JP2017530116A - スキンケア組成物の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
SEQ ID NO:1から16のアミノ酸又はヌクレオチド配列を示す配列表が、「13534M2配列表ST25」というファイル名のASCIIテキストファイルとして本願と同時に出願されている。このASCIIテキストファイルは、2015年9月8日に作成したもので、サイズは4.24KBである。MPEP 605.08及び米国特許規則1.52(e)に従い、このASCIIテキストファイルの主題は本明細書に参照により組み込まれる。
「年齢による染み」は、内因性又は外因性の加齢要因による色素過剰スポットを意味する。
HMGB1がメラニン産生細胞の増殖を助長することなく、ヒト初代メラニン産生細胞中の樹状突起形成度及び細胞体領域の成長を刺激するという驚くべき発見から、皮膚色調剤を特定する新たな方法が導かれている。本方法は、潜在的な皮膚色調剤としての試験薬及び試験薬の組合せを、当該検定内のHMGB1濃度及び/又は活性を制御するための試験薬の能力に基づいて特定する、試験管内スクリーニング検定のための便利な手段を提供する。本方法により評価される試験薬は、当該技術分野において既知の任意の好適な手法により選択することができる。例えば、接続性マッピングを使用して、遺伝子発現特性、生物学的プロセス、関心経路又はテーマと関連付けられる特定の遺伝子又は遺伝子群を調製することが知られている試験薬を特定してもよい。潜在的な皮膚色調剤を特定するための接続性マッピングに使用する非限定的な例は、ハコザキらにより2013年3月27日に出願された米国特許公開公報第2013/0261007A1号に開示されている。
本発明の方法は、美容的処置、調節、改善、及び/又はまだらな皮膚の色調及び/又は色素過剰スポットを防ぐことを意図した組成物に使用される皮膚色調剤を特定するために使用可能である。これらの化粧組成物は、哺乳動物の皮膚表面、特にヒトの皮膚に塗布されるためのものである。組成物は、限定するものではないが、溶液、懸濁液、ローション、クリーム、ゲル、化粧水、スティック、ペンシル、スプレー、エアゾル、軟膏、クレンジング洗剤液及びクレンジング棒状固形物(cleansing liquid washes and solid bar)、シャンプー及びヘアコンディショナー、ペースト、フォーム、パウダー、ムース、髭剃りクリーム、ティッシュ、細片(strip)、パッチ、電気駆動パッチ、創傷被覆材及び粘着性包帯、ヒドロゲル、フィルム形成製品、顔及び皮膚マスク(不溶性シートを有する及び有さない)、ファンデーション、アイライナー及びアイシャドウ等の化粧品等の、非常に様々な製品形態を有し得る。組成物の形態は、組成物中に存在する場合、選択される具体的な皮膚科学的に許容可能な担体に従い得る。
本明細書のスクリーニング方法は、1以上の皮膚色調剤を特定するために使用され、その皮膚色調剤がスキンケア組成物に組み込まれる。当該組成物は、局所用スキンケア組成物を製造する技術分野において既知であるような従来の方法によって調製され得る。このような方法は、通常、加熱、冷却、真空の適用等を用いて又は用いずに、成分を1つ以上の工程で混合して比較的均一な状態にする工程を伴う。一般に、エマルションは、最初に水相物質を脂肪相物質とは別個に混合し、その後2相を適宜組み合わせて、所望の連続相を得ることにより調製される。組成物を、安定性(物理的安定性、化学的安定性、光安定性)、及び/又は活性物質の送達を最適化するように調製することが重要である。この最適化には、適切なpH(例えば、7未満)、活性剤と複合体を形成して、安定性又は送達に有害な影響を与え得る材料の排除(例えば混入鉄の排除)、複合体形成を防止する手法(例えば、適切な分散剤又は二重区画包装)の使用、適切な光安定性の手法(例えば、日焼け止め剤/日焼け防止剤の配合、不透明包装の使用)の使用等を挙げることができる。
処置、塗布、調節、又は改善の様々な方法において、前述した組成物を使用することができる。組成物は、HMGB1阻害を必要とする対象皮膚表面に塗布されてもよい。例えば、組成物は、色素沈着状態(例えば色素過剰スポット又はまだらな色調)を含む皮膚表面に塗布されてもよい。最も問題の皮膚表面は、顔の皮膚表面、手及び腕の皮膚表面、足及び脚の皮膚表面、並びに首及び胸の皮膚表面(例えば、デコルタージュ)等の、衣服で覆われない皮膚表面である傾向がある(が、これらに限定されない)。特に、色素過剰スポットの識別は額、口周囲、頤、眼窩周囲、鼻及び/又は頬の皮膚表面を含む顔の皮膚表面であってもよい。
以下の方法は、本発明の様々な実施形態の所定の特徴及び利点を説明するために提供され、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。試験方法は、本方法で使用される細胞のプレーティング、投薬、培養に適した手段を提供するものである。更に試験方法は、RNA及びタンパク質を分離、分析するのに適した手段を提供する。更に試験方法は、メラニン産生細胞の樹状突起形成度及び細胞体を判定するのに適した手段を提供する。試験方法の説明にて、特定の細胞、材料、及び/又は器具が例示されるが、当業者であれば、ここで開示されたものと同等の、その他の細胞種類、材料及び/又は容器を使用して本試験方法を利用できよう。
40,000細胞/1mLのケラチン産生細胞懸濁液210mLを、好適な媒質を使用して、細胞懸濁液を生成する。細胞懸濁液2mLを、適宜1つ以上の12ウェルプレートの、適切な数のウェルに入れる。細胞のピペットの際に、ウェルごとに速度と挿入角度を同一とする。12ウェルプレートを、一晩37℃で恒温放置する。細胞プレーティング品質が低い場合(例えば、プレートに細胞が貼り付いていない、シーディング密度が不均一である)、破棄してやり直す。
試験薬を所望の濃度(例えば0.0001%〜10%)まで好適な媒質(例えば細胞懸濁液の生成に用いられた媒質と同じ)で希釈し、投薬媒質を調整する。好適なレベルまで(例えば0.0001%〜10%、0.01%〜8%、0.1%〜5%、又は0.5%〜3%)試験薬を希釈することは、スキンケア組成物に対する試験薬の生体内効果をシミュレーションするのに重要となり得る。このようなレベルのスキンケア組成物に、スキンケア活性剤が含まれるのは一般的でなくはない。任意で、試験用サンプルに可溶化剤0.1%が含まれるよう、十分な可溶化剤を含める。12ウェルプレートの各ウェルに、投薬媒質2mLを加え、4℃で一晩又は試験用サンプルに試験薬を加えるまで恒温放置する。
調製された投薬媒質を、37℃のインキュベータに少なくとも30分又はpHが均等になるまで置いておく。投薬媒質が温められ、適切なpHとなれば、細胞を投与する。投与された細胞を6時間37℃で恒温放置する。
6時間恒温放置の内、最後の20分で、顕微鏡で全てのウェルを視認する。形態変化、毒性、沈殿が認められた全ての対照及びサンプルの写真を撮る(例えば顕微鏡写真)。12ウェルプレートの媒質を、バケツに放り込む。ペーパータオルで軽く叩いて、更に媒質を除去する。プレートを逆さにして新しいペーパータオルに1〜2分置き、更に軽く叩いて残留した媒質を除去する。8チャネルMATRIXブランドのピペット(1つ置きのチャネルに先端部を備える)を使用して、各ウェルに700μLのTRIzol(登録商標)ブランドの試薬を添加する。各ウェルからの溶菌液を、1つ置きのチャネルにのみ充填された8チャネルピペットを使用して、96ウェルプレートに移動させる。粘着質のプレートカバーを96ウェルプレートにくっつけて、−20℃で保管する。
全RNA(スモールRNAを含む)を、メーカーの指示に従ってQIAgen(登録商標)(ドイツ、Helden)のmiRNeasy Miniカラムを使用して、細胞溶菌液から分離させる。溶菌液は、短い渦流によって均質化されており、精製の準備が整うまで−80℃で冷凍されてもよい。精製のために、溶菌液は氷の上で解凍され、一旦クロロホルムに抽出される。抽出物の水相にエタノールを添加し、この混合物をRNeasy(登録商標)スピンカラムに添加する。カラムを洗浄し、汚染物を取り除き、精製された全RNAをカラムからヌクレアーゼを含まない温水に溶出させる。RNA量は、NanoDrop(登録商標)8000(Thermo Scientific(マサチューセッツ州Waltham))分光光度計を使用して決定する。RNAの品質及び完全性は、Agilent(登録商標)(カリフォルニア州Santa Clara)2100 BioAnalyzerを使用して確認される。精製されたRNAは−80℃で保管する。
250ngの全RNAは、Beckman Coulter(登録商標)(インディアナ州Indianapolis)Biomek(登録商標)FXp自動化ワークステーションでの使用に最適化されたAffymetrix(登録商標)(カリフォルニア州Santa Clara)HT 3’ IVT Expressプロトコルを使用してGeneChip(登録商標)ブランドのマイクロアレイターゲットに変換される。標識化された対象は、一晩Affymetrix(登録商標)U219−96ブランドのマイクロアレイプレートに対してハイブリダイゼーションされ、続いて、Affymetrix(登録商標)GeneTitan(登録商標)器具でメーカーの指示に従って洗浄、染色、スキャンされる。
1ugの全RNAを、Affymetrix(登録商標)FlashTag Biotin HSR標識化キット及び提供されるプロトコルを使用して標識化する。ビオチン標識化されたRNAは、一晩Affymetrix(登録商標)miRNA 3.0−96ブランドのマイクロアレイプレートに対してハイブリダイゼーションされ、続いて、Affymetrix(登録商標)GeneTitan(登録商標)器具で提供されるプロトコルに従って洗浄、染色、スキャンされる。
ケラチン産生細胞(又は他の細胞)は、上述のように、約200,000細胞/ウェルのシーディング密度で12ウェルプレートに入れ、5%のCO2を加えて37℃で一晩恒温放置する。ケラチン産生細胞は、試験薬を含有する投薬媒質と共に投薬され、プレートは更に20時間インキュベータに戻される。それぞれの上澄みを回収し、ELISA(USCN Life Sciences)を使用してHMGB1の濃度をメーカーの指示に従って分析する。細胞は、Glo Lysis Buffer(Promega)によって溶解され、タンパク質濃度をメーカーの指示に従ってBCAキット(Pierce)を使用して決定する。ELISAによって決定されHMGB1の値は、細胞からの総タンパク質濃度に正規化させる。
ヒト初代メラニン産生細胞(ATCC)を、T150フラスコ中で2パッセージにわたり培養する。樹状突起形成度の実験に関して、メラニン産生細胞は96ウェルプレート(クリアな)に約5000細胞/ウェルの密度で入れる。このプレートを、37℃で5%のCO2のインキュベータ内に収められたIncucyte ZOOM(登録商標)生細胞撮像システム(Essen Bioscience(ミシシッピ州Ann Arbor))に入れる。位相モードを使用して、毎時20X画像を収集する。Neurite Outgrowth Software Package(Essen)を使用して、細胞体の大きさ、樹状突起形成度、及び細胞の数を測定する。
本例では、試験薬を、HMGB1の濃度を低減させるその能力に基づいて、皮膚色調剤として特定する本方法の能力を証明する。表1は、ケラチン産生細胞を異なる濃度のヒドロキシ桂皮酸(「HCA」)又はメチルヒドロキシ桂皮酸(「ME−HCA」)に接触させた結果のHMGB1の濃度の変化を示す。対照サンプルは、試験薬はないが、試験用サンプルと同様である。表1の試験用サンプル及び対照は、本方法に従って調整及び分析された。表1に示すように、HCA及びME−HCAにより、対照に対してHMGB1レベルが十分に低減された。したがって、HCA及びME−HCAが、本方法に係る皮膚色調剤として特定される。
本例では、試験薬を、HMGB1の濃度を低減させるその能力に基づいて、皮膚色調剤として特定する本方法の能力を更に証明する。以下の表2は、ケラチン産生細胞を異なる濃度のPitera(登録商標)から商業的に入手可能なガラクトミセス培養液(「GFF」)又はClariju(登録商標)から商業的に入手可能なPrunus domestica抽出物に接触させた結果のHMGB1の濃度の変化を示す。対照サンプルは、試験薬はないが、試験用サンプルと同様である。表2の試験用サンプル及び対照は、本方法に従って調整及び分析された。表2に示すように、GFF及びプルヌスにより、対照に対してHMGB1レベルが十分に低減された。したがって、GFF及びプルヌスが、本方法に係る皮膚色調剤として特定される。
Claims (12)
- スキンケア組成物の製造方法であって、
a.約1,000セル/mL〜約2,000,000セル/mLの濃度の細胞を第1の媒質中に懸濁させて試験用懸濁液を提供する工程と、
b.前記試験用懸濁液の少なくとも一部を容器に入れる工程と、
c.前記容器中の前記懸濁させた細胞の少なくとも一部を試験薬に接触させて試験用サンプルを作成する工程と、
d.前記試験用サンプル中に存在する1以上のバイオマーカーの濃度を決定する工程であって、前記1以上のバイオマーカーは、高移動度グループタンパク質B1(HMGB1)、HMGB1の発現及び/又は調節に関連付けられるメッセンジャーRNA(HMGB1 mRNA)、HMGB1の発現及び/又は調節に関連付けられるマイクロRNA(HMGB1 miRNA)、及びこれらの組合せから選択される工程と、
e.(d)の前記バイオマーカーの濃度を対照と比較する工程と、
f.前記試験用サンプル中に存在するHMGB1の濃度がHMGB1の濃度の増加に対応せず、HMGB1 mRNAの濃度がHMGB1 mRNAの転写における下方制御に対応し、並びに/若しくはHMGB1 miRNAの濃度がHMGB1 miRNAの上方制御に対応する場合に、皮膚色調剤としての前記試験薬を特定する工程と、
g.前記皮膚色調剤の有効量を皮膚科学的に許容可能な担体に組み込む工程と、を含む、方法。 - 前記細胞は、ケラチン産生細胞、線維芽細胞、及びマクロファージからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記試験用サンプル中の前記細胞の少なくとも一部を化学的に溶解させ、前記試験用サンプルの総タンパク質濃度を決定し、前記試験用サンプル中に存在するHMGB1の濃度を前記総タンパク質濃度に対して正規化させる、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記試験用サンプル中の前記細胞の少なくとも一部を化学的に溶解させ、HMGB1 mRNA又はHMGB1 miRNAを分離し、標識化し、マイクロアレイに対してハイブリダイゼーションする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試験薬を第2の媒質に希釈する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試験薬を0.0001%〜10% w/vの濃度に希釈する、請求項5に記載の方法。
- 前記対照が、前記試験用サンプルと同種の細胞を含む細胞懸濁液である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対照が可溶化剤を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記可溶化剤がジメチルスルホキシドである、請求項8に記載の方法。
- 前記組成物に、軟化剤、保湿剤、ビタミン、ペプチド、糖アミン、日焼け止め活性剤、紫外線吸収剤、着色剤、界面活性剤、フィルム形成組成物、レオロジー変性剤、及びこれらの組合せから選択される少なくとも1つの追加成分を組み込むことを更に含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 色素過剰スポットの外観を改善する方法であって、
a.色素過剰スポットを含む皮膚の対象部を特定する工程と、
b.皮膚の前記対象部に請求項1に記載された組成物を、前記皮膚色調剤にとって十分な期間塗布して、皮膚の前記対象部に存在するメラニン産生細胞のHMGB1の刺激を阻害することにより、前記色素過剰スポットの外観を改善することと、を含む、方法。 - 外観の改善は、前記色素過剰スポットの大きさを小さくすること、前記色素過剰スポットの美白化、又は前記色素過剰スポットのメラニン量の減少のうち少なくとも1つに対応する、請求項11に記載の方法。
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