cadeia de polipeptídeos de um multímero são idênticas àque-las em uma segunda cadeia de polipeptídeos do multímero. Alternativamente, os mo- nômeros contendo porção de cadeia pesada da divulgação não são idênticos. Por exemplo, cada monômero pode compreender um sítio de ligação alvo diferente,formando, por exemplo, um anticorpo biespecífico.

[058]As porções de cadeia pesada de uma molécula de ligação para o uso nos métodos divulgados neste relatório podem ser derivadas de moléculas de imuno- globulina diferentes. Por exemplo, uma porção de cadeia pesada de um polipeptídeo pode compreender um domínio CH1 derivado de uma molécula de IgG1 e uma região de dobradiça derivada de uma molécula de IgG3. Em um outro exemplo, uma porção de cadeia pesada pode compreender uma região de dobradiça derivada, em parte, de uma molécula de IgG1 e, em parte, de uma molécula de IgG3. Em um outro exemplo, uma porção de cadeia pesada pode compreender uma dobradiça quimérica derivada, em parte, de uma molécula de IgG1 e, em parte, de uma molécula de IgG4.

[059]Conforme usado neste relatório, o termo “porção de cadeia leve” inclui sequências de aminoácidos derivadas de uma cadeia leve de imunoglobulina, por exemplo, uma cadeia leve capa ou lambda. Em alguns aspectos, a porção de cadeia leve compreende pelo menos um entre um domínio VL ou CL.

[060]Os anticorpos anti-SEMA4D ou fragmentos de ligação ao antígeno, vari-antes ou derivados dos mesmos divulgados neste relatório podem ser descritos ou especificados em termos dos epítopos ou porções de um antígeno, por exemplo, um polipeptídeo alvo divulgado neste relatório (por exemplo, SEMA4D) que eles reconhecem ou se ligam especificamente. A porção de um polipeptídeo alvo que interage especificamente com o domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo é um “epítopo” ou um “determinante antigênico”. O polipeptídeo alvo pode compreender um epítopo único, mas, tipicamente, compreende pelo menos dois epítopos e pode incluir qualquer número de epítopos, dependendo do tamanho, conformação e tipo do antígeno. Além disso, deve ser observado que um “epítopo” em um polipeptídeo alvo pode ser ou pode incluir elementos sem polipeptídeo, por exemplo, um epítopo pode incluir uma cadeia lateral de carboidrato.

[061]O tamanho mínimo de um epítopo de peptídeo ou polipeptídeo para um anticorpo pode apresentar cerca de quatro a cinco aminoácidos. Epítopos de peptídeo ou polipeptídeo podem conter, por exemplo, pelo menos sete, pelo menos nove ou entre pelo menos cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos. Visto que uma CDR pode reconhecer um peptídeo ou polipeptídeo antigênico em sua forma terciária, os amino- ácidos que compreendem um epítopo não precisam ser contíguos e, em alguns casos, podem estar em cadeias de peptídeos separadas. Um epítopo de peptídeo ou poli- peptídeo reconhecido pelos anticorpos anti-SEMA4D da presente divulgação podem conter uma sequência de pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25 ou entre cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos contíguos ou não contíguos de SEMA4D.

[062]“Se liga especificamente a”, em geral, significa que um anticorpo se liga a um epítopo por intermédio de seu domínio de ligação ao antígeno e que a ligação exige alguma complementaridade entre o domínio de ligação ao antígeno e o epítopo. De acordo com esta definição, um anticorpo “se liga especificamente” a um epítopo quando ele se liga a tal epítopo, por intermédio de seu domínio de ligação ao antígeno, mais facilmente do que se ligaria a um epítopo aleatório e não relacionado. O termo “especificidade” é usado neste relatório para qualificar a afinidade relativa pela qual um determinado anticorpo se liga a um determinado epítopo. Por exemplo, o anticorpo “A” pode ser considerado por apresentar uma maior especificidade para um dado epí- topo do que o anticorpo “B” ou o anticorpo “A” pode se ligar ao epítopo “C” com uma maior especificidade do que apresenta para o epítopo “D” relacionado.

[063]“Se liga preferencialmente a” significa que o anticorpo se liga especificamente a um epítopo mais facilmente do que se ligaria a um epítopo relacionado, similar, homólogo ou análogo. Assim, um anticorpo que “se liga preferencialmente” a um dado epítopo se ligaria de forma mais provável a tal epítopo do que a um epítopo relacionado, ainda que tal um anticorpo possa reagir de forma cruzada com o epitope relacionado.

[064]Por via de exemplo não limitante, um anticorpo pode se ligar a um pri-meiro epítopo, preferencialmente, se ele se liga ao primeiro epítopo com uma cons-tante de dissociação (KD) que é menor do que a KD do anticorpo para o segundo epí- topo. Em um outro exemplo não limitante, um anticorpo pode se ligar a um primeiro antígeno, preferencialmente, se ele se liga ao primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos uma ordem de magnitude menor do que a KD do anticorpo para o segundo epítopo. Em um outro exemplo não limitante, um anticorpo se liga a um primeiro epítopo, preferencialmente, se ele se liga ao primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos duas ordens de magnitude menores do que a KD do anticorpo para o segundo epítopo.

[065]Em um outro exemplo não limitante, um anticorpo se liga a um primeiro epítopo, preferencialmente, se ele se liga ao primeiro epítopo com uma taxa de disso-ciação (k(off)) que é menor do que a k(off) do anticorpo para o segundo epítopo. Em um outro exemplo não limitante, um anticorpo se liga a um primeiro epítopo, preferen-cialmente, se ele se liga ao primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos uma ordem de magnitude menor do que a k(off) do anticorpo para o segundo epítopo. Em um outro exemplo não limitante, um anticorpo pode se ligar a um primeiro epítopo, preferencialmente, se ele se liga ao primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos duas ordens de magnitude menores do que a k(off) do anticorpo para o segundo epítopo. Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado divulgado neste relatório pode se ligar a um polipeptídeo alvo divulgado neste relatório (por exemplo, SEMA4D, por exemplo, SEMA4D humana, de murino ou humana e de murino) ou um fragmento ou variante do mesmo com uma taxa de dissociação (k(off)) menor do que ou igual a 5 X 10-2 s-1, 10-2 s-1, 5 X 10-3 s-1 ou 10-3 s-1. Em certos aspectos, um anticorpo da divulgação pode se ligar a um polipeptídeo alvo divulgado neste relatório (por exemplo, SEMA4D, por exemplo, SEMA4D humana, de murino ou humana e de murino) ou um fragmento ou variante do mesmo com uma taxa de dissociação (k(off)) menor do que ou igual a 5 X 10-4 s-1, 10-4 s-1, 5 X 10-5 s-1 ou 10-5 s-1, 5 X 10-6 s-1, 10-6 s-1, 5 X 10-7 s-1 ou 10-7 s-1.

[066]Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado divulgado neste relatório pode se ligar a um polipeptídeo alvo divulgado neste relatório (por exemplo, SEMA4D, por exemplo, SEMA4D humana, de murino ou humana e de murino) ou um fragmento ou variante do mesmo com uma taxa de associação (k(on)) maior do que ou igual a 103 M-1 s-1, 5 X 103 M-1 s-1, 104 M-1 s-1 ou 5 X 104 M-1 s-1. Em algumas formas de realização, um anticorpo da divulgação pode se ligar a um poli- peptídeo alvo divulgado neste relatório (por exemplo, SEMA4D, por exemplo, SEMA4D humana, de murino ou humana e de murino) ou um fragmento ou variante do mesmo com um taxa de associação (k(on)) maior do que ou igual a 105 M-1 s-1, 5 X 105 M-1 s-1, 106 M-1 s-1 ou 5 X 106 M-1 s-1 ou 107 M-1 s-1.

[067]Um anticorpo inibe competitivamente a ligação de um anticorpo de refe-rência a um dado epítopo se ele preferencialmente se liga a tal epítopo na medida em que ele bloqueia, em algum grau, a ligação do anticorpo de referência ao epítopo. A inibição competitiva pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, ensaios ELISA de competição. Um anticorpo pode inibir competitivamente a ligação do anticorpo de referência a um dado epítopo em pelo menos 90 %, pelo menos 80 %, pelo menos 70 %, pelo menos 60 % ou pelo menos 50 %.

[068]Conforme usado neste relatório, o termo “afinidade” se refere a uma me-dição da concentração da ligação de um epítopo individual com a CDR de uma molé-cula de imunoglobulina. Veja, por exemplo, Harlow et al. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed.) páginas 27 e 28. Conforme usado neste relatório, o termo “avidez” se refere à estabilidade global do complexo entre uma população de imunoglobulinas e um antígeno, isto é, a concentração de combinação funcional de uma mistura de imunoglobulina com o antígeno. Veja, por exemplo, Harlow nas páginas 29 a 34. A avidez está relacionada à afinidade de mo-léculas de imunoglobulina individuais na população com epítopos específicos e, também, às valências das imunoglobulinas e do antígeno. Por exemplo, a interação entre um anticorpo monoclonal bivalente e um antígeno com uma estrutura de epítopo de alta repetição, tal como um polímero, seria aquela de alta avidez.

[069]Os anticorpos anti-SEMA4D ou fragmentos de ligação ao antígeno, vari-antes ou derivados dos mesmos da divulgação também podem ser descritos ou es-pecificados em termos de sua reatividade cruzada. Conforme usado neste relatório, o termo “reatividade cruzada” se refere à capacidade de um anticorpo específico para um antígeno reagir com um segundo antígeno; uma medição de relação entre duas substâncias antigênicas diferentes. Assim, um anticorpo é reativo de forma cruzada se ele se liga a um epítopo, exceto aquele que induziu sua formação. O epítopo reativo de forma cruzada, em geral, contém muitas das mesmas características estruturais complementares quanto à indução do epítopo e, em alguns casos, pode, realmente, se ajustar de maneira mais adequada em relação ao original.

[070]Por exemplo, certos anticorpos apresentam algum grau de reatividade cruzada, em que eles se ligam a epítopos relacionados, mas não idênticos, por exem-plo, epítopos com pelo menos 95 %, pelo menos 90 %, pelo menos 85 %, pelo menos 80 %, pelo menos 75 %, pelo menos 70 %, pelo menos 65 %, pelo menos 60 %, pelo menos 55 % e pelo menos 50 % de identidade (conforme calculado usando métodos conhecidos na técnica e descritos neste relatório) a um epítopo de referência. Um anticorpo pode apresentar pouca ou nenhuma reatividade cruzada, caso ele não se ligue a epítopos com menos do que 95 %, menos do que 90 %, menos do que 85 %, menos do que 80 %, menos do que 75 %, menos do que 70 %, menos do que 65 %, menos do que 60 %, menos do que 55 % e menos do que 50 % de identidade (con-forme calculado usando métodos conhecidos na técnica e descritos neste relatório) a um epítopo de referência. Um anticorpo pode ser considerado “altamente específico” para um determinado epítopo, caso ele não se ligue a qualquer outro análogo, ortólogo ou homólogo de tal epítopo.

[071]Moléculas de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos, da divulgação também podem ser descritos ou especificados em termos de sua afinidade de ligação a um polipeptídeo da divulgação, por exemplo, SEMA4D, por exemplo, SEMA4D humana, de murino ou humana e de murino. Em certos aspectos, as afinidades de ligação incluem aquelas com uma constante de dissociação ou Kd menor do que 5 x 102 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 1015 M ou 10-15 M. Em certas formas de realização, a molécula de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da divulgação se liga à SEMA4D humana com uma Kd de cerca de 5 x 10-9 a cerca de 6 x 109. Em uma outra forma de realização, a molécula de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da divulgação se liga à SEMA4D de murino com uma Kd de cerca de 1 x 10-9 a cerca de 2 x 10-9.

[072]Conforme usado neste relatório, o termo “anticorpo quimérico” será mantido para significar qualquer anticorpo em que a região ou sítio imunorreativo é obtido ou derivado de uma primeiro espécie e a região constante (que pode ser intacta, parcial ou modificada, de acordo com a presente divulgação) é obtida a partir de uma segunda espécie. Em certas formas de realização, a região ou sítio de ligação alvo ocorrerá a partir de uma fonte não humana (por exemplo, camundongo ou primata) e a região constante é humana.

[073]Conforme usado neste relatório, o termo “anticorpo construído” se refere a um anticorpo em que o domínio variável na cadeia pesada e/ou leve é alterado pelo menos pela substituição parcial de uma ou mais CDRs a partir de um anticorpo de especificidade conhecida e, se necessário, pela substituição da região de estrutura parcial e modificação da sequência. Embora as CDRs possam ser derivadas de um anticorpo da mesma classe ou ainda subclasse do anticorpo a partir da qual as regiões de estrutura são derivadas, é considerado que as CDRs serão derivadas de um anticorpo de classe diferente ou a partir de um anticorpo a partir de uma espécie diferente. Um anticorpo construído em que uma ou mais CDRs “doadoras” a partir de um anticorpo não humano de especificidade conhecida são enxertadas em uma região de estrutura de cadeia pesada ou leve humana é referido neste relatório como um “anticorpo humanizado”. Nem sempre é necessário substituir todas as CDRs com as CDRs completas a partir do domínio variável doador para transferir a capacidade de ligação ao antígeno de um domínio variável a um outro. De preferência, uma pessoa habilitada pode transferir apenas aqueles resíduos necessários para manter a atividade do sítio de ligação alvo que precisa ser transferido.

[074]Ainda deve ser reconhecido que as regiões de estrutura dentro do domí-nio variável em uma cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo humanizado pode compreender somente resíduos de origem humana, caso este em que estas regiões de estrutura do anticorpo humanizado são referidas como “regiões de estrutura completamente humanas” (por exemplo, MAbs 1515/2503 ou 67, divulgados na Publicação de Pedido de Patente U.S. No US 2010/0285036 A1 como MAb 2503, integralmente incorporada neste relatório como referência). Alternativamente, um ou mais resíduos das regiões de estrutura do domínio variável doador podem ser construídos na posição correspondente das regiões de estrutura humanas de um domínio variável em uma cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo humanizado, se necessário, para manter a ligação apropriada ou para acentuar a ligação ao antígeno de SEMA4D. Uma região de estrutura humana que foi construída desta maneira, assim, compreenderia uma mistura de resíduos de estrutura humanos e doadores e é referida neste relatório como uma “região de estrutura parcialmente humana”.

[075]Por exemplo, a humanização de um anticorpo anti-SEMA4D pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature 321:522 - 525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 - 327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 - 1536 (1988)) através da substituição de CDRs de roedor ou de roedor mutantes ou sequências de CDR para as sequências correspondentes de um anticorpo anti-SEMA4D humano. Veja também as Patentes U.S. Nos 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.859.205; incorporadas neste relatório como referência. O anticorpo anti-SEMA4D humanizado resultante compreenderia pelo menos uma CDR de roedor ou de roedor mutante nas regiões de estrutura completamente humanas do domínio variável da cadeia pesada e/ou leve do anticorpo humanizado. Em alguns exemplos, os resíduos nas regiões de estrutura de um ou mais domínios variáveis do anticorpo anti-SEMA4D humanizado são substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes (por exemplo, de roedor) (veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; e 6.180.370), caso este em que o anticorpo anti-SEMA4D humanizado resultante compreenderia regiões de estrutura parcialmente humanas no domínio variável da cadeia pesada e/ou leve.

[076]Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo doador. Estas modifica-ções são feitas para ainda refinar o desempenho do anticorpo (por exemplo, para ob-ter a afinidade desejada). Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá, substan-cialmente, pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variáveis, em que toda ou, substancialmente, todas as CDRs correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou, substancialmente, todas as regiões de estrutura são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imuno- globulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para outros detalhes, veja Jones et al., Nature 331:522 - 525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 - 329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593 - 596 (1992); incorporados neste relatório como referência. Consequentemente, tais anticorpos “humanizados” podem incluir anticorpos em que substancialmente menos do que um domínio variável hu-mano intacto foi substituído pela sequência correspondente a partir de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos huma-nos em que alguns resíduos de CDR e, possivelmente, alguns resíduos de estrutura são substituídos por resíduos a partir de sítios análogos em anticorpos de roedor. Veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.859.205. Veja também a Patente U.S. No 6.180.370 e Publicação International No WO 01/27160, onde os anticorpos humanizados e técnicas para produzir anticorpos humanizados que apresentam afinidade melhorada para um antígeno pré-determi-nado são divulgados.

[077]Conforme usado neste relatório, o termo “prestador de cuidados de sa-úde” se refere aos indivíduos ou instituições que interagem e administram diretamente aos sujeitos vivos, por exemplo, pacientes humanos. Exemplos não limitantes de prestadores de cuidados de saúde incluem médicos, enfermeiros, técnicos, terapeutas, farmacêuticos, conselheiros, praticantes de medicina alternativa, instalações médicas, consultórios médicos, salas de emergência hospitalar, clínicas, centros de cuidados urgentes, clínicas/instalações de medicina alternativa e qualquer outra entidade que fornece tratamento, avaliação, apoio, terapia, medicação e/ou assistência geral e/ou especializado que se referem ao estado de saúde do paciente, incluindo, mas não limitados ao tratamento médico geral, médico especializado, cirúrgico e/ou qualquer outro tipo de tratamento, avaliação, apoio, terapia, medicação e/ou assistência.

[078]Conforme usado neste relatório, o termo “prestador de benefícios de cui-dados de saúde” abrange partes, organizações ou grupos individuais que fornecem, apresentam, oferecem, pagam no todo ou em parte ou estão, de outro modo, associ-ados ao fornecimento de um acesso do paciente a um ou mais benefícios de cuidados de saúde, planos de benefício, plano de saúde e/ou programas de despesas com cuidados de saúde.

[079]Conforme usado neste relatório, o termo “laboratório clínico” se refere a uma instalação para o exame ou processamento de materiais ou imagens derivados de um sujeito vivo, por exemplo, um ser humano. Exemplo não limitantes de proces-samento incluem aqueles com base em imagem biológica, bioquímica, sorológica, química, imuno-hematológica, hematológica, biofísica, citológica, patológica, genética ou outro exame de materiais derivados do corpo humano ou de qualquer parte ou todo o corpo humano para o propósito de fornecer informação, por exemplo, para o diagnóstico, prevenção ou tratamento de qualquer doença ou dano ou para a avaliação da saúde de sujeitos vivos, por exemplo, seres humanos. Estes exames também podem incluir procedimentos para coletar ou, de outro modo, obter uma imagem, uma amostra, preparar, determinar, medir ou, de outro modo, descrever a presença ou ausência de várias substâncias no corpo de um sujeito vivo, por exemplo, um ser humano ou uma amostra obtida a partir do corpo de um sujeito vivo, por exemplo, um ser humano.

II. DESCRIÇÃO DO POLIPEPTÍDEO ALVO

[080]Conforme usado neste relatório, os termos “Semaforina 4D”, “SEMA4D” e “polipeptídeo de SEMA4D” são permutavelmente usados, como são “SEMA4D” e “Sema4D”. Em certas formas de realização, SEMA4D é expressa sobre a superfície de uma célula ou secretada por uma célula. Em uma outra forma de realização, SEMA4D é ligada à membrana. Em outras formas de realização, SEMA4D é solúvel, por exemplo, sSEMA4D. Em outras formas de realização, SEMA4D pode incluir uma SEMA4D de comprimento total ou um fragmento da mesma ou um polipeptídeo vari-ante de SEMA4D, em que o fragmento de SEMA4D ou polipeptídeo variante de SEMA4D conserva algumas ou todas as propriedades funcionais da SEMA4D de comprimento total.

[081]A proteína de SEMA4D humana de comprimento total é uma proteína transmembrana homodimérica que consiste em duas cadeias de polipeptídeos de 150 kDa. SEMA4D pertence à família da semaforina de receptores de superfície celular e também é referida como CD100. SEMA4D/Sema4D humana e de camundongo são proteoliticamente clivadas a partir de sua forma transmembrana para gerar formas solúveis de 120 kDa, indicando a existência de duas isoformas de Sema4D (Kumano- goh et al., J. Cell Science 116(7):3464 (2003)). As semaforinas consistem em proteínas solúveis e ligadas à membrana que foram originalmente definidas como fatores de guia axonal durante o desenvolvimento que desempenham um papel importante em estabelecer conexões precisas entre neurônios e seu alvo apropriado. Estruturalmente considerada uma semaforina classe IV, SEMA4D consiste em uma sequência sinal amino-terminal, seguido por um domínio “Sema” característico, que contém 17 resíduos de cisteína conservados, um Domínio do tipo Ig, um estiramento rico em lisina, uma região transmembrana hidrofóbica e uma cauda citoplasmática.

[082]A cadeia de polipeptídeos de SEMA4D pode incluir uma sequência sinal de cerca de 13 aminoácidos e ainda inclui um domínio de semaforina de cerca de 512 aminoácidos, um domínio do tipo imunoglobulina (do tipo Ig) de cerca de 65 aminoá- cidos, um estiramento rico em lisina de 104 aminoácidos, uma região transmembrana hidrofóbica de cerca de 19 aminoácidos e uma cauda citoplasmática de 110 aminoá- cidos. Um sítio consenso para a fosforilação de tirosina na cauda citoplasmática suporta a associação prognosticada de SEMA4D com uma tirosina cinase (Schlossman et al. eds. (1995) Leucocyte Typing V (Oxford University Press, Oxford).

[083]SEMA4D é conhecida por apresentar pelo menos três receptores funci-onais, Plexina-B1, Plexina-B2 e CD72. Um dos receptores, Plexina-B1, é expresso em tecidos não linfoides e foi mostrado como um receptor de alta afinidade (1 nM) para SEMA4D (Tamagnone et al., Cell 99:71 - 80 (1999)). O estímulo de SEMA4D da sinalização de Plexina-B1 foi mostrado induzir o crescimento de colapso do cone de neurônios e induzir o colapso de extensão de processo e apoptose de oligodendrócitos (Giraudon et al., J. Immunol. 172:1246 - 1255 (2004); Giraudon et al., NeuroMolecular Med. 7:207 - 216 (2005)). Depois da ligação à SEMA4D, a sinalização de Plexina-B1 medeia a inativação de R-Ras, levando a uma diminuição na ligação mediada por integrina à matriz extracelular, assim como a ativação de RhoA, levando à reorgani-zação do citoesqueleto e migração celular. Veja Kruger et al., Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6:789 - 800 (2005); Pasterkamp, TRENDS in Cell Biology 15:61 - 64 (2005)). Plexina-B2, por outro lado, apresenta uma afinidade intermediária para SEMA4D e relatos recentes indicam que Plexina-B2 regula a migração de neurônios corticais e proliferação e migração de neuroblastos na zona subventricular do adulto (Azzarelli et al,. Nat Commun 27 de Fev. de 2014, 5:3405, DOI: 10.1038/ncomms4405; e Saha et al., J. Neuroscience, 21 de Novembro de 2012, 32(47):16892-16905).

[084]Em tecidos linfoides, CD72 é utilizado como um receptor de SEMA4D de baixa afinidade (300 nM) (Kumanogoh et al., Immunity 13:621 - 631 (2000)). As células B e CAAs expressam CD72 e anticorpos anti-CD72 apresentam muitos dos mesmos efeitos de sSEMA4D, tal como aumento de respostas de células B induzidas por CD40 e derramamento de células B de CD23. É considerado que CD72 atua como um regulador negativo de respostas de células B através do recrutamento da tirosina fosfa- tase SHP-1, que pode se associar com muitos receptores inibitórios. A interação de SEMA4D com CD72 resulta na dissociação de SHP-1 e na perda deste sinal de ativação negativo. Foi relatado que SEMA4D promove o estímulo de células T e agregação e sobrevivência de células B in vitro. A adição de células que expressam SEMA4D ou sSEMA4D acentua a proliferação de células induzida por CD40 e produção de imuno- globulina in vitro e acelera as respostas do anticorpo in vivo (Ishida et al., Inter. Immunol. 15:1027 - 1034 (2003); Kumanogoh e H. Kukutani, Trends in Immunol. 22:670 - 676 (2001)). sSEMA4D acentua a maturação induzida por CD40 de células dendríticas (CDs), incluindo a suprarregulação de moléculas coestimulantes e secreção aumentada de IL-12. Além disso, sSEMA4D pode inibir a migração de células imunes, que pode ser revertida pela adição do bloqueio dos anticorpos anti-SEMA4D (Elhabazi et al., J. Immunol. 166:4341 - 4347 (2001); Delaire et al., J. Immunol. 166:4348 - 4354 (2001)).

[085]Sema4D é expressa em altos níveis em órgãos linfoides, incluindo baço, timo e linfonodos, e em órgãos não linfoides, tais como o cérebro, coração e rim. Em órgãos linfoides, Sema4D é abundantemente expressada em células T em repouso, mas apenas fracamente expressada em células B em repouso e células apresentadoras de antígeno (CAAs), tais como CDs. A ativação celular aumenta a expressão de superfície de SEMA4D, assim como a geração de SEMA4D solúvel (sSEMA4D).

[086]O padrão de expressão de SEMA4D sugere que a mesma desempenha um papel fisiológico, assim como patológico importantes no sistema imune. Foi mos-trado que SEMA4D promove a ativação, agregação e sobrevivência de células B; acentua a proliferação induzida por CD40 e produção de anticorpos; acentua a res-posta do anticorpo aos antígenos dependentes de células T; aumenta a proliferação de células T; acentua a maturação de células dendríticas e capacidade de estimular células T; e está diretamente implicada na desmielinação e degeneração axonal (Shi et al., Immunity 13:633 - 642 (2000); Kumanogoh et al., J Immunol 169:1175 - 1181 (2002); e Watanabe et al., J Immunol 167:4321 - 4328 (2001)).

[087]Camundongos nocaute para SEMA4D (SEMA4D-/-) forneceram evidên-cia adicional de que SEMA4D desempenha um papel importante nas respostas imu-nes humorais e celulares. Não existem anormalidades principais conhecidas de teci-dos não linfoides em camundongos SEMA4D-/-. CDs a partir dos camundongos SEMA4D-/- apresentam capacidade aloestimulantes deficientes e mostram defeitos na expressão de moléculas coestimulantes, que podem ser resgatadas pela adição de sSEMA4D. Camundongos deficientes em SEMA4D (SEMA4D-/-) não conseguem desenvolver encefalomielite autoimune experimental induzida pelo peptídeo de glico- proteína do oligodendrócito da mielina, pelo fato de que células T específicas da glicoproteína do oligodendrócito da mielina são deficientemente geradas na ausência de SEMA4D (Kumanogoh et al., J Immunol 169:1175 - 1181 (2002)). Uma quantidade significante de SEMA4D solúvel também é detectada nos soros de camundongos MRL/lpr propensos à autoimunidade (modelo de doenças autoimunes sistêmicas, tais como SLE), mas não em camundongos normais. Além disso, os níveis de sSEMA4D se correlacionam com níveis de autoanticorpos e aumentam com a idade (Wang et al., Blood 97:3498 - 3504 (2001)). Também foi mostrado que SEMA4D solúvel se acumula no fluido cérebro-espinhal e nos soros de pacientes com doença desmielinizante e sSEMA4D induz a apoptose de precursores neurais pluripotentes humanos (células Dev) e inibe a extensão do processo e induz a apoptose de oligodendrócitos de rato in vitro (Giraudon et al., J Immunol 172(2):1246 - 1255 (2004)). Esta apoptose foi bloqueada por um MAb anti-SEMA4D.

III. ANTICORPOS ANTI-SEMA4D

[088]Os anticorpos que se ligam à SEMA4D foram descritos na técnica. Veja, por exemplo, a Patente U.S. No 8.496.938, Publ. U.S. Nos 2008/0219971 A1, US 2010/0285036 A1 e US 2006/0233793 A1, Pedidos de Patente Internacional WO 93/14125, WO 2008/100995 e WO 2010/129917 e Herold et al., Int. Immunol. 7(1): 1 - 8 (1995), cada um dos quais é integralmente incorporado neste relatório como refe-rência.

[089]A divulgação, em geral, se refere a um método para aliviar os sintomas em um sujeito que apresenta um transtorno neuroinflamatório ou neurodegenerativo, por exemplo, um paciente humano, compreendendo a administração de um anticorpo que se liga especificamente à SEMA4D ou um fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo. Em certas formas de realização, o anticorpo bloqueia a interação de SEMA4D com um ou mais de seus receptores, por exemplo, Plexina-B1. Os anticorpos anti-SEMA4D que apresentam estas propriedades podem ser usados nos métodos fornecidos neste relatório. Os anticorpos que podem ser usados incluem, mas não são limitados a MAbs VX15/2503, 67 e 76 e fragmentos de ligação ao antí- geno, variantes ou derivados dos mesmos que são completamente descritos no US 2010/0285036 A1. Anticorpos adicionais que podem ser usados nos métodos fornecidos neste relatório incluem os anticorpos BD16 e BB18 descritos no US 2006/0233793 A1, assim como fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos; ou qualquer um entre MAb 301, MAb 1893, MAb 657, MAb 1807, MAb 1656, MAb 1808, Mab 59, MAb 2191, MAb 2274, MAb 2275, MAb 2276, MAb 2277, MAb 2278, MAb 2279, MAb 2280, MAb 2281, MAb 2282, MAb 2283, MAb 2284 e MAb 2285, assim como quaisquer fragmentos, variantes ou derivados dos mesmos, conforme descrito no US 2008/0219971 A1. Em certas formas de realização, um anticorpo anti-SEMA4D para o uso nos métodos fornecidos neste relatório se liga à SEMA4D humana, de murino ou humana e de murino. Também úteis são os anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo como qualquer um dos anticorpos anteriormente mencionados e/ou anticorpos que inibem competitivamente qualquer um entre os anticorpos anteriormente mencionados.

[090]Em certas formas de realização, um anticorpo anti-SEMA4D ou frag-mento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo útil nos métodos for-necidos neste relatório apresenta uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos cerca de 80 %, cerca de 85 %, cerca de 88 %, cerca de 89 %, cerca de 90 %, cerca de 91 %, cerca de 92 %, cerca de 93 %, cerca de 94 % ou cerca de 95 % de identidade de sequência à sequência de aminoácidos para uma molécula de anticorpo anti-SEMA4D de referência, por exemplo, aquelas descritas acima. Em uma outra forma de realização, a molécula de ligação compartilha pelo menos cerca de 96 %, cerca de 97 %, cerca de 98 %, cerca de 99 % ou 100 % de identidade de sequência a um anticorpo de referência.

[091]Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-SEMA4D ou frag-mento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo útil nos métodos fornecidos neste relatório compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (domínio VH), onde pelo menos uma entre as CDRs do domínio VH apresenta uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80 %, cerca de 85 %, cerca de 90 %, cerca de 95 %, cerca de 96 %, cerca de 97 %, cerca de 98 %, cerca de 99 % ou idêntica à CDR1, CDR2 ou CDR3 da SEQ ID NO: 9 ou 10.

[092]Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-SEMA4D ou frag-mento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo útil nos métodos for-necidos neste relatório compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (domínio VH), onde pelo menos uma entre as CDRs do domínio VH apresenta uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80 %, cerca de 85 %, cerca de 90 %, cerca de 95 %, cerca de 96 %, cerca de 97 %, cerca de 98 %, cerca de 99 % ou idêntica à SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8.

[093]Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-SEMA4D ou frag-mento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo útil nos métodos for-necidos neste relatório compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (domínio VH), onde pelo menos uma entre as CDRs do domínio VH apresenta uma sequência de aminoácidos idêntica, exceto para 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de aminoácidos conservativas, à SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8.

[094]Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-SEMA4D ou frag-mento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo útil nos métodos for-necidos neste relatório compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um domínio VH que apresenta uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80 %, cerca de 85 %, cerca de 90 %, cerca de 91 %, cerca de 92 %, cerca de 93 %, cerca de 94 %, cerca de 95 %, cerca de 96 %, cerca de 97 %, cerca de 98 %, cerca de 99 % ou 100 % idêntica à SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10 em que um anticorpo anti-SEMA4D compreendendo o domínio VH codificado se liga específica ou prefe-rencialmente à SEMA4D.

[095]Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-SEMA4D ou frag-mento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo útil nos métodos for-necidos neste relatório compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (domínio VL), onde pelo menos uma entre as CDRs do domínio VL apresenta uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80 %, cerca de 85 %, cerca de 90 %, cerca de 95 %, cerca de 96 %, cerca de 97 %, cerca de 98 %, cerca de 99 % ou idêntica à CDR1, CDR2 ou CDR3 da SEQ ID NO: 17 ou 18.

[096]Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-SEMA4D ou frag-mento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo útil nos métodos for-necidos neste relatório compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (domínio VL), onde pelo menos uma entre as CDRs do domínio VL apresenta uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80 %, cerca de 85 %, cerca de 90 %, cerca de 95 %, cerca de 96 %, cerca de 97 %, cerca de 98 %, cerca de 99 % ou idêntica à SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 16.

[097]Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-SEMA4D ou frag-mento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo útil nos métodos for-necidos neste relatório compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (domínio VL), onde pelo menos uma entre as CDRs do domínio VL apresenta uma sequência de aminoácidos idêntica, exceto para 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de aminoácidos conservativas, à SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 16.

[098]Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-SEMA4D ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo útil nos métodos fornecidos neste relatório compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um domínio VL que apresenta uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80 %, cerca de 85 %, cerca de 90 %, cerca de 91 %, cerca de 92 %, cerca de 93 %, cerca de 94 %, cerca de 95 %, cerca de 96 %, cerca de 97 %, cerca de 98 %, cerca de 99 % ou 100 % idêntica à SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 18, em que um anticorpo anti-SEMA4D compreendendo o domínio VL codificado se liga específica ou preferencialmente à SEMA4D.

[099]Também incluídos para o uso nos métodos fornecidos neste relatório estão os polipeptídeos que codificam os anticorpos anti-SEMA4D ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos, conforme descrito neste re-latório, os polinucleotídeos que codificam tais polipeptídeos, vetores que compreen-dem tais polinucleotídeos e células hospedeiras que compreendem tais vetores ou polinucleotídeos para a produção de anticorpos anti-SEMA4D ou fragmentos de liga-ção ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos para o uso nos métodos descri-tos neste relatório.

[0100]Variantes biologicamente ativas adequadas dos anticorpos anti- SEMA4D da divulgação podem ser usadas nos métodos da presente divulgação. Tais variantes conservarão as propriedades de ligação desejadas do anticorpo anti- SEMA4D precursor. Métodos para fabricar variantes de anticorpo estão, em geral, disponíveis na técnica.

[0101]Métodos para mutagênese e alterações de sequência de nucleotídeos são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Walker e Gaastra eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nova Iorque); Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 - 492 (1985); Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367 - 382 (1987); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y.); Patente U.S. No 4.873.192; e as referências citadas nos mesmos incorporadas neste relatório como referência. Um guia quanto às substitui-ções de aminoácidos apropriadas que não afetam a atividade biológica do polipeptí- deo de interesse pode ser encontrado no modelo de Dayhoff et al. (1978) no Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), pá-ginas 345 - 352, integralmente incorporado neste relatório como referência. O modelo de Dayhoff et al. utiliza a matriz de similaridade de aminoácidos de Mutação de Ponto Aceita (PAM) (matriz PAM 250) para determinar substituições de aminoácidos conser- vativas adequadas. Em certas formas de realização, substituições conservativas, tais como a troca de um aminoácido por um outro que apresenta propriedades similares, podem ser usadas. Exemplos de substituições de aminoácidos conservativas mostradas pela matriz PAM 250 do modelo de Dayhoff et al. incluem, mas não são limitadas a GlyθAla, ValθIleθLeu, AspθGlu, LysθArg, AsnθGIn e PheθTrpθTyr.

[0102]Na construção de variantes da molécula de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, polipeptídeos de interesse, modificações são feitas, tal que as variantes continuam a possuir as propriedades desejadas, por exemplo, são capazes de ligação específica a uma SEMA4D, por exemplo, SEMA4D humana, de murino ou humana e de murino, por exemplo, expressada sobre a superfície de, ou secretada por uma célula, e apresentam atividade de bloqueio de SEMA4D, conforme descrito neste relatório. Obviamente, quaisquer mutações feitas no DNA que codifica o polipeptídeo variante não devem colocar a sequência fora do quadro de leitura e, em certas formas de realização, não criarão regiões complementares que podem produzir estrutura de mRNA secundária. Veja a Publicação do Pedido de Patente EP No 75.444.

[0103]Métodos para medir a molécula de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, especificidade de ligação de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, vari-ante ou derivado do mesmo, incluem, mas não são limitados a ensaios de ligação competitiva padrão, ensaios para monitorar a secreção de imunoglobulina através de células T ou células B, ensaios de proliferação de células T, ensaios de apoptose, ensaios ELISA e semelhantes. Veja, por exemplo, tais ensaios divulgados no WO 93/14125; Shi et al., Immunity 13:633 - 642 (2000); Kumanogoh et al., J Immunol 169:1175 - 1181 (2002); Watanabe et al., J Immunol 167:4321 - 4328 (2001); Wang et al., Blood 97:3498 - 3504 (2001); e Giraudon et al., J Immunol 172(2):1246 - 1255 (2004), incorporados neste relatório como referência.

[0104]Quando debatido neste relatório, se qualquer polipeptídeo particular, incluindo as regiões constantes, CDRs, domínio VHs ou domínio VLs divulgados neste relatório, é pelo menos cerca de 65 %, cerca de 70 %, cerca de 75 %, cerca de 80 %, cerca de 85 %, cerca de 90 %, cerca de 91 %, cerca de 92 %, cerca de 93 %, cerca de 94 %, cerca de 95 %, cerca de 96 %, cerca de 97 %, cerca de 98 %, cerca de 99 % ou ainda cerca de 100 % idêntico a um outro polipeptídeo, a % de identidade pode ser determinada usando métodos e programas/software de computador conhecidos na técnica, tais como, mas não limitados ao programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711). BESTFIT utiliza o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482 - 489 para encontrar o melhor segmento de homologia entre duas sequências. Quando do uso de BESTFIT ou qualquer outro programa de alinhamento de sequência para determinar se uma sequência particular é, por exemplo, 95 % idêntica a uma sequência de referência, de acordo com a presente divulgação, os parâmetros são ajustados, certamente, tal que a porcentagem de identidade é calculada sobre o comprimento total da sequência de polipeptídeos de referência e que intervalos na homologia de até 5 % do número total de aminoácidos na sequência de referência são permitidos.

[0105]Para propósitos da presente divulgação, a porcentagem de identidade de sequência pode ser determinada usando o algoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman usando uma pesquisa de intervalo afim com uma penalidade aberta de intervalo de 12 e uma penalidade da extensão da abertura de 2, matriz BLOSUM de 62. O algoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman é mostrado em Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482 - 489. Uma variante, por exemplo, pode diferir de um anticorpo anti-SEMA4D de referência (por exemplo, MAb VX15/2503, 67 ou 76) em 1 a 15 resíduos de aminoácidos, 1 a 10 resíduos de amino- ácidos, tal como 6 a 10, 5, 4, 3, 2 ou ainda 1 resíduo de aminoácido.

[0106]A porcentagem de “identidade de sequência” também pode ser deter-minada através da comparação de duas sequências idealmente alinhadas em uma janela de comparação. De modo a alinhar idealmente sequências para comparação, a porção de um polinucleotídeo ou sequência de polipeptídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções denominadas intervalos, enquanto a sequência de referência é mantida constante. Um alinhamento ideal é aquele alinhamento que mesmo com intervalos produz o maior número possível de posições “idênticas” entre as sequências de referência e comparadoras. A porcentagem de “identidade de sequência” entre as duas sequências pode ser determinada usando a versão do programa “BLAST 2 Sequences” que se apresenta disponível a partir do National Center for Biotechnology Information como aquele de 1 de Setembro de 2004, tal programa incorpora os programas BLASTN (para comparação de sequência de nucleotí- deos) e BLASTP (para comparação de sequência de polipeptídeos), tais programas são fundamentados no algoritmo de Karlin e Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5873 - 5877, 1993). Quando se utiliza as “BLAST 2 Sequences”, os parâmetros que foram parâmetros pré-determinados, como aqueles de 1 de Setembro de 2004, podem ser usados para tamanho de palavra (3), penalidade de intervalo de abertura (11) penalidade de extensão de abertura (1), queda de intervalo (gap drop-off) (50) valor esperado (10) e qualquer outro parâmetro exigido, incluindo, mas não limitado à opção de matriz.

[0107]A região constante de um anticorpo anti-SEMA4D pode ser modificada para alterar a função efetora em diversas maneiras. Por exemplo, veja a Patente U.S. No 6.737.056B1 e Publicação de Pedido de Patente U.S. No 2004/0132101A1, que divulgam mutações Fc que otimizam a ligação do anticorpo aos receptores Fc.

[0108]Em certos anticorpos anti-SEMA4D ou fragmentos, variantes ou derivados dos mesmos úteis nos métodos fornecidos neste relatório, a porção Fc pode ser modificada para diminuir a função efetora usando técnicas conhecidas no ramo. Por exemplo, a deleção ou inativação (através de mutações de ponto ou outros meios) de um domínio de região constante pode reduzir a ligação ao receptor Fc do anticorpo modificado circulante, desse modo, aumentando a localização do tumor. Em outros casos, as modificações de região constante compatíveis com a presente divulgação moderam a ligação ao complemento e, assim, reduzem a meia-vida no soro. Outras modificações da região constante podem ser usadas para modificar ligações dissulfeto ou porções de oligossacarídeos que levam em consideração a localização realçada, devido à especificidade do antígeno aumentada ou flexibilidade do anticorpo. O perfil fisiológico, biodisponibilidade e outros efeitos bioquímicos resultantes das modificações, tais como localização do tumor, biodistribuição e meia-vida no soro, podem ser facilmente medidos e quantificados usando técnicas imunológicas bem conhecidas sem experimentação indevida. Os anticorpos anti-SEMA4D para o uso nos métodos fornecidos neste relatório incluem derivados que são modificados, por exemplo, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo, tal que a ligação covalente não previne o anticorpo da ligação específica ao seu epítopo cognato. Por exemplo, mas não por via de limitação, os derivados de anticorpos incluem anticorpos que foram modificados, por exemplo, através de glicosilação, acetilação, pegilação, fosfo- rilação, amidação, derivatização pelos grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou outra proteína etc. Qualquer uma entre as numerosas modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitadas à clivagem química específica, acetilação, formilação etc. Adicionalmente, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos.

[0109]A “substituição de aminoácidos conservativa” é aquela em que o resí-duo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que apresenta uma cadeia lateral com uma carga similar. As famílias de resíduos de aminoácido que apresentam cadeias laterais com cargas similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Alternativamente, as mutações podem ser aleatoriamente introduzidas ao longo de toda ou parte da sequência codificante, tal como através de mutagênese por saturação e os mutantes resultantes podem ser triados quanto à atividade biológica para identificar mutantes que conservam atividade (por exemplo, a capacidade de ligação a um polipeptídeo anti-SEMA4D, bloqueio da interação de SEMA4D com seu receptor ou alívio dos sintomas associados com um transtorno neurodegenerativo em um paciente).

[0110]Por exemplo, é possível introduzir mutações apenas nas regiões de es-trutura ou apenas nas regiões de CDR de uma molécula de anticorpo. Mutações in-troduzidas podem ser mutações silenciosas ou missense neutras, isto é, apresentam pouco ou nenhum efeito sobre uma capacidade de anticorpo se ligar ao antígeno. Estes tipos de mutações podem ser úteis para otimizar a utilização preferencial de códons ou melhorar uma produção de anticorpo do hibridoma. Alternativamente, as mutações missense não neutras podem alterar uma capacidade de anticorpo se ligar ao antígeno. Uma pessoa de habilidade na técnica seria capaz de projetar e testar moléculas mutantes com propriedades desejadas, tais como nenhuma alteração na atividade de ligação ao antígeno ou alteração na atividade de ligação (por exemplo, melhoras na atividade de ligação ao antígeno ou mudança na especificidade do anti-corpo). Após a mutagênese, a proteína codificada pode ser rotineiramente expressada e a atividade funcional e/ou biológica da proteína codificada, (por exemplo, capacidade de se ligar imunoespecificamente a pelo menos um epítopo de um polipeptídeo de SEMA4D) pode ser determinada usando técnicas descritas neste relatório ou através de técnicas de modificação de rotina conhecidas no ramo.

[0111]Em certas formas de realização, os anticorpos anti-SEMA4D para o uso nos métodos fornecidos neste relatório compreendem pelo menos uma região determinante de complementaridade otimizada (CDR). “CDR otimizada” significa que a CDR foi modificada e otimizada para melhorar a afinidade de ligação e/ou atividade anti-SEMA4D que é comunicada a um anticorpo anti-SEMA4D compreendendo a CDR otimizada. “Atividade anti-SEMA4D” ou “atividade de bloqueio de SEMA4D” pode incluir a atividade que modula uma ou mais entre as seguintes atividades associadas com SEMA4D: ativação, agregação e sobrevivência de células B; proliferação induzida por CD40 e produção de anticorpo; resposta do anticorpo aos antígenos dependentes de células T; proliferação de células T ou de outras células imunes; maturação de células dendríticas; desmielinação e degeneração axonal; apoptose de precursores neurais pluripotentes e/ou oligodendrócitos; indução de migração celular endote- lial; inibição de migração de monócitos espontânea; ligação à Plexina-B1 de superfície celular ou outro receptor ou qualquer outra atividade associada com SEMA4D solúvel ou SEMA4D que é expressada sobre a superfície de células SEMA4D+. A atividade anti-SEMA4D também pode ser atribuída a uma diminuição na incidência ou severidade de doenças associadas com a expressão de SEMA4D, incluindo, mas não limitadas a certos tipos de cânceres, incluindo linfomas, doenças autoimunes, doenças inflamatórias, incluindo doenças inflamatórias do sistema nervoso central (SNC) e sistema nervoso periférico (SNP), rejeições ao transplante e angiogênese invasiva. Exemplos de anticorpos otimizados com base em MAbs anti-SEMA4D de murino BD16 e BB18, foram descritos na Publ. U.S. No 2008/0219971 A1, Pedido de Patente Internacional WO 93/14125 e Herold et al., Int. Immunol. 7(1): 1 - 8 (1995) os quais são integralmente incorporados neste relatório como referência. As modificações po-dem envolver a substituição de resíduos de aminoácido dentro da CDR, tal que um anticorpo anti-SEMA4D conserva especificidade para o antígeno de SEMA4D e apre-senta afinidade de ligação melhorada e/ou atividade anti-SEMA4D melhorada.

IV. ASTRÓCITOS

[0112]Os astrócitos são células gliais especializadas que realizam muitas funções complexas essenciais no SNC saudável, incluindo a regulação do fluxo sanguíneo, homeostase de fluido/íon/pH/neurotransmissor, formação/função de sinapse, energia e metabolismo e manutenção da barreira sangue-cérebro (Barres BA (2008) The mystery and magic of glia: a perspectiva em their roles in health and disease. Neuron 60:430-440.) Com importância, os astrócitos respondem à lesão do SNC através de um processo referido como astrogliose reativa, que serves como uma indicação patológica principal de doenças neuroinflamatórias e neurodegenerativas. O aumento de pontos de evidência em direção ao potencial de astrogliose reativa desempenha papéis primários ou contribuintes nos transtornos do SNC por intermédio da perda de funções de astrócitos normais ou ganho de atividades anormais. Dado seu papel central em muitas doenças do SNC, existe uma necessidade significante para identificar e testar rigorosamente novos alvos moleculares que restauram função de astrócitos normal para eficazmente reduzir ou ainda reverter a progressão da doença. Existem várias vias potenciais através das quais os astrócitos podem impactar doenças do SNC.

[0113]Astrócitos e Suporte de OPC. A desmielinação que ocorre em doenças neuroinflamatórias, tais como esclerose múltipla, está associada com destruição marcada e perda de células compreendendo a linhagem de oligodendrócitos (Ozawa K et al. Patterns of oligodendroglia pathology in multiple sclerosis. Brain. 1994;117:1311 - 1322.). Mecanismos de remielinação endógena falham durante a fase de recuperação, em parte por causa da incapacidade de as OPCs se diferencia-rem completamente em oligodendrócitos mielinizantes maduros (Wolswijk G. Oligo-dendrocyte survival, loss and birth in lesions of chronic-stage multiple sclerosis. Brain. 2000;123:105 - 115.). Os dados obtidos a partir de outros modelos de desmielinação experimentalmente induzidos indicam que OPCs recém maduras, ao contrário de oli- godendrócitos maduros sobreviventes, são exigidas para a remielinação durante a fase de recuperação (Levine JM, Reynolds R. Activation and proliferation of endogenous oligodendrocyte precursor cells during ethidium bromide-induced demyelination. Exp Neurol. 1999;160:333 - 347). Foi mostrado que os astrócitos desempenham um papel significante no suporte da função e viabilidade da linhagem de oligodendrócitos. Por exemplo, Talbott e colaboradores mostraram que nas lesões desmielinadas induzidas por brometo de etídio, os astrócitos são exigidos para OPCs Nkx2.2+/Olig2+ para se diferenciarem completamente em oligodendrócitos e realizarem remielinação (Exp Neurol. Mar de 2005;192(1):11 - 24. Células precursoras de oligodendrócitos Nkx2.2+/Olig2+ endógenas falham em remielinar a medula espinhal do rato adulto desmielinizada na ausência de astrócitos. Talbott JF, Loy DN, Liu Y, Qiu MS, Bunge MB, Rao MS, Whittemore SR). Arai e Lo demonstraram in vitro que os astrócitos fornecem suporte de fator trófico solúvel às OPCs que protegem estas células do estresse oxidativo aumentado (Arai, K. e Lo e. H. (2010), Astrocytes protect oligodendrocyte precursor cells via MEK/ERK and PI3K/Akt signaling. J. Neurosci. Res., 88: 758-763. doi: 10.1002/jnr.22256). Outros mostraram que a inibição da ativação de as- trócitos nos parâmetros de encefalomielite autoimune experimental, neurite óptica experimental e lesão da medula espinhal leva a perfis de remielinação melhorados e medições de resultados funcionais (Brambilla R, Persaud T, Hu X, Karmally S,Shestopalov VI, Dvoriantchikova G, Ivanov D, Nathanson L, Barnum SR, Bethea JR. 2009. A inibição transgênica de NF-capa B astroglial melhora o resultado funcional em encefalomielite autoimune experimental através da supressão da inflamação crônica do sistema nervoso central. J Immunol 182:2628-2640; Brambilla R, Dvoriantchikova G, Barakat D, Ivanov D, Bethea JR, Shestopalov VI. 2012. A inibição transgênica de NF-capaB astroglial protege do dano no nervo óptico e perda de célula ganglionar da retina em neurite óptica experimental. J Neuroinflammation 9:213; Brambilla R, Brac- chi-Ricard V, Hu WH, Frydel B, Bramwell A, Karmally S, Green EJ, Bethea JR. 2005. A inibição de fator capaB nuclear astroglial reduz a inflamação e melhora a recuperação funcional depois da lesão da medula espinhal. J Exp Med 202:145-156).

[0114]Dado o papel que os astrócitos desempenham na facilitação de sobre-vivência e função de OPC, a justaposição de OPCs que expressam SEMA4D e astró- citos que expressam receptor de SEMA4D identificados neste relatório sugere que a ativação relacionada à doença de astrócitos com suprarregulação associada de re-ceptores de plexina-B e sinalização de SEMA4D apresentam efeitos profundos sobre a função de OPC.

[0115]Astrócitos e Suporte Neuronal. O acúmulo de evidência indica que os astrócitos desempenham papéis diretos na transmissão sináptica através da liberação regulada de moléculas sinapticamente ativas, incluindo glutamato, purinas (ATP e adenosina), GABA e D-serina (revisado por Halassa MM, Fellin T, Haydon PG (2007), The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends Mol Med 13:54-63; Nedergaard M, Ransom B, Goldman SA (2003) New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain. Trends Neurosci 26:523-530). A liberação de tais gliotransmissores ocorre em resposta às mudanças na atividade sináptica neuronal, envolve a excitabilidade de astrócitos, conforme refletido pelos aumentos na sinalização de cálcio de astrócitos e pode alterar a excitabilidade neuronal (Halassa MM, Fellin T, Haydon PG (2007), The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends Mol Med 13:54-63; Nedergaard M, Ransom B, Goldman SA (2003) New roles for astrocytes: redefining the functional ar-chitecture of the brain. Trends Neurosci 26:523-530). Além de apresentar efeitos dire-tos sobre a atividade sináptica por intermédio da liberação de gliotransmissores, os astrócitos apresentam o potencial de exercer influências potentes e a longo prazo so-bre a função sináptica através da liberação de fatores de crescimento e moléculas relacionadas (Barres BA (2008) The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron 60:430-440).

[0116]Astrócitos e Integridade da BSC. Os astrócitos desempenham um papel essencial na formação da barreira sangue-cérebro (BSC) e na regulação do transporte através da BSC, um processo homeostático crítico para a função neuronal apropriada. A BSC é uma estrutura endotelial do cérebro altamente complexa do sistema neurovascular diferenciado compreendida de perícitos, astrócitos e células endoteliais. O comprometimento da BSC foi implicado em diversas doenças neurodegenerativas, incluindo meningite, edema do cérebro, epilepsia, doença de Alzheimer (DA), doença de Parkinson (PD), acidente vascular cerebral, esclerose lateral amiotrófica (ELA) e esclerose múltipla (EM; revisado por Zlokovic BV. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer’s disease and other disorders. Nat Rev Neurosci. 2011;12:723 - 738).

[0117]Os astrócitos são células “polarizadas” em que as mesmas se esten-dem em processos membranosos especializados compreendidos de maquinaria ce-lular única e componentes de membrana que interagem com tipos celulares específi-cos. Por exemplo, processos astrocíticos próximos aos microvasos cerebrais ou pia são caracterizados por uma alta densidade do canal aquático, aquaporina 4 (Aqp4) (Neely JD, Amiry-Moghaddam M, Ottersen OP, Froehner SC, Agre P, Adams ME (2001) Syntrophin-dependent expression and localization of Aquaporin-4 water channel protein. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 14108 - 14113; Amiry-Moghaddam M, Otsuka T, Hurn PD, Traystman RJ, Haug FM, Froehner SC, Adams ME, Neely JD, Agre P, Ottersen OP, Bhardwaj A (2003) Um agrupamento dependente de alfa-sintrofina de AQP4 em podócito astroglial confere fluxo de água bidirecional entre sangue e cére-bro. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 2106 - 2111.). Ao contrário, os processos astrocí- ticos faceando as regiões sinápticas são enriquecidos em transportadores de gluta- mato, enquanto a densidade de Aqp4 é comparativamente baixa (Nielsen S, Nagelhus EA, Amiry-Moghaddam M, Bourque C, Agre P, Ottersen OP (1997) Specialized membrane domains for water transport in glial cells: High-resolution immunogold cytochemistry of aquaporin-4 in rat brain. J Neurosci 17, 171 - 180; Chaudhry FA, Lehre KP, van Lookeren Campagne M, Ottersen OP, Danbolt NC, Storm-Mathisen J (1995) Glutamate transporters in glial plasma membranes: Highly differentiated localizations revealed by quantitative ultrastructural immunocytochemistry. Neuron 15, 711 - 720). De forma interessante, a polarização astrocítica é interrompida em um cérebro que sofre neurodegeneração. Por exemplo, na definição de DA, intensidades de pigmentação de Aqp4 diminuem significantemente em regiões com carga da placa amiloide signifi- cante. De fato, Yang e colaboradores mostraram que o acúmulo de patologia amiloide em camundongos tg-ArcSwe DA está ligado temporal e espacialmente à perda de polarização de astrócitos (J Alzheimer’s Dis. 2011;27(4):711 - 22. doi: 10.3233/JAD- 2011 - 110725; Loss of astrocyte polarization in the tg-ArcSwe mouse model of Alzheimer’s disease. Yang JL, Lunde LK, Nuntagij P, Oguchi T, Camassa LM, Nilsson LN, Lannfelt L, Xu Y, Amiry-Moghaddam M, Ottersen OP, Torp R.).

[0118]Papel da Sinalização de SEMA4D na Promoção da Ativação de Astró- citos. Dada a associação da expressão do receptor de SEMA4D e o marcador de ativação de astrócitos GFAP, existe a possibilidade de que a sinalização de SEMA4D possa potencializar a ativação de astrócitos, desse modo, fornecendo um mecanismo de “alimentação direta” durante os estados da doença. Para examinar os efeitos de SEMA4D sobre a ativação de astrócitos, culturas primárias de astrócitos de rato foram geradas e tratadas com SEMA4D em isolamento ou em combinação com tioacetamida (TAA) (Exemplo 6 e Figura 18A abaixo), um agente hepatotóxico e hepatocarcinogê- nico bem conhecido que foi mostrado para induzir a expressão de plexina-B1 in vivo (Lim, J. S., Jeong, S. Y., Hwang, J. Y., Park, H. J., Cho, J. W., & Yoon, S. (2006) ou prostaglandina D2 (Exemplo 6 e Figura 18B abaixo), um fator de ativação conhecido produzido pela micróglia no SNC, Toxicogenomics Analysis on Thioacetamide-induced Hepatotoxicity in Mice. MOLECULAR & CELLULAR TOXICOLOGY, 2(2), 126 - 133.).

V. MÉTODOS DE TRATAMENTO USANDO ANTICORPOS ANTI-SEMA4D TERAPÊUTICOS

[0119]Os métodos da divulgação são dirigidos ao uso de moléculas de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpos, incluindo fragmentos de ligação ao antígeno, variantes e derivados dos mesmos, para tratar um sujeito que apresenta um transtorno neurodegenerativo. Em certas formas de realização, as células endoteliais expressam um receptor de SEMA4D, em outras, as células neuronais expressam um receptor de SEMA4D e, em outras, células endoteliais e neuronais expressam um receptor de SEMA4D. Em certas formas de realização, o receptor é Plexina-B1. Apesar do seguinte debate se referir à administração de um anticorpo anti-SEMA4D, os métodos descritos neste relatório também são aplicáveis aos fragmentos de ligação ao antí- geno, variantes e derivados destes anticorpos anti-SEMA4D ou outros produtos biológicos ou moléculas pequenas que conservam as propriedades desejadas dos anticorpos anti-SEMA4D da divulgação, por exemplo, capazes de se ligar especificamente à SEMA4D, por exemplo, à SEMA4D humana, de camundongo ou humana e de camundongo, que apresentam atividade neutralizante de SEMA4D e/ou bloqueiam a interação de SEMA-4D com seu receptor, por exemplo, Plexina-B1. Em uma outra forma de realização, os métodos se referem à administração de um anticorpo anti- SEMA4D, os métodos descritos neste relatório também podem se referir à administração de moléculas de ligação anti-Plexina-B1 ou anti-Plexina-B2 que são capazes de se ligar especificamente à Plexina-B1 e/ou Plexina-B2 e bloquear a inte-ração de SEMA-4D com um ou ambos de seu receptores de Plexina, por exemplo, Plexina-B1 e/ou Plexina-B2.

[0120]Em uma forma de realização, o tratamento inclui a aplicação ou admi-nistração de uma molécula de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou outro produto biológico ou pequena molécula que se liga e neutraliza SEMA4D, conforme descrito neste relatório, a um paciente, onde o paciente apresenta, ou apresenta o risco de desenvolver um trans-torno neurodegenerativo. Em uma outra forma de realização, o tratamento também é intencionado a incluir a aplicação ou administração de uma composição farmacêutica que compreende a molécula de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, a um paciente, onde o paciente apresenta, ou apresenta o risco de desenvolver um transtorno neurodegenerativo.

[0121]As moléculas de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpos ou fra-gmentos de ligação dos mesmos, conforme descrito neste relatório, são úteis para o tratamento de vários transtornos neurodegenerativos. Em algumas formas de realiza-ção, o tratamento de um transtorno neurodegenerativo é intencionado a induzir uma melhora nos sintomas associados com o transtorno. Em outras formas de realização, o tratamento de um transtorno neurodegenerativo é intencionado a reduzir, retardar ou interromper um aumento nas manifestações do sintoma. Em outras formas de re-alização, o tratamento de um transtorno neurodegenerativo é intencionado a inibir, por exemplo, suprimir, retardar, prevenir, interromper ou reverter uma manifestação dos sintomas. Em outras formas de realização, o tratamento de um transtorno neurodege- nerativo é intencionado a aliviar, em algum grau, um ou mais entre os sintomas associados com o transtorno. Nestas situações, os sintomas podem ser sintomas neuro- psiquiátricos, sintomas cognitivos e/ou disfunção motora. Em outras formas de realização, o tratamento de um transtorno neurodegenerativo é intencionado a reduzir morbidez e mortalidade. Em outras formas de realização, o tratamento de um transtorno neurodegenerativo é intencionado a melhorar a qualidade de vida.

[0122]Em uma forma de realização, a divulgação se refere ao uso de molécu-las de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos, como um medicamento, em particular, para o uso no tratamento de transtornos neurodegenerativos para melhorar os sinto-mas associados com o transtorno.

[0123]De acordo com os métodos da presente divulgação, pelo menos uma molécula de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de liga-ção ao antígeno, variante ou derivado do mesmo ou outro produto biológico ou pe-queno molécula, conforme definido em outra parte neste relatório, pode ser usada para promover uma resposta terapêutica positiva com respeito ao transtorno neuro- degenerativo. Uma “resposta terapêutica positiva” com respeito ao transtorno neuro- degenerativo é intencionada a incluir uma melhora nos sintomas associados com o transtorno. Tais respostas terapêuticas positivas não são limitada à via de administra-ção e podem compreender administração ao doador, ao tecido do doador (tal como, por exemplo, perfusão de órgão), ao hospedeiro, qualquer combinação dos mesmos e semelhantes. Em particular, os métodos fornecidos neste relatório são dirigidos à inibição, prevenção, redução, alívio ou diminuição da progressão de um transtorno neurodegenerativo em um paciente. Assim, por exemplo, uma melhora no transtorno pode ser caracterizada como uma ausência de sintomas clinicamente observáveis, uma diminuição na incidência de sintomas clinicamente observáveis ou uma mudança nos sintomas clinicamente observáveis.

[0124]As atividades que mudam os sintomas associados com os transtornos neurodegenerativos podem ser detectadas e medidas usando modelos de camun-dongo in vivo. Em certas formas de realização, um modelo de camundongo CVN pode ser utilizado. O camundongo CVN incorpora as mutações da proteína precursora Aβ que são características da doença de Alzheimer (DA) familiar em três linhagens inde-pendentes junto com uma mutação que reproduz algumas das condições da inflama-ção do cérebro associada com DA (Colton et al., J Alzheimer’s Dis,15:571-587, 2008; Van Nostrand et al., Stroke 41:S135-S138, 2010). O modelo CVN exibe algumas das patologias primárias associadas com a doença de Alzheimer: placas Aβ, tau hiperfos- forilada causando emaranhados neurofibrilares e morte celular (perda neuronal) e perda de memória espacial compatível e déficits neurovasculares. Em comparação a outros mutantes de camundongo usados para modelar a doença de Alzheimer, o Ca-mundongo CVN mostra mais patologias relacionadas a Alzheimer em uma idade mais precoce. Em outras formas de realização, o modelo de camundongo YAC128 de Doença de Huntington (DH) pode ser utilizado. Os camundongos YAC128 expressam o gene de huntingtin humano mutante de comprimento total (mHTT) e recapitulam precisamente muitos dos sinais e sintomas de DH. Deve ser avaliado que pessoas habilitadas na técnica reconhecerão que outros modelos foram descritos e proveitosamente utilizados para estudos de mecanismos da doença e tratamento de sintomas em transtornos neurodegenerativos na literatura e que a presente divulgação não deve ser limitada a qualquer modelo particular.

[0125]As moléculas de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpos ou fra-gmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos ou outros pro-dutos biológicos ou moléculas pequenas podem ser usados em combinação com pelo menos um ou mais outros tratamentos para transtornos neurodegenerativos; onde a terapia adicional é administrada antes, durante ou subsequente à terapia com molécula de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao an- tígeno, variante ou derivado do mesmo. Assim, onde as terapias combinadas compreendem a administração de uma molécula de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo em combinação com a administração de um outro agente terapêutico, os métodos da di-vulgação abrangem coadministração, usando formulações separadas ou uma formu-lação farmacêutica única, com administração simultânea ou consecutiva em qualquer ordem.

[0126]Para aplicar os métodos e sistemas da divulgação, em certas formas de realização, as amostras ou imagens a partir de um paciente podem ser obtidas antes ou depois da, ou antes e depois da administração de uma terapia que compreende uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação isolada que se liga especifica-mente à Semaforina-4D (SEMA4D), a um sujeito determinado a apresentar um trans-torno neurodegenerativo ou a um sujeito suspeito de apresentar um transtorno neuro- degenerativo. Em alguns casos, amostras ou imagens sucessivas podem ser obtidas a partir do paciente depois do início da terapia ou depois do término da terapia ou antes e depois de terapia. As amostras ou imagens, por exemplo, podem ser solicitadas por um prestador de cuidados de saúde (por exemplo, um médico) ou prestador de benefícios de cuidados de saúde, obtidas e/ou processadas pelos mesmos ou por um prestador de cuidados de saúde diferente (por exemplo, um enfermeiro, um hospital) ou um laboratório clínico e depois do processamento, os resultados podem ser ainda enviados para um outro prestador de cuidados de saúde, prestador de benefícios de cuidados de saúde ou ao paciente. Similarmente, a medição/determinação de um ou mais escores, comparações entre avaliação de escores dos escores e decisões de tratamento pode ser realizada por um ou mais prestadores de cuidados de saúde, prestadores de benefícios de cuidados de saúde e/ou laboratórios clínicos.

[0127]Em certos aspectos de qualquer um entre os procedimentos anterior-mente mencionados, o transtorno neurodegenerativo é selecionado a partir de um grupo que consiste de doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Hun-tington, síndrome de Down, ataxia, esclerose lateral amiotrófica (ELA), demência frontotemporal (DFT), disfunção cognitiva relacionada ao HIV, Lúpus do SNC, perda cognitiva leve ou uma combinação dos mesmos. Em certos aspectos de qualquer um entre os procedimentos anteriormente mencionados, o transtorno neurodegenerativo é doença de Alzheimer ou doença de Huntington.

[0128]Em alguns aspectos, um prestador de cuidados de saúde pode admi-nistrar ou instruir um outro prestador de cuidados de saúde a administrar uma terapia compreendendo uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação isolada que se liga especificamente à Semaforina-4D (SEMA4D), onde o sujeito apresenta, é deter-minado a apresentar ou é suspeito a apresentar um transtorno neurodegenerativo. Um prestador de cuidados de saúde pode implementar ou instruir um outro prestador de cuidados de saúde ou paciente a realizar as seguintes ações: obter uma amostra ou imagem, processar uma amostra ou imagem, apresentar uma amostra ou imagem, receber uma amostra ou imagem, transferir uma amostra ou imagem, analisar ou me-dir uma amostra ou imagem, quantificar uma amostra ou imagem, fornecer os resul-tados obtidos depois de analisar/medir/quantificar uma amostra ou imagem, receber os resultados obtidos depois de analisar/medir/quantificar uma amostra ou imagem, comparar/registrar os resultados obtidos depois de analisar/medir/quantificar uma ou mais amostras ou imagens, fornecer a comparação/escore a partir de uma ou mais amostras, obter a comparação/escore a partir de uma ou mais amostras ou imagens, administrar uma terapia, por exemplo, uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação isolada que se liga especificamente à Semaforina-4D (SEMA4D), iniciar a administração de uma terapia, interromper a administração de uma terapia, continuar a administração de uma terapia, interromper temporariamente a administração de uma terapia, aumentar a quantidade de um agente terapêutico administrado, diminuir a quantidade de um agente terapêutico administrado, continuar a administração de uma quantidade de um agente terapêutico, aumentar a frequência de administração de um agente terapêutico, diminuir a frequência de administração de um agente terapêutico, manter a mesma frequência de dosagem em um agente terapêutico, substituir uma terapia ou agente terapêutico por pelo menos uma outra terapia ou agente terapêutico, combinar uma terapia ou agente terapêutico com pelo menos uma outra terapia ou agente terapêutico adicional.

[0129]Em alguns aspectos, um prestador de benefícios de cuidados de saúde pode autorizar ou negar, por exemplo, a coleta de uma amostra, processamento de uma amostra, apresentação de uma amostra, recepção de uma amostra, transferência de uma amostra, análise ou medição de uma amostra, quantificação de uma amostra, provisão dos resultados obtidos depois de analisar/medir/quantificar uma amostra, transferência dos resultados obtidos depois de analisar/medir/quantificar uma amostra, comparação/registro dos resultados obtidos depois de analisar/medir/quantificar uma ou mais amostras, transferência da comparação/escore a partir de uma ou mais amostras, administração de uma terapia ou agente terapêutico, início da administração de uma terapia ou agente terapêutico, término da administração de uma terapia ou agente terapêutico, continuação da administração de uma terapia ou agente terapêutico, interrupção temporária da administração de uma terapia ou agente terapêutico, aumento da quantidade de agente terapêutico administrado, diminuição da quantidade de agente terapêutico administrado, continuação da administração de uma quantidade de um agente terapêutico, aumento na frequência de administração de um agente terapêutico, diminuição na frequência de administração de um agente terapêutico, manutenção da mesma frequência de dosagem em um agente terapêutico, substituição de uma terapia ou agente terapêutico por pelo menos uma outra terapia ou agente terapêutico ou combinação de uma terapia ou agente terapêutico com pelo menos uma outra terapia ou agente terapêutico adicional.

[0130]Em certos aspectos de qualquer um entre os procedimentos anterior-mente mencionados, o transtorno neurodegenerativo é selecionado a partir de um grupo que consiste de doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Hun-tington, síndrome de Down, ataxia, esclerose lateral amiotrófica (ELA), demência frontotemporal (DFT), disfunção cognitiva relacionada ao HIV, Lúpus do SNC, perda cognitiva leve ou uma combinação dos mesmos. Em certos aspectos de qualquer um entre os procedimentos anteriormente mencionados, o transtorno neurodegenerativo é doença de Alzheimer ou doença de Huntington.

[0131]Além disso, um prestador de benefícios de cuidados de saúde, por exemplo, pode autorizar ou negar a prescrição de uma terapia, autorizar ou negar cobertura para terapia, autorizar ou negar reembolso para o custo da terapia, deter-minar ou negar eligibilidade para terapia etc.

[0132]Em alguns aspectos, um laboratório clínico, por exemplo, pode coletar ou obter uma amostra, processar uma amostra, apresentar uma amostra, receber uma amostra, transferir uma amostra, analisar ou medir uma amostra, quantificar uma amostra, fornecer os resultados obtidos depois de analisar/medir/quantificar uma amostra, receber os resultados obtidos depois de analisar/medir/quantificar uma amostra, comparar/registrar os resultados obtidos depois de analisar/medir/quantificar uma ou mais amostras, fornecer a comparação/escore a partir de uma ou mais amos-tras, obter a comparação/escore a partir de uma ou mais amostras ou outras ativida-des relacionadas.

[0133]Em certos aspectos de qualquer um entre os procedimentos anterior-mente mencionados, o transtorno neurodegenerativo é selecionado a partir de um grupo que consiste de doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Hun-tington, síndrome de Down, ataxia, esclerose lateral amiotrófica (ELA), demência frontotemporal (DFT), disfunção cognitiva relacionada ao HIV, Lúpus do SNC, perda cognitiva leve ou uma combinação dos mesmos. Em certos aspectos de qualquer um entre os procedimentos anteriormente mencionados, o transtorno neurodegenerativo é doença de Alzheimer ou doença de Huntington.

[0134]Em certos aspectos, qualquer um entre os procedimentos anterior-mente mencionados pode ser usado para determinar se um sujeito apresenta um transtorno neurodegenerativo. Em certos aspectos, o transtorno neurodegenerativo é selecionado a partir de um grupo que consiste de doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, síndrome de Down, ataxia, esclerose lateral amio- trófica (ELA), demência frontotemporal (DFT), disfunção cognitiva relacionada ao HIV, Lúpus do SNC, perda cognitiva leve ou uma combinação dos mesmos. Em certos aspectos de qualquer um entre os procedimentos anteriormente mencionados, o transtorno neurodegenerativo é doença de Alzheimer ou doença de Huntington.

[0135]Em alguns aspectos, um prestador de cuidados de saúde, laboratório clínico ou outra entidade, por exemplo, pode coletar ou obter uma imagem, processar uma imagem, apresentar uma imagem, receber uma imagem, transferir uma imagem, analisar ou medir uma imagem, quantificar uma imagem, fornecer os resultados obti-dos depois de analisar/medir/quantificar uma imagem, receber os resultados obtidos depois de analisar/medir/quantificar uma imagem, comparar/registrar os resultados obtidos depois de analisar/medir/quantificar uma ou mais imagens, fornecer a compa- ração/escore a partir de uma ou mais imagens, obter a comparação/escore a partir de uma ou mais imagens ou outras atividades relacionadas. As imagens que podem ser usadas em tais aspectos incluem, mas não são limitadas às imagens obtidas por an- giografia, ultrassom, tomografia computadorizada (TC), imageamento por ressonância magnética (IRM), tomografia de emissão positrônica (TEP), tomografia de coerência óptica (TCO), espectroscopia no infravermelho próximo (EIP) e fluorescência NIR. Em certas formas de realização, as técnicas de imageamento que foram descritas na literatura podem ser usadas (Tardif et al. Circ Cardiovasc Imaging 4:319 - 333 (2011)).

VI. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E MÉTODOS DE ADMINISTRAÇÃO

[0136]Os métodos para preparar e administrar moléculas de ligação anti- SEMA4D, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos a um sujeito em necessidade dos mesmos são bem conhe-cidos a, ou são facilmente determinados por aqueles habilitados na técnica. A via de administração da molécula de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpo ou frag-mento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo, pode ser, por exemplo, oral, parenteral, através de inalação ou tópica. O termo parenteral, conforme usado neste relatório, inclui, por exemplo, administração intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, retal ou vaginal. Embora todas estas formas de administração sejam claramente consideradas no escopo da divulgação, um exemplo de uma forma para administração seria uma solução para injeção, em particular, para injeção intravenosa ou intra-arterial ou gota. Uma composição farmacêutica adequada para injeção pode compreender um tampão (por exemplo, tampão acetato, fosfato ou citrato), um tensoativo (por exemplo, polissorbato), opcionalmente, um agente estabilizador (por exemplo, albumina humana) etc. Entretanto, em outros métodos compatíveis com os ensinamentos neste relatório, as moléculas de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos, podem ser diretamente liberados ao sítio da população celular adversa, desse modo, aumentando a exposição do tecido doente ao agente terapêutico.

[0137]Conforme debatido neste relatório, as moléculas de ligação anti- SEMA4D, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos, podem ser administrados em uma quantidade farmaceuti- camente eficaz para o tratamento in vivo de transtornos neurodegenerativos. Neste respeito, será avaliado que as moléculas de ligação divulgadas podem ser formuladas, de modo a facilitar a administração e promover a estabilidade do agente ativo. Em certas formas de realização, as composições farmacêuticas, de acordo com a presente divulgação, compreendem um portador estéril farmaceuticamente aceitável, não tóxico, tal como solução salina fisiológica, tampões não tóxicos, preservantes e semelhantes. Para os propósitos do presente pedido, uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma molécula de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo, deve ser mantida para significar uma quantidade suficiente para obter ligação eficaz a um alvo e para obter um benefício, por exemplo, melhorar os sintomas associados com um transtorno neu- rodegenerativo.

[0138]As composições farmacêuticas usadas nesta divulgação compreendem portadores farmaceuticamente aceitáveis, incluindo, por exemplo, trocadores de íon, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas do soro, tais como albumina do soro humano, substâncias tampão, tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de glicerídeo parciais de ácidos graxos de vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, tais como sulfato de protamina, fosfato de hidrogênio dissó- dico, fosfato de hidrogênio potássico, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinilpirrolidona, substâncias com base em celulose, polie- tilenoglicol, carboximetilcelulose sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros em bloco de polietileno-polioxipropileno, polietilenoglicol e gordura de lã.

[0139]Preparações para administração parenteral incluem soluções, suspen-sões e emulsões aquosas ou não aquosas e estéreis. Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, tais como óleo de oliva e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. Portadores aquosos incluem, por exemplo, água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas, incluindo solução salina e meio tamponado. Na divulgação objeto, os portadores farmaceutica- mente aceitáveis incluem, mas não são limitados a tampão fosfato 0,01 a 0,1 M, por exemplo, cerca de 0,05 M, ou solução salina a 0,8 %. Outros veículos parenterais comuns incluem soluções de fosfato de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, óleos de Ringer lactados ou fixos. Veículos intravenosos incluem reabaste- cedores de fluido e nutriente, reabastecedores de eletrólitos, tais como aqueles com base em dextrose de Ringer e semelhantes. Preservantes e outros aditivos também podem estar presentes, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes e semelhantes.

[0140]Mais particularmente, as composições farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas estéreis (onde solúveis em água) ou disper-sões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões inje-táveis estéreis. Em tais casos, a composição deve ser estéril e deve ser fluida na medida em que exista fácil seringabilidade. A mesma deve ser estável sob as condi-ções de fabricação e armazenagem e pode ser preservada contra a ação contami- nante de micro-organismos, tais como bactérias e fungos. O portador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exem-plo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e semelhantes) e misturas ade-quadas dos mesmos. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exi-gido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Formulações adequadas para o uso nos métodos terapêuticos divulgado neste relatório são descritas em Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16a ed. (1980).

[0141]A prevenção da ação de micro-organismos pode ser obtida através de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, agentes isotônicos podem ser incluídos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[0142]Em qualquer caso, as soluções injetáveis estéreis podem ser prepara-das através da incorporação de um composto ativo (por exemplo, um anticorpo anti- SEMA4D ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo, por si só ou em combinação com outros agentes ativos) na quantidade exigida em um solvente apropriado com uma ou uma combinação de ingredientes enumerados neste relatório, conforme exigido, seguido por esterilização por filtração. Em geral, as dispersões são preparadas através da incorporação do composto ativo em um veículo estéril, que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes exigidos a partir daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação incluem secagem a vácuo e liofilização, que fornecem um pó de um ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma solução previamente estéril-filtrada do mesmo. As preparações para injeções são processadas, enchidas em recipientes, tais como am-polas, bolsas, garrafas, seringas ou frascos, e vedada sob condições assépticas, de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Além disso, as preparações podem ser embaladas e vendidas na forma de um kit. Tais artigos de fabricação podem apre-sentar marcações ou insertos na embalagem indicando que as composições associadas são úteis para tratar um sujeito que sofre de, ou predisposto a uma doença ou transtorno.

[0143]As formulações parenterais podem ser uma dose de bolo única, uma infusão ou uma dose de bolo de carregamento, seguido com uma dose de manuten-ção. Estas composições podem ser administradas em intervalos fixos ou variáveis específicos, por exemplo, uma vez ao dia ou em uma base “conforme necessário”.

[0144]Certas composições farmacêuticas usadas nesta divulgação podem ser oralmente administradas em uma forma de dosagem aceitável incluindo, por exemplo, cápsulas, tabletes, suspensões ou soluções aquosas. Certas composições farmacêuticas também podem ser administradas através de aerossol nasal ou inalação. Tais composições podem ser preparadas como soluções em solução salina, utilizando álcool benzílico ou outros preservantes adequados, promotores de absorção para realçar a biodisponibilidade e/ou outros agentes solubilizantes ou dispersantes convencionais.

[0145]A quantidade de uma molécula de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivado do mesmo, que será combinada com os materiais portadores para produzir uma forma de dosagem única variarão depen-dendo do hospedeiro tratado e do modo de administração particular. A composição pode ser administrada como uma dose única, múltiplas doses ou durante um período de tempo estabelecido em uma infusão. Os regimes de dosagem também podem ser ajustados para fornecer a resposta desejada ideal (por exemplo, uma resposta tera-pêutica ou profilática).

[0146]De acordo com o escopo da presente divulgação, os anticorpos anti- SEMA4D ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos podem ser administrados a um ser humano ou outro animal, de acordo com os méto-dos de tratamento anteriormente mencionados em uma quantidade suficiente para produzir um efeito terapêutico. Os anticorpos anti-SEMA4D ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos podem ser administrados a tal ser humano ou outro animal em uma forma de dosagem convencional preparada através da combinação do anticorpo da divulgação com um portador ou diluente convencional farmaceuticamente aceitável, de acordo com técnicas conhecidas. Será reconhecido por uma pessoa de habilidade na técnica que a forma e caráter do portador ou diluente farmaceuticamente aceitável são ditados pela quantidade de ingrediente ativo com o qual deve ser combinado, a via de administração e outras variáveis bem conhecidas. Aqueles habilitados na técnica ainda avaliarão que um coquetel compreendendo uma ou mais espécies de moléculas de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos da divulgação, podem ser usadas.

[0147]“Dose ou quantidade terapeuticamente eficaz” ou “quantidade eficaz” significa uma quantidade de molécula de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, anti-corpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo, que quando administrada realiza uma resposta terapêutica positiva com respeito ao trata-mento de um paciente com uma doença que deve ser tratada. No caso de um transtorno neurodegenerativo, uma resposta terapêutica positiva pode aliviar os sintomas do transtorno; diminuir, reduzir, retardar ou interromper a incidência dos sintomas; diminuir, reduzir, retardar a severidade dos sintomas; inibir, por exemplo, suprimir, retardar, prevenir, interromper ou reverter a manifestação dos sintomas; aliviar, em algum grau, um ou mais entre os sintomas associados com o transtorno; reduzir morbidez e mortalidade; melhorar a qualidade de vida; ou uma combinação de tais efeitos.

[0148]Doses terapeuticamente eficazes das composições da presente divul-gação para a diminuição na incidência dos sintomas variam dependendo de muitos fatores diferentes, incluindo meios de administração, sítio alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é humano ou um animal, outras medicações administradas e se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em certas formas de realização, o paci-ente é um ser humano, mas mamíferos não humanos, incluindo mamíferos transgêni- cos, também podem ser tratados. As dosagens de tratamento podem ser tituladas usando métodos de rotina conhecidos àqueles de habilidade na técnica para otimizar a segurança e a eficácia.

[0149]A quantidade de pelo menos uma molécula de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação, variante ou derivado do mesmo, que será administrada é facilmente determinada por uma pessoa de habilidade comum na técnica sem experimentação indevida, dada a presente divulgação. Os fatores que influenciam o modo de administração e a quantidade respectiva de pelo menos uma molécula de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo, incluem, mas não são limitados à severidade da doença, o histórico da doença e a idade, altura, peso, saúde e condição física do indivíduo que sofre a terapia. Similarmente, a quantidade de molécula de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpo ou fragmento, variante ou derivado do mesmo, que será administrada será dependente do modo de administração e se o sujeito sofrerá uma dose única ou múltiplas doses deste agente.

[0150]A divulgação também fornece o uso de uma molécula de ligação anti- SEMA4D, por exemplo, anticorpo da divulgação ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo, na fabricação de um medicamento para tratar um sujeito para tratar um transtorno neurodegenerativo, em que o medicamento é usado em um sujeito que foi pré-tratado com pelo menos uma outra terapia. “Pré-tratado” ou “pré-tratamento” significa que o sujeito recebeu uma ou mais terapias (por exemplo, foi tratado com pelo menos uma outra terapia neurodegenerativa) antes de receber o medicamento compreendendo a molécula de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo. “Pré- tratado” ou “pré-tratamento” inclui sujeitos que foram tratados com pelo menos uma outra terapia dentro de 2 anos, dentro de 18 meses, dentro de 1 ano, dentro de 6 meses, dentro de 2 meses, dentro de 6 semanas, dentro de 1 mês, dentro de 4 semanas, dentro de 3 semanas, dentro de 2 semanas, dentro de 1 semana, dentro de 6 dias, dentro de 5 dias, dentro de 4 dias, dentro de 3 dias, dentro de 2 dias ou ainda dentro de 1 dia antes do início do tratamento com o medicamento compreendendo a molécula de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, os anticorpos monoclonais VX15/2503, 67 ou 76 divulgados neste relatório ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado dos mesmos. Não é necessário que o sujeito tenha respondido ao pré-tratamento com a terapia ou terapias anteriores. Assim, o sujeito que recebe o medicamento compreendendo a molécula de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo, pode ter respondido ou não ao pré-tratamento com a terapia anterior ou a uma ou mais terapias anteriores onde o pré-tratamento compreendeu múltiplas terapias.

[0151]A prática da presente divulgação utilizará, a menos que de outro modo indicado, técnicas convencionais de biologia celular, cultura celular, biologia molecular, biologia transgênica, microbiologia, DNA recombinante e imunologia, que estão dentro da habilidade da técnica. Tais técnicas são completamente explicadas na lite-ratura. Veja, por exemplo, Sambrook et al. ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2a ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al. ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I e II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Syn-thesis; Mullis et al. Pat. U.S. No 4.683.195; Hames e Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames e Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller e Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 e 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, Londres); Weir e Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); e em Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley e Sons, Baltimore, Md.).

[0152]Princípios gerais de construção de anticorpos são apresentados em Borrebaeck ed. (1995) Antibody Engineering (2a ed.; Oxford Univ. Press). Princípios gerais de construção de proteína são apresentados em Rickwood et al. eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford Eng.). Princípios gerais de anticorpos e ligação de anticorpo-hapteno são apresenta-dos em: Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2a ed.; Sinauer Associates, Sunder-land, Mass.); e Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman e Hall, Nova Iorque, N.Y.). Adicionalmente, os métodos padrão em imunologia conheci-dos na técnica e não especificamente descritos são, em geral, seguidos como no Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nova Iorque; Stites et al. eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8a ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) e Mishell e Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman e Co., NY).

[0153]Trabalhos de referência padrão que apresentam os princípios gerais de imunologia incluem Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nova Iorque; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett et al. eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimensão in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) “Monoclonal Antibody Technology” em Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology ed. Burden et al., (Elsevere, Amsterdam); Goldsby et al. eds. (2000) Kuby Immunology (4a ed.; H. Freemand & Co.); Roitt et al. (2001) Immunology (6a ed.; Londres: Mosby); Abbas et al. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5a ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann e Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlang); Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall 2003); Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach e Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press).

[0154]Todas as referências citadas acima, assim como todas as referências citadas neste relatório, são integralmente incorporadas neste relatório como referên-cia.

[0155]Os exemplos seguintes são oferecidos por via de ilustração e não por via de limitação.

EXEMPLOS Exemplo 1: Teste do efeito de uma molécula de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo, por exemplo, VX15/2503, 67 ou 76 sobre a doença de Alzheimer (DA) no Modelo de Camundongo CVN

[0156]Projeto Experimental. O modelo CVN foi usado para estudar o efeito do anticorpo anti-SEMA4D (por exemplo, MAb 67) sobre as patologias e sintomas asso-ciados com DA. O camundongo CVN incorpora mutações da proteína precursora Aβ humana que são características de doença de Alzheimer (DA) familiar nas três linha-gens independentes junto com uma deleção de um gene (óxido nítrico sintase-2) para promover mecanismos neuroinflamatórios associados com DA (Colton et al., J Alzhei- mers Dis,15:571-587, 2008; Van Nostrand et al., Stroke 41:S135-S138, 2010).

[0157]O projeto experimental básico é mostrado na FIG. 1. Camundongos CVN propensos à doença de Alzheimer (obtidos a partir da Charles River) foram usa-dos para testar o efeito de uma molécula de ligação anti-SEMA4D sobre DA. Em 10 semanas de idade, os camundongos foram submetidos à hemorragia para obter níveis de sorologia de referência. Entre 10 a 12 semanas de idade, os camundongos sofreram pré-teste comportamental para garantir que eles foram capazes de participar no estudo. Após a randomização, os camundongos CVN foram tratados semanalmente com anticorpo anti-SEMA4D (Mab-67) ou isotipo controle (MAb 2B8) (30 mg/kg, i.v.) a partir da semana 26 a 38, tempo no qual foram administrados vários testes compor- tamentais. Os testes comportamentais foram o teste de campo aberto e o labirinto radial aquático.

[0158]Teste de Campo Aberto - A atividade exploratória do animal é estudada no teste de campo aberto nas 10 e 38 semanas de idade para possível hipo- ou hipe- ratividade induzida por tratamento (teste controle) ou outro efeito. Os camundongos são levados ao ambiente experimental durante pelo menos 30 min de aclimatação às condições do ambiente experimental antes do teste. As câmaras de atividade (Med Associates Inc, St Albans, VT; 27 x 27 x 20,3 cm) são equipadas com feixes IR. Os camundongos são colocados no centro da câmara e seu comportamento é registrado durante 30 min em caixas de 5-minutos. A análise quantitativa é realizada nas seguintes cinco medições dependentes: locomoção total, locomoção no centro do campo aberto, taxa da parte traseira no centro, frequência e velocidade da parte traseira total. Os animais são testados em condições de baixo estresse onde a luz é diminuída em aproximadamente 10 a 30 lux de luz vermelha.

[0159]Labirinto Radial Aquático - Em 11 e 39 semanas de idade, os camun-dongos são levados ao ambiente experimental durante pelo menos 30 min de aclimatação às condições experimentais ambientais antes do teste. Labirinto radial aquático de dois dias foi descritos previamente em detalhes (Alamed et al. 2006). Brevemente, um labirinto de seis ramos é submerso em uma piscina de água e uma plataforma é colocada na extremidade de cada ramo. O camundongo recebe 15 experimentos por dia durante 2 d e em cada experimento é iniciado em um ramo diferente, enquanto o ramo contendo a plataforma permanece o mesmo para cada camundongo. A localização da plataforma da qual permanece constante durante os 2 d para cada camundongo em uma dada idade, mas esta localização é modificada para cada camundongo entre as 11 e 40 semanas de idade do ponto no tempo do teste. Usando pistas visuais em torno do ambiente, o camundongo aprende a posição da plataforma de escape. Os primeiros 10 experimentos são considerados treinamento e são alternados entre uma plataforma visível e uma oculta. Os experimentos finais para o dia 1 e todos os experimentos no dia 2 utilizam uma plataforma oculta. O número de erros (entradas no ramo incorreto) foi contado durante um período de 1 min. Os erros são medidos durante os três experimentos resultando em 10 bloqueios durante o período de 2 d.

[0160]Após a conclusão do teste comportamental, os camundongos foram sacrificados e os tecidos do cérebro foram processados para imuno-histoquímica embebida em parafina fixada com formalina (FFPE). Tendo em vista os relatos de um papel para SEMA4D na indução de sinapses GABAérgicas inibitórias (Kuzirian et al., J Neuroscience, 33:8961- 8973 • 8961, 2013), a densidade das vesículas e intensidade da expressão de Transportador GABA Vesicular (VGAT) foram determinadas no Giro denteado de camundongos CVN tratados. O Giro denteado é um dos poucos centros principais de neurogênese continuada no SNC do adulto e é considerado desempe-nhar um papel na formação e retenção de memória. Para todos os testes, a análise estatística foi realizada usando o teste ANOVA bidirecional.

[0161]Anti-SEMA4D reduz o comportamento do tipo ansiedade. A atividade exploratória foi estudada em grupos de 12 camundongos CVN propensos à DA trata-dos com anti-SEMA4D ou isotipo controle. Um teste de campo aberto foi administrado em 38 semanas de idade para possíveis efeitos induzidos pelo tratamento sobre a atividade locomotora e comportamento do tipo ansiedade. Os camundongos foram colocados no centro de uma câmara iluminada e seu comportamento foi registrado durante 30 min em seis caixas de tempo de 5-minutos. A análise quantitativa foi reali-zada para locomoção total (FIG. 2A) e a locomoção no centro do campo aberto (FIG. 2B), que, como é conhecido na técnica, é uma medida do comportamento relacionado à ansiedade.

[0162]Os resultados mostraram que os camundongos CVN propensos à DA tratados semanalmente com o anticorpo anti-SEMA4D manifestam maior exploração do campo aberto e menos comportamento do tipo ansiedade (incursões no centro do campo) em relação aos camundongos tratados com MAb controle 2B8. Estes resulta-dos são mostrados na FIG. 2.

[0163]Anti-SEMA4D melhora a memória espacial. Em 39 semanas de idade, os camundongos CVN tratados com anti-SEMA4D ou isotipo controle 2B8 (n = 9 a 13/grupo) foram testados durante 2 dias em um labirinto radial aquático (Alamed et al. 2006, mostrado na FIG. 3A). Brevemente, cada camundongo recebeu 15 experimen-tos por dia (3 experimentos per bloqueio) em cada um dos dois dias consecutivos. Cada experimento foi iniciado a partir de um ramo diferente, enquanto o ramo con-tendo a plataforma permaneceu o mesmo para cada experimento. Os bloqueios de experimento no Dia 1 foram alternados entre uma plataforma visível e uma oculta para propósitos de treinamento. Todos os experimentos no Dia 2 foram realizados com uma plataforma oculta para avaliar a memória espacial. O Dia 1 foi um período de treina- mento/aprendizagem e no dia 2 a latência para descobrir a plataforma foi registrada.

[0164]Os resultados mostraram que a administração de anticorpo anti- SEMA4D (MAb 67) leva a uma diminuição mensurável na latência sugerindo memória espacial melhorada em comparação à coorte controle (tratada com MAb 2B8). Os resultados são mostrados na FIG. 3B.

[0165]Anti-SEMA4D diminui as Sinapses GABAérgicas. As seções de tecido de cérebro FFPE a partir de camundongos CVN e WT tratados com Mab-67 ou MAb- 2B8 (n = 9 a 13/grupo) foram pigmentadas com anticorpo anti-VGAT para detectar vesículas sinápticas GABAérgicas. As porcentagens de sinal de vesícula VGAT- positiva e intensidades de sinal VGAT por vesícula foram quantificadas no giro denteado de todos os animais e normalizadas à área do giro denteado total escaneada.

[0166]Os resultados mostraram que o tratamento com anticorpo anti-SEMA4D de camundongos DA CVN levam a uma tendência de diminuição de densidade de vesículas VGAT positivas (FIG. 4A) e uma diminuição estatisticamente significante no nível de intensidade de pigmentação de VGAT por vesícula (FIG. 4B), uma descoberta que sugere um papel para SEMA4D na modulação de sinalização GABAérgica in vivo e pode fornecer visão mecanicista nos efeitos comportamentais observados nos camundongos CVN tratados com MAb 67. A sinalização GABAérgica está associada com uma classe heterogênea de neurônios inibitórios. Conforme demonstrado na FIG. 15 do Exemplo 6 abaixo, efeitos mais significantes de tratamento com anticorpo anti- SEMA4D sobre a densidade de neurônios inibitórios são observados quando a análise é focada no subconjunto de neurônios positivos para somatostatina, NPY ou NPY2R.

Exemplo 2: Teste do efeito de uma molécula de ligação anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado do mesmo, por exemplo, MAbs VX15/2503 ou 67, sobre a doença de Huntington (DH) no modelo de camundongo YAC128.

[0167]Projeto Experimental. Um segundo experimento utilizando um modelo YAC128 in vivo foi realizado para estudar o efeito do anticorpo anti-SEMA4D sobre as patologias e sintomas associados com DH. O projeto experimental básico foi similar àquele mostrado no Exemplo 1 e FIG. 1, acima, mas a dosagem de MAb (anticorpo), neste caso, foi semanalmente realizada a partir da semana 6 até a semana 47 com 13 e 22 camundongos YAC128 ou WT por grupo. Os camundongos YAC128 foram criados e mantidos na University of British Columbia, Centre for Molecular Medicine and Therapeutics.

[0168]Anti-SEMA4D reduz o comportamento do tipo ansiedade no Modelo de Camundongo YAC128. Para avaliar a ansiedade durante a exploração de campo aberto, os camundongos tratados com MAb foram colocados no canto esquerdo infe-rior de uma caixa acrílica cinza aberta 50 x 50 cm com lados altos de 20 cm em um ambiente iluminado por luzes de teto fluorescente. A atividade de campo aberto foi registrada durante 10 min através de uma câmera de vídeo montada no teto. As en-tradas na (FIG. 5A) e o tempo gasto no centro do campo (FIG. 5B) foram registrados como uma medição do comportamento do tipo ansiedade.

[0169]Ao contrário dos animais tratados com controle onde camundongos YAC128 manifestam maior comportamento do tipo ansiedade na exploração de campo aberto em relação aos camundongos do tipo selvagem (WT), não existe dife-rença entre camundongos WT e YAC128 tratados com anticorpo anti-SEMA4D (MAb 67) indicando que MAb-67 melhora o comportamento do tipo ansiedade em camun-dongos YAC128. Estes resultados são mostrados na FIG. 5.

[0170]Anti-SEMA4D melhora a memória espacial no modelo de camundongo YAC128. Para avaliar a preferência quanto ao um objeto conhecido em uma nova localização, dois novos objetos diferente foram colocados nos cantos superiores es-querdos e direitos de uma caixa de campo aberto. Os camundongos tratados com anti-SEMA4D foram introduzidos à caixa no canto esquerdo inferior e registrados durante 5 minutos (min) por uma câmera de vídeo montada no teto, tempo no qual o número de investigações dos dois novos objetos foi registrado (Experimento 1, FIG. 6A). Os camundongos depois foram removidos da caixa durante 5 min e o objeto no canto superior esquerdo da caixa foi movido para o canto inferior direito da caixa. Os camundongos foram reintroduzidos à caixa e registrados durante um adicional de 5 min (Experimento 2, FIG. 6B). A porcentagem das investigações ou empurradas com o focinho, ao objeto alvo (aquele na nova localização) em relação a todas as empur-radas com o focinho foi computada.

[0171]Ao contrário dos animais do tipo selvagem (EM PESO) tratados com controle ou Mab 67 que preferencialmente exploram um objeto em uma nova localização no Experimento 2, camundongos YAC128 tratados com controle não reconhecem ou mostram preferência para o objeto em uma nova localização. O tratamento com anticorpo anti-SEMA4D restaura a preferência normal ao novo objeto em camundongos YAC128 (p<0,01). Isto sugere que a memória espacial em camundongos YAC128 foi melhorada pelo tratamento com Mab-67, de modo que eles reconheceram um objeto em uma nova localização. Os resultados são mostrados na FIG. 6.

[0172]Anti-SEMA4D previne degeneração cortical e do corpo caloso em ca-mundongos YAC128. Seções de tecido do cérebro de flutuação livre a partir de ca-mundongos YAC128 e WT tratados com MAb com 12 meses de vida (n = 13 a 21/grupo) foram pigmentadas com anticorpo anti-NeuN. Volumes corticais (FIG. 7A) e do corpo caloso (FIG. 7B) foram determinados traçando o perímetro da estrutura de-finida em seções em série usando software StereoInvestigator (Microbrightfield) e os volumes foram determinados usando o princípio de Cavalieri.

[0173]Os resultados mostram que o tratamento com anticorpo anti-SEMA4D inibe a redução relacionada à doença normal no volume cortical e do corpo caloso em camundongos YAC128 em 12 meses de vida. Os resultados são mostrados na FIG. 7.

[0174]Mab 67 Previne a Degeneração Testicular em Camundongos YAC128. A degeneração testicular é observada em pacientes DH machos e é recapitulada em camundongos YAC128 machos. Conforme mostrado na FIG. 8, o tratamento com an-ticorpo anti-SEMA4D previne a degeneração testicular em camundongos YAC128 com 12 meses de vida. É possível que os efeitos da doença e o anticorpo anti- SEMA4D no cérebro e testículos reflitam uma dependência comum sobre os meca-nismos de transporte dependentes de actina intracelular na função normal destes te-cidos.

Exemplo 3: Exame dos padrões de expressão de SEMA4D, plexina-B1, ple- xina-B2 e CD72 no SNC do rato

[0175]Para visualizar os tipos celulares no SNC que expressa SEMA4D e seus receptores plexina-B1, plexina-B2 e CD72, a coimuno-histoquímica foi realizada em seções de medula espinhal coronal a partir de ratos naive (FIG. 9A-P). A copigmenta- ção para o marcador de células precursoras de oligodendrócitos, Nkx2.2 e SEMA4D (FIG. 9A-C), plexina-B1 e o marcador astrocítico, GFAP (FIG. 9E a G), plexina-B1 e CD72 (FIG. 9I a K) e plexina-B1 e o marcador microglial, Iba1 (FIG. 9M-O) foi realizada em seções de medula espinhal a partir de ratos naive. Além disso, todas as seções foram pigmentadas com DAPI para visualizar núcleos celulares (FIG. 9D, H, L e P). As lâminas foram visualmente representadas em ampliação de 60X usando uma câmera EXi-Aqua-14 bit ligada a um microscópio Olympus Ix50.

[0176]Os resultados na FIG. 9 mostram que dentro do SNC normal, SEMA4D é robustamente expressada em precursores de oligodendrócitos Nkx2.2-positivos, enquanto seus receptores, plexina-B1, plexina-B2 (dados não mostrados) e CD72, são expressados em múltiplos tipos celulares e são especialmente proeminentes sobre os astrócitos positivos para proteína acida fibrilar glial (GFAP).

Exemplo 4: Caracterização dos padrões de expressão de receptores de ple- xina-B1 e plexina-B2 no modelo de camundongo CVN de doença de Alzheimer

[0177]Os camundongos CVN DA bigênicos homozigóticos exibiram patologia amiloide clássica e ativação glial no subículo em comparação aos camundongos do tipo selvagem pareados por tempo de vida. Os padrões de expressão de plexina-B1 foram examinados no modelo de camundongo CVN de doença de Alzheimer. Os camundongos bigênicos CVN (também conhecidos como APPSwDI/NOS2-/-) hospedam o transgene mutante da proteína precursora amiloide Swedish-Dutch-Iowa (AP- PSwDI) e uma mutação “nula” alvejada do loco da óxido nítrico sintase 2 (Nos2 ou NOS induzível, iNOS). Em 41 semanas de idade, os camundongos CVN e do tipo selvagem controle foram sacrificados e processados para imuno-histoquímica de DAB. Os resultados são mostrados na FIG. 10, com as seções do camundongo do tipo selvagem nos painéis superiores e as seções do camundongo CVN nos painéis inferiores). As seções foram separadamente pigmentadas para peptídeo amiloide- beta 1 a 42 (painéis superiores e inferiores na esquerda), marcador microglial Iba1 (painéis centrais superiores e inferiores) ou marcador de astrócitos GFAP (painéis superiores e inferiores na direita). As lâminas foram visualmente representadas na ampliação de 20X usando uma câmera Retiga QICAM-12 bit ligada a um microscópio Olympus Ix50.

[0178]Os resultados na FIG. 10 mostram que os camundongos CVN bigênicos homozigóticos (APPSwDI/NOS2-/-) desenvolveram patologia amiloide clássica, mi- croativação glial e astrogliose (painéis superiores).

[0179]Astrócitos ativados em camundongos CVN DA exibem expressão de plexina-B1 acentuada em comparação aos camundongos do tipo selvagem pareados por tempo de vida. Em 41 semanas de idade, camundongos CVN e do tipo selvagem controle foram sacrificados e processados para coimuno-histoquímica fluorescente (FIG. 11A). As seções foram separadamente pigmentadas para o receptor de SEMA4D plexina-B1 e marcador de astrócitos GFAP e DAPI para visualizar os núcleos celulares. As imagens de compósito são mostradas nos painéis mais à esquerda. As lâminas foram visualmente representadas na ampliação de 60X usando uma câmera EXi-Aqua-14 bit ligada a um microscópio Olympus Ix50.

[0180]Conforme mostrado na FIG. 11A, as análises coimuno-histoquímicas de plexina-B1 (segundos painéis a partir da esquerda) e astrócitos GFAP-positivos (terceiros painéis a partir da esquerda) nos cérebros de camundongos CVN e do tipo selvagem pareados por tempo de vida demonstram que a ativação astrocítica, con-forme evidenciado pela pigmentação do marcador GFAP aumentada, se correlacio-nam positivamente com a expressão de plexina-B1 corregistrada acentuada, suge-rindo que a sinalização de SEMA4D/plexina participa no processo de ativação de as- trócitos.

[0181]A inibição da sinalização de SEMA4D em camundongos CVN DA res-taura a expressão de plexina-B2 em comparação aos camundongos do tipo selvagem pareados por tempo de vida. Para determinar se o bloqueio da sinalização de SEMA4D em camundongos CVN DA causaria impacto na expressão de plexina-B1 e/ou seu receptor cognato alternado, plexina-B2, nas regiões do cérebro afetadas precocemente na patogênese de DA, camundongos CVN e do tipo selvagem controle com 26 semanas de vida foram semanalmente injetados com 30 mg/kg de anticorpo monoclonal anti-SEMA4D (67-2) ou IgG controle (2B8) intravenosamente durante 13 semanas. Em 41 semanas de idade, os camundongos foram sacrificados e as seções do tecido do cérebro a partir de camundongos tratados com MAb foram pigmentadas com anti-plexina-B1 ou anti-plexina-B2 para detectar se o tratamento com anti- SEMA4D alterou a expressão do receptor cognato na definição de patogênese relacionada com DA em curso. A porcentagem de sinais de plexina-B1 e plexina-B2-positi- vos foi quantificada no subículo de todos os animais e normalizada à área do subículo total escaneada.

[0182]Conforme mostrado na FIG. 11B, o tratamento com anticorpo anti- SEMA4D de camundongos CVN DA leva a uma restauração nos níveis de intensidade de pigmentação de plexina-B2 (gráfico direito) em comparação àqueles quantificados em camundongos WT controle, mas nenhuma mudança significante nos níveis de ple- xina-B1 (gráfico esquerdo) em relação aos camundongos controle CVN DA pareados por tempo de vida. Estes resultados sugerem que a inibição de SEMA4D mediada pelo anticorpo leva seletivamente à desestabilização de plexina-B2 e/ou impede um mecanismo de alimentação direta acionado por SEMA4D que promove seletivamente a expressão de plexina-B2.

Exemplo 5: Caracterização dos padrões de expressão do receptor de plexina- B2 em um modelo de camundongo YAC128 de doença de Huntington

[0183]Os camundongos YAC128 expressam o gene de huntingtin humano mutante de comprimento total (mHTT) e precisamente recapitulam muitos dos sinais e sintomas de DH (veja também o Exemplo 2). Os astrócitos ativados em camundon-gos YAC128 doença de Huntington exibem expressão de plexina-B2 acentuada em comparação aos camundongos do tipo selvagem pareados por tempo de vida. Em 12 meses de vida, os camundongos YAC128 e os camundongos do tipo selvagem con-trole foram sacrificados e processados para coimuno-histoquímica fluorescente (FIG. 12). As seções foram copigmentadas para plexina-B2 (Plexina-B2, terceiros painéis a partir da esquerda), marcador de astrócitos GFAP (segundos painéis a partir da es-querda) e DAPI para visualizar núcleos celulares. As imagens de compósito são mostradas nos painéis mais à esquerda. As lâminas foram visualmente representadas na ampliação de 60X usando uma câmera EXi-Aqua-14 bit ligada a um microscópio Olympus Ix50.

[0184]Conforme mostrado na FIG. 12, as análises coimuno-histoquímicas de plexina-B2 e astrócitos GFAP-positivos nos cérebros de camundongos YAC128 e do tipo selvagem demonstram que a ativação astrocítica, conforme evidenciado por pig-mentação do marcador GFAP aumentada, novamente, se correlaciona positivamente com a expressão do receptor de SEMA4D corregistrada. Plexina-B2, cujo melhor ligante caracterizado é SEMA4C, também apresenta uma afinidade intermediária para SEMA4D (Azzarelli R et al. An antagonistic interaction between PlexinB2 and Rnd3 controls RhoA activity and cortical neuron migration. Nature Commun. 2014; DOI:10,1038/ncomms4405)

Exemplo 6: Exame dos mecanismos pelos quais a sinalização de SEMA4D pode modular a função de astrócitos

[0185]A correlação entre a expressão do receptor de SEMA4D acentuada e a ativação astrocítica na definição de doença neurodegenerativa DA e DH sugere que a sinalização de SEMA4D desempenha um papel na função e/ou disfunção de astró- citos. Sem limitar a invenção a uma teoria, este exemplo fornece a evidência de que a sinalização de SEMA4D pode participar na regulação da função astrocítica durante as respostas à lesão do SNC, ainda que a partir de estímulos agudos ou crônicos. Um modelo esquemático sustentado pelos dados é representado na FIG. 13, que mostra três mecanismos pelos quais a sinalização de SEMA4D pode modular potencialmente a função de astrócitos. Estes três mecanismos são debatidos abaixo.

[0186]Papel de astrócitos e suporte de OPC. Os processos astrocíticos de Plexina+ se adequam entre células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) SEMA4D+ NKX2,2+ e fornecem suporte trófico. Na doença do SNC, os astrócitos ati-vados suprarregulam a expressão de Plexina e retratam os processos por intermédio de sinalização de SEMA4D. Localmente, esta perda de proximidade de astrócito:OPC pode resultar em suporte trófico diminuído e movimento de OPC acionado por quimi- otaxia aumentado em direção às regiões de dano, enquanto a falta de suporte astro- cítico no sítio da lesão pode impedir a diferenciação e remielinação de OPC.

[0187]Para testar esta hipótese, ratos controle do tipo selvagem foram sacrifi-cados e as medulas espinhais foram processadas para coimuno-histoquímica fluorescente (FIG. 14). As seções foram copigmentadas para SEMA4D (segundo painel a partir da esquerda), marcador de astrócitos GFAP (terceiro painel a partir da esquerda) e DAPI para visualizar os núcleos celulares (painel da direita). As imagens de compósito são mostradas nos painéis mais à esquerda e a caixa pontilhada representa uma inserção aumentada 1,67X abaixo. As lâminas foram visualmente representadas na ampliação de 60X usando uma câmera EXi-Aqua-14 bit ligada a um microscópio Olympus Ix50.

[0188]Conforme mostrado na FIG. 14, OPCs que expressam SEMA4D são orientadas em proximidade com processos de astrócitos GFAP+. Dado o papel que os astrócitos desempenham na facilitação de sobrevivência e função de OPC, a jus-taposição de OPCs que expressam SEMA4D e astrócitos que expressam receptor de SEMA4D sugere que a ativação relacionada à doença de astrócitos com suprarregu- lação associada de receptores de plexina-B e sinalização de SEMA4D pode afetar a função de OPC.

[0189]Papel de astrócitos no suporte neuronal. Na doença do SNC, a ativação astrocítica leva à suprarregulação da expressão de Plexina, sinalização de SEMA4D aumentada e retração de processo, o que resulta em uma perda de orientação de axônio neuronal, suporte trófico diminuído e/ou absorção/liberação de glutamato des- regulada. Em última análise, dependendo da severidade do estímulo da doença, perda de sinapse e morte neuronal excitotóxica subsequente podem ocorrer.

[0190]Para determinar se o bloqueio da sinalização de SEMA4D em camun-dongos CVN DA causaria impacto na expressão do marcador sináptico em regiões do cérebro afetadas precocemente na patogênese de DA, camundongos CVN e do tipo selvagem controle com 26 semanas de vida foram semanalmente injetados com 30 mg/kg de anticorpo monoclonal anti-SEMA4D (67-2) ou IgG controle (2B8) intravenosamente durante 13 semanas. Em 41 semanas de idade, os camundongos foram sacrificados e as seções do tecido do cérebro a partir de camundongos tratados com MAb foram pigmentadas com anticorpo anti-somatostatina, anti-Neuropeptídeo-Y (NPY), receptor 1 anti-NPY (NPY1R) ou receptor 2 anti-NPY (NPY2R) para detectar subgrupos específicos de neurônios inibitórios que se degeneraram em DA precoce. As porcentagens de sinal somatostatina-positivo foram quantificadas no subículo e sinais NPY-, NPY1R- ou NPY2R-positivo foram quantificados no giro denteado para todos os animais e normalizados, respectivamente, à área de subículo ou giro dente-ado total escaneada. Os resultados são mostrados na FIG. 15 A a D.

[0191]As FIGS. 15A a 15D mostram que o tratamento com anticorpo anti- SEMA4D de camundongos CVN DA leva a uma restauração nos níveis de intensidade de pigmentação de somatostatina (painel A), NPY (painel B) e NPY2R (painel D) aos níveis característicos de camundongos do tipo selvagem. De forma interessante, os agonistas de NPY1R são relatados para reduzir estresse e ansiedade, enquanto os antagonistas específicos para NPY2R reduzem o estresse e ansiedade (Markus Hei- lig. The NPY system in stress, anxiety and depression. Neuropeptides 38 (2004) 213224). Conforme mostrado na FIG. 2 acima, os camundongos CVN tratados com anti- SEMA4D exibiram severidade reduzida em ansiedade nos testes de campo aberto, descobertas que se correlacionaram com níveis de NPY2R normalizados (inferiores), enquanto os níveis de NPY1R não foram modificados por tratamento com MAb anti- SEMA4D e permaneceram maiores do que camundongos do tipo selvagem. Consequentemente, estas mudanças em níveis de receptor de NPY são concordantes com comportamentos de ansiedade reduzidos observados em camundongos CVN tratados com anti-SEMA4D, uma descoberta que ainda suporta um papel para SEMA4D na modulação da neurotransmissão in vivo. É digno de nota que a infrarregulação do neurotransmissor NPY inibitório observada no modelo CVN DA também foi relatada no córtex cerebral de pacientes com doença de Alzheimer (Beal et al., Ann. Neurol. 20, 282-288 (1986).

[0192]Papel de astrócitos na manutenção da integridade da barreira sangue- cérebro. Conforme debatido em outra parte neste relatório, os processos astrocíticos próximos aos microvasos cerebrais ou pia são caracterizados por uma alta densidade do canal aquático, aquaporina 4 (Aqp4). Processos astrocíticos faceando as regiões sinápticas são enriquecidos em transportadores de glutamato, onde a densidade de Aqp4 é comparativamente baixa. A ativação de astrócitos induzida por doença do SNC aumenta a sinalização de SEMA4D através de Plexina, o que leva a uma retração de processos de raiz astrocítica, conforme evidenciado por redistribuição de aquaporina- 4. Isto resulta na desregulação e permeabilidade da BSC, desse modo, facilitando a inflamação endotelial e entrada de leucócitos subsequente no SNC. Na definição de DA, intensidades de pigmentação de Aqp4 diminuem significantemente nas regiões com carga da placa amiloide significante.

[0193]Para medir os padrões de expressão de aquaporina-4 em camundon-gos CVN DA em comparação aos camundongos do tipo selvagem pareados por tempo de vida, camundongos CVN e do tipo selvagem controle foram sacrificados em 41 semanas de idade e processados para coimuno-histoquímica fluorescente. Os resultados são mostrados na FIG. 16, com camundongos do tipo selvagem nos painéis superiores e camundongos CVN nos painéis inferiores. As seções foram copigmenta- das para aquaporina-4 (segundos painéis a partir da esquerda), marcador de astróci- tos GFAP (terceiros painéis a partir da esquerda) e DAPI (painéis da direita) para visualizar os núcleos celulares. As imagens de compósito são mostradas nos painéis mais à esquerda. As lâminas foram visualmente representadas na ampliação de 60X usando uma câmera EXi-Aqua-14 bit ligada a um microscópio Olympus Ix50.

[0194]Conforme mostrado na FIG. 16, a pigmentação de Aqp4 em camundongos CVN pareados por tempo de vida revelou uma troca significante em direção a um padrão difuso. Isto ocorre ao contrário de análises coimuno-histoquímicas de Aqp4 e astrócitos GFAP-positivos nos cérebros de camundongos do tipo selvagem, que demonstram o padrão de pigmentação de Aqp4 no subículo que é restrito às áreas próximas à microvasculatura. Esta alteração na distribuição de Aqp4 ou perda em polaridade, se correlaciona com alta ativação de astrócitos, conforme evidenciado pela intensidade aumentada na pigmentação de GFAP. Dado o forte corregistro na pig-mentação de plexina-B1 em astrócitos ativados (FIG. 11) e o papel da sinalização de SEMA4D/plexina-B1 na retração de processo celular, estes dados sugerem que a si-nalização de SEMA4D pode desempenhar um papel na alteração da polaridade de astrócitos na interface BSC durante a doença.

[0195]Para analisar o impacto de SEMA4D sobre a BSC, um modelo de bar-reira sangue-cérebro in vitro dinâmico (DIV-BSC) foi utilizado. Brevemente, o modelo consiste em fibras de polipropileno ocas que contêm poros de diâmetro de 2 a 4 μm transcapilares. As fibras foram conectadas a uma bomba pulsátil que facilita o fluxo contínuo de meio e compostos experimentais através das fibras e estímulo normal de receptores de fluxo endotelial. Células endoteliais de cérebro humano foram inocula-das no compartimento luminal e aderidas a, e revestidas dentro das paredes das fi-bras, enquanto astrócitos humanos foram semeados no compartimento abluminal que banham o exterior da superfície das fibras. As células endoteliais e astrócitos interagem através da membrana para induzir a formação de uma barreira com junções firmes entre as células endoteliais. A integridade desta barreira pode ser continuamente monitorada através da medição de resistência elétrica trans-endotelial (RETE). Células endoteliais de cérebro humano foram inoculadas no compartimento luminal e aderidas às fibras de polipropileno e astrócitos humanos foram separadamente semeados sobre a superfície abluminal das fibras. No pico da RETE (aproximadamente 14 dias in vitro), 0,5, 5 e 50 μg/ml de SEMA4D recombinante foram sucessivamente adicionados em intervalos de 12 h. Em 36 h depois da exposição de SEMA4D inicial, 250 μg/ml de IgG controle (MAb 2955; 1 unidade de DIV-BSC) ou anti-SEMA4D (VX15/2503; 2 unidades de DIV-BSC) foram adicionados e RETE medida durante mais 132 h. Os resultados são mostrados na FIG. 17. As barras de erro representam o desvio padrão. Os dados mostrados são representativos de três experimentos independente, com cada um demonstrando efeitos similares de SEMA4D e anticorpo sobre a integridade DIV-BSC.

[0196]Conforme mostrado na FIG. 17, a ruptura da BSC foi revertida em 24 h através da adição do anticorpo anti-SEMA4D (VX15/2503). A introdução de uma pro-teína controle recombinante não resultou em uma diminuição em RETE (dados não mostrados). Além disso, a introdução de anticorpo IgG controle (MAb 2955) não afetou o compromisso da BSC induzida por SEMA4D.

[0197]Estes dados sugerem que a ativação de astrócitos induzida por doença do SNC aumenta a sinalização de SEMA4D através da suprarregulação de plexina- B1 e/ou plexina-B2, o que leva a uma retração de processos de raiz astrocítica, con-forme evidenciado pela redistribuição de aquaporina-4. Isto resulta em desregulação e permeabilidade da BSC, desse modo, facilitando a inflamação endotelial e entrada de leucócitos subsequente no SNC.

[0198]Papel da Sinalização de SEMA4D na Promoção de Ativação de Astró- citos. Dada a associação da expressão do receptor de SEMA4D e o marcador de ativação de astrócitos GFAP, existe a possibilidade de que a sinalização de SEMA4D possa potencializar a ativação de astrócitos, desse modo, fornecendo um mecanismo de “alimentação direta” durante os estados da doença. Para examinar os efeitos de SEMA4D sobre a ativação de astrócitos, culturas primárias de astrócitos de rato foram geradas e tratadas com SEMA4D em isolamento ou em combinação com pré-trata-mento de tioacetamida (TAA), um agente hepatotóxico e hepatocarcinogênico bem conhecido que foi mostrado para induzir a expressão de plexina-B1 in vivo (Lim, J. S. et al., (2006). Mol. Cell. Tox., 2(2), 126 - 133). Astrócitos primários de rato foram pré- tratados durante 4 h com TAA, seguido por SEMA4D solúvel durante 24 h. As células depois foram fixadas e pigmentadas para GFAP e escaneadas em ampliação de 20x. As barras de erro representam o desvio padrão. “*” = p<0,05 através de ANOVA uni-lateral com Teste de Comparação Múltipla de Bonferroni.

[0199]Conforme mostrado na FIG. 18A, um aumento significante em GFAP, um marcador de ativação para astrócitos, foi observado após a adição de SEMA4D às células pré-tratadas com TAA, sugerindo que a sinalização de SEMA4D acentua a ativação de astrócitos.

[0200]Em um segundo conjunto de estudos in vitro, astrócitos de rato primá-rios foram cultivados e tratados com ou sem prostaglandina D2, um fator de ativação conhecido produzido pela micróglia no SNC, seguido por uma exposição de 8 ou 24 h à proteína de SEMA4D recombinante. As células foram fixadas, processadas para histo-química de faloidina (F-actina) e Dnase (G-actina) e razões de área de F-ac- tina/G-actina foram calculadas para cada condição de tratamento. As barras de erro representam o desvio padrão. “**” = p<0,01 através de ANOVA bilateral com Teste de Comparação Múltipla de Bonferroni.

[0201]Conforme mostrado na FIG. 18B, astrócitos ativados por PGD2 expos-tos à SEMA4D recombinante sofrem uma transição globular a filamentosa em seu citoesqueleto de actina que é indicativa de sinalização mediada por SEMA4D/Plexina e um estado de ativação de astrócitos elevado.

[0202]Muitas modificações e outras formas de realização das divulgações apresentadas neste relatório podem ser realizadas por uma pessoa habilitada na téc-nica a qual estas divulgações pertencem tendo o benefício dos ensinamentos apre-sentados nas descrições precedentes e nos desenhos associados. Portanto, deve ser entendido que as divulgações não devem ser limitadas às formas de realização específicas divulgadas e pretende-se que as modificações e outras formas de realização sejam incluídas no escopo das reivindicações anexas e lista das formas de realização divulgadas neste relatório. Embora termos específicos sejam utilizados neste relatório, eles são usados apenas em um sentido genérico e descritivo e não para propósitos de limitação.

Claims

1. Uso de uma quantidade eficaz de um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente à semaforina-4D (SEMA4D), CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de um medica-mento para aliviar os sintomas em um indivíduo que tem doença de Huntington (DH), em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inibe a interação de SEMA4D com seu receptor; e em que o anticorpo ou fragmento do mesmo com-preende uma cadeia pesada variável (VH) compreendendo VHCDRs 1 a 3 compreendendo as SEQ ID NOs: 6, 7 e 8, respectivamente, e uma cadeia leve variável (VL) compreendendo VLCDRs 1 a 3 compreendendo as SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o receptor SEMA4D é selecionado dentre o grupo consistindo em Plexina-B1, Plexina- B2 e CD72.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo se liga especificamente ao mesmo epítopo SEMA4D como um anticorpo monoclonal de referência ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo uma cadeia pesada variável (VH) compreendendo VHCDRs 1 a 3 compreendendo as SEQ ID NOs: 6, 7 e 8, respectivamente, e uma cadeia leve variável (VL) compreendendo VLCDRs 1 a 3 compreendendo as SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo inibe com-petitivamente um anticorpo monoclonal de referência ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo uma cadeia pesada variável (VH) compreen-dendo VHCDRs 1 a 3 compreendendo as SEQ ID NOs: 6, 7 e 8, respectivamente, e uma cadeia leve variável (VL) compreendendo VLCDRs 1 a 3 compreendendo as SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que os sintomas são selecionados dentre um grupo consistindo em sintomas neuropsiquiátricos, sintomas cognitivos, disfunção motora e qualquer combinação dos mesmos.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que os sintomas neuropsiquiátricos são selecionados dentre um grupo consistindo em comportamento semelhante à ansiedade, memória espacial reduzida, locomoção prejudicada e qualquer combinação dos mesmos.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo é humano.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo pode inibir a transdução de sinal de Plexina-B1 mediada por SEMA4D.

9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo pode inibir a transdução de sinal de Plexina-B2 mediada por SEMA4D.