CN106554961B - 一种厌氧梭菌木聚糖诱导型启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体的说是一种厌氧梭菌木聚糖诱导型启动子及其应用。启动子如下述：a)序列为序列表1中所示的DNA片段；b)与a)限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；c)严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。本发明中在厌氧型解纤维梭菌中诱导型启动子的发现，主要是采用核黄素单核苷酸依赖的荧光蛋白(FbFP)为报告系统的方法进行筛选的，通过将其培养在以五种不同碳源为底物的培养基中获得不同程度的表达量，且在纤维二糖上表达量极低，而在木聚糖上表达量很高。本发明中的诱导型启动子对于革兰氏阳性细菌的可控基因表达、遗传改造有重要意义，同时也丰富了合成生物学的遗传元件。

Description

一种厌氧梭菌木聚糖诱导型启动子及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体的说是一种厌氧梭菌木聚糖诱导型启动子及其应用。

背景技术

厌氧梭菌在木质纤维素的降解过程中发挥着十分重要的作用，为能源的可再生环节贡献一份力量。解纤维梭菌是一类能够进行多种底物(纤维糊精、纤维二糖、葡萄糖、木糖、木聚糖、阿拉伯糖等等)利用的中温厌氧梭菌，是一类可以潜在应用于CBP一步发酵的菌株。随着其基因组转录组的日益完善，解纤维梭菌日益成为纤维素降解研究的模式生物。但其遗传改造的过程是其应用于工业生产的必经之路，那么在解纤维梭菌中建立一套高效简便的可控启动子系统是十分必要的。

诱导型启动子在基因的表达调控、基因工程改造领域发挥着非常重要的作用。目前已经有很多诱导型启动子被发现，如乳糖操纵子、阿拉伯糖操纵子、四环素诱导型系统等等。但是在革兰氏阳性细菌，尤其梭菌中高效的、严谨的优秀启动子还是不多见的，需要进一步优化和寻找新的启动子。同时启动子活性的检测一般都依赖于酶促反应系统，存在的问题是比较突出的，(1)繁琐，酶促反应一般都依赖于底物的利用和信号的检测；(2)具有菌种的选择性，比如一些细胞中酶的本底水平表达。

因此，为获得具有木聚糖的诱导型启动子无疑对基因表达调控以及遗传改造具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种厌氧梭菌木聚糖诱导型启动子及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种厌氧梭菌木聚糖诱导型启动子，启动子为

a)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列；

b)与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；

或，c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。

所述启动子受木聚糖诱导。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

一种重组载体，重组载体为在出发载体的多克隆位点插入所述启动子序列。

所述重组载体为pXL007重组质粒。

具体是，所述DNA分子(启动子)替换掉pMTC6载体中自身启动子后得到的重组质粒(p1133promoter::FbFP载体)。

更具体是，将所述DNA分子(启动子)替换掉pMTC6载体的PstI和MluI之间的小片段后所形成的重组质粒。

一种重组菌，含有所述重组载体或启动子的重组菌。

一种重组菌株系，含有所述重组载体或启动子的重组菌株系。

所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。

在本发明的一个实施例中，所述表达盒中的所述目的基因具体为FbFP基因(来源于所述pMTC6载体)；所述表达盒中的所述转录终止序列具体为pMTC6载体所固有。

一种厌氧梭菌木聚糖诱导型启动子的应用，所述启动子在木聚糖存在下诱导调控下游目的基因表达中的应用。

所述启动子在木聚糖的类似物、木聚糖的降解产物或木聚糖的降解产物类似物的存在下诱导调控下游目的基因表达中的应用

所述启动子在革兰氏阳性细菌内进行调控。

本发明所具有优点：

首先，本发明以革兰氏阳性细菌中的厌氧解纤维梭菌为模式菌，采用一种不依赖于氧气的绿色荧光蛋白作为报告基因，进行诱导型启动子的鉴定。筛选启动子的方法简便、稳定，不依赖氧气，通用性强。

其次，正如许多来源于革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌和丙酮丁醇梭菌的启动子一样，本发明中的诱导型启动子是在革兰氏阳性菌——解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum H10)中发现的，因此它同样具有应用到其他革兰氏阳性细菌发挥作用的潜力，具体实施需要进一步考察。

最后，本发明中的启动子能够驱动FbFP基因在解纤维梭菌中表达，并将获得的转基因解纤维梭菌培养在不同碳源为底物的培养基中，发现FbFP在纤维二糖、阿拉伯糖中生长时抑制表达，而在木聚糖上高表达。说明本发明中的启动子具有底物诱导活性，对于(但又不局限于)解纤维梭菌的遗传改造具有重要意义；为解纤维梭菌的遗传改造打下了物质基础。

附图说明

图1A—C为本发明实施例提供的FbFP蛋白的鉴定；其中，(A)FbFP的质粒构建及荧光的直接检测；(B)通过SDS-PAGE鉴定的FbFP的表达；(C)通过LC-MS鉴定的FbFP蛋白的表达。

图2A—D为本发明实施例提供的启动子活性检测方法的可靠性鉴定；其中，(A)FbFP蛋白激发光的确定；(B)FbFP蛋白发射光的确定；(C)含有不同启动子的菌株中荧光蛋白的相对量与荧光强度的比较；(D)荧光蛋白相对含量与荧光强度的皮尔森相关分析。

图3A—D为本发明实施例提供的FbFP蛋白的稳定性；其中，(A)H10野生型细胞和含有荧光蛋白的细胞生长曲线的比较，其中采用两种方法一种是完整细胞，一种是经过超声波破碎的细胞；(B)野生型细胞和含有荧光蛋白的细胞荧光强度的比较；(C)在培养过程中，两种测量荧光强度模式下(完整细胞和破碎细胞)荧光稳定性比较；(D)终止培养的细胞荧光强度稳定性探究。

图4A—C为本发明实施例提供的诱导型启动子的鉴定，其中，(A)诱导型启动子在五种不同碳源上荧光强度的比较；(B)不同木聚糖浓度下，实时追溯的诱导型启动子(p1133)诱导活性的监测；(C)p1133在纤维二糖和木聚糖上生长的荧光检测。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

解纤维梭菌：记载在“Clostridium-Cellulolyticum Sp-Nov,a Cellulolytic,Mesophilic Species from Decayed Grass”中，同时可在公众流通的方式获得。

pMTC6载体：记载在“Targeted gene engineering in Clostridiumcellulolyticum H10without methylation”，同时可在公众流通的方式获得。

下述实施例中所涉及的培养基配方如下：

进行含有质粒的解纤梭菌培养时，DCB-1培养基中需要加入20μg/ml的红霉素，而在培养含有质粒的大肠杆菌时，需要在LB培养基中加入100μg/ml的氨苄青霉素。

下面对本发明作进一步说明：

本发明采用中温厌氧解纤维梭菌作为模式生物，通过基于厌氧荧光蛋白的报告系统，筛选到木聚糖诱导型启动子。

实施例1

启动子及解纤维梭菌转化子的获得：

1)启动子的获得

设计引物，以F:AACTGCAGTCAAGATATTTTATAA CTAAAGAT；R:CGACGCGTCATGTTCTCAAATCCTCC，为引物对，以解纤维梭菌的基因组为模板通过PCR的手段，克隆到Ccel_3398的启动子(即p3398)片段(如SEQ ID NO:1中所示片段)。此启动子的功能区包括：翻译起始密码子ATG上游的SD序列(核糖体结合位点)——AGGAGG，转录起始位点为G，-10区的TATA box——TATAAAT，-35区——TTGGAAAT，以及上游的调控区域。

2)重组质粒的获得

用限制性内切酶PstI和MluI对上述获得p1133片段在37度水浴中进行这两个酶的双酶切反应，获得具有粘性末端的p1133片段；

同时，采用限制性内切酶PstI和MluI对pMTC6载体进行双酶切，回收酶切片段；将上述回收的两个片段采用T4连接酶连接，于16度进行过夜反应。最终通过转化大肠杆菌DH5α细胞，将其涂布在有100μg/ml ampicillin的抗性平板上进行鉴定，最后通过质粒提取获得此重组载体pXL007。进行测序验证，表明所得重组载体pXL007，用所述SEQ ID NO:1核苷酸所示的启动子替换掉pMTC6载体中自身启动子(p1133promoter::FbFP载体)(参见图1)。

3)解纤维梭菌转化子的获得

将上述获得重组载体pXL007经过MspI甲基化酶的作用才能进行解纤维梭菌的转化，然后将其培养在DCB-1(以纤维二糖为碳源)培养基中，将生长至对数晚期的解纤维梭菌细胞进行3次电转缓冲液(pH7.4PBS，1mM MgCl₂，0.27M蔗糖)的洗涤，再采用0.1cm电转杯于BTX ECM630电转仪上进行电转(750v，25μF，～6ms)，复苏6h后，涂布含有红霉素抗性的DCB-1培养基平板，进行筛选。最终得到阳性转化子。

SEQ ID NO:1

AGAGCTAGTTCGTTTACAGACGCCGTCACAATTATTAAGCGAATTTTTATGGATTTCAGCCTGCGAATTGACGTAGGAAGAGTAGGTGTTTCCAGATACCAACTGGCATTGTGCTGTGGAGTAATAGCTTTTTTACTTTTAGTACAGCTTTTCCAGAGAAATAAGGTAATAAGCAATGAATTGAGTAATCGGCACACAGTATTCAGATGGGCTGTTTACTATTCAGCATTGATTTTTATTATTTTATTTGGGGTTTTTAATACAAATTCCTTTATTTACTTTCAGTTCTGATTAAAAATGGAGGGGTATATAATGTTATAAACCAGTAAATAAGCTCAGGCTAAAGTAAAAGCTATTATTGTTTATGCAATGTTGCTAACTTATGGTAACAAAATTATATAAATGTCACAAAATTATATGAAGAAGTAAGTTTTCT

AAATTAAAATGCCTCCTTTACCATGCTAAAATTAAAGCATAAT

-35区 -10区 转录起始位点

TATAAAGGAGGCAAAAATATG

SD序列

序列特征：

长度：500bp

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线性

分子类型：DNA

特异性名称：p1133启动子

最初来源：解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum H10)

实施例2

基于厌氧荧光蛋白的报告系统的建立

一般来讲，启动子特性的研究是要基于一种简便、可靠、直观的报告系统的，这样启动子的活性才能被显示出来。目前，大多数报告系统都是酶促反应依赖的，但是操作基本上是非常繁琐的，而且实现高通量还是比较难的。虽然基于GFP(绿色荧光蛋白)的启动子筛选已经实现高通量了，如FACS荧光激发的细胞筛选，但由于GFP是氧气依赖的，所以无法适用于厌氧细胞。而本发明采用厌氧荧光蛋白作为报告系统，很好的避免了GFP的不足。本发明进一步考察了此基于厌氧荧光蛋白报告系统的可靠性。

1)细胞的培养

这里涉及到两种细胞的培养，一种是大肠杆菌细胞DH5α，一种是解纤维梭菌细胞(H10细胞)。大肠杆菌DH5α细胞的培养：此种细胞培养在LB培养基中，37度(如果含有转化的质粒，培养基中需加入100μg/ml的ampicillin)。其培养的主要目的是为了通过菌体的复制获得更多的质粒，用于解纤维梭菌的转化。

解纤维梭菌的培养：由于此菌为严格厌氧菌，所以对其培养主要是厌氧操作，恒温33～35度培养，培养基为DCB-1培养基，此种培养基需要在厌氧工作站中进行除氧步骤，并且加入0.4g/L还原剂半胱氨酸，以0.0005％刃天青作为含氧指示剂。当细胞培养至对数中后期时，可进行转接操作，采用1ml注射器进行。

2)厌氧荧光蛋白的鉴定

荧光蛋白基因fbfp为长447bp的一段DNA序列，采用三种方法证明fbfp的表达。

首先，将上述培养至对数晚期的含有fbfp基因的解纤维梭菌细胞通过直接的紫外光照射，可直接观测到绿色荧光的存在，初步证明有绿色荧光蛋白的表达。其次，解纤维梭菌细胞通过PBS溶液洗涤两次，并超声破碎后，进行上清液的蛋白电泳，发现大概在16kDa附近，与110*(447/3)的16.4kDa极为吻合。再次，SDS-PAGE蛋白凝胶上的目的蛋白条带，通过切割，剪成1mm³的小块、酶解等步骤进行处理，进行LC-MS分析(安捷伦)，检测到的蛋白序列与目的基因翻译所得到的氨基酸序列结果吻合，表明正是FbFP蛋白(图1)。此部分工作对于厌氧荧光蛋白的确定，为后面的实验奠定物质基础。

3)厌氧荧光蛋白稳定性研究

解纤维梭菌细胞以2％接种量进行接种至新鲜的DCB-1培养基中后，在生长的48hr内每隔3-5小时进行取样(分两批取样)，一批以完整细胞的形态，进行两次PBS洗涤后，直接进行荧光强度的检测，另一批细胞经过两次PBS洗涤后，悬浮于PBS溶液中，采用超声破碎的办法进行细胞破碎，然后离心取上清液进行荧光强度的检测，然后比较两种模式下荧光强度的稳定性(图2)，

由图2可见荧光强度检测的条件为激发光波长452nm，发射光波长为495nm，电压950v，积分5s，延滞0.1s。可见以完整细胞存在的样本，在细胞生长初期有比较大的误差，可能是由于细胞数目太少，导致OD600不是很准确，当用细胞的OD600作归一化时，引入很大的误差造成的。但在对数生长期时，荧光强度相对稳定，比如细胞培养20到40hr之间较为稳定。然而，经过超声破碎的细胞在整个培养过程中都能表现出较为稳定的荧光强度，但考虑到操作的简便性，采用对数期的完整细胞这一方式是可行的(图2)。

此外，由于有时收集的样本比较多，每个样本不可能在同一时间内全部测完，进而将当细胞生长至对数后期时，停止生长，置于有氧环境的4度保存。20h内定时取样，进行荧光强度的检测，步骤如前所述。通过Kruskal-Wallis检验发现，荧光强度在20hr内的各个时间点处并没有显著性差异(图2；p＝0.37)。由此含有FbFP的细胞停止生长后，依然保持着稳定的荧光强度。

4)厌氧荧光蛋白可靠性研究

根据启动子活性的原理，可知强启动子可以使得下游的报告基因高表达，因此我们可以根据报告基因的表达量来确定启动子的强和弱。根据不同碳源下解纤维梭菌的转录组数据，挑选出若干个启动活性不同的启动子，并通过引物的设计(如下表1)、PCR的方法，获得不同启动子的DNA片段。然后通过PstI和MluI两种酶进行酶切、连接，转化大肠杆菌DH5α，并通过质粒提取和MspI甲基化的过程，实现质粒的甲基化，最后通过电转的手段(0.1cm电转杯，750v，25μF，6ms)进行点击转化，通过红霉素(20μg/ml)筛选获得转化子。获得的转化子经过单克隆挑取，在常规的以纤维二糖为碳源的DCB-1中厌氧培养至对数后期，收集细胞(如前所述)，PBS洗涤后，超声破碎。经过超声破碎的细胞，离心取上清液，通过BCA蛋白定量试剂盒对总蛋白进行定量，然后在SDS-PAGE中load相同含量的蛋白总量，然后通过Bio-Rad GelDoc XR系统对每一条胶带进行目的蛋白的谱图，然后经过LabSpec5软件对谱图进行baseline，最终获得目的蛋白相对于总蛋白的含量，并与后面每个转化子测得的荧光强度进行相关分析(图3)。较高的R²值，证明启动子活性荧光强度检测法的可靠性。

表1

实施例3——木聚糖诱导型启动子的应用

对上述获得启动子的功能鉴定主要是在不同碳源条件下，启动子所表现出的启动活性的差异。具体维护：

1)细胞的培养

将上述实施例获得含重组载体pXL007的解纤维梭菌转化子接种于含有20μg/ml的红霉素的DCB-1培养基中于亨盖特滚管内恒温～35度，厌氧培养，以0.0005％刃天青作为含氧指示剂，培养至对数中后期。细菌接种与转接采用1ml注射器进行。

2)诱导型启动子的鉴定

将上述实施例获得含重组载体pXL007的解纤维梭菌转化子以及对照组细胞(含有pthl启动子的细胞，即含有pMTC6的细胞)，分别培养在五种不同底物碳源下。首先，都将这两种细胞在纤维二糖上进行活化，然后再通过注射器2％转接入其相应的碳源下活化两代，到第三代时也是保持2％的接种量(设有3个生物学平行)，当第三代细胞生长至对数中期或晚期的时候，离心收集细胞(8000rpm×3min)，进行两次PBS洗涤，后将不同底物碳源下培养的细胞进行如案例1中描述的荧光强度检测。比较发现，在几种不同碳源下，含有pXL007质粒的细胞在纤维二糖和阿拉伯糖上只有极低的启动活性，而在木聚糖上的启动活性最高。

3)木聚糖诱导型启动子的特征

通过木聚糖底物活化的细胞，转接到具有不同木聚糖含量的培养基中，0g/L，0.001g/L，0.01g/L，0.1g/L，1g/L，3g/L，并在不同时间点时收集细胞，0h，2h，4.5h，10.5h，20h。细胞的收集、细胞的洗涤、细胞荧光强度的检测过程都如案例1所述。最后通过比较发现，在低浓度的木聚糖培养条件下，细胞的荧光强度呈现先上升后下降的趋势，比如0.001g/L和0.01g/L(参见图4)。而在高浓度木聚糖中生长的细胞，随着时间的延长有逐渐递增的趋势，表明随着细胞的分裂，具有高荧光强度的细胞越来越多，更加均一，故而逐渐上升。这种种迹象也都表明，木聚糖虽然是一种诱导剂，但同时也是一种需要利用的碳源。说明木聚糖诱导活性的发挥是依赖于细胞的木聚糖可利用性的。

本发明中在厌氧型解纤维梭菌中诱导型启动子的发现，主要是采用核黄素单核苷酸依赖的荧光蛋白(FbFP)为报告系统的方法进行筛选的，通过将其培养在以五种不同碳源为底物的培养基中获得不同程度的表达量，且在纤维二糖上表达量极低，而在木聚糖上表达量很高。本发明中的诱导型启动子对于革兰氏阳性细菌的可控基因表达、遗传改造有重要意义，同时也丰富了合成生物学的遗传元件。

由实施例可知，本发明的内源性诱导型启动子不仅在解纤维梭菌的遗传改造具有重要意义，而且还丰富了合成生物学的遗传学元件。此外，基于厌氧荧光蛋白的启动子筛选方法在厌氧菌中筛选启动子也是首次应用，简便、稳定、不依赖氧气的存在。

Claims (2)

1.一种诱导性启动子在厌氧梭菌中启动下游目的基因表达的应用，其特征在于：所述启动子为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。

2.按权利要求1所述的应用，其特征在于：所述启动子受木聚糖诱导。

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