CN1166675C - 生产高活性银杏叶提取物的萃取剂及其提取与分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明具体涉及从银杏叶中提取银杏叶提取物的萃取剂、提取工艺及测试方法。发明的关键是创制一种新的萃取剂，采用水提法提取银杏黄酮和EGb，工艺中无需增加去除银杏酚酸的步骤。还包括一种利用次级化学平衡定量分析银杏酚酸的高效液相色谱法。产品总黄酮甙24%-32%，总萜内酯6%-13%，原花青素8-14%，银杏酚酸含量小于5毫克/千克，得率为2.8%-3.6%。萃取剂成本低，用量小，无残留。可明显提高银杏叶中黄酮类和萜内酯及原花青素类化合物的溶出率并抑制银杏酚酸的溶出。

Description

生产高活性银杏叶提取物的萃取剂及其提取与分析方法

                             技术领域

本发明属于天然产物提取技术领域，发明涉及一种以银杏叶为原料生产银杏叶提取物的萃取剂和水提取方法，并包括一种对银杏酚酸含量进行定量分析的方法。

                             背景技术

银杏叶提取物在治疗上已经使用30余年了，目前在国内外市场上有众多以银杏叶提取物为主要成份的药品和保健食品，如天保宁、银可络、Tanakan、Tebonin、银杏茶等，是预防和治疗心脑血管和神经系统疾病的有效植物药。用于上述目的的银杏叶提取物的特征在于其成份中含有22％-27％黄酮甙、5％-7％萜内酯(银杏内酯A、B、C 2.8％-3.4％；白果内酯2.6％-3.2％)、且银杏酚酸在5mg/kg以下。

银杏叶提取物的生产工艺有很多，国外多采用有机溶剂法，有代表性的工艺是德国Schwabe公司的一系列专利DE2117419、DE1767098、DE3940092；以及意大利Indena公司的专利工艺EP0360556，这些工艺的共同特点是生产过程中使用大量的有机溶剂，如丙酮、乙醇、四氯化碳、正己烷、甲乙酮、正丁醇等，工艺的优点是产品质量好且稳定，缺点是生产成本极高，生产工艺安全性差、对环境影响大。

国内生产银杏叶提取物多采用溶剂(乙醇或甲醇、丙酮)提取，结合树脂塔精制的工艺方法，如CN1116532A、CN1145320A，与国外工艺比较虽然大大减少了有机溶剂使用的种类，但由于在提取阶段使用的溶剂量甚大，且回收率低，因此生产成本仍然较高，且存在产品中银杏酚酸严重超标、水溶解性差的问题。

中国发明专利公开号CN1172669A和CN1322723A的专利申请中分别涉及了用超临界和亚临界二氧化碳萃取法生产银杏叶提取物的方法，由于高压工艺上的限制，该方法多用于实验性和小规模生产，难以实现大规模的工业化生产。

银杏酚酸是银杏叶及其提取物中的致敏性有害成分，系一类碳数和饱和度不同的长链烃基酚酸，也是银杏叶提取物及其药物制剂引起临床不良反应的主要物质。国际医药市场对其限量要求极为严格，是影响EGb产品质量和出口外销的最关键限量指标之一。

目前，国内外对银杏叶及其提取物质量控制的研究仅集中在黄酮和萜内酯等有效成分的分析上，而对于银杏酚酸分析方法的研究报道极少。意大利报道了银杏酚酸的超临界流体萃取分离和毛细管气相色谱/质谱鉴定，该方法的优点是干扰少，能对多种银杏酚酸进行分离鉴定，但样品前处理操作繁琐、费时，不能用于微量样品的定量分析。国内报道了银杏酸的超临界流体萃取分离和高效液相色谱测定，同样也存在上述问题，而且各银杏酸之间不能很好分离。

本发明的目的在于克服现有技术的不足，研制一种萃取剂和以水浸提法代替现有溶剂法生产银杏叶提取物的方法，本发明的萃取剂及其工艺具有提取工艺简便、提取率高、产品中活性成分含量高而银杏酚酸含量低、能耗低、生产成本低、产品质量好、对环境影响小的优点。

                            发明内容

本发明通过以下技术方案实现：

一种用于生产高活性银杏叶提取物的萃取剂按w/w的成份和配比为：

亚硫酸盐或亚硫酸氢盐                0.001-0.5

水                                  补充至100

pH值                                2.0-5.5

经优化的萃取剂按w/w的成份和配比为：

亚硫酸盐或亚硫酸氢盐                0.04-0.2

水                                  补充至100

pH值                                3.5-5.5

所述的萃取剂从亚硫酸钠、亚硫酸氢钠中选择。

一种生产高活性银杏叶提取物的工艺，所述的工艺包括以下步骤：

(1)在待处理的银杏叶中加入所述的萃取剂，该萃取剂从亚硫酸钠、亚硫酸氢钠中选择，添加量按w/w比例为0.001-0.5，并补充水至100。

(2)按w/w，将干净的银杏叶按原料与萃取剂之比为1∶5-20，投料浸提萃取，浸提温度30-100℃，处理30分钟-20小时，浸提过程中间歇搅拌原料，控制降温速度1-10℃/小时，然后留取料液，再加入5-20倍于银杏叶的萃取剂进行第二次提取，合并两次料液；

(3)将步骤(2)得到的料液过滤，去200目以下的杂质，料液冷却至30℃以下；

(4)将步骤(3)得到的料液流经树脂吸附柱精制纯化，用水洗涤去除杂质后，再用30％-95％的低级醇冲洗树脂柱，得到洗脱液；

(5)将步骤(4)所述的洗脱液在温度50℃以下真空浓缩，回收溶剂，得到浓缩液；

(6)将步骤(5)得到的浓缩液干燥，和

(7)将步骤(6)得到的产品采用反相高效液相色谱法定量分析银杏黄酮、萜内酯和银杏酚酸。

所述的步骤(1)中的的萃取剂从亚硫酸钠、亚硫酸氢钠中选择，其添加量按w/w比例为0.04-0.2，并补充水至100。

所述的生产原料可以是银杏鲜叶或经干燥的银杏叶，所述的叶不需要经过粉碎。

所述的工艺还包括从步骤(1)到步骤(6)均在密闭容器内进行。

所述的工艺还包括：

(1)步骤(4)中的精制柱为大孔树脂柱；

(2)步骤(4)中的低级醇为乙醇或甲醇，和

(3)将步骤(5)得到的醇洗脱液在真空条件下浓缩。

所述的生产工艺采用冷冻干燥或喷雾干燥或真空干燥将步骤(6)得到的浓缩液进行干燥。

所述的银杏酚酸液相色谱法的流动相按v/v组成为：

甲醇或乙晴或四氢呋喃      70-90

水                        30-10

添加银离子至              0.005-0.05mol.L^-1

pH调整为                  3.5

更详细的技术方案如下所述：

一、浸提：将干净的银杏叶按原料与萃取剂之比为1∶5-20(w/w)投料置提取罐中，浸提温度30-100℃，提取时间30分钟-20小时，浸提过程中，每小时间歇搅拌原料2-3次，每次0.5-5分钟，提取过程结束时，料液温度控制在45℃以下，滤出料液。向残余银杏叶中加入5-15倍的萃取剂进行第二次提取，过程同上，合并两次料液，待温度降到40℃以下后，精滤，去除200目以下的杂质；

二、精制：将步骤一得到的料液泵入已再生好的大孔树脂吸附柱上，用20-40倍柱体积的自来水洗涤去除杂质后，用2-5倍的去离子水过柱，再用30％-95％的低级醇溶液冲洗树脂吸附柱，收集醇洗脱液；

三、浓缩：醇洗脱液在50℃以下真空浓缩，回收溶剂，得到银杏叶提取物的浓缩液；

四、干燥：将步骤三得到的银杏叶提取物的浓缩液干燥。

五、质检：依照国际公认的检验方法和标准进行，其中银杏酚酸的检验(尚无公认方法)方法如下：

准确称取0.5-2.0g左右的银杏叶提取物，分次加入体积分数小于10％的酸性甲醇溶液10-15m1溶解，随后加入5-8ml正己烷、石油醚或苯萃取三次，分别收集上层有机相，合并，浓缩后的残留物以氯仿或乙醇溶解后供高效液相色谱分析。该方法平均回收率97.3％，精密度RSD为1.6％，最低检测限26ng(S/N＝3)。各银杏酚酸之间的分离因子均大于1.3，分离度均大于1.5(色谱图见附图2及图3)。各种银杏酚酸的定性通过SIMS、LC/(-)ESI-MS鉴定(见附图4、图5)。

色谱柱为：中国科学院大连化学物理研究所KF-C18 ODS(250mm×4.6mm，7μm)或Waters C18 ODS(150mm×2.1mm，5μm)，

流动相组成为：

甲醇或乙晴或四氢呋喃      70-90

水                        30-10

添加银离子至浓度为        0.005-0.05mol.L^-1

pH调整为                  3.5

柱温：25-40℃

检测波长：310nm

流速：0.8-1.0ml.min^-1

在上述工艺中，原料银杏叶可以是鲜叶，也可用经干燥处理的银杏叶，与其它工艺不同的是，银杏叶不需要经过粉碎。

在上述工艺中，原料浸提至醇洗脱液浓缩，均在密闭的陶瓷或不锈钢容器内进行。

在上述工艺中，精制纯化所使用的吸附柱为对银杏黄酮和萜内酯有选择性吸附的大孔树脂柱，如D101、SH-03、NKA-9、ADS-17等。洗脱用的低级醇可以是乙醇或甲醇，推荐使用70％的乙醇。

在上述工艺中，可以采用冷冻干燥或喷雾干燥或真空干燥对银杏叶提取物的浓缩液进行干燥。为了使产品有更好的内在质量和外观，建议采用冷冻干燥。

经过长期工业化生产总结，采用本发明的工艺方法生产银杏叶提取物，产品收得率为2.8％-4.2％(与原料银杏叶的质量相关)，生产周期为40-50小时，每生产1公斤银杏叶提取物，乙醇消耗量低于5公斤。

采用本发明工艺方法生产的银杏叶提取物，产品的主要质量指标能稳定地达到如下标准：总黄酮甙≥24.0％(高效液相色谱法)；总萜内酯≥6.0％(高效液相色谱法，其中白果内酯≥2.4％)；原花青素≥8％；银杏酚酸≤5ppm(银化高效液相色谱法)；无萃取剂和醇残留；水中溶解度≥5％。

研究证明本发明所使用的萃取剂能明显提高银杏叶中黄酮甙和萜内酯溶出率，同时抑制银杏酚酸等杂质溶出的功能(见附图2和图3测定结果)，而且提取料液只需经过过滤便可直接上树脂吸附柱精制纯化，比有机溶剂提取法减少了回收溶剂和原料粉粹的过程，因此大大降低了能源和溶剂的消耗，生产成本也随之大幅度下降。

通过实验证明，本发明的萃取剂中的水若被含水甲醇、含水乙醇、含水丙酮替代，也有同样好的效果，但生产成本又将上升。

以下结合实例，对本发明作进一步的详细描述，但并不说明本发明仅限于此范围。

                              附图说明：

图1：本发明的银杏叶提取物中银杏酚酸(Ginkgolic acids，GA)的结构；

图2：本发明实施例1生产的银杏叶提取物中银杏酚酸(Ginkgolic acids，GA)色谱图

图中1代表GA15∶1，2代表G A13∶0，3代表GA17∶1，银杏酚酸总含量：3.7ppm；

图3：对比技术(醇提法)生产的银杏叶提取物中银杏酚酸(Ginkgolic acids，GA)色谱图；图中1代表GA15∶1，2代表G A13∶0，3代表GA17∶1，4代表GA15∶0，银杏酚酸总含量：313.7ppm；

图4：银杏酚酸的选择离子LC/(-)ESI-MS图；

图5：银杏酚酸的Negative SIMS图。

图中m/z 319.2281代表GA13∶0，m/z 275.2379代表与GA13∶0对应的银杏酚，m/z 345.2433代表GA15∶1，m/z 301.2537代表与GA15∶1对应的银杏酚，m/z347.2596代表GA15∶0，m/z 303.2693代表与GA15∶0对应的银杏酚，m/z 373.2756代表GA17∶1。

                          具体实施方式

实施例1

萃取剂的成分及配比(按份量计算)：亚硫酸氢钠10kg；自来水8000kg；pH5.0。

将干燥的银杏叶300kg清洁干净，滤水，投入提取罐，加入94℃的萃取剂5000kg，加盖密闭，升高提取罐内温度使之达到97℃，并保持1个大气压，每半小时搅拌1分钟，控制罐内温度每小时下降2.5℃，浸提16小时后，滤出料液4400kg。再向提取罐中加入3000kg萃取剂溶液，进行第二次浸提，10小时后滤出料液3100kg，合并两次料液用离心过滤机粗滤出20目以下杂质，砂滤机精滤出200目以下杂质，并将料液冷却到30℃。

将料液以1500kg/小时流量流过NKA-9树脂吸附柱，然后用水洗下不被吸附或吸附较小的杂质，换2倍柱体积去离子水洗涤，再用70％的乙醇冲洗树脂吸附柱，收得乙醇洗脱液1500kg，在43℃温度下采用三效浓缩塔浓缩乙醇洗脱液20倍，浓缩液采用冷冻干燥，得到产品9.8kg。

检验结果：总黄酮甙28.1％，总萜内酯9.4％，原花青素10.6％，银杏酚酸3.7ppm(见附图2)，水中溶解度7.7％

实施例2

萃取剂的组成及配比(按份量计算)：亚硫酸钠5kg；水6000kg；pH为5.5。

取干燥的银杏叶(湖北安陆)300kg清洁干净，滤水，投入提取罐，加入93℃萃取剂4000kg，加盖密闭，每半小时搅拌3分钟，浸提10小时后，罐内温度降至60℃，滤出料液，加入2000kg萃取剂作第二次提取，6小时后过滤，合并两次提取液共5600kg，料液用离心过滤机粗滤，砂滤机精滤，并冷却至35℃；仍采用实施例1中的树脂柱精制，收集乙醇洗脱液1300kg，浓缩至40kg后，采用喷雾干燥得9.02kg淡黄色银杏叶提取物。

检验结果：总黄酮甙27.6％，总萜内酯8.1％，原花青素9.6％，银杏酚酸4.8ppm，水中溶解度5.7％

实施例3

萃取剂组成成份及配比(按份量计算)：亚硫酸氢钠9kg；自来水4500kg；pH4.8。

取刚采摘的银杏鲜叶600kg(含水量72％)、萃取剂3000kg一并投入提取罐，控制温度70℃，每小时间歇搅拌10分钟，浸提20小时后，滤出料液，以1500kg萃取剂再作20小时的第二次提取，两次提取液合并后过滤，滤液4400kg三小时流过ADS-17树脂吸附柱，依此用6000kg自来水，1000kg去离子水洗柱后，以70％乙醇洗脱，乙醇洗脱液浓缩至20kg后，采用冷冻干燥，可得产品4.81kg。

检验结果：总黄酮甙36.0％，总萜内酯12.8％，原花青素12.5％，银杏酚酸2.6ppm，水中溶解度8.1％。

Claims (10)

1、一种用于生产高活性银杏叶提取物的萃取剂，其特征在于所述的萃取剂按w/w的成份和配比为：

亚硫酸盐或亚硫酸氢盐                                0.001-0.5

水                                                  补充至100

pH值                                                2.0-5.5

2、根据权利要求1所述的萃取剂，其特征在于所述的萃取剂按w/w的成份和配比为：

亚硫酸盐或亚硫酸氢盐                                0.04-0.2

水                                                  补充至100

pH值                                                3.5-5.5

3、根据权利要求1或2所述的萃取剂，其特征在于所述的萃取剂从亚硫酸钠、亚硫酸氢钠中选择。

4、一种生产高活性银杏叶提取物的工艺，其特征在于所述的工艺包括以下步骤：

(1)在待处理的银杏叶中加入萃取剂亚硫酸钠或亚硫酸氢钠，添加量按w/w比例为0.001-0.5，并补充水至100；

(2)按w/w，将干净的银杏叶按原料与萃取剂之比为1∶5-20，投料浸提萃取，浸提温度30-100℃，处理30分钟-20小时，浸提过程中间歇搅拌原料，控制降温速度1-10℃/小时，然后留取料液，再加入5-20倍于银杏叶的萃取剂进行第二次提取，合并两次料液；

(3)将步骤(2)得到的料液过滤，去除200目以下的杂质，料液冷却至30℃以下；

(4)将步骤(3)得到的料液流经树脂吸附柱精制纯化，用水洗涤去除杂质后，再用30％-95％的低级醇冲洗树脂柱，得到洗脱液；

(5)将步骤(4)所述的洗脱液在温度50℃以下真空浓缩，回收溶剂，得到浓缩液；

(6)将步骤(5)得到的浓缩液干燥，和

(7)将步骤(6)得到的产品采用反相高效液相色谱法定量分析银杏黄酮、萜内酯、原花青素和银杏酚酸。

5、根据权利要求4所述的生产工艺，其特征在于所述的步骤(1)中的的萃取剂从亚硫酸钠、亚硫酸氢钠中选择，其添加量按w/w比例为0.04-0.2，并补充水至100。

6、根据权利要求4所述的生产工艺，其特征在于：所述的生产原料可以是银杏鲜叶或经干燥的银杏叶，所述的叶不需要经过粉碎。

7、根据权利要求4所述的生产工艺，其特征在于：所述的工艺还包括从步骤(1)到步骤(6)均在密闭容器内进行。

8、根据权利要求4所述的生产工艺，其特征在于：所述的工艺还包括：

(1)步骤(4)中的精制柱为大孔树脂柱；

(2)步骤(4)中的低级醇为乙醇或甲醇，和

(3)将步骤(5)得到的醇洗脱液在真空条件下浓缩。

9、根据权利要求4所述的生产工艺，其特征在于，采用冷冻干燥或喷雾干燥或真空干燥将步骤(6)得到的浓缩液进行干燥。

10、根据权利要求4所述的生产工艺，其特征在于所述的银杏酚酸液相色谱法的流动相按v/v组成为：

甲醇或乙晴或四氢呋喃           70-90

水                             30-10

添加银离子至                   0.005-0.05mol.L^-1

pH调整为                       3.5

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