CN116671439B - 用于丝瓜大孢子培养单倍体的诱导培养基及组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于丝瓜大孢子培养单倍体的诱导培养基及组织培养方法，属于植物组织培养技术领域，本发明提供一种用于丝瓜大孢子培养单倍体的诱导培养基，配方为：MS+0.04mg/L TDZ+2mg/L AgNO3+2mg/L 2,4‑D+蔗糖50g/L+琼脂7g/L+嫩丝瓜汁。在所述诱导培养基中添加一定浓度的嫩丝瓜汁，采用未授粉丝瓜幼瓜为外植体，可以有效诱导未受精胚膨大突出脱落，从而出芽成苗。本发明提供的简单高效的丝瓜单倍体获取方法，为葫芦科作物的单倍体研究奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种用于丝瓜大孢子培养单倍体的培养基及组织培养方法。
背景技术
作物的单倍体培育有利于加速育种进度、有助于远缘杂交类型的培育、物种进化研究、构建连锁图谱、作为外源基因转化的受体等，特别是和传统育种结合，具有显著的应用价值。
目前，通过人工获得单倍体的方法有四种：1、花药和花粉培养；2、未受精子房和胚珠培养；3、远缘杂交亲本染色体消除法；4、辐射花粉结合胚抢救。其中，以花粉和花药培养的研究最广泛也最成功。
但是，葫芦科作物的花药和花粉培养很难成功或者其诱导单倍体频率太低，未受精子房和胚珠离体培养可能提供另一条有效的单倍体诱导途径。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的一在于提供一种用于丝瓜大孢子培养单倍体的诱导培养基，目的二在于提供上述诱导培养基在诱导丝瓜大孢子培养单倍体方面的应用，目的三在于提供一种获取丝瓜单倍体的组织培养方法。利用本发明所述的诱导培养基和组织培养方法，可以诱导未授粉幼瓜的未受精胚发育成苗，从而获得完整的再生植株，方法简单，结果高效。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
第一方面，一种用于丝瓜大孢子培养单倍体的诱导培养基，是在常规MS培养基的基础上，还包括0.04mg/L TDZ、 2 mg/L AgNO3、2 mg/L 2,4-D、50g/L蔗糖、7g/L琼脂和25~100 g/L嫩丝瓜汁。
作为对上述诱导培养基的进一步优化，所述诱导培养基中，嫩丝瓜汁的浓度为50g/L。
更进一步地，上述嫩丝瓜汁是取嫩丝瓜切片，加水煮10min，经四层纱布过滤所得的滤液。
第二方面，上述诱导培养基在诱导丝瓜大孢子培养单倍体方面的应用。
一种获取丝瓜单倍体的组织培养方法，是采用未授粉的丝瓜幼瓜为外植体，通过诱导未受精胚发育成芽，进而继代培养获取再生组织；在所述组织培养过程中，采用上述的诱导培养基。
作为对上述组织培养方法的进一步优化，具体包含以下步骤：
步骤一、培养基配制：
诱导培养基：MS+ 0.04mg/L TDZ + 2 mg/L AgNO3+2 mg/L 2,4-D +蔗糖50 g/L+琼脂7g/L+嫩丝瓜汁50 g/L；
生根培养基：1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂7g/L；
步骤二、材料选择：选择开花前的丝瓜嫩瓜；
步骤三、材料消毒：采用0.1%升汞消毒10min，无菌水清洗5-7次，每次2min；
步骤四、材料处理与接种：无菌条件下，用手术刀刮去丝瓜外皮，切割成1mm-2mm厚片，接种到灭过菌的诱导培养基上；
步骤五、组织培养：在温度26±1℃、光照2500-4000LX、光照周期14h/10h的条件下培养，7-10天后，未受精胚膨大突出；2-3周后脱离外植体；
步骤六、植株生根成苗：继续培养30-40天，将诱导出的胚状体形成的小芽，继代到生根培养基上，再培养15-20天，获得再生植株。
有益效果：本发明通过未受精幼瓜获得单倍体，提供了一种简单高效的获取丝瓜单倍体的组织培养技术，单倍体数量比例可达70-80%，为葫芦科作物的单倍体研究提供了基础。
附图说明
图1是未受精丝瓜嫩瓜切片胚膨大突起示意图；其中。左图为横切局部；右图为纵切局部；
图2是未受精胚脱落示意图；其中，右图为局部放大图；
图3是未受精胚珠出芽示意图；
图4是未受精胚珠再生丝瓜苗；
图5是丝瓜根尖压片（染色体数n=13）示意图；
图6是流式细胞仪的检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
下述实施例中，选用的丝瓜品种为“艾莱克”。
实施例1
本发明提供一种通过未授粉幼瓜获得单倍体的组织培养方法，其中诱导培养基是关键，本发明所用诱导培养基配方为：诱导培养基：MS+ 0.04mg/L TDZ + 2 mg/L AgNO3 +2mg/L 2,4-D +蔗糖50 g/L +琼脂7g/L+嫩丝瓜汁；
其中，以50 g/L的浓度为例，嫩丝瓜汁指50克嫩丝瓜切片，加水煮10min，经四层纱布过滤获得的滤液，加入到1升培养基中。
嫩丝瓜汁作用明显，不添加或用量不合适，胚珠膨大凸起极少或没有。本发明分别选取0、25、50、75、100 g/L的浓度，研究了不同浓度嫩丝瓜汁对未受精胚发育情况的影响，结果如下表1所示。
表1 嫩丝瓜汁对未受精胚发育的影响。
由上表1可知，当诱导培养基中不添加嫩丝瓜汁时，胚珠难以发育。加入一定浓度的嫩丝瓜汁后，能明显促进未受精胚发育，尤以50g/L浓度的促进效果最佳。
实施例2
本发明提供一种通过未授粉幼瓜获得单倍体的组织培养方法，是以诱导培养基为基础，结合整个组织培养工艺，诱导未受精胚发育成苗。
1 培养基 诱导培养基：MS+ 0.04mg/L TDZ + 2 mg/L AgNO3 +2 mg/L 2,4-D +蔗糖50 g/L+琼脂7g/L+嫩丝瓜汁50 g/L；生根培养基：1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂7g/L。
2 材料选择 开花前天下午（开花前12小时）取嫩瓜。
3 材料消毒 0.1%升汞消毒10min，无菌水清洗5-7次，每次2min。
4 材料处理与接种 无菌条件下，用手术刀刮去丝瓜外皮，切割成1mm-2mm厚片，接种到灭过菌的诱导培养基上。
5 组织培养 温度26±1℃；光照2500-4000LX，14h/10h光照周期。7-10天后，未受精胚膨大突出，如图1所示；2-3周后可脱离外植体，如图2所示，部分未受精胚不脱落，也可形成发育成苗。
6 植株生根成苗 继续培养30-40天，将诱导出的胚状体形成的小芽（如图3所示），继代到生根培养基上，再培养15-20天，获得再生植株，如图4所示。
7 倍性鉴定 取再生植株的根尖，采用压片法，龙胆紫染色观察其染色体数量，进行倍性鉴定。如图5所示，可观察到单倍体。
采用本发明所述组织培养技术获取丝瓜单倍体，对其进行统计分析，单倍体数量比例可达70-80%。
采用流式细胞仪对采用上述方法获得的单倍体进行检测，结果如图6所示，单倍体比对照出现更早的一个峰。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种用于丝瓜大孢子培养单倍体的诱导培养基，其特征在于：在常规MS培养基的基础上，还包括0.04mg/L TDZ、 2 mg/L AgNO3、2 mg/L 2,4-D、50g/L蔗糖、7g/L琼脂和25~100g/L嫩丝瓜汁。
2.根据权利要求1所述的诱导培养基，其特征在于：所述诱导培养基中，嫩丝瓜汁的浓度为50g/L。
3.根据权利要求2所述的诱导培养基，其特征在于：所述嫩丝瓜汁是取嫩丝瓜切片，加水煮10min，经四层纱布过滤所得的滤液。
4.根据权利要求1-3任意一种所述的诱导培养基在诱导丝瓜大孢子培养单倍体方面的应用。
5.一种获取丝瓜单倍体的组织培养方法，其特征在于：是采用未授粉的丝瓜幼瓜为外植体，通过诱导未受精胚发育成芽，进而继代培养获取再生组织；在所述组织培养过程中，采用权利要求1-3任意一种所述的诱导培养基。
6.根据权利要求5所述的组织培养方法，其特征在于：具体包含以下步骤：
步骤一、培养基配制：
诱导培养基：MS+ 0.04mg/L TDZ + 2 mg/L AgNO3 +2 mg/L 2,4-D +蔗糖50 g/L+琼脂7g/L+嫩丝瓜汁50 g/L；
生根培养基：1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂7g/L；
步骤二、材料选择：选择开花前的丝瓜嫩瓜；
步骤三、材料消毒：采用0.1%升汞消毒10min，无菌水清洗5-7次，每次2min；
步骤四、材料处理与接种：无菌条件下，用手术刀刮去丝瓜外皮，切割成1mm-2mm厚片，接种到灭过菌的诱导培养基上；
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