CN116671440A - 一种丝瓜下胚轴离体再生方法及培养基配制 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丝瓜下胚轴离体再生方法及培养基配制。属于植物组织培养和生物技术领域，具体步骤：1、无菌苗的制备；2、愈伤组织和不定芽的诱导；3、生根诱导；4、炼苗；5、移栽。本发明的特点是：1、本发明通过丝瓜下胚轴实现离体再生，只需要一种培养基配方不需要多次更换培养基配方即能实现离体再生；2、本发明以丝瓜下胚轴作为外植体，经诱导可获得大量不定芽，可不受季节限制获得再生植株，为丝瓜转基因提供技术支撑。本发明建立的丝瓜离体再生方法为丝瓜新品种创制、分子机理研究等提供技术保障，促进丝瓜产业发展；3、本发明主要解决丝瓜离体组织再生的问题，同时为丝瓜遗传转化的研究做铺垫。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养和生物技术领域，涉及了一种丝瓜下胚轴离体再生方法及培养基配制；具体的是，涉及了一种高效丝瓜下胚轴离体再生方法及培养基配制。
背景技术
丝瓜又名布瓜、天罗，一年生攀缘草本葫芦科丝瓜属作物，是我国普遍栽培的一种蔬菜；丝瓜具有丰富的营养价值，蛋白质、淀粉、钙、磷、铁以及各种维生素的含量都比较高，深受消费者的喜爱。随着科研人员对丝瓜的深入研究，丝瓜在遗传育种和分子生物学方面都有一定的进展；但分子育种方面进行缓慢，严重制约了丝瓜新品种的创制和推广，成为丝瓜推广和产业化进程的绊脚石。
由于东南亚之外地区丝瓜食用及栽培较少，丝瓜的研究不大重视，丝瓜组织培养研究的报道也较少；Nahar等(2010)及Singh等(2011)对丝瓜进行组织快繁，但再生植株获得率极低。Shrivastava等(2013)以丝瓜子叶为试材，在MS+1.5mg/LBAP培养基上进行诱导，仅获得愈伤组织。
国内研究者开展了比较多的研究，部分研究成功获得了再生植株；王慧莲(1999)用普通丝瓜子叶进行了离体培养，诱导出大量愈伤组织，形成丛芽后生根培养，成苗率高达98％；谭兆平等(2001)以有棱丝瓜‘绿旺‘的真叶、下胚轴、上胚轴及胚芽为外植体进行组织培养，经诱导形成愈伤组织并分化成苗；尽管国内有报道丝瓜能够通过愈伤组织再生成植株，但重复性差，不同研究的结果差异也较大。
随着分子生物学的发展，分子育种在培育新品种方面发挥着日益重要的作用；实现分子育种的关键是高效稳定的遗传转化体系。但丝瓜遗传转化困难，严重影响丝瓜育种的进展。其中制约遗传转化最关键的因素就是丝瓜的离体再生困难。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供了一种丝瓜下胚轴离体再生方法及培养基配制，。
技术方案：本发明所述的一种丝瓜下胚轴离体再生方法，其具体制备步骤如下：
步骤(1)、无菌苗的制备：采用次氯酸钠(V次氯酸钠：v无菌水＝1：1)对丝瓜种子进行2次消毒，再用无菌水冲洗3次；
将丝瓜种子平铺到组培瓶中，每瓶平铺3粒；
步骤(2)、愈伤组织和不定芽的诱导：切取步骤(1)丝瓜发芽后5-7天的下胚轴(优选长度5mm左右)接种于愈伤诱导和不定芽诱导培养基；
其中，愈伤诱导培养基和不定芽诱导培养基均为MS+2.256-BAmg/L+0.1NAAmg/L、MS+1 6-BAmg/L+0.1mg/LNAA、MS+2.256-BAmg/L+0.2mg/LNAA、MS+1 6-BAmg/L+0.2mg/LNAA、MS+2.256-BAmg/L+0NAAmg/L、MS+1 6-BAmg/L+0mg/L NAA；
将其放在12h光照和12h黑暗条件下培养6-7周，下胚轴外植体即可产生不定芽；
其中，最优组合为MS+2.25 6-BAmg/L+0.1NAAmg/L，不定芽发生率为82.3％；
步骤(3)、生根诱导：取步骤(2)单个不定芽放入生根培养基，于12h光照12h黑暗下培养7d左右，生根诱导率为98.3％；
其中，生根培养基为MS基本培养基，
步骤(4)、炼苗：挑选步骤(3)中已经生根且长势旺盛的瓶苗进行炼苗；
所述炼苗方法为：将瓶盖打开2-3d置于室温(常规在25摄氏度左右)、自然光下培养；
将瓶苗掏出清洗干净根部的培养基；
步骤(5)、移栽：将炼苗后的再生苗进行移栽，移栽基质配比草炭：蛭石：珍珠岩＝3：1：1；
将再生苗移栽在种植盆里，2周后统计成活率，成活率在93.4％以上。
有益效果：本发明与现有技术相比，本发明的特点是：1、本发明通过丝瓜下胚轴实现离体再生，只需要一种培养基配方不需要多次更换培养基配方即能实现离体再生；2、本发明以丝瓜下胚轴作为外植体，经诱导可获得大量不定芽，可不受季节限制获得再生植株，为丝瓜转基因提供技术支撑。本发明建立的丝瓜离体再生方法为丝瓜新品种创制、分子机理研究等提供技术保障，促进丝瓜产业发展；3、本发明主要解决丝瓜离体组织再生的问题，同时为丝瓜遗传转化的研究做铺垫。
附图说明
图1是本发明的操作流程图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面结合附图对本发明的技术方案做进一步的详细说明；
实施例一：
(1)、取材：选取饱满的‘肉丝瓜’丝瓜种子；
(2)、消毒：种子用次氯酸钠(v次氯酸钠：v无菌水＝1：1)2次消毒后，用无菌水冲洗3次，接种至1/4MS培养基中，培养14d后获得无菌苗，此时子叶展开，真叶显露(一般发芽后5-7d即可达到这个状态)；
其中培养基含有30g/L蔗糖、7g/L琼脂、pH为5.8；培养条件20-25℃，光照强度2000-3000lx，光照12h，黑暗12h；
(3)、愈伤组织和不定芽的诱导：选(2)中的无菌苗用解剖刀切5mm左右下胚轴，接种于愈伤诱导和不定芽诱导培养基上；愈伤诱导和不定芽诱导培养基均是以MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA(2.25、1.0mg/L、0mg/L)与NAA(0.1、0.2、0mg/L)；
两种常用植物激素进行不同浓度的组合，旨在获得高效诱导愈伤不定芽的激素配比(表1)；2周后统计愈伤率；
其中培养基所含的蔗糖为30g/L，所含琼脂粉为7g/L，调节pH为5.8；培养条件20-25℃，光照强度2000-3000lx，12h光照、12h黑暗，每个处理重复3次，每个重复30瓶；
结果表明，不同浓度的NAA和6-BA激素组合均能诱导下胚轴产生愈伤组织；当6-BA浓度一定时随着NAA浓度升高，愈伤诱导率出现逐渐上升的趋势，最适的NAA浓度为0.1mg/L；当NAA浓度一定时，随着6-BA浓度的升高，愈伤组织呈现上升的趋势；最佳6-BA浓度为2.25mg/L；尽管愈伤组织诱导率均呈上升状态，但激素浓度配比的不同对愈伤生长状态不同；MS+2.25mg/L 6-BA+0.1NAA下胚轴愈伤组织致密，愈伤组织生长状态最佳。
表1不同激素组合对诱导下胚轴愈伤组织及不定芽出芽率的影响
备注：愈伤率和愈伤组织质地在接种15d统计；不定芽诱导在接种后45d统计
从表1中，发现不同激素浓度配比对愈伤组织质地的影响很大，愈伤组织质地状态对不定芽的出芽率有一定的影响，只有愈伤组织质地紧密，出芽率才能提高；疏松的愈伤组织没有出不定芽，可能是激素的配比不适宜影响细胞的脱分化进而影响不定芽的发生。
表2激素对不定芽生根的影响
从表2可知，激素对不定芽生根的影响仅体现在生根时间的长短，加入激素后能够提早发根，不加入激素丝瓜不定芽的生根率也很高，说明激素有无丝瓜不定芽都能生根。
将已经生根的丝瓜苗进行炼苗，将组培瓶丝瓜苗放入室温、自然光照下，开盖2-3d；将丝瓜根部培养基清洗干净，定植于种植盆内(草炭：蛭石：珍珠岩＝3：1：1)；在25℃左右、光照强度2000-3000lx、12h光照、12h黑暗温室内生长良好，长成与自然生长的小苗一致的丝瓜再生苗。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种丝瓜下胚轴离体再生方法，其特征在于，其具体制备步骤如下：
步骤(1)、无菌苗的制备；
步骤(2)、愈伤组织和不定芽的诱导；
步骤(3)、生根诱导；
步骤(4)、炼苗；
步骤(5)、移栽。
2.根据权利要求1所述的一种丝瓜下胚轴离体再生方法，其特征在于，
在步骤(1)中，所述无菌苗的制备具体是：采用次氯酸钠溶液对丝瓜种子进行2次消毒，再用无菌水冲洗3次；
将丝瓜种子平铺到组培瓶中，每瓶平铺3粒。
3.根据权利要求2所述的一种丝瓜下胚轴离体再生方法，其特征在于，其特征在于，
在所述次氯酸钠溶液中，次氯酸钠与无菌水的比例是：1：1。
4.根据权利要求1所述的一种丝瓜下胚轴离体再生方法，其特征在于，其特征在于，
在步骤(2)中，所述愈伤组织和不定芽的诱导具体是：切取步骤(1)中丝瓜发芽后5-7天的下胚轴接种于愈伤诱导和不定芽诱导培养基，将其放在12h光照和12h黑暗条件下培养6-7周，下胚轴外植体即可产生不定芽。
5.根据权利要求4所述的一种丝瓜下胚轴离体再生方法，其特征在于，其特征在于，
所述下胚轴的长度为5mm；
所述愈伤诱导培养基和不定芽诱导培养基均为MS+2.256-BAmg/L+0.1NAAmg/L、MS+16-BAmg/L+0.1mg/LNAA、MS+2.256-BAmg/L+0.2mg/LNAA、MS+1 6-BAmg/L+0.2mg/LNAA、MS+2.256-BAmg/L+0NAAmg/L、MS+1 6-BAmg/L+0mg/L NAA。
6.根据权利要求1所述的一种丝瓜下胚轴离体再生方法，其特征在于，其特征在于，
在步骤(3)中，所述生根诱导具体是：取步骤(2)中单个不定芽放入生根培养基中，于12h光照12h黑暗下培养7d；
其中，所述生根培养基为MS基本培养基。
7.根据权利要求1所述的一种丝瓜下胚轴离体再生方法，其特征在于，
在步骤(4)中，所述炼苗具体是：挑选步骤(3)中已生根且长势旺盛的瓶苗进行炼苗。
8.根据权利要求7所述的一种丝瓜下胚轴离体再生方法，其特征在于，所述炼苗的方法为：将瓶盖打开2-3d置于室温、自然光下培养；
再将瓶苗掏出清洗干净根部的培养基。
9.根据权利要求1所述的一种丝瓜下胚轴离体再生方法，其特征在于，
在步骤(5)中，所述移栽具体是：将炼苗后的再生苗进行移栽；
将再生苗移栽在种植盆里，2周后统计成活率。
10.根据权利要求9所述的一种丝瓜下胚轴离体再生方法，其特征在于，所述移栽基质配比是草炭：蛭石：珍珠岩＝3：1：1。
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-
2023
- 2023-06-20 CN CN202310733016.2A patent/CN116671440B/zh active Active
Patent Citations (7)
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