CN116656778A - 可消化粘蛋白的样本保存液 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,特别涉及可消化粘蛋白的样本保存液。本发明提供的组合物包括异硫氰酸胍、三(2‑羧乙基)膦盐酸盐和乙二胺四乙酸二钠二水合物,能够快速消化处理咽拭子、鼻拭子等样本上携带的粘蛋白物质,在将拭子放入保存液后在20s内即可将携带的粘蛋白物质消化掉,为后续样本的转移、核酸提取提供便利。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别涉及可消化粘蛋白的样本保存液。
背景技术
呼吸道疾病在世界范围内是危害人类健康的重大疾病之一,其中又以急性病毒性呼吸道感染为主。目前,病原微生物感染检测的“金标准”是基于核酸的检测方法。核酸诊断被广泛应用于各种病原体的检测上,但是核酸样本DNA/RNA降解是PCR检测中的常见问题。
在整个检测过程中出现的任何问题都可能会导致错误的诊断结果,尤其由于病毒核酸发生降解所导致的假阴性。在提取核酸之前,病毒样本将会在保存液中保存数小时或者数天。如果样本在采集、运输过程不能持续保持低温,样本中的核酸得不到有效保护,很容易导致样本发生降解,检测结果的质量就难以得到保证。
因此,病毒核酸样品保存对检测至关重要,而与其相关的研究较少。商业化的一次性使用病毒采样管是以咽拭子或鼻拭子加病毒保存液及保存管的形式。在检测呼吸道疾病时,会使用咽拭子或鼻拭子进行样本采集,随后将其放入保存液中。目前市场上的新型冠状病毒核酸检测试剂盒,多数样本类型为咽拭子,试剂盒使用的拭子洗脱试剂多数使用含有蛋白质稳定剂和抗生素的缓冲液,而使用这种试剂不能解决DNA/RNA容易降解的问题。此外,在样本采集完成之后,需要进行核酸检测,在此过程中,需要对采集到的样本进行处理,主要包括样本转移处理、核酸提取、上机检测。其中在样本转移处理过程中,拭子上的样本可能携带粘蛋白物质,该物质造成枪头的堵塞,存在以下风险:1.移液枪未吸到足够的样本,造成结果不准确;2.在全自动机器提取过程中造成样本的浪费(仪器枪头堵塞可能会造成仪器故障);3.造成枪头堵塞后,可能会造成样本飞溅等情况,造成污染;4.在使用含有磁珠的提取试剂时,会造成磁珠的凝结,造成结果的异常。而且现有的试剂成本高、保存液试剂因含有高浓度胍盐瓶口螺纹处有结晶现象。因此,提供稳定性好的样本保存液具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此,本发明提供的可消化粘蛋白的样本保存液,可在常温下一定时间内保持样本中的核酸完整、不降解,具有预裂解、消化粘蛋白的作用。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了组合物,包括异硫氰酸胍、三(2-羧乙基)膦盐酸盐和乙二胺四乙酸二钠二水合物。
在本发明的一些具体实施方案中,上述组合物中:
所述异硫氰酸胍的浓度为0.4~4mol/L;和/或
所述三(2-羧乙基)膦盐酸盐的浓度为5~50mmol/L;和/或
所述乙二胺四乙酸二钠二水合物的浓度为5~10mmol/L。
在本发明的一些具体实施方案中,上述组合物还包括氯化钠、缓冲液、表面活性剂、消泡剂或色素中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中,上述组合物中:
所述氯化钠的浓度为50~100mmol/L;和/或
所述缓冲液的浓度为0.2~0.5%;和/或
所述表面活性剂的浓度为0.2~1%;和/或
所述消泡剂的浓度为0.005~0.03%;和/或
所述色素的浓度为0.005~0.03%。
在本发明的一些具体实施方案中,上述组合物中:
所述酸度调节剂包括冰乙酸;和/或
所述表面活性剂包括TritonX-100。
本发明还提供了上述组合物在如下任意项中的应用:
(I)、提高样本的保存能力;和/或
(II)、制备样本保存液。
在本发明的一些具体实施方案中,上述应用中,所述样本包括含核酸的样本。
本发明还提供了样本保存液,包括上述组合物以及可接受的辅料或助剂。
本发明还提供了试剂盒,包括上述组合物或上述样本保存液,以及可接受的辅料或助剂。
本发明还提供了装置,包括上述组合物或上述样本保存液,以及可接受的部件。
本发明的可消化粘蛋白的样本保存液有如下效果:
主要为:能够快速消化处理咽拭子、鼻拭子等样本上携带的粘蛋白物质,在将拭子放入保存液后在20s内即可将携带的粘蛋白物质消化掉,为后续样本的转移、核酸提取提供便利。具体地:
1.方便快捷,采集完样本后将拭子直接放入样本保存管液体中即可;
2.采样过程中即可灭活病毒,切断病毒传播途径,保护医护及采样人员;
3.常温下保持样本中的核酸在3天内完整、不降解,保证核酸在运输过程的稳定性,为获得下游实验所需要的高质量核酸提供了可靠保障;
4.起到预裂解、消化粘蛋白的作用,可使采集到的核酸样本充分从细胞中破裂释放出来,并消化掉鼻咽拭子上含有的粘蛋白(会造成核酸提取中枪头的堵塞),为顺利提取核酸提供便利。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示不同样品保存液消化粘蛋白的效果(消化前);
图2示不同样品保存液消化粘蛋白的效果(消化后);
图3示55℃加速8天的样品保存液处理痰液的效果(消化前);
图4示55℃加速8天的样品保存液处理痰液的效果(消化后)。
具体实施方式
本发明公开了可消化粘蛋白的样本保存液,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
在上述的背景下,目前正在开发的新型冠状病毒核酸检测试剂盒也需要面对这个问题,本发明拟开发一种专用的集样本收集与保存于一体的试剂,用于支持新型冠状病毒核酸检测试剂盒的开发及使用。本试剂盒利用样本保存液涮洗拭子样本,采用缓冲液和核酸酶抑制剂胍盐稳定样本中核酸,用于后续核酸提取检测,实现呼吸道拭子样本的短期常温保存,提升呼吸道核酸检测试剂易用性,减少用户的使用成本,提升产品竞争力。
本发明的保存液提供了一种简单、安全、有效的保存咽拭子、鼻拭子等样本核酸的方法,可在常温下一定时间内保持样本中的核酸完整、不降解,为获得下游实验所需要的高质量核酸提供了可靠保障。
本发明的样本保存液含有高效处理粘蛋白的能力,可以迅速消化粘液物质,避免在核酸半自动、全自动仪器提取过程中造成堵针,为顺利提取核酸提供便利。
具体地:
1)本试剂以0.2%~0.5%冰乙酸作为试剂缓冲液。
2)本试剂盒含有5~10mmol/L乙二胺四乙酸二钠二水合物(EDTA-2Na)作为螯合物,可以与金属离子形成稳定的水溶性螯合物,能够防止自身的氧化。
3)本试剂盒含有0.2%~1% TritonX-100作为表面活性剂。
4)本试剂盒含有0.5~2mol/L异硫氰酸胍,能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶,快速灭活样本中可能存在的病毒,切断传染源。
5)本试剂盒含有5~50mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP),TCEP作为一种高效的二硫键还原剂,能够快速消化处理咽拭子、鼻拭子等样本上携带的粘蛋白物质,该物质会造成核酸提取中枪头的堵塞,为顺利提取核酸提供便利。
如无特殊说明,本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品,均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1:三(2-羧乙基)膦盐酸盐添加前后比较
预试验保存液配方含有:1mol/L异硫氰酸胍,0.15%Trizma Base、6mmol/L乙二胺四乙酸二钠二水合物(EDTA-2Na)、0.5%TritonX-100、75mmol/L的氯化钠、0.01%消泡剂MH-109和0.01%日落色。
具体实验步骤:
1)取相同量的粘蛋白物质于离心管;
2)加入约2~3ml的纯化水或样本保存液;
3)手工颠倒混匀,然后静置观察粘蛋白消化效果。
实验结果:
在未筛选到三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)之前,对保存液进行粘蛋白消化实验,未能对粘蛋白进行消化。如图1、图2中所述“保存液”所示。
添加TCEP后保存液可以将粘蛋白消化,如图1、图2中所述“本专利保存液”所示。(注:由于TCEP会使色素褪色,因此在未添加TCEP之前所用色素和添加之后所用色素不同,导致颜色存在差异)。
实施例2:不同浓度的异硫氰酸胍对稳定性的影响
本保存液具体浓度为:0.05~4mol/L异硫氰酸胍、0.3%的冰乙酸、6mmol/L的EDTA-2Na、80mmol/L的氯化钠、0.3% TritonX-100、30mmol/L三(2-羧乙基)膦盐酸盐、0.01%消泡剂和0.01%色素。
对不同的异硫氰酸胍浓度进行验证,在可以使样本稳定保存的条件下,异硫氰酸胍最低浓度为0.4mol,最高浓度为4mol(浓度再高会使异硫氰酸胍的溶解度达到饱和,且会增加成本预算)。具体结果如表1所示。
表1
注:该保存液中能够稳定保存样本的物质为异硫氰酸胍,TCEP主要作用为消化粘蛋白,其余物料均为辅助,因此其余物质未进行不同浓度的筛选。
实施例3:保存液稳定性实验
保存液配方含有:2mol/L异硫氰酸胍、0.3%的冰乙酸、6mmol/L的EDTA-2Na、80mmol/L的氯化钠、0.3% TritonX-100、30mmol/L三(2-羧乙基)膦盐酸盐、0.01%消泡剂MH-109和0.01%色素柠檬色。
具体实验步骤:
将配制好的样本保存液放置到55℃恒温培养箱中;
分别在不同时间点(例:第3天、5天、8天)将55℃恒温培养箱中样本保存液取出,验证其消化粘蛋白的能力;
取相同体积的样本保存液和纯化水,取健康人痰液样本,在生物安全柜中将其分割成相同大小;然后将痰液均匀的放入样本保存液和纯化水中;
将含有样本保存液和纯化水的痰液颠倒混匀5-10次,然后室温放置3-5min,中间可以继续颠倒混匀,观察痰液消化效果。
实验结果:
经55℃加速8天破坏的优化后的样本保存液依然可以将粘液完全消化,如图3、图4所示。其中,图3示消化前,图4示消化后。
实施例4:常温保存实验
本保存液含有:2mol/L异硫氰酸胍、0.3%的冰乙酸、6mmol/L的EDTA-2Na、80mmol/L的氯化钠、0.3% TritonX-100、30mmol/L三(2-羧乙基)膦盐酸盐、0.01%消泡剂MH-109和0.01%色素柠檬色。
样本采用新冠新冠病毒培养物样本进行检测。
表2
分析:如表2所示,采用生产的3个批次的样本保存液进行检测,将样本放入保存液中室温保存3、7天;37℃破坏保存3、7天在检测限浓度时均能全检出,没有漏检情况。
结论:可在常温条件下运输样本,并在7天之内稳定保存核酸。
实施例5:与现有保存液效果比对
本保存液具体浓度为:2mol/L异硫氰酸胍、0.3%的冰乙酸、6mmol/L的EDTA-2Na、80mmol/L的氯化钠、0.3% TritonX-100、30mmol/L三(2-羧乙基)膦盐酸盐、0.01%消泡剂和0.01%色素。
材料信息:安图全自动核酸提纯及实时荧光PCR分析系统Automolec3000。
具体操作步骤:使用不同厂家的样本保存液对邦德盛质控品稀释至相同的浓度,然后在安图全自动核酸提纯及实时荧光PCR分析系统Automolec 3000上进行测试(注:该仪器为全自动仪器,只需制备样本,其余操作按照仪器的操作步骤进行)。
使用安图新冠核酸检测系统检测,安图全自动核酸提纯及实时荧光PCR分析系统Automolec 3000,不同厂家采样液含拭子稀释邦德盛质控至200cp/mL(结果如表3所示)、100cp/mL(结果如表4所示)、50cp/mL(结果如表5所示),稀释的样本每个浓度点重复5次。
判断标准:
1、每个浓度点做5个重复,双靶标全部检出判断为检出;
2、全部检出,且荧光高度均值和信噪比排序正80%判定A类;3、全部检出,且荧光高度均值和信噪比排序最后20%判定B类;4、检出能力差的判定为C类;
表3
表4
表5
结论:
1)有7个厂家采样液评估对试剂检出能力无影响,安图样本保存液从保存样本能力要≥其余厂家;
2)有6个厂家采样液评估对试剂检出能力无影响,但一定程度抑制扩增曲线的扩增高度;
3)有5个厂家采样液评估对试剂检出能力有抑制。
综上,安图样本保存液在保存样本的能力均优于或等于其余厂家,且安图样本保存液还增加了高效处理粘蛋白的能力,避免在核酸半自动、全自动仪器提取过程中造成堵针,为顺利提取核酸提供便利。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.组合物,其特征在于,包括异硫氰酸胍、三(2-羧乙基)膦盐酸盐和乙二胺四乙酸二钠二水合物。
2.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,包括:
所述异硫氰酸胍的浓度为0.4~4mol/L;和/或
所述三(2-羧乙基)膦盐酸盐的浓度为5~50mmol/L;和/或
所述乙二胺四乙酸二钠二水合物的浓度为5~10mmol/L。
3.如权利要求1或2所述的组合物,其特征在于,还包括氯化钠、缓冲液、表面活性剂、消泡剂或色素中的一种或多种。
4.如权利要求3所述的组合物,其特征在于,包括:
所述氯化钠的浓度为50~100mmol/L;和/或
所述缓冲液的浓度为0.2~0.5%;和/或
所述表面活性剂的浓度为0.2~1%;和/或
所述消泡剂的浓度为0.005~0.03%;和/或
所述色素的浓度为0.005~0.03%。
5.如权利要求4所述的组合物,其特征在于,所述酸度调节剂包括冰乙酸;和/或
所述表面活性剂包括TritonX-100。
6.如权利要求1至5任一项所述的组合物在如下任意项中的应用:
(I)、提高样本的保存能力;和/或
(II)、制备样本保存液。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述样本包括含核酸的样本。
8.样本保存液,其特征在于,包括如权利要求1至5所述的组合物,以及可接受的辅料或助剂。
9.试剂盒,其特征在于,包括如权利要求1至5所述的组合物或如权利要求8所述的样本保存液,以及可接受的辅料或助剂。
10.装置,其特征在于,包括如权利要求1至5所述的组合物或如权利要求8所述的样本保存液,以及可接受的部件。
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