CN116549474A

CN116549474A - 一种治疗黄褐斑的组合物及其乳膏

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Publication number: CN116549474A
Application number: CN202310665076.5A
Authority: CN
Inventors: 沈志滨; 黄耿就; 欧志文; 郑诗倩
Original assignee: Guangdong Plant Skin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangdong Plant Skin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-06-07
Filing date: 2023-06-07
Publication date: 2023-08-08
Anticipated expiration: 2043-06-07
Also published as: CN116549474B

Abstract

本发明公开了一种治疗黄褐斑的组合物及其乳膏。其组合物包括异鼠李素‑3‑O‑新橙皮苷和桃叶珊瑚苷，乳膏则包含该含有治疗黄褐斑的组合物。本发明中异鼠李素‑3‑O‑新橙皮苷和桃叶珊瑚苷组合成的组合物作用于α‑MSH‑MC1R‑MITF‑TYR信号通路，体内外试验表明，组合物可下调MC1R的表达，下调MITF表达，抑制酪氨酸酶活性，对色素沉积疾病黄褐斑表现出优异的治疗潜力，为黄褐斑治疗难度大的现状提供解决方案。

Description

一种治疗黄褐斑的组合物及其乳膏

技术领域

本发明涉及个人护理领域，特别是涉及一种治疗黄褐斑的组合物及其乳膏。

背景技术

促黑激素-小眼畸形相关转录因子-酪氨酸酶(α-MSH-MITF-TYR)信号通路是黄褐斑发病机制中经典的信号通路，α-促黑色素激素(α-MSH)与黑色素细胞膜上的肾上腺皮质受体1(MC1R)结合后，通过G蛋白偶联受体(GPCR)并激活腺苷酸环化酶(AC)产生胞内第二信使环腺苷酸(cAMP)，环腺苷酸(cAMP)随后激活蛋白激酶A(PKA)，PKA通过环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)的磷酸化，最终激活下游小眼球畸形相关转录因子(microphthalmiaassociated transcription factor,MITF)表达增加，并发生磷酸化后刺激酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)的转录，使黑色素合成增加、黑色素小体转运增强。MITF调控黑色素细胞的生长发育是通过正向激活调控黑色素生成的基因，从而使黑色素合成增加。人体在接受紫外线照射时体内a-MSH水平会上升，并通过旁分泌的方式激活细胞膜上的MC1R经由CAMP-PKA通路在核内激活MITF活化的MITF激活TYR促使其表达增加。

酪氨酸酶TYR是一种调控黑色素生成的限速酶，酪氨酸在酪氨酸酶的作用下生成多巴，再经过一系列的步骤最终生成黑色素。合成的黑色素没有固定的分子质量，黑色素不断产生和沉积并形成均匀的黑色素颗粒，成熟的黑色素颗粒沿着微管、微丝运动到黑色素细胞的树突上，再到达相邻的角质细胞中，最后被角质细胞内的溶酶体降解，随表皮细胞的脱落而排出。如果人体皮肤中的酪氨酸酶活性异常或者黑色素代谢途径发生阻碍就会诱发黄褐斑、雀斑、老年斑等黑色素过度沉积类疾病。

黄褐斑是临床皮肤病中最常见的难治疗皮肤疾病。目前临床上通过口服维生素E和维生素C，激光或者化学剥脱等手段降解已生成的色斑，外用氢醌乳膏、曲酸乳霜、氨甲环酸、木质素过氧化物酶、苯丙氨酸等治疗黄褐斑，上述的黄褐斑治疗方案治疗效果并不明显，临床上尚无特效的黄褐斑治疗方案。

因此，亟需找到一种治疗黄褐斑的技术方案，来克服上述问题。

发明内容

本发明从黄褐斑发病机制中经典的信号通路出发，为黄褐斑患者开发一种抑制色素过度沉积的皮肤外用药。

本发明中异鼠李素-3-O-新橙皮苷和桃叶珊瑚苷组合成的组合物作用于α-MSH-MC1R-MITF-TYR信号通路，体内外试验表明，组合物可下调MC1R的表达，下调MITF表达，抑制酪氨酸酶活性，对色素沉积疾病黄褐斑表现出优异的治疗潜力，为黄褐斑治疗难度大的现状提供解决方案。

本发明的一个目的，在于提供一种治疗黄褐斑的组合物，其包括异鼠李素-3-O-新橙皮苷和桃叶珊瑚苷。

进一步地，所述异鼠李素-3-O-新橙皮苷和桃叶珊瑚苷的质量比为5:1-1:5。

进一步地，所述治疗黄褐斑的组合物还包括溶剂。

进一步地，所述溶剂选自极性溶剂或非极性溶剂。

本发明的另一个目的，在于提供上述含有治疗黄褐斑的组合物的乳膏。

进一步地，所述含有治疗黄褐斑的组合物的乳膏中，含有治疗黄褐斑的组合物占比为0.01-0.1wt％。

进一步地，所述乳膏包括油相和水相，其中

所述油相中含有醇类、酯类、醚类，以及含有治疗黄褐斑的组合物。

进一步地，所述油相中包括液体石蜡和凡士林。

本发明具有以下有益效果：

黄褐斑是临床皮肤病中最常见的难治疗皮肤疾病。目前临床上通过口服维生素E和维生素C，激光或者化学剥脱等手段降解已生成的色斑，外用氢醌乳膏、曲酸乳霜、氨甲环酸、木质素过氧化物酶、苯丙氨酸等治疗黄褐斑，上述的黄褐斑治疗方案治疗效果并不明显，临床上尚无特效的黄褐斑治疗方案。为此，本发明从黄褐斑发病机制中经典的信号通路出发，为黄褐斑患者开发一种抑制色素过度沉积的皮肤外用药。

说明书附图

图1示出了不同浓度药物对B16细胞活力的影响(n＝6，X±SD)。

图2示出了不同比例组合物抑制B16细胞MC1R表达的结果。

图3示出了构建黄褐斑小鼠模型与给药操作图。

图4示出了各组小鼠背部皮肤(100X)与耳部皮肤(200X)组织病理图(n＝6)。

图5示出了各给药组对黄褐斑小鼠皮肤MC1R含量的影响(X±SD,n＝6)。

图6示出了药物对小鼠皮肤组织中MITF含量的影响(n＝3,×200)。

图7示出了TYR活力定量实验拟合曲线(X±SD，n＝6)。

图8示出了各给药组对黄褐斑小鼠皮肤TYR活力的影响(X±SD,n＝6)。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明的技术方案，列举如下制备例和应用例。制备例和应用例中所出现的原料、反应和后处理手段，除非特别声明，均为市面上常见原料，以及本领域技术人员所熟知的技术手段。

小鼠黑色素瘤细胞(B16)，货号为MZ-0024，购自宁波明舟生物科技有限公司；

本发明制备例和应用例中的异鼠李素-3-O-新橙皮苷、桃叶珊瑚苷、熊果苷，购自成都曼思特生物科技有限公司，纯度均大于98wt％；

本发明制备例和应用例中的左旋多巴(L-DOPA)采购自上海麦克林生化科技有限公司。

制备例

药物储备液的配制：以DMSO作溶剂，将药物制备成储备液，0.22μm孔径滤膜过滤除菌，用EP管分装，封口，贴标签，于-20℃避光环境保存备用。其中，A组合物(异鼠李素-3-O-新橙皮苷：桃叶珊瑚苷＝5:3，m/m)、B组合物(异鼠李素-3-O-新橙皮苷：桃叶珊瑚苷＝1:1，m/m)、C组合物(异鼠李素-3-O-新橙皮苷：桃叶珊瑚苷＝3:5，m/m)等按照比例配制。

应用例1

配制MTT工作液：称取50.00mg MTT粉末，加入15mL离心管，转移至超净台内环境，加10.0mLPBS溶液并震荡使完全溶解，制成5mg/mL浓度工作液。0.22μm孔径滤膜过滤除菌，用EP管分装，封口，贴标签，-20℃避光保存备用。

采用MTT实验检测药物对B16细胞活力的影响，具体实验步骤如下。

细胞分组与给药。设置Control组与给药组(熊果苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、桃叶珊瑚苷、A组合物、B组合物、C组合物等浓度设置为0.5、1、2、4、8、16和32μM)，每组设置6个复孔。将B16细胞(2万/孔)接种在96孔板中，培养24h，当细胞融合度约为60％时，吸弃原有的培养基，每孔加100μL不含药物的B16完全培养基，给药组第一行再加100μL含64μM浓度药物的1640培养基，向下梯度稀释后成梯度浓度给药孔，每组设置6个复孔。整板放入培养箱中继续培养24h。

采用MTT实验检测药物对细胞活力的影响。具体步骤如下：加药培养后，吸弃原有的培养基，PBS洗涤2次，于避光条件下用无血清1640培养基10倍稀释5mg/mLMTT工作液，各孔加100μL浓度为0.5mg/ml的MTT溶液，于培养箱中避光培养4h，取出孔板并倾倒液体，PBS洗涤2次以上，每孔加入100μL DMSO溶液，充分溶解10min，490nm处检测整板OD值，并计算细胞活力。

所采用的待测样品和相关测试结果，如表1和图1所示。

表1不同浓度药物对B16细胞活力的影响(n＝6，X±SD)

注：用one-wayANOVA方法进行统计分析时，样品组与control组相比，显著性以*表示，*p-value＜0.05表示具有显著性差异，**p-value＜0.01表示有极显著差异。

图1示出了不同浓度药物对B16细胞活力的影响(n＝6，)。从上表可知，与Control组比较，32μM的异鼠李素-3-O-新橙皮苷显著抑制B16细胞活性(P＜0.0001)，异鼠李素-3-O-新橙皮苷合适的给药范围为0.5-16μM。与Control组比较，16-32μM的A组合物显著抑制B16细胞活性(P＜0.05)，A组合物合适的给药范围为0.5-8μM。与Control组比较，0.5-32μM的熊果苷、B组合物、C组合物基本不影响B16细胞活力，其合适给药浓度范围为0.5μM-32μM。与Control组比较，8μM桃叶珊瑚苷显著抑制B16细胞活性(P＜0.05)，但8μM桃叶珊瑚苷对应的细胞活力为96.41％±0.01。

在后面实验中，设置给药浓度为8μM。

应用例2

采用基于细胞实验的Elisa法检测不同比例组合物抑制MC1R表达的影响，具体实验步骤如下：

S1、细胞分组及给药。根据应用例1的实验结果，给药浓度设置为8μM。设置Control组、桃叶珊瑚苷组、异鼠李素-3-O-新橙皮苷组、A组合物组、B组合物和C组合物组，每组设置3个复孔。将B16细胞(20万每孔)接种在24孔板中，放入培养箱中培养24h，当B16细胞达到约50％融合度时给药。用无血清1640培养基将药物储备液稀释至8μM浓度。吸弃原有培养基，Control组加1000μL不含药物的完全培养基，给药组加1000μL含药物浓度8μM的完全培养基，放入细胞培养箱中继续培养24h。

S2、检测药物对B16细胞MC1R表达的影响。培养结束后吸弃培养液，每孔加1mL 1％的曲拉通裂解液，于冰上裂解细胞1h。收集裂解后的细胞悬液至1.5mL离心管中，于4℃，3000rpm离心20min，取上清液按照MC1R Elisa试剂盒说明步骤操作，设置标准品孔、空白孔和待测样品孔，以空白孔校零，酶标仪检测450nm处OD值。以标准品蛋白浓度为横坐标，标准品OD值为纵坐标，绘制标准曲线。将待测样品OD值代入标准曲线并计算蛋白浓度，再乘以样品稀释倍数，即得样品组蛋白浓度，根据如下计算公式计算MC1R蛋白下调率：

MC1R下调率％＝(1-实验组平均蛋白浓度/Control组平均蛋白浓度)×100％。

所得结果如表2和图2所示。

表2：不同比例组合物抑制B16细胞MC1R表达的结果(X±SD，n＝3)

注：用one-wayANOVA方法进行统计分析时，与熊果苷组相比，显著性以*表示，*p-value＜0.05表示具有显著性差异，****p-value＜0.0001表示有极显著差异。与桃叶珊瑚苷组相比，显著性以#表示，^#p-value＜0.05表示具有显著性差异，

^####p-value＜0.0001表示有极显著差异。与异鼠李素-3-O-新橙皮苷组相比，显著性以+表示，⁺p-value＜0.05表示具有显著性差异，++++p-value＜0.0001表示有极显著差异。

图2示出了不同比例组合物抑制B16细胞MC1R表达的结果。

实验结果如表2和图2所示，与阳性药熊果苷组相比，桃叶珊瑚苷(P<0.001)、异鼠李素-3-O-新橙皮苷(P<0.0001)、A组合物(P<0.0001)、B组合物(P<0.0001)以及C组合物(P<0.0001)均能极显著下调B16细胞中MC1R表达。

与桃叶珊瑚苷组相比，异鼠李素-3-O-新橙皮苷(P<0.0001)、A组合物(P<0.0001)、B组合物(P<0.0001)以及C组合物(P<0.0001)均能极显著下调B16细胞中MC1R表达。

与异鼠李素-3-O-新橙皮苷组相比，A组合物(P<0.0001)、B组合物(P<0.0001)以及C组合物(P<0.01)均能极显著下调B16细胞中MC1R表达。其中，A组合物对MC1R表达下调率最高，达38.63％。

综上分析，A组合物、B组合物以及C组合物抑制B16细胞中MC1R表达的作用优于单独使用熊果苷、桃叶珊瑚苷或者异鼠李素-3-O-新橙皮苷，说明组合物对MC1R表达下调率优于单用异鼠李素-3-O-新橙皮苷或桃叶珊瑚苷。后续实验将进一步探讨A组合物对黄褐斑小鼠皮肤的影响。

应用例3

实验动物：SPF级6周龄、雌性C57BL/6J小鼠60只，体重17±2g，购自广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCXK(粤)2022-0002。实验动物饲养于广东药科大学动物实验中心，实验单位使用许可证编号：SYXK(粤)2017-0125，温度维持在20-25℃，相对湿度为40％-60％，自由摄食，适应性饲养一周后进行实验。

实验药物：配置乳膏成分，乳膏成分如表3所示。

表3乳膏成分

其中，A组合物的取值分别为低剂量(占乳膏的0.01wt％)、中剂量(占乳膏的0.03wt％)以及高剂量(占乳膏的0.05wt％)，而熊果苷(占乳膏的3wt％)和空白样(无有效成分)。

上述乳膏的制备步骤如下所示：

S1、制备A组合物的储备液：将甘油和水按照甘油:水＝1:1的比例混合，煮沸后冷却到室温备用，用甘油和水的混合液溶解A组合物粉末，制备成浓度为10mg/mL的储备液。

S2、先按照表3称取油相，混合并加热至80℃充分溶解，充分搅匀，降温至65℃，分组加入熊果苷(3g熊果苷)，A组合物(A组合物低、中、高剂量组分别加A组合物的储备液1mL、3mL和5mL)，再加入2g异山梨醇二甲基醚，搅拌均匀，超声使油相溶解完全。再按照以上表格称取水相，并用纯水补充至乳膏总量为100g，水相加热至60℃使其充分溶解。将油相缓缓倒入预热的水相中，搅拌至室温，即成乳膏。

黄褐斑模型的构建、皮肤给药及取材：

1、动物分组与脱毛处理

动物分组。设置Control组、Model组、熊果苷组(阳性药物组)、基质组、A组合物低剂量组、中剂量组以及高剂量组，共7组。将42只SPF级C57BL/6小鼠随机分成7组，每组6只。

动物剃毛和脱毛处理。适应性饲养7d后，全部小鼠进行脱毛。先用宠物推剪剔除背部较长毛发，再按照脱毛膏说明书脱除小鼠背部和双耳的短绒毛，脱毛的背部皮肤面积约为3cm×2cm，脱毛后所有小鼠休息2d，第3d开始造模。为保证造模与给药效果，确保全部小鼠每2d剃毛一次；为减轻脱毛膏对小鼠皮肤的刺激，每2周进行一次脱毛。

2、黄褐斑模型的构建与皮肤给药

适应性饲养7d后，按照图3(构建黄褐斑小鼠模型与给药操作)进行相应的实验操作。设置UVB灯照射剂量为180mJ/cm²，UVB灯的照射距离为49cm，照射强度为308μW/cm²，根据照射剂量(mJ/cm²)＝照射强度(mW/cm²)×照射时间(s)计算出在照射距离为49cm条件下，照射时长约为10min，造模前UVB紫外预热15min，隔天照射。黄体酮肌肉注射剂量为20mg/kg，配制的黄体酮注射液浓度为8mg/mL，计算得每只小鼠的注射剂量约为50μL，邻日异侧、隔日同侧给与黄体酮肌肉注射给药。每次给予乳膏涂抹皮肤应在造模操作后进行，给药量为0.6mg/只/d，至第31d实验结束，小鼠皮肤累计用药天数为23d。实验期间各组小鼠自由饮水摄食，每周更换两次垫料。

需要注意的是，UVB照射期间，紫外照射箱内需要放置适量的冰袋，以防高温致小鼠中暑。另外，造模期间须观察小鼠皮肤有无炎症、创口等，若出现创口，应停止造模和给药，休息2-3d至症状消失，再继续造模。

3、取材

第31d实验结束后，全部小鼠眼球取血，脱颈处死，迅速剥取小鼠背部和耳部裸露部位的表皮，生理盐水清洗后拭干。将皮肤分成两份，一份用锡纸固定防止褶皱，浸入4％多聚甲醛组织固定液中，用于后续包埋检测；另外一份称重并分装在离心管中，标记后投入液氮中保存，用于后续检测皮肤中TYR活力和MC1R的表达量。

4、检测水提物对黄褐斑小鼠耳部、背部皮肤组织的病理改变

制作皮肤组织石蜡切片。取固定后的皮肤组织，于脱水机内用梯度酒精进行脱水浸蜡，包埋并并切片、准备下一步染色。

将石蜡切片脱蜡至水，浸入黑色素工作液并于4℃避光孵育18h，继续按步骤复染后用中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。分析Masson-Fontana染色切片中小鼠皮肤组织基底层黑色素颗粒的分布与黑素小体的生成与转运状态。

所得结果如图4所示。图4示出了各组小鼠背部皮肤(100X)与耳部皮肤(200X)组织病理图(n＝6)。从图中可以看出，与Control组相比，Model组与基质组视野中基底层的黑素细胞下沉，深入真皮层，摆脱了与角质形成细胞黏附的状态。Control组小鼠皮肤红色的胶原纤维排列紧密有序，胶原纤维的粗细和大小均匀，胶原纤维均匀地分布在皮肤真皮层。与Control组相比，Model组与基质组小鼠真皮层胶原纤维变粗，胶原纤维断裂并且有结构松散的现象。Control组视野中真皮层含有极少的游离黑色素和噬黑素细胞，而Model组与基质组视野中真皮层充斥较多黑素细胞与噬黑素细胞。Model组与基质组病理指征近似。

与Model组相比，A组合物低、中、高剂量组视野中基底层的黑素细胞深入真皮层现象有所减轻，胶原纤维排列较规则、均匀，且真皮层含有更少的噬黑素细胞；游离黑色素减少，色素观感减轻。

与熊果苷组相比，A组合物低、中、高剂量组视野中基底层的黑素细胞较少，更多处于基底层交界处，且胶原纤维排列较规则、均匀，A组合物低、中、高剂量组视野观察显示真皮层游离黑色素减少。

应用例4

提前制备好皮肤组织上清，按照MC1R Elisa试剂盒说明步骤操作，于450nm处检测OD值。以蛋白浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。将待测样品OD值代入标准曲线并计算蛋白浓度，再乘以样品稀释倍数，即得样品组蛋白浓度，根据如下计算公式计算MC1R蛋白下调率：

MC1R下调率％＝(1-实验组平均蛋白浓度/Model组平均蛋白浓度)×100％。

所得结果如表4和图5所示。

表4各给药组对黄褐斑小鼠皮肤MC1R含量的影响(X±SD,n＝6)

注：与Control组相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，^****P<0.0001；与Model组相比，^#P<0.05，^##P<0.01，

^###P<0.001，^####P<0.0001；与熊果苷组相比，⁺P<0.05，⁺⁺P<0.01，⁺⁺⁺P<0.001，⁺⁺⁺⁺P<0.0001

从以上数据可知，采用Elisa法检测各给药组对黄褐斑小鼠背部皮肤中MC1R含量的影响，结果如表4和图5所示。与Control组相比，Model组(P<0.0001)、基质组(P<0.0001)、熊果苷组(P<0.0001)、A组合物低剂量组(P<0.001)皮肤MC1R含量显著增加，而A组合物中剂量组(P＞0.05)和A组合物高剂量组(P＞0.05)与Control组皮肤MC1R含量无显著性差异。

与Model组相比，A组合物低剂量组(P<0.05)、中剂量组(P<0.001)、高剂量组(P<0.0001)皮肤MC1R均显著降低。

与熊果苷组相比，A组合物高剂量组(P<0.05)皮肤MC1R显著降低。

应用例5

制作小鼠背部皮肤组织石蜡切片。取固定后的皮肤组织，于脱水机内用梯度酒精进行脱水浸蜡，包埋并切片，将切片脱水后置于盛有EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，此过程中应防止干片。自然冷却后将玻片置于PBS中晃动洗涤3次，甩干。对切片进行IF染色，于荧光显微镜下观察并拍照。滴加BSA均匀覆盖组织表面，室温封闭30min。甩掉封闭液，在孔板里滴加用PBS配好的一抗，培养板4℃孵育过夜。孔板置于脱色摇床上洗涤3次。稍甩干后在圈内滴加相应种属的二抗，室温孵育50min。爬片置于PBS中洗涤3次，玻片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。最后洗涤甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。按照CLSM操作说明对封好的免疫荧光染色片进行拍照观察。

所得结果如图6所示。图6示出了药物对小鼠皮肤组织中MITF含量的影响(n＝3,×200)。

采用IF染色实验检测各组小鼠皮肤组织中MITF含量，荧光强度半定量结果如图6所示。与Model组相比，熊果苷组(P<0.05)、A组合物低剂量组(P<0.05)、A组合物中剂量组(P<0.0001)、A组合物高剂量组(P<0.0001)皮肤组织中MITF含量均显著降低。与熊果苷组相比，A组合物低剂量组(P＞0.05)、A组合物中剂量组(P＞0.05)降低皮肤组织中MITF含量与熊果苷没有显著性差异。与熊果苷组相比，A组合物高剂量组显著降低皮肤组织中MITF含量(P<0.01)。

应用例6

制备皮肤组织匀桨：依次称取50mg小鼠背部皮肤与耳部组织入匀浆管，按照质量比为1:9的比例，往组织中加入4℃预冷的生理盐水，每管放入3粒钢珠，用组织匀浆机在低温条件下匀桨，制成10％的皮肤组织匀浆。每管样品加入100μL浓度为1％的细胞裂解液，于冰上裂解30min，之后低温离心(4℃，4000rpm)20min，收集上清液并分装标记，-80℃保存备用。

左旋多巴(L-DOPA)溶液配制：称取20.00mg的L-DOPA粉末，加入15mL离心管中，转移至超净台内环境，加10.0mL PBS溶液并震荡使完全溶解，制成2g/L L-DOPA溶液。试剂易氧化变黑，宜现配现用。

TYR活力定量：取2.5KUnits活力量的蘑菇酪氨酸酶粉末，常温下溶于10mLPBS溶液中，制成250U/mL酶溶液，依次梯度稀释成125、51.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95U/mL各组酶溶液，以每孔100μL的量加入96孔板中，另设一组Control组，加入等量PBS，每组设置5个复孔。37℃孵育并加入10μL质量浓度为2g/L的L-DOPA溶液，反应1h。测定492nm处的OD值，校零后作出酶活力(U/mL)关于OD值的曲线图，计算曲线方程，得出酶活力与OD值间的数量关系。TYR活力定量实验结果显示酶活力值y(U/mL)与490nm处OD值x之间的拟合曲线如图7所示，方程如下：

y＝108.13*x^2+46.275*x-2.1163

图7示出了TYR活力定量实验拟合曲线(X±SD，n＝6)。

TYR活力的测定与计算：取待测样品50μL加入96孔板中，设置3个复孔，于37℃孵育并加入10μL质量浓度为2g/L的L-DOPA溶液，反应1h。测定492nm处的OD值，代入上述TYR酶活力定量的曲线方程，得到酶活力数值。依照下列TYR活力抑制率计算公式，计算不同浓度药物处理后对B16细胞酪氨酸酶的抑制率：

TYR抑制率％＝(1-实验组平均酶活力/Model组平均酶活力)×100％。

所得结果如表5和图8所示。

表5各给药组对黄褐斑小鼠皮肤TYR活力的影响(X±SD,n＝6)

注：与Control组相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，^****P<0.0001；与Model组相比，^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001，^####P<0.0001；与熊果苷组相比，⁺P<0.05，⁺⁺P<0.01，⁺⁺⁺P<0.001，⁺⁺⁺⁺P<0.0001图8示出了各给药组对黄褐斑小鼠皮肤TYR活力的影响(X±SD,n＝6)。

与Control组相比，Model组(P<0.0001)、基质组(P<0.0001)、熊果苷组(P<0.01)、A组合物低剂量组(P<0.05)TYR活力均显著升高。与Model组相比，熊果苷组、A组合物低剂量、中剂量以及高剂量组TYR活力均极显著降低(P<0.0001)。与熊果苷组相比，A组合物中剂量组(P<0.01)、A组合物高剂量组(P<0.05)TYR活力均显著降低。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性制备例和应用例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将制备例和应用例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各制备例和应用例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims

1.一种治疗黄褐斑的组合物，其特征在于，所述治疗黄褐斑的组合物包括异鼠李素-3-O-新橙皮苷和桃叶珊瑚苷。

2.根据权利要求1所述治疗黄褐斑的组合物，其特征在于，所述异鼠李素-3-O-新橙皮苷和桃叶珊瑚苷的质量比为5:1-1:5。

3.根据权利要求1所述治疗黄褐斑的组合物，其特征在于，所述治疗黄褐斑的组合物还包括溶剂。

4.根据权利要求3所述治疗黄褐斑的组合物，其特征在于，所述溶剂选自极性溶剂或非极性溶剂。

5.如权利要求1-4任一项所述含有治疗黄褐斑的组合物的乳膏。

6.根据权利要求5所述含有治疗黄褐斑的组合物的乳膏，其特征在于，所述含有治疗黄褐斑的组合物的乳膏中，含有治疗黄褐斑的组合物占比为0.01-0.1wt％。

7.根据权利要求5所述含有治疗黄褐斑的组合物的乳膏，其特征在于，所述乳膏包括油相和水相，其中

8.根据权利要求7所述含有治疗黄褐斑的组合物的乳膏，其特征在于，所述油相中包括液体石蜡和凡士林。