CN116678965A - 一种同时检测青稞中30种真菌毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测青稞中30种真菌毒素的方法，包括以下步骤：青稞样品粉碎后过筛，得到青稞样品粉末；将提取液加入到青稞样品粉末中，涡旋震荡混匀；加入QuEChERS提取包，继续涡旋震荡混匀；离心后取上清液，氮吹至干，加入复溶液溶解，过滤膜，收集滤液；采用液相色谱‑质谱联用对收集得滤液进行检测；该方法成本低、准确、灵敏度高、回收率好、稳定性强，可以一次性快速筛查青稞中30种真菌毒素，为进一步明确青稞中真菌毒素的污染及控制、保障青稞的质量安全奠定了技术基础。
Description
技术领域
本发明涉及农产品检测技术领域，特别涉及一种同时检测青稞中30种真菌毒素的方法。
背景技术
真菌毒素是一类由丝状真菌在适宜的环境条件下产生的有毒次级代谢产物，广泛存在于谷物作物中。人或动物摄入后可能会引发多种中毒症状，严重时可危害到生命安全。粮食作物及其制品中可检出镰刀菌毒素、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、杂色曲霉毒素、交链孢霉毒素等多种真菌毒素。
青稞是一种分布在高海拔极端环境条件下的典型禾本科大麦属植物，具有耐旱、耐低温、适应性强、易栽培等特点，是我国青藏高原地区世居民族依赖的最重要的粮食作物。但受全球气候变化的影响，青藏高原整体呈现增温趋势，雅鲁藏布江流域夏季降雨逐渐增多，使青稞在生长期受到各种病原真菌侵染并导致其真菌毒素污染的风险加大。真菌毒素是由病原真菌侵染大麦以后产生的，与常规农药残留(外源)检测的目标物残留方式和化学结构不同。因此，建立针对青稞中多种真菌毒素的一次性快速筛查技术，为进一步明确青稞中真菌毒素的污染现状，保障青稞产品质量安全及消费者身体健康等提供有力的检测技术支持，具有重要的现实意义。
目前，针对粮食作物中多种真菌毒素检测技术主要有液相色谱法及液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)等。液相色谱法是较为常用的检测方法，但由于选择性差，一般只能针对一种或结构类似的真菌毒素进行检测，在开展多种真菌毒素检测时，检测灵敏度难以达到要求。
粮食作物成分复杂，目前常用的净化富集方法有固相萃取柱和免疫亲和柱净化法。两种方法都有较好的回收率和重复性，但相对成本较高，不适用于大批量样品的检测。目前，在谷物类样品中多种真菌毒素的前处理方法上，通常采用QuEChERS法，但该方法在多组分提取净化过程中，需要对提取试剂的组成和比例进行优化，以便获得满足检测需要的回收率。
总体而言，尽管存在对青稞中多种真菌毒素的检测方法。但是，由真菌毒素检测种类增加而导致检测方法的精密度、准确度、稳定性和重复性降低，仍然是限制青稞中多种真菌毒素检测方法建立的主要因素。目前关于青稞中多种真菌毒素的检测方法的报道中，最多可以同时检测15种真菌毒素，尚未见可以同时检测30种真菌毒素的检测方法的报道。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种同时检测青稞中30种真菌毒素的方法。
具体而言，上述发明目的是通过以下方案实现的：
一种同时检测青稞中30种真菌毒素的方法，其具体步骤如下：
1)取青稞样品，粉碎后完全通过2.00mm孔筛，得到青稞样品粉末；
2)准确称取2.00g青稞样品粉末至洁净的50mL离心管中，加入20mL提取液I，涡旋震荡混匀(优选2500rpm震荡混匀5min)，获得样品提取液；
上述提取液I由乙腈、水、甲酸组成；
优选的，提取液I中乙腈、水、甲酸体积比为80:19.9:0.1；
本步骤中，青稞样品粉末与提取液I的质量体积比优选为1：10，质量体积比单位为g/mL。
3)向步骤2)获得的样品提取液中加入6.5g QuEChERS提取包和1颗陶瓷均质子，继续涡旋震荡混匀(优选2500rpm震荡混匀2min)；然后10000r/min离心5min后，取2mL上清液至新的洁净玻璃管中，通入氮气吹至干，获得残渣；
上述QuEChERS提取包由无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸二钠盐(C6H6Na2O7)按照质量比4：1：1：0.5混合后获得。
4)将步骤3)获得的残渣溶解于0.5mL的提取液II中，通过0.22μm有机系针筒式过滤器过滤，获得的滤液即为待测液；
上述提取液II是由乙腈、水、甲酸按照体积比50:49.9:0.1混合后获得；
本步骤所加入提取液II与步骤3)上清液的体积比为1:4；
5)采用液相色谱-质谱联用对步骤4)收集的待测液进行检测：建立各种真菌毒素标准曲线，采用外标法定量测定液待测组分的浓度，建立响应值与浓度的线性拟合方程，计算获得样品中30种真菌毒素含量；上述30种真菌毒素”是指表1中所检测的30种毒素。
色谱柱：Agilent XDB C18(2.1×150mm，3.5μm)；流动相A：含0.1％(体积比，下同)甲酸水溶液；流动相B：甲醇溶液；流速：0.4mL/min；进样量：3μL；柱温：40℃；
洗脱梯度程序：(以体积比计)0～0.5min,90％A；0.5～2.0min,50％A；2.0～4.0min,40％A；4.0～5.00min，5％A；5.0～8.0min,5％A；8.0～8.1min,90％A；8.1～10.0min,90％A。
质谱条件：
离子化方式：电喷雾电离子源；扫描模式：多反应监测模式；离子源温度：600℃；气帘气：30psi，雾化气：55psi；辅助气：60psi；喷雾电压：5.5kV(ESI+)、4.5kV(ESI-)；碰撞室射出电压：10V(ESI+)、6V(ESI-)。
本申请采用QuEChERS结合高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS)，通过提取包和陶瓷均质子对青稞样品中蛋白等杂质净化效果的研究，提出一种成本低、准确、灵敏度高、回收率好、稳定性强的青稞中30种真菌毒素的一次性快速筛查检测技术，为进一步明确青稞中真菌毒素的污染现状，保障青稞的质量安全奠定了技术基础。
与现有有检测方法相比，本申请所提供的检测方法具有以下有益效果：
1)本申请在样品前处理环节优化提取试剂成分和比例，加入可以提高样品分散性的陶瓷均质子，确保只采用一次提取，30种真菌毒素的提取回收率即达到检测要求；
2)本申请在液相-串联质谱检测方法上，通过优化流动相比例、洗脱程序、调整质谱参数，确保所有参数的检出限和定量限满足检测需要，以实现一次性检测30种真菌毒素的目的。
附图说明
图1为实施例1检测的30种真菌毒素的色谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例中涉及的仪器：
高效液相色谱仪购自日本岛津公司，型号20ADXR；
质谱仪购自美国ABSCIEX公司，型号Qtrap 6500；
0.22μm有机系针筒式过滤器，购自天津市津腾实验设备有限公司；
陶瓷均质子，购自华谱生物科技(重庆)有限公司。
实施例1
(1)样品的提取与净化
取市售青稞样品，粉碎后过2.00mm孔筛，得到青稞样品粉末。分别采用SN/T 3136-2012(测定黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA、FB1、DON、T-2、HT-2)、NY/T 3867-2021(测定杂色曲霉毒素)、GB 5009.240-2016(测定FB1、FB2、FB3)、GB/T 5009.111-2016(测定DON、3ADON、15ADON)以及GB/T 5009.209-2016(测定ZEN)测定相关的真菌毒素，获得不含上述真菌毒素的空白样品。
称取2.00g青稞粉末样品至50mL洁净离心管中，按样品与提取液I质量体积比1：10加入提取液I，以2500r/min震荡混匀5min。向样品与提取液I混匀后的混合物中加入6.5gQuEChERS提取包(含无水硫酸镁4g、氯化钠1g、柠檬酸钠1g、柠檬酸二钠盐0.5g)，同时加入1颗陶瓷均质子，以2500r/min震荡混匀2min后，10000r/min离心5min后取2mL上清液，氮吹至干，加入0.5mL提取液II，振荡混合均匀后通过0.22μm的有机系针筒式过滤器过滤，收集滤液待测。
(2)液相色谱-质谱联用分析
色谱条件：
色谱柱：Agilent XDB C18(2.1×150mm，3.5μm)；
柱温：40℃；进样量：3μL；流速：0.4mL/min；
流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：甲醇；
流动相梯度程序见表1。
表1流动相梯度程序
| 时间 | 流动相A | 流动相B |
| 0min | 90％ | 10％ |
| 0.5min | 90％ | 10％ |
| 2.0min | 50％ | 50％ |
| 4.0min | 40％ | 60％ |
| 5.0min | 5％ | 95％ |
| 8.0min | 5％ | 95％ |
| 8.1min | 90％ | 10％ |
| 10.0min | 90％ | 10％ |
质谱条件：
离子化方式：电喷雾电离子源；
扫描模式：多反应监测模式；
离子源温度：600℃；气帘气：30psi，雾化气：55psi；辅助气：60psi；
喷雾电压：5.5kV(ESI+)、4.5kV(ESI-)；
碰撞室射出电压：10V(ESI+)、6V(ESI-)。
30种真菌毒素质谱参数见表2及图1，图1中，1-30分别对应表2中30种真菌毒素。
表2 30种真菌毒素质谱参数
表2中*为定量离子
检测如图1所示，利用本实施例方法同时检测青稞中等30种真菌毒素，色谱图的峰形良好，分离度高，基线平稳，且具有良好的响应强度，能满足定性和定量的要求。
(3)建立标准曲线
准确吸取一定量的30种真菌毒素标准溶液母液于5mL棕色容量瓶中，用50％乙腈水溶液定容至刻度，配制成合适浓度的混合标准储备液，密封存贮于-20℃冰箱内。
将30种真菌毒素的混合标准储备溶液用空白基质溶液稀释成不同浓度的标准工作液，并上机检测，经外标法定量，建立响应值与浓度的线性拟合方程。
其中空白基质溶液为不含30种真菌毒素的空白样品，按照(1)样品提取与净化步骤中的方法进行提取所得到的乙腈-水-甲酸(50:49.9:0.1，V:V:V)混合均匀的溶液。
(4)检出限(LOD)和定量限(LOQ)
30种真菌毒素不同浓度的标准工作液经上机检测后，在一定的范围内呈良好的线性关系，相关系数r2均大于0.997。以3倍信噪比确定本方法的检出限(LOD)，以10倍信噪比确定本方法的定量限(LOQ)，30种真菌毒素的线性范围、相关系数r2、检出限和定量限见表3。
表3 30种真菌毒素的线性范围、相关系数、检出限和定量限
对比目前现行的粮食中部分真菌毒素高效液相色谱串联质谱检测方法(外标法)的检出限和定量限要求，发现本方法的检出限和定量限与标准方法一致或优于现有方法，详见表4。
表4对比本方法与标准方法的定量限
(5)不同提取试剂、是否添加陶瓷均质子对回收率的影响
(5.1)不同提取试剂对回收率的影响：
尽管乙腈和甲醇水溶液是真菌毒素提取过程中较为常用的提取溶剂，但由于乙腈对蛋白沉淀效果以及提取液离心后的澄清度要高于甲醇，且部分真菌毒素含有羧基，在酸性条件下更容易以分子形式进入有机相。因此，本研究考察了在添加定量限浓度下，不同比例的乙腈-水-甲酸对30种真菌毒素的提取效率，包括50:49.9:0.1(V:V:V)、60:39.9:0.1(V:V:V)、70:29.9:0.1(V:V:V)和80:19.9:0.1(V:V:V)，分析了30种真菌毒素回收率，每种提取溶剂重复6次。结果如表5所示，乙腈-水-甲酸(V:V:V，50:49.9:0.1)的平均回收率为46.9％～259.4％、乙腈-水-甲酸(V:V:V，60:39.9:0.1)的平均回收率为31.9％～188.4％、乙腈-水-甲酸(V:V:V，70:29.9:0.1)的平均回收率为40.5％～148.7％。而乙腈-水-甲酸(V:V:V，80:19.9:0.1)的提取回收率在61.3％～128.9％，效果最好。因此，本方法采用乙腈-水-甲酸(V:V:V，80:19.9:0.1)作为提取溶剂。
表5不同提取溶剂下真菌毒素回收率(n＝6)
(5.2)是否添加陶瓷均质子对回收率的影响：
尽管本方法采用乙腈-水-甲酸(V:V:V，80:19.9:0.1)作为提取溶剂，可以使30种真菌毒素均可以获得较高的回收率，但部分真菌毒素回收率较低或较高，部分真菌毒素的相对标准偏差较高。为此，进一步比较了在添加定量限浓度下，是否添加陶瓷均质子对其回收率的影响，结果如表6所示，添加均质子可以进一步提高样品分散性，优化DON、FB1、FB2、ENNB1、DOM、ATXI等部分真菌毒素提取回收率；提高3ADON、15ADON、FB3、FUX、T-2、HT-2、BEA、NEO、STE、ENNA、ENNB、D3G、NIV、ZEN、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AOH、AME、ALT等真菌毒素的回收率；降低所有真菌毒素的相对标准偏差。
表6添加陶瓷均质子对真菌毒素回收率影响(n＝6)
(6)优化方法后获得的回收率和精密度
(6.1)回收率实验：
采用基质加标法向空白青稞样品中添加低、中、高3个浓度水平的30种真菌毒素混合标准溶液，按本发明的方法进行处理，每个浓度水平重复6次，计算添加回收率和相对标准偏差，结果见表7。采用基质加标法对方法的回收率进行考察，低、中、高三个浓度6个平行的添加回收率范围为60.6％-113.1％，相对标准偏差0.3％-12.9％。
表7 30种真菌毒素的添加回收率(n＝6)
/>
对比目前现行的粮食中部分真菌毒素高效液相色谱串联质谱检测方法(外标法)的回收率和相对标准偏差要求，发现本方法的回收率和相对标准偏差均优于标准方法，详见表8。
表8部分真菌毒素回收率对比
(6.2)日内和日间精密度试验：
日内精密度：空白基质中加入高、中、低三个浓度水平的30种真菌毒素的混合标准储备溶液(添加浓度同回收率实验)，在同一天内，按照本发明的方法进行处理，每个处理6个重复。
日间精密度：空白基质中加入高、中、低三个浓度水平的30种真菌毒素的混合标准储备溶液(添加浓度同回收率实验)，在连续的5天内，按照本发明的方法进行处理，每个处理6个重复。精密度、重复性及稳定性结果见表9。上述30种真菌毒素的日内精密度范围为0.8％-8.2％，日间精密度范围为2.3％-13.9％，重复性范围为1.4％-8.0％，稳定性范围为2.9％-15.0％。
表9 30种真菌毒素的精密度、重复性及稳定性(n＝6)
| 真菌毒素 | 日内精密度 | 日间精密度 | 重复性 | 稳定性 |
| DON | 1.9 | 8.6 | 2.1 | 9.3 |
| 3ADON | 1.8 | 3.9 | 1.5 | 5.1 |
| 15ADON | 2.8 | 4.6 | 3.1 | 4.1 |
| FB1 | 3.3 | 9.7 | 2.6 | 9.6 |
| FB2 | 5.9 | 11.5 | 2.9 | 10.0 |
| FB3 | 6.0 | 11.6 | 8.0 | 13.2 |
| FUX | 7.9 | 7.3 | 5.4 | 5.7 |
| T-2 | 8.1 | 13.9 | 7.7 | 15.0 |
| HT-2 | 8.2 | 7.1 | 7.5 | 8.7 |
| BEA | 5.2 | 13.9 | 4.1 | 3.6 |
| NEO | 2.0 | 9.6 | 2.6 | 8.5 |
| STE | 2.1 | 5.5 | 3.1 | 7.1 |
| ENNA | 1.3 | 6.1 | 2.5 | 7.2 |
| ENNA1 | 4.2 | 8.6 | 4.7 | 7.9 |
| ENNB | 3.1 | 5.7 | 2.8 | 6.6 |
| ENNB1 | 2.1 | 5.1 | 3.0 | 4.7 |
| DOM | 6.8 | 8.3 | 5.9 | 8.5 |
| D3G | 2.2 | 3.0 | 1.9 | 3.6 |
| NIV | 1.5 | 2.3 | 1.9 | 4.6 |
| ZEN | 1.2 | 4.9 | 1.4 | 5.4 |
| DAS | 4.1 | 6.8 | 3.6 | 6.8 |
| AFB1 | 3.7 | 3.5 | 6.0 | 5.5 |
| AFB2 | 4.6 | 6.5 | 6.1 | 9.1 |
| AFG1 | 3.9 | 3.2 | 5.4 | 5.4 |
| AFG2 | 3.3 | 5.6 | 4.0 | 6.8 |
| OTA | 2.1 | 5.0 | 4.3 | 6.3 |
| AOH | 3.6 | 9.1 | 4.0 | 7.3 |
| AME | 5.5 | 5.6 | 7.4 | 9.1 |
| ALT | 3.9 | 5.2 | 4.2 | 7.3 |
| ATXI | 0.8 | 2.3 | 6.3 | 2.9 |
实施例2实际样品的测定
应用实施例1建立的方法对西藏拉萨和林芝地区采集的48批次青稞样品，进行30种真菌毒素检测分析，检测结果如表10所示，检出的真菌毒素有11种，包括镰刀菌毒素8种(ENNB、ENNB1、ENNA1、ENNA、ZEN、BEA、NIV、DAS)，交链孢霉毒素3种(ATXI、AOH、AME)。11种真菌毒素的总检出率达到70.8％。
表10青稞样品中真菌毒素检出情况
| 真菌毒素 | 检出率/％ | 检出样品平均值(μg/kg) |
| ENNB | 37.0 | 390.6 |
| ATXI | 26.1 | 4.82 |
| ZEN | 17.4 | 4.31 |
| AOH | 13.0 | 5.73 |
| ENNB1 | 10.9 | 80.8 |
| AME | 10.9 | 6.13 |
| ENNA1 | 6.5 | 18.9 |
| BEA | 4.3 | 15.2 |
| NIV | 2.2 | 33.1 |
| DAS | 2.2 | 29.2 |
| ENNA | 2.2 | 20.8 |
本发明的青稞中30种真菌毒素的检测方法，应用QuEChERS结合高效液相色谱-质谱联用仪，采用QuEChERS提取包及陶瓷均质子对青稞样品中蛋白等杂质净化效果的研究，提出一种简单、快速、准确的青稞中真菌毒素的一次性快速筛查检测技术。本发明的检测方法成本低、准确、灵敏度高、回收率好、稳定性强，极大地提高了检测效率，可以满足大批量青稞样品中30种真菌毒素的快速筛查、定性及定量分析，极大的节省了成本及分析时间，为进一步明确青稞中真菌毒素的污染及控制、保障青稞的质量安全奠定了技术基础。
同时，为了验证方法的精密度和准确性，采用GB/T 5009.209-2016(测定ZEN)、DB32/T 3205-2017(测定NIV)分别测定了3份ZEN检出样品和1份NIV检测样品中ZEN和NIV毒素含量，结果如表11所示，通过实施例1方法所得到的真菌毒素的含量与国标法得到的含量基本一致，偏差≤10％，符合国标要求，证明本方法准确可靠。
表11对比实施例1与标准方法检测青稞中真菌毒素含量
本发明的保护范围并不限于实施例中所作的描述，不偏离本发明方案中心的修改都属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种同时检测青稞中30种真菌毒素的方法，其特征在于，具体步骤如下：
1）取青稞样品粉碎后过2.00mm孔筛，得到青稞样品粉末；
2）取青稞样品粉末至离心管中，加入提取液I，涡旋震荡混匀，获得样品提取液；所述提取液I由乙腈、水、甲酸组成；
3）向步骤2）获得的样品提取液中加入 QuEChERS 提取包和1颗陶瓷均质子，继续涡旋震荡混匀后离心，取上清液以氮气吹干，获得残渣；
所述QuEChERS 提取包由无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸二钠盐按照质量比4：1：1：0.5混合后获得；
4）将步骤3）获得的残渣溶解于提取液II中，通过0.22 μm有机系针筒式过滤器过滤，获得的滤液即为待测液；
所述提取液II是由乙腈、水、甲酸混合后获得；
5）采用液相色谱-质谱联用对步骤4）收集的待测液进行检测：
色谱柱：Agilent XDB C18 ；流动相A：含0.1%甲酸水溶液；流动相B：甲醇溶液；流速：0.4mL/min；进样量：3 μL；柱温：40℃；
洗脱梯度程序：0 ~ 0.5 min, 90% A；0.5 ~ 2.0 min, 50% A；2.0 ~ 4.0 min, 40%A；4.0 ~ 5.00 min，5% A；5.0 ~ 8.0 min, 5% A；8.0 ~ 8.1 min, 90% A；8.1 ~ 10.0min, 90% A；
质谱条件： 离子化方式：电喷雾电离子源；扫描模式：多反应监测模式；离子源温度：600 ℃；气帘气：30 psi，雾化气：55 psi；辅助气：60 psi；喷雾电压：5.5 kV(ESI+)、4.5 kV(ESI-)；碰撞室射出电压：10 V(ESI+)、6 V(ESI-)。
2.根据权利要求1所述同时检测青稞中30种真菌毒素的方法，其特征在于，步骤2）所述涡旋震荡混匀是指2500rpm震荡混匀5 min。
3.根据权利要求1所述同时检测青稞中30种真菌毒素的方法，其特征在于，步骤2）所述提取液I中乙腈、水、甲酸体积比为80:19.9:0.1。
4.根据权利要求1所述同时检测青稞中30种真菌毒素的方法，其特征在于，步骤2）中，青稞样品粉末与提取液I的质量体积比为1：10，质量体积比单位为g/mL。
5.根据权利要求1所述同时检测青稞中30种真菌毒素的方法，其特征在于，步骤3）所加入的QuEChERS提取包与青稞样品粉末的质量比为6.5：2。
6.根据权利要求1所述同时检测青稞中30种真菌毒素的方法，其特征在于，步骤3）所述涡旋震荡是指2500rpm震荡2 min。
7.根据权利要求1所述同时检测青稞中30种真菌毒素的方法，其特征在于，步骤3）所述离心是指10000rpm离心5min。
8.根据权利要求1所述同时检测青稞中30种真菌毒素的方法，其特征在于，步骤4）所述提取液II是由乙腈、水、甲酸按照体积比50:49.9:0.1混合后获得。
9.根据权利要求1所述同时检测青稞中30种真菌毒素的方法，其特征在于，其特征在于，步骤4）所加入的提取液II与步骤3）上清液的体积比为1:4。
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