CN116640783A - 一个新型报告基因hbpR的鉴定及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及报告基因鉴定技术领域，特别涉及可视化红色蛋白编码基因hbpR的鉴定及其应用。发明人发现了耻垢分枝杆菌中的一个红色蛋白HbpR，该蛋白可以与血红素结合而呈现红色，并可直接用肉眼观察，可视化明显。发明人成功鉴定了该红色蛋白编码基因hbpR具有报告基因的功能并构建了hbpR报告系统，可高效检测启动子的启动强弱。该报告系统减少了在实际应用中的操作步骤并降低了实验成本，保留原有lacZ和gfp报告系统的优势并同时改进了其不足。该报告系统具有报告基因分子量小，操作灵活，便捷高效，成本低等优点，具有广泛应用前景。
Description
【技术领域】
本发明涉及报告基因技术领域，特别涉及可视化红色蛋白编码基因hbpR的报告系统构建及其应用。
【背景技术】
报告基因分析是生物医学和药学研究的一个非常有价值的工具，用于监测与基因表达、调节和信号转导相关的细胞事件。基于通过将反应元件连接到这些报告基因上而介导的报告基因活性的改变，可以提供一种灵敏、可靠和方便的测定法来有效地报告特定信使级联的激活及其对细胞或活体中基因表达和调节的影响。报告基因具有以下特征：(1)序列是已知的；(2)细胞中无类似物；(3)检测快速、简便、灵敏度高；(4)对基因的表达进行动态观察；(5)不影响宿主生理活性等。目前常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶(CAT)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(β-gal)、绿色荧光蛋白(GFP)、荧光素酶等。常见的报告基因系统具有如下特点：①氯霉素乙酰转移酶具有无内源性活性、稳定的优势，但是其依赖于放射化学物质；测定的线性范围和灵敏度不如其他报告基因；②碱性磷酸酶具有多种多样的分析方法、高灵敏性、具有线性范围的优势，但大多数细胞存在内源性活性；③β-半乳糖苷酶具有特征鲜明、稳定、简单的比色读数、提供灵敏的生物或化学发光分析的优势，但是其需要底物ONPG/X-Gal的存在，片段约3kb，增加载体负担，哺乳动物细胞中存在内源性活性；④绿色荧光蛋白具有自发荧光(不需要底物)、无内源性活动、光谱质量改变的突变体可用的优势，但是其需要翻译后修饰；低灵敏度；会出现荧光淬灭的缺陷；⑤荧光素酶具有灵敏度高；无内源性活动；宽动态范围；分析便捷的优势，但是需要底物(荧光素)以及O2和ATP的存在的缺陷。因此，为了提高报告基因的应用范围，不断发现新报告基因，并构建新的报告系统，是目前该领域研究的重点。本发明鉴定了一种新的报告基因hbpR，并成功构建了基于hbpR的报告系统，较于现有报告系统更加便捷高效、成本低廉。
【发明内容】
鉴于上述内容，发明人鉴定了一种更加便捷高效的报告基因，该基因表达的红色蛋白可以直接用肉眼观察，可视化明显；为基因的转录调控研究和启动子筛选提供了更为快速于便捷的技术手段。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
编码可视化红色蛋白的报告基因hbpR，所述报告基因hbpR的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
本发明还包括包含所述报告基因hbpR的报告系统，所述报告系统含重组质粒pET28EXba-hbpR，所述重组质粒pET28EXba-hbpR的核酸序列如表SEQ ID NO:4所示。
本发明还包括包含所述报告基因hbpR的报告系统构建方法，所述方法包括如下步骤：
(1)以耻垢分枝杆菌为模板，设计引物对hbpR-EcoRI-F/hbpR-XbaI-R扩增出hbpR基因片段，所述hbpR基因核酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述hbpR-EcoRI-F的核酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；所述hbpR-XbaI-R核酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示；
(2)琼脂糖凝胶电泳进行检测，片段大小和浓度符合预期后，回收步骤(1)的片段；
(3)用EcoRI和XbaI酶切好的pET28EXba载体和步骤(2)回收的片段连接，获得重组质粒pET28EXba-hbpR；所述重组质粒pET28EXba-hbpR的核酸序列如表SEQ ID NO:4所示；
(4)对步骤(3)的pET28EXba-hbpR重组质粒原有的诱导型启动子T7-lac的两侧设计反向扩增引物对：cm1-hbpR-F-NheI/cm1-hbpR-R-HindIII，以pET28EXba-hbpR重组质粒为模板进行反向扩增，回收扩增片段后，用限制性内切酶HindIII和NheI进行酶切得到含报告基因的线性化载体，将其命名为pET28EXba-hbpR(HindIII/NheI)；所述cm1-hbpR-F-NheI的核酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示；所述cm1-hbpR-R-HindIII的核酸序列如序列表SEQID NO:6所示。
本发明还包括所述的报告系统在检测不同启动子启动活性上的应用。
进一步的，所述启动子为大肠杆菌表达系统的常用启动子。
本发明还包括应用所述报告系统评价不同启动子启动活性的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)选取不同强度的启动子，设计含有HindIII和NheI酶切位点的引物；
(2)退火得到含HindIII和NheI酶切位点的启动子片段，将启动子片段与pET28EXba-hbpR(HindIII/NheI)进行连接并转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，验证成功后得到不同启动子的重组菌株；
(3)将重组菌株的菌液等量接种到培养基中，培养相同时间后，通过肉眼判定或通过对红色蛋白进行定量检测的方式，对比判定启动子的强弱。
进一步的，所述步骤(1)不同强度的启动子分别为：Ptrc、PlacUV5、PT7、Ptrp、Ptac、PBAD、Plac和PL；所述启动子Ptrc的引物对如序列表SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；所述启动子PlacUV5的引物对如序列表SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；所述启动子PT7的引物对如序列表SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；所述启动子Ptrp的引物对如序列表
SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；所述启动子Ptac的引物对如序列表SEQ IDNO:15和
SEQ ID NO:16所示；所述启动子PBAD的引物对如序列表SEQ ID NO:17和SEQ IDNO:18所示；所述启动子Plac的引物对如序列表SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示；所述启动子PL的引物对如序列表SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示。
进一步的，所述步骤(3)中肉眼判定的方法为：培养相同时间后，通过肉眼观察不同重组菌株的菌液或菌体颜色；当菌液或菌体的红色越明显说明启动子的启动活性越强；红色越不明显，说明启动子的启动活性越弱。
进一步的，所述步骤(3)的定量检测的方法为：培养相同时间后，对菌体进行裂解后测定其上清液的OD410(HbpR蛋白的特征吸收峰)吸光度值，数值越高代表红色蛋白质的含量越多，说明启动子的活性越强；吸光度值越低代表红色蛋白含量越少，说明启动子的活性越弱。
进一步的，所述对菌体进行裂解的裂解液配制方法为，将5M尿素和10mg/ml溶菌酶按照9:1的体积比配制、混匀即得、现配现用。
本发明具有如下有益效果：
发明人发现了耻垢分枝杆菌中的一种红色蛋白HbpR。该蛋白可以与血红素结合并使之呈现红色，同时这种红色蛋白可以直接用肉眼观察，可视化明显。发明人成功验证了红色蛋白编码基因hbpR具有报告基因的功能，可通过肉眼观察初步判断该报告基因的表达量，也可以通过紫外分光光度计或酶标仪等方式快速的检测出其具体结果。利用不同强度的启动子对该报告系统进行验证，发现该报告系统可以有效的评估启动子的启动活性。该报告系统保留原有lacZ和gfp报告系统的优势，并同时改进了其不足。该报告系统具有报告基因分子量小，操作灵活，便捷高效，成本低等优点，具有广泛的应用前景。
【附图说明】
图1是pET28EXba-hbpR重组质粒的PCR验证图。图中，M为DL2000 marker；泳道1-3分别为以pET28EXba-hbpR重组质粒为模板、以耻垢分枝杆菌基因组为模板(CK+)、以水为模板(CK-)，以hbpR基因的特异性引物(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)进行扩增得到的产物。
图2是不同强度启动子重组质粒的PCR验证图。图中，M为DL2000 marker；泳道1-8分别为8个不同强度的启动子Ptrc、PlacUV5、PT7、Ptrp、Ptac、PBAD、Plac和PL的重组质粒的PCR验证图；泳道9为无关对照的验证图；泳道10为空白对照的验证图。
图3是不同强度启动子重组菌株的菌液图。
图4是不同强度启动子重组菌株的裂解前菌体图(a)和裂解后上清图(b)。
图5是不同强度启动子重组菌株生长曲线(OD600)图(左)和裂解后上清的OD410吸光度曲线图(右)。
【具体实施方式】
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
发明人发现了耻垢分枝杆菌中的一种红色蛋白HbpR。该蛋白可以与血红素结合并使之呈现红色，同时这种红色蛋白可以直接用肉眼观察，可视化明显。发明人成功验证了红色蛋白编码基因hbpR具有报告基因的功能，可通过肉眼观察初步判断该报告基因的表达量，也可以通过紫外分光光度计或酶标仪等方式快速的检测出其具体结果。本发明降低了启动子报告系统在实际应用中的操作步骤和实验成本，保留原有lacZ和gfp报告系统的优势并同时改进了其不足。该报告系统具有报告基因分子量小，操作灵活，便捷高效，成本低等优点，具有广泛的应用前景。
实施例1：
可视化红色蛋白由报告基因hbpR所编码，所述基因hbpR的核酸序列如序列表SEQID NO:1所示。
基因hbpR的克隆及重组菌株的构建
(1)扩增hbpR基因
以耻垢分枝杆菌基因组为模板，以SnapGene软件设计的hbpR-EcoRI-F/hbpR-XbaI-R为引物，扩增出hbpR基因片段，该片段序列如SEQ ID NO:1所示：
表1hbpR基因的扩增引物
| 引物名称 | 引物序列5’-3’ | 序列表 |
| hbpR-EcoRI-F | ATGCGAATTCACGTGACCGAGACACCAACCGC | SEQ ID NO:2 |
| hbpR-XbaI-R | GTATTCTAGATCAGGACAGCCCTGCGCGCA | SEQ ID NO:3 |
(2)构建重组质粒pET28EXba-hbpR
琼脂糖凝胶电泳进行检测，片段大小和浓度符合预期后，用DNA纯化试剂盒纯化，纯化后的片段用对应的限制性内切酶进行酶切，37℃，4h，随后用DNA回收试剂盒纯化相应的酶切片段。其中，hbpR片段的限制性内切酶为EcoRI和XbaI。
将回收后的hbpR片段连接至用EcoRI和XbaI酶切好的pET28EXba载体上，16℃连接过夜，之后将酶连产物转化至DH5α感受态中。37℃恒温培养1天，第二天挑取转化子，活化后提取质粒，对重组质粒进行PCR验证(图1)，确定成功连接上hbpR片段，并纯化克隆正确的重组质粒，命名为pET28EXba-hbpR，其中，该载体的基因序列如SEQ ID NO:4所示。
(3)反向扩增重组质粒pET28EXba-hbpR
利用SnapGene软件对pET28EXba-hbpR重组质粒原有的诱导型启动子T7-lac的两侧设计反向扩增引物：cm1-hbpR-F-NheI/cm1-hbpR-R-HindIII，以pET28EXba-hbpR为模板，进行反向扩增。琼脂糖凝胶电泳进行检测，片段大小和浓度符合预期后，用DNA纯化试剂盒纯化，纯化后的片段用对应的限制性内切酶进行酶切，37℃，6h，随后用DNA回收试剂盒纯化相应的酶切片段。其中，反向扩增片段的限制性内切酶为HindIII和NheI。至此，含有报告基因的载体构建完成，将其命名为pET28EXba-hbpR(HindIII/NheI)。
表2pET28EXba-hbpR载体的反向扩增引物
实施例2：
启动子强度定性检测实验
选取大肠杆菌表达系统中常用的中8个不同强度的启动子Ptrc、PlacUV5、PT7、Ptrp、Ptac、PBAD、Plac和PL，用于检测该报告系统，设计含有HindIII和NheI酶切位点的引物(序列如表3所示)，通过退火程序得到启动子片段。将启动子片段(HindIII/NheI)与酶切后的pET28EXba-hbpR(HindIII/NheI)载体进行连接并转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态，然后抽提质粒进行PCR验证(图2)，确定不同强度启动子重组菌株构建是否成功。从图2可见，泳道1-8在500-700bp之间均有扩增产物，而泳道9-10无扩增产物，说明不同启动子重组菌株构建成功。
表3Ptrc、PlacUV5、PT7、Ptrp、Ptac、PBAD、Plac和PL的扩增引物
将100μL重组菌株的甘油菌液接种于5mL添加30μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、160rpm/min活化培养10h。然后6000rpm/min离心5min收集菌体，用培养基将其重悬后接种到100mL培养基中，并保证OD600＝0.1，于37℃、160rpm/min摇床培养18h，观察不同强度启动子重组菌株的菌液颜色和菌体颜色、裂解后上清液颜色的差异情况。
得到的结果如图3和图4所示，可以看出，不同启动子重组菌株的菌液及菌体颜色具有明显差异，随着启动子的启动活性增强，菌液及菌体红色越来越明显。由此说明，基于hbpR构建的报告系统可用于便捷评估强弱启动子。
实施例3：
启动子强度定量检测实验
选取Ptrc、PlacUV5、PT7、Ptrp、Ptac、PBAD、Plac和PL8个不同强度的启动子，设计含有HindIII和NheI酶切位点的引物(序列如表3所示)，通过退火程序得到启动子片段。将启动子片段(HindIII/NheI)与酶切后的pET28EXba-hbpR(HindIII/NheI)载体进行连接、转化，然后抽提质粒进行PCR验证，确定不同强度启动子重组菌株构建成功。
将100μL重组菌株的甘油菌液接种于5mL添加30μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、160rpm/min活化培养10h，6000rpm/min离心5min收集菌体，用培养基将其重悬后接种到100mL培养基中，并保证OD600＝0.1，每个样品设置三组平行；
将菌株置于37℃、160rpm/min摇床培养24h，期间每隔2h取一次样品，测定其菌液的OD600，同时取3.5mL菌液8000rpm/min离心1min收集于1.5mL离心管中，弃去上清，小心吸干剩余的液体，以待细胞裂解使用。其中，细胞裂解液的配制方法：将5M尿素和10mg/ml溶菌酶按照9:1的体积比配制，充分混匀，现配现用。(5M尿素：将300.3g尿素溶解于去离子水中，定容至1L；10mg/mL溶菌酶：将100mg溶菌酶溶解于去离子水中，定容至10mL)。
向上述1.5mL离心管收集的菌体中加入400μL裂解液，使用涡旋仪涡旋7min使菌体充分裂解；12000rpm/min离心5min后，取300μL上清液加入的酶标板中，用酶标仪测定其OD410处的吸光度，并裂解液作为空白对照。
如图5的左图所示，不同启动子的重组菌株的OD600生长曲线基本相同；如图5的右图所示，不同启动子的重组菌株菌体裂解液的OD410曲线差异显著，强启动子重组菌株菌体裂解液的OD410曲线增长迅速且峰值很高，而弱启动子重组菌株菌体裂解液的OD410曲线增长缓慢，这是由于该报告系统中不同启动子启动的启动活性不同，导致该红色蛋白表达量的差异。由此说明，hbpR可以用作报告基因，且hbpR基因报告系统是可行高效的，以可视红色蛋白表达量的高低便捷评估不同启动子的启动活性。
综上所述，hbpR基因表达红色蛋白，该蛋白可以通过肉眼分辨，成功构建了可视化红色蛋白编码基因报告系统。利用不同强度启动子对其进行验证，表明该报告系统可行且高效，可用于便捷评估不同启动子的启动活性，具有广泛的应用前景。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.编码可视化红色蛋白的报告基因hbpR，其特征在于，所述报告基因hbpR的核酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
2.包含如权利要求1所述报告基因hbpR的报告系统，其特征在于，所述报告系统含重组质粒pET28EXba-hbpR，所述重组质粒pET28EXba-hbpR的核酸序列如表SEQ ID NO:4所示。
3.包含如权利要求1所述报告基因hbpR的报告系统构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)以耻垢分枝杆菌为模板，设计引物对hbpR-EcoRI-F/hbpR-XbaI-R扩增出hbpR基因片段，所述hbpR基因核酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述hbpR-EcoRI-F的核酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；所述hbpR-XbaI-R核酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示；
(2)琼脂糖凝胶电泳进行检测，片段大小和浓度符合预期后，回收步骤(1)的片段；
(3)用EcoRI和XbaI酶切好的pET28EXba载体和步骤(2)回收的片段连接并进行转化、纯化，获得重组质粒pET28EXba-hbpR；所述重组质粒pET28EXba-hbpR的核酸序列如表SEQ IDNO:4所示；
(4)对步骤(3)的pET28EXba-hbpR重组质粒原有的诱导型启动子T7-lac的两侧设计反向扩增引物对：cm1-hbpR-F-NheI/cm1-hbpR-R-HindIII，以pET28EXba-hbpR重组质粒为模板进行反向扩增，回收扩增片段后，用限制性内切酶HindIII和NheI进行酶切后得到含报告基因的线性化载体，并将其命名为pET28EXba-hbpR(HindIII/NheI)；所述cm1-hbpR-F-NheI的核酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示；所述cm1-hbpR-R-HindIII的核酸序列如序列表SEQID NO:6所示。
4.如权利要求2所述的报告系统或应用如权利要求3所述构建方法构建得到的报告系统在检测不同启动子启动活性上的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述启动子为大肠杆菌表达系统的常用启动子。
6.应用如权利要求3所述的报告系统评价不同启动子启动活性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)选取不同强度的启动子，设计含有HindIII和NheI酶切位点的引物；
(2)退火得到含HindIII和NheI酶切位点的启动子片段，将启动子片段与pET28EXba-hbpR(HindIII/NheI)进行连接并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中；验证成功后得到不同启动子的重组菌株；
(3)将重组菌株的菌液等量接种到培养基中，培养相同时间后，通过肉眼判定或通过对红色蛋白进行定量检测的方式，对比判定启动子的强弱。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)不同强度的启动子分别为：Ptrc、PlacUV5、PT7、Ptrp、Ptac、PBAD、Plac和PL；所述启动子Ptrc的引物对如序列表SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8所示；所述启动子PlacUV5的引物对如序列表SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；所述启动子PT7的引物对如序列表SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；所述启动子Ptrp的引物对如序列表SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；所述启动子Ptac的引物对如序列表SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示；所述启动子PBAD的引物对如序列表SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示；所述启动子Plac的引物对如序列表SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示；所述启动子PL的引物对如序列表SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中肉眼判定的方法为：培养相同时间后，通过肉眼观察不同重组菌株的菌液或菌体颜色，当菌液或菌体的红色越明显说明启动子的启动活性越强；红色越不明显，说明启动子的活性越弱。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的定量检测的方法为：培养相同时间后，对菌体进行裂解后测定其上清液的OD410吸光度值，数值越高代表红色蛋白质的含量越多，说明启动子的活性越强；吸光度值越低代表红色蛋白含量越少，说明启动子的活性越弱。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述对菌体进行裂解的裂解液配制方法为：将5M尿素和10mg/ml溶菌酶按照9:1的体积比配制、混匀即得。
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