CN116640671A - 一株虫草菌wzfw1及其应用和制得的杀虫剂 - Google Patents
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Abstract
本发明属于害虫生物防治领域，具体涉及一株虫草菌WZFW1及其应用和制得的杀虫剂。该虫草菌WZFW1已于2022年6月8日将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022835；可将其制成相应的杀虫剂进行使用。本发明发现的一株新种，即虫草菌WZFW1，其对于灰茶尺蠖有良好的灭杀效果，且不存在化学农药的一系列弊端，能够实现对茶园病虫害的可持续治理。
Description
技术领域
本发明属于害虫生物防治领域，具体涉及一株虫草菌WZFW1及其应用和制得的杀虫剂。
背景技术
茶园单品种大面积种植，具有稳定的微气候，使其易受到众多害虫的侵袭。节肢动物害虫（昆虫和螨类）会造成5-55%的茶叶产量损失，约5亿美元到10亿美元的经济损失。为了防治茶叶害虫，茶农往往过分依赖化学农药的使用，这导致了害虫抗药性的增加、农药残留，这对人类生命健康和自然环境构成严重威胁，因此亟需发展新型的防治策略。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术的不足，基于此，发明人发现了一株虫草菌WZFW1（名称为Cordycepssp. WZFW1），通过鉴定发现该菌株为虫草属Cordyceps的一个新种，发明人已于2022年6月8日将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2022835。所述虫草菌WZFW1的ITS序列如SEQ ID No：1所示。
SEQ ID No：1：
TTGTCTTCGACTTTAACTCCCACCCTCCTGTGACCTACCCATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCGTCCGGACGGCCTCGCGCCGGCCCGCGACCTGGACCCAGGCGGCCGCCGGAGACCACGCAACCCTGCATCCATCAGTCTCTCTGAATCCGCCGCAAGGCAACACAAACGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACGTCCCCCGGGACGTCGGCCTTGGGGACCGGCAGCACCCCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCCCGTCCGCGGCGACCTCTGCGAAGTACTACAGCTCGCACCGGAAACCCGACGCGGCCCCGCCGTGAAACCCCCAACTCTGAACGTTGACCTCGGATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGGCCGGAGGAAA。
发明人发现虫草菌WZFW1对于灰茶尺蠖有良好的灭杀效果，且不存在化学农药的一系列弊端。
其中，虫草菌WZFW1的培养扩增可采用PDA培养基，包含50 µg/mL氯霉素和100 µg/mL硫酸链霉素。
发明人基于上述菌株及其效果的发现，还提供了一种杀虫剂，其组分包括上述的虫草菌WZFW1（优选孢子浓度为1 ×108孢子/mL），还可包括其他与剂型相匹配的助剂。
本发明的有益效果为：本发明发现了一株新种，即虫草菌WZFW1，其对于灰茶尺蠖良好的灭杀效果，且不存在化学农药的一系列弊端，能够实现对茶园病虫害的可持续治理。
附图说明
图1所示为大蜡螟幼虫感染虫草菌WZFW1死亡的僵虫表型图；
图2所示为虫草菌WZFW1的菌落形态图；
图3所示为虫草菌WZFW1序列在NCBI数据库中的比对结果图；
图4所示为虫草菌WZFW1基于ITS基因序列的系统发育树图；
图5所示为虫草菌WZFW1对灰茶尺蠖幼虫的毒力测定实验结果图；
图6所示为灰茶尺蠖幼虫感染虫草菌WZFW1死亡后的僵虫表型图。
具体实施方式
以下将结合实施例和附图对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。
实施例1：
虫草菌WZFW1（CCTCC NO：M 2022835）的筛选和鉴定：
分离自江西省赣州市上犹县五指峰有机茶园土壤，具体为：清除茶园土壤表面凋落物，采集茶园茶树树冠下直径5 cm，深度10 cm的土壤，经8目的筛网过筛后，混合均匀，取一定量的土壤于透明塑料碗，每份土壤样品中放入10头刚经过高温预处理4-5龄大蜡螟幼虫（防止大蜡螟幼虫结网）。实验过程中每天翻转容器，以便大蜡螟与土壤充分接触。将土壤样品放置在23±2 ℃环境中，黑暗环境下。每日观察，将死亡的幼虫经表面消毒处理后，单独放置在垫有湿润无菌滤纸的培养皿中。实验过程持续14天左右，直到大部分幼虫进入成虫状态。待菌丝或者孢子长出后，用接种环轻轻挑取感染幼虫上少许虫生真菌的孢子或菌丝，放置在PDA培养基（含50 µg/mL氯霉素和100 µg/mL硫酸链霉素）平板上，平板放置在25±1 ℃的霉菌培养箱中黑暗培养，待菌丝长出后进行分子和形态鉴定。
图1所示为该菌株感染大蜡螟幼虫死亡的僵虫表型图。注：大蜡螟在与茶园土壤充分接触8天后，虫体死亡，随后虫体发硬，长出白色菌丝。挑取菌丝于PDA培养基上分离培养，图2为该菌株在PDA培养基上生长10天的菌落形态图，初期为白色毛绒状菌丝，后期菌丝明显伸长且为淡粉色粉状孢子，菌落背面为淡黄色、平展状。
将上述所分离到的真菌菌株，先基于定殖模式，群落外貌，正反面色素沉积等进行分离菌株的形态观察，参考相关真菌分类资料，对各菌株进行形态鉴定，确定分类地位。采取分子生物学方式辅助鉴定，使用真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株DNA，并使用内转录间隔区（ITS）通用引物前引ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和后引ITS-4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行PCR扩增。序列结果于美国国家生物技术信息检索中心数据库（NCBI）中进行BLAST比对。
图3为本发明的虫草菌WZFW1序列在NCBI数据库种比对结果图。序列比对结果显示，本专利分离的虫草菌和目前数据库种所有的虫草菌不同，和最相似的株系Cordycepsblackwelliae（NR_164416.1）具有96.63%的相似性。图4为本发明菌株WZFW1基于ITS基因序列的系统发育树，分析发现该菌株单独聚为一个分支，与其他种明显区分开来。综上，将该发明菌株鉴定为虫草属Cordyceps的一个新种，根据国际命名法将该菌株命名为Cordycepssp.WZFW1。
实施例2：
采用虫草菌WZFW1（CCTCC NO：M 2022835）对灰茶尺蠖幼虫进行毒力测定实验：
将虫草菌菌株WZFW1接种于PDA平板上，放置在25±1 ℃的霉菌培养箱中黑暗培养10天，用0.05%吐温80溶液冲洗平板，将真菌孢子冲洗下来，收集分子孢子后用滤纸过滤，用血细胞技术板在生物显微镜下统计孢子原液的孢子数并计算孢子浓度，再用0.05%吐温80溶液稀释成浓度为1*108，1*107，1*106，1*105，1*104孢子/mL的溶液，每个浓度3个重复。每个重复组15头灰茶尺蠖二龄幼虫，对照组（CK））为0.05%吐温80无菌水溶液。采用浸虫法，即用软毛笔将二龄幼虫挑入1*107孢子/mL的孢子悬浮液（虫草菌WZFW1）中10 s，再将幼虫挑出至无菌滤纸上，自然风干后，将幼虫转移至培养皿中培养。培养皿放置于养虫室，温度为25±1 ℃、湿度为65±5%以及光照为L：D=16：8。每24 h 统计一次死虫数，持续10天。将死虫挑出，放置在底部垫有湿润滤纸的培养基中，观察真菌侵染虫体情况。
结果如图5和图6所示。图6所示为灰茶尺蠖幼虫感染虫草菌WZFW1死亡后的僵虫表型图。
根据图5可知，孢子浓度为1×108孢子/mL时，处理10天后的累计校正死亡率达77%，半致死时间（LT50）为2.9天，半致死浓度（LC50）为5.77×106孢子/mL，表明该菌株在灰茶尺蠖防治中具有很高应用潜力。
以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。
Claims (10)
1.一株虫草菌WZFW1，其特征在于，所述虫草菌WZFW1的名称为Cordyceps sp. WZFW1，已于2022年6月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022835。
2.根据权利要求1所述的虫草菌WZFW1，其特征在于，所述虫草菌WZFW1的ITS序列如SEQID No：1所示。
3.根据权利要求1所述的虫草菌WZFW1，其特征在于，采用PDA培养基对所述虫草菌WZFW1进行培养。
4.根据权利要求3所述的虫草菌WZFW1，其特征在于，所述PDA培养基包含50 µg/mL氯霉素。
5.根据权利要求4所述的虫草菌WZFW1，其特征在于，所述PDA培养基包含100 µg/mL硫酸链霉素。
6.权利要求1至5任一项所述虫草菌WZFW1在制备灰茶尺蠖杀虫剂中的应用。
7.一种杀虫剂，其特征在于，包括权利要求1至5任一项所述的虫草菌WZFW1。
8.根据权利要求7所述的杀虫剂，其特征在于，所述的虫草菌WZFW1的孢子浓度为1 ×108 孢子/mL。
9.根据权利要求7所述的杀虫剂，其特征在于，还包括与剂型相匹配的助剂。
10.权利要求7至9任一项所述杀虫剂在防治灰茶尺蠖的应用。
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