CN116426644A - 用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分真实性的引物探针组、试剂盒及方法 - Google Patents
用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分真实性的引物探针组、试剂盒及方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116426644A CN116426644A CN202211094478.6A CN202211094478A CN116426644A CN 116426644 A CN116426644 A CN 116426644A CN 202211094478 A CN202211094478 A CN 202211094478A CN 116426644 A CN116426644 A CN 116426644A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fugu
- probe
- primer
- authenticity
- base
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 79
- 241001441723 Takifugu Species 0.000 title claims abstract description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 241001627955 Tetraodon lineatus Species 0.000 title claims description 17
- 241000980706 Takifugu obscurus Species 0.000 claims abstract description 39
- CFMYXEVWODSLAX-QOZOJKKESA-N tetrodotoxin Chemical compound O([C@@]([C@H]1O)(O)O[C@H]2[C@@]3(O)CO)[C@H]3[C@@H](O)[C@]11[C@H]2[C@@H](O)N=C(N)N1 CFMYXEVWODSLAX-QOZOJKKESA-N 0.000 claims abstract description 25
- 229950010357 tetrodotoxin Drugs 0.000 claims abstract description 25
- CFMYXEVWODSLAX-UHFFFAOYSA-N tetrodotoxin Natural products C12C(O)NC(=N)NC2(C2O)C(O)C3C(CO)(O)C1OC2(O)O3 CFMYXEVWODSLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 36
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 35
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 35
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- 241001441722 Takifugu rubripes Species 0.000 claims description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims 5
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 29
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 13
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 11
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 54
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 31
- 241000894007 species Species 0.000 description 31
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 101150087323 COI gene Proteins 0.000 description 9
- 238000013461 design Methods 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 4
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 4
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 2
- 108050008072 Cytochrome c oxidase subunit IV Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 1
- 101150001086 COB gene Proteins 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000006162 Chenopodium quinoa Species 0.000 description 1
- 108050004212 Cytochrome c oxidase subunit I Proteins 0.000 description 1
- 102000015884 Cytochrome c oxidase subunit I Human genes 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150053771 MT-CYB gene Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000269907 Pleuronectes platessa Species 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 235000020235 chia seed Nutrition 0.000 description 1
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 101150006264 ctb-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000013332 fish product Nutrition 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000002705 metabolomic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001431 metabolomic effect Effects 0.000 description 1
- 101150088166 mt:Cyt-b gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- -1 pplication Species 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000013026 undiluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物检测技术领域，公开了用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分真实性的引物探针组、试剂盒及方法，包括黑腮兔头鲀、兔头鲀、暗鳍兔头鲀、月尾兔头鲀、棕斑兔头鲀的引物和探针、试剂盒及应用。该引物组可特异、灵敏扩增兔头鲀属河鲀鱼成分，该检测方法特异性好、灵敏度高、稳健性好，可以对食品中掺杂着含量低至0.1％的兔头鲀属河鲀鱼成分加以鉴别出来，保障了经认证授权养殖可食用河鲀鱼的食品真实性。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分真实性的引物探针组、试剂盒及方法。
背景技术
河鲀(pufferfish)泛指硬骨鱼纲、鲀形目、鲀科的各属鱼类。其肉味鲜美、营养丰富，被誉为“菜肴之冠”，但其卵巢、肝脏、肾脏、眼睛、血液中含有剧毒的河豚毒素，处理不当或误食，轻者中毒，重者丧命。此外，在兔头鲀属中有若干种河鲀鱼种类的肌肉也含有河豚毒素，有的甚至有剧毒，不管是被加工制造成鱼干或直接烹食，中毒事件时有所闻。快速增长的高档水产品趋势导致需求增加，助长了欺诈行为，例如错误贴标签和用非认证养殖的野生河鲀鱼产品替代。除了故意欺诈之外，由于河鲀鱼形态特征非常相似，没有经验的消费者在形态学上很难正确识别，特别是经过加工后出售的食品已无法从形态上加以识别。
然而，加工食品通常已经被破坏了形态特征，已无法从形态上有效识别。因此，近几年，人们进行了大量的基于组学的食品真实性鉴别技术研究，包括基因组学、蛋白质组学、代谢组学等分析，以评估食品真实性。基于TaqMan的实时定量聚合酶链式反应(qPCR)在食品真实性鉴别中发挥了重要作用。该方法非常灵敏和特异。此类方法已成功开发用于受欺诈影响的不同材料，例如用于检测杏仁糖中的桃仁，用于检测所谓的“超级食品”奇亚籽和藜麦。以DNA为基础的分子生物学方法仍被认为是食品真实性鉴别中最有效的方法。根据基因进化特点选择合适的靶基因，可实现对物种、同一种物种不同品系的精细区分。
现有技术中未见有效、准确、快速地检测兔头鲀属河鲀鱼成分真实性的方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于TaqMan探针的实时 PCR用于检测食品中兔头鲀属河鲀鱼成分，包括黑腮兔头鲀、兔头鲀、暗鳍兔头鲀、月尾兔头鲀、棕斑兔头鲀的引物和探针、试剂盒及应用。该引物组可特异、灵敏扩增兔头鲀属河鲀鱼成分，该检测方法特异性好、灵敏度高、稳健性好，可以对食品中掺杂着含量低至0.1％的兔头鲀属河鲀鱼成分加以鉴别出来，保障了经认证授权养殖可食用河鲀鱼的食品真实性。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：
用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分真实性的引物探针组，所述兔头鲀属河鲀鱼，包括黑腮兔头鲀、兔头鲀、暗鳍兔头鲀、月尾兔头鲀、棕斑兔头鲀，所述引物和探针序列如表1所示。
表1本发明中使用的引物和探针
用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分真实性的试剂盒，该试剂盒包括如上所述的引物对和探针，在探针的5’端和3’端分别标记报告基团和淬灭基团。
如上所述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括酶混合物Probe qPCR Mix，型号为Code391A，由TaKaRa Co.,Ltd.公司生产；1μL浓度为 0.4pmol/μL的正向引物；1μL浓度为0.4pmol/μL的反向引物；1μL浓度为 0.4pmol/μL的探针。
用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分真实性的方法，包括如下步骤：
S1、从样品中提取DNA；
S2、对步骤S1提取的所述DNA进行实时荧光qPCR扩增；其中，在反应体系中，采用如上所述的用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分的引物和探针组；
S3、结果判定：
若有“S”型荧光信号扩增曲线，Ct值<35，则判断为阳性；
若无“S”型荧光信号扩增曲线，无Ct值或Ct值>45则判断为阴性；
若Ct值在35-45之间，建议重复实验，若Ct值<45，荧光信号扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。
如上所述的检测方法，优选地，在步骤S2中，探针的5’端和3’端分别标记FAM为报告基团，标记BHQ为淬灭基团。
如上所述的检测方法，优选地，在步骤S2中，所述实时荧光qPCR 的反应体系包括16μL酶混合物Probe qPCRMix，型号为Code391A，由 TaKaRa Co.,Ltd.公司生产；1μL浓度为0.4pmol/μL的正向引物；1μL浓度为0.4pmol/μL的反向引物；1μL浓度为0.4pmol/μ的探针；2μL待测样品 DNA；4μL H2O。
如上所述的检测方法，优选地，在步骤S2中，实时荧光qPCR扩增的程序包括95℃30s，1个循环；95℃5s，60℃30s，45个循环；在60℃时收集FAM荧光信号。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供的用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分实时荧光qPCR扩增的引物和探针组，可灵敏、特异性的有效用于快速检测兔头鲀属河鲀鱼成分，兔头鲀属河鲀鱼主要包括包括黑腮兔头鲀、兔头鲀、暗鳍兔头鲀、月尾兔头鲀、棕斑兔头鲀，能有效避免假阴性，提高检测的准确性，大大降低了漏检、错检的风险。
本发明提供的试剂盒灵敏度高、特异性强、稳健性好、可以快速扩增兔头鲀属河鲀鱼成分，具有广阔的应用前景。
本发明提供的检测方法操作简单，快速准确，特异性好，灵敏度高，稳健性好，不会存在假阳性或假阴性及漏检的可能性，适合规模性推广和应用。
附图说明
图1是针对黑腮兔头鲀和兔头鲀(A)、暗鳍兔头鲀(B)、月尾兔头鲀(C)、棕斑兔头鲀(D)特异性qPCR方法开发的不同河鲀鱼物种的COI基因区域的一段排列，每个种类引物和探针的位置和方向分别用浅灰色和深灰色方框表示；差异碱基用加黑加粗表示。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
实施例1：兔头鲀属河鲀鱼成分，包括黑腮兔头鲀、兔头鲀、暗鳍兔头鲀、月尾兔头鲀、棕斑兔头鲀实时荧光qPCR扩增的引物和探针组设计及筛选
1.序列检索和分析。从美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中检索河鲀鱼物种线粒体cds区域的细胞色素氧化酶I亚单位(COI)基因序列。此序列用作blast搜索中的模板。此外，还检索了用于排他性测试的其他物种的DNA序列。使用MEGA 4.0对DNA序列进行比对。该比对用于识别具有高变异性的DNA片段，分析引物和探针的特异性，确保理论上该引物探针不能扩增出相近物种的基因。所用DNA序列的登录号如表2所示。
表2用于实时qPCR分析的COI基因序列的登录号
2.qPCR引物和探针设计。对目标物种的细胞色素氧化酶I亚单位 (COI)基因序列和特别相关的物种(例如常见的东方鲀属的河鲀鱼物种) 的DNA序列进行排列，并筛选出碱基差异最大的基因片段。引物的3′端被放置在目标物种和相关物种显示不同核苷酸的位置，确保目标物种特异性。
将用于设计引物选择的核苷酸序列导入"Oligocalc"程序，并根据产生的“salt-adjusted”退火温度对长度进行优化。采用“salt-adjusted”算法计算的退火温度作为qPCR的起始值。四种qPCR方法使用TaqMan探针，在探针的5′端用6-FAM标记，在3′端用淬灭染料BHQ1标记。考虑食品加工过程对DNA质量有很大影响，为了提高实时qPCR分析中的扩增效率，因此，在四种qPCR方法中，设计的引物对扩增的DNA片段比较短，黑腮兔头鲀和兔头鲀为196bp，暗鳍兔头鲀为174bp，月尾兔头鲀为150bp，棕斑兔头鲀为173bp。此外，使用通用的18SrRNA基因的引物和探针作为内参照，用于检测所有样品材料DNA，确保没有抑制性污染物。表3列出了本发明中使用的所有引物和探针的序列。所有引物和探针由宝生物工程 (大连)有限公司合成。
表3本发明中使用的引物和探针
3.引物和探针的设计结果
选择线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因的DNA片段作为河鲀鱼物种实时qPCR方法开发的靶标。这个COI基因区域的碱基序列在物种间遗传变异较大，而在种内遗传变异较小，相对稳定，具有高度的鉴别能力，已被广泛用于鱼类物种鉴别。我们检索了NCBI中几乎所有的兔头鲀属(包括黑腮兔头鲀、兔头鲀、暗鳍兔头鲀、月尾兔头鲀、棕斑兔头鲀)(表2)。在NCBI中有18个登录号的黑腮兔头鲀COI基因序列，9个登录号的兔头鲀COI基因序列，这两种物种的COI基因同源性为100％。此外，在NCBI中有15个登录号的暗鳍兔头鲀、19个登录号的月尾兔头鲀、 41个登录号的棕斑兔头鲀，他们均具有碱基序列的差异，可以实现每个物种的鉴定。兔头鲀5种河鲀鱼种类和东方鲀属8种河鲀鱼种类的DNA序列进行比对(图1A～图1D)，搜索能够区分兔头鲀5种河鲀鱼物种和其他物种DNA序列的引物序列。所分析的引物分别能够排除其他河鲀鱼物种。值得关注的是，在NCBI中有3个登录号的虫纹东方鲀COI基因序列，与黑腮兔头鲀、兔头鲀的COI基因同源性为100％，依据COI基因序列无法区分该3个物种。有报道虫纹东方鲀在16S rRNA、Cytb基因及COI基因的DNA片段序列的同源性聚类分析结果，都与兔头鲀属归为一组，其同源性达99％～100％。
实施例2：引物组的特异性扩增验证
1.特异性和交叉反应性验证。通过qPCR分析评估检测方法的特异性和交叉反应性。使用13种密切相关的不同的河鲀鱼物种及9种其他不相关的鱼类物种获得的未稀释的样品材料DNA。每个物种DNA分析重复测试不少于3次。用于测试的所有样品DNA均采用内参照18SrRNA的引物和探针检测过，确保没有抑制性物质。
2.引物探针组的特异性扩增验证结果。为了确定方法的特异性，使用目标样品材料(包括黑腮兔头鲀、兔头鲀、暗鳍兔头鲀、月尾兔头鲀、棕斑兔头鲀)和非目标样品材料的DNA进行了分析。为了排除DNA制备中可能存在的抑制作用，在进行特异性检测之前，使用内参照18SrRNA引物探针对样品材料进行qPCR分析，所有测试的目标和非目标动物物种均成功扩增(表4)，从而证实了所有样品材料DNA对qPCR分析的适用性。使用来自13种不同河鲀鱼物种及9种其他鱼类物种的DNA样品测试了特异性(表4)。在黑腮兔头鲀、兔头鲀qPCR检测方法中，可以同时检测出该两个河鲀鱼物种，除虫纹东方鲀出现交叉反应性，在其余被检测样品中没有检测到假阳性信号。通过特异性试验结果也验证了黑腮兔头鲀、兔头鲀和虫纹东方鲀的COI基因序列同源性一致，说明虫纹东方鲀种类的属分类需要进一步探索。此外，在暗鳍兔头鲀、月尾兔头鲀、棕斑兔头鲀的各自qPCR 检测方法中，非目标样品材料DNA均未出现交叉反应性，没有检测到假阳性信号。这些qPCR分析结果证实了检测方法的准确性和特异性。
表4 qPCR结果特异性分析
实施例3：实时荧光qPCR扩增检测扩增效率试验
1.扩增效率(E)验证试验。
为了计算qPCR的扩增效率，使用黑腮兔头鲀、兔头鲀、暗鳍兔头鲀、月尾兔头鲀、棕斑兔头鲀样品DNA，制备8个系列稀释水平，包括：100， 50，20，10，5，2，1和0.1％(以百分比为单位)。每个稀释水平进行3 次重复测试。将每个稀释水平获得的平均Ct值与DNA浓度作图，并进行线性回归分析。使用回归线的斜率，用公式E＝100(10-1/斜率-1)计算qPCR效率，并以百分比表示。对于每个目标，回归曲线的斜率应在-3.9和-2.9之间，对应的PCR效率范围应为80％到120％。同时，线性曲线的相关系数R2，这是衡量PCR反应线性度的一个指标。每个目标的R2应该≥0.98。
3.扩增效率(E)和相关系数(R2)验证结果。
这四种方法的qPCR效率都是分别通过对兔头鲀属5种河鲀鱼种类样品 DNA(包括黑腮兔头鲀、兔头鲀、暗鳍兔头鲀、月尾兔头鲀、棕斑兔头鲀) 的8个连续稀释水平(m＝8)，每个稀释水平至少3次重复测试(n＝3)进行 qPCR分析，将阈值循环值(Ct值)与DNA浓度(以pg/μl为单位)进行绘制线性回归曲线计算出来的。根据方程E＝100(10-1/斜率-1)，将分析效率确定为回归线的斜率，显示了Ct值与DNA浓度之间有很好的线性关系，这些 qPCR方法的相关系数R2为0.9808～0.9903，回归曲线的斜率为-3.824～-3.228，效率E为82.60％～104.07％(表5)。这些结果符合通用qPCR验证指南的规格，要求相关系数R2≥0.98，回归曲线的斜率应为从-3.9到-2.9之间，效率E 为80-120％。
表5兔头鲀属5种河鲀鱼物种qPCR检测方法的扩增效率(E)和相关系数 (R2)a
实施例4：实时荧光qPCR扩增检测灵敏度试验
1.灵敏度试验
检出限(LOD)是根据公认的指南通过实验确定的。为此，从黑腮兔头鲀、兔头鲀、暗鳍兔头鲀、月尾兔头鲀、棕斑兔头鲀的鱼肉组织中分别提取DNA，采用从鲽鱼鱼片中提取的背景DNA进行8个系列的连续稀释，以模拟真实样品进行qPCR分析，确定LOD。8个稀释系列涵盖范围包括： 100、50、20、10、5、2、1和0.1％(以百分比为单位)。qPCR方法的LOD6是通过实验确定的，即对连续稀释的每个稀释点进行6个重复分析，每个重复分析在可重复性条件下进行三次运行，导致每个稀释点总共有18个结果。最低稀释水平的所有18个重复结果都给出了阳性和特异性扩增，可被视为LOD6。qPCR方法的分析灵敏度LOD95％是通过实验确定的。即使用对应的LOD6水平以及高一个稀释水平和低稀释水平，每个水平进行60次重复测试。所有60次重复都显示出特异性阳性扩增的最低稀释水平被认为是LOD95％，置信度为95％。LOD95％是采用半对数回归分析计算的，输入qPCR 中样品材料的相应数量、重复次数和阳性结果的数量。
2.灵敏度结果
qPCR方法的灵敏度是一个需要评估的重要参数，特别是考虑到未经授权认证公司养殖的野生河鲀鱼不允许食用的规定以及检测可能存在着低含量的物种。本发明采用LOD6和LOD95％两种类型的检测限(LOD)来表示qPCR方法的灵敏度。它是通过在各自的检测中测量五种河鲀鱼样品 DNA的连续稀释水平来确定的。分析结果显示(表6)，黑腮兔头鲀和兔头鲀方法的灵敏度LOD6为37.24pg和32.90pg；LOD95％为40.83pg (17.31-233.44pg,95％CI)和45.64pg(19.25-265.22pg,95％CI)。暗鳍兔头鲀、月尾兔头鲀、棕斑兔头鲀的LOD6分别为35.99pg，33.91pg和32.85pg， LOD95％均能达到34.79pg(14.70-207.20pg,95％CI)、32.78pg(13.85-195.23 pg,95％CI)、31.76pg(13.41-189.13pg,95％CI)，均具有很高的灵敏度。这种高灵敏度表明，当在水产品中含有0.1％的少量未经认证养殖的野生河鲀鱼材料，便可以可靠地进行真实性鉴别及追踪。
表6兔头鲀属5种河鲀鱼物种qPCR检测方法的LOD6和LOD95％
实施例5：实时荧光qPCR扩增检测稳健性试验
1.稳健性试验
通过改变qPCR反应的几个参数来检查黑腮兔头鲀、兔头鲀、暗鳍兔头鲀、月尾兔头鲀、棕斑兔头鲀分析的稳健性，例如qPCR仪器(CFX96实时荧光定量PCR仪，Bio-Rad公司)，qPCR试剂(GoTaq qPCR Master Mix， CodeA6101，Promega公司)，引物和探针的浓度(±25％)，PCR退火温度(±1℃)。使用正交设计评估参数变化(表7)。在每个组合中，使用4 倍LOD6量的模板，每个分析重复测试至少3次。采用SPSS软件回归分析，使用Kruskal-WallisH检验评估每个方法正交设计组合获得的结果差异显著性水平，当统计学中的p>0.05时表示结果无显著性差异。
表7作为正交设计的稳健性实验的条件a
2.稳健性试验结果
为了评估qPCR方法的稳健性，我们使用正交设计，稍微改变了比较重要的不同实验条件，包括不同的qPCR仪器、qPCR试剂、引物和探针浓度以及PCR退火温度的轻微偏差，使用5％的样品DNA模板，研究其对结果稳定性的影响。在每个方法的正交设计组合中，兔头鲀属五种河鲀鱼物种检测方法的Ct值均无显著性差异(表8)。黑腮兔头鲀的Ct值为29.84±0.43 (p＝0.692),兔头鲀的Ct值为30.23±0.20(p＝0.063),暗鳍兔头鲀的Ct值为 28.33±0.34(p＝0.433),月尾兔头鲀的Ct值为28.59±0.20(p＝0.291),棕斑兔头鲀的Ct值为28.61±0.24(p＝0.564)。从这些结果可以得出结论，每组方法 Ct值的统计学p值满足p>0.05，这些qPCR方法是稳定的，可转移到其他实验室以及在常规分析中使用。
表8稳健性实验结果
实施例6：兔头鲀属河鲀鱼成分真实性检测的实时荧光qPCR检测试剂盒及应用
1.方法提要
提取样品DNA，以DNA为模板，分别采用兔头鲀属4种河鲀鱼成分的特异性引物和探针进行实时荧光PCR检测，观察实时荧光PCR的荧光信号扩增曲线增幅现象，进行常见鱼类及加工食品中4种兔头鲀属河鲀鱼源性成分的真实性检测。
2.该试剂盒的组成
该试剂盒的组成配方：每次检测在25μL反应体积中进行，其中，2μL 是所提取的样品DNA，23μL为本发明试剂盒反应液。反应液中含有16μL 酶混合物Probe qPCR Mix(Code391A,TaKaRa Co.,Ltd.)，所述的正向引物 1μL(0.4pmol/μL)，反向引物1μL(0.4pmol/μL)，探针1μL(0.4pmol/μL)，4μL H2O。
3.检测时所需要的器材
设备：实时荧光定量PCR仪；移液器(量程0.1-200μL)。
4.试剂盒的应用方法
4.1样品处理及DNA提取
称取研磨后的300mg样品于2mL离心管中，加入1.5mL CTAB缓冲液和10μL蛋白酶K，振荡混匀，65℃30min，期间每隔10min振荡混匀； 2000r/min离心5min，吸取上清液至一个新离心管中，加400μL三氯甲烷：异戊醇(24：1)，充分混匀；12000r/min离心5min，吸取上清液另一个新离心管中，加入0.8倍体积异丙醇，室温下沉淀1～2h；12000r/min离心10min，弃上清液；70％乙醇洗涤一次，晾干；加入50μL TE，溶解DNA 沉淀，于-20℃保存备用。也可以使用商业化的DNA提取试剂盒。这些都是常规的样品处理及DNA提取步骤。
4.2操作步骤
每次扩增在25μL反应体积中进行，反应体积中含有16μL酶混合物 Probe qPCRMix(Code391A,TaKaRa Co.,Ltd.)，如表3所属的正向引物 1μL(0.4pmol/μL)，反向引物1μL(0.4pmol/μL)，探针1μL(0.4pmol/μL)，2μL 模板DNA。qPCR的优化热循环方案包括95℃30s，1个循环；95℃5s， 60℃30s，45个循环；在60℃时收集FAM荧光信号。
结果判定：根据有无“S”型荧光信号扩增曲线判定结果。当无“S”型荧光信号扩增曲线，即无Ct值或Ct值>45，可报告为阴性，表示为“未检出暗鳍兔头鲀(或月尾兔头鲀、棕斑兔头鲀、黑腮兔头鲀)河鲀鱼源性成分”；当出现“S”型荧光信号扩增曲线，即Ct值<45，可报告为阳性，表示为“检出暗鳍兔头鲀(或月尾兔头鲀、棕斑兔头鲀、黑腮兔头鲀)河鲀鱼源性成分”。
上述实施例只是用于对本发明的举例和说明，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明不局限于上述实施例，根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围内。
Claims (10)
1.用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分真实性的引物探针组，兔头鲀属河鲀鱼包括黑腮兔头鲀、兔头鲀、暗鳍兔头鲀、月尾兔头鲀、棕斑兔头鲀，其特征在于，所述黑腮兔头鲀和兔头鲀的正向引物的序列为GAGGACGATGTCTAGTGA，位置在第254个碱基至第271个碱基之间；反向引物的序列为AGCCTATTTTACCTCTGC，位置在第431个碱基至第449个碱基之间；探针的序列为FAM-TGCCATTCCCACGGGTGTAA-BHQ1，位置在第399个碱基至第419个碱基之间。
2.如权利要求1所述的用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分真实性的引物探针组，其特征在于，所述暗鳍兔头鲀的正向引物的序列为CCCAAGAACATAACCATAA，位置在第96个碱基至第114个碱基之间；反向引物的序列为CCTAGATATTGTCCTTCATG，位置在第249个碱基至第269个碱基之间；探针的序列为FAM-TGCTCACTTCCACAATGTCCTCT-BHQ1，位置在第211个碱基至第233个碱基之间。
3.如权利要求1所述的用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分真实性的引物探针组，其特征在于，所述月尾兔头鲀的正向引物的序列为GGAAGAAGGTTAGGTTGA，位置在第76个碱基至第93个碱基之间；位置在第206个碱基至第225个碱基之间；位置在第174个碱基至第195个碱基之间。
4.如权利要求1所述的用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分真实性的引物探针组，其特征在于，所述棕斑兔头鲀的正向引物的序列为CGTCTATACCAACAGTGA，位置在第450个碱基至第467个碱基之间；位置在第611个碱基至第632个碱基之间；位置在第491个碱基至第516个碱基之间。
5.用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分真实性的试剂盒，其特征在于，试剂盒包括如权利要求1-4任意一项权利要求所述的引物对和探针，在探针的5’端和3’端分别标记报告基团和淬灭基团。
6.如权利要求5所述的用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分真实性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶混合物Probe qPCR Mix，型号为Code391A，由TaKaRa Co.,Ltd.公司生产；1μL浓度为0.4pmol/μL的正向引物；1μL浓度为0.4pmol/μL的反向引物；1μL浓度为0.4pmol/μL的探针。
7.用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分真实性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、从样品中提取DNA；
S2、对步骤S1提取的所述DNA进行实时荧光qPCR扩增；其中，在反应体系中，采用如权利要求1-4任意一项权利要求所述的用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分的引物和探针组；
S3、结果判定：
若有“S”型荧光信号扩增曲线，Ct值<35，则判断为阳性；
若无“S”型荧光信号扩增曲线，无Ct值或Ct值>45则判断为阴性；
若Ct值在35-45之间，建议重复实验，若Ct值<45，荧光信号扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。
8.如权利要求7所述的用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分真实性的方法，其特征在于，在步骤S2中，探针的5’端和3’端分别标记FAM为报告基团，标记BHQ为淬灭基团。
9.如权利要求7所述的用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分真实性的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述实时荧光qPCR的反应体系包括16μL酶混合物Probe qPCR Mix，型号为Code391A，由TaKaRa Co.,Ltd.公司生产；1μL浓度为0.4pmol/μL的正向引物；1μL浓度为0.4pmol/μL的反向引物；1μL浓度为0.4pmol/μ的探针；2μL待测样品DNA；4μL H2O。
10.如权利要求7所述的用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分真实性的方法，其特征在于，在步骤S2中，实时荧光qPCR扩增的程序包括95℃30s，1个循环；95℃5s，60℃30s，45个循环；在60℃时收集FAM荧光信号。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211094478.6A CN116426644A (zh) | 2022-09-08 | 2022-09-08 | 用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分真实性的引物探针组、试剂盒及方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211094478.6A CN116426644A (zh) | 2022-09-08 | 2022-09-08 | 用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分真实性的引物探针组、试剂盒及方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116426644A true CN116426644A (zh) | 2023-07-14 |
Family
ID=87080246
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211094478.6A Pending CN116426644A (zh) | 2022-09-08 | 2022-09-08 | 用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分真实性的引物探针组、试剂盒及方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116426644A (zh) |
-
2022
- 2022-09-08 CN CN202211094478.6A patent/CN116426644A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101318311B1 (ko) | 식품 중의 돼지고기 함량을 확인하는 방법 | |
| Ning et al. | Different influences of DNA purity indices and quantity on PCR-based DGGE and functional gene microarray in soil microbial community study | |
| EP2078756A1 (en) | Detection of bacterium by utilizing dnaj gene and use thereof | |
| KR101883117B1 (ko) | 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 snp 마커 | |
| CN113881789A (zh) | 用于检测隐球菌的探针及引物对组合物及检测方法和应用 | |
| CN110066880A (zh) | 一种快速定性检测四大家鱼鱼肉制品的方法 | |
| CN106434959A (zh) | 一种食品及饲料中鸡源成分快速检测试剂盒及其应用 | |
| CN103031382A (zh) | 食品及饲料中貂源性成分实时荧光pcr检测方法 | |
| Fu et al. | Rapid and quantitative detection of Leifsonia xyli subsp. xyli in sugarcane stalk juice using a real‐time fluorescent (TaqMan) PCR assay | |
| CN101768640B (zh) | 河豚鱼成分荧光定量pcr检测试剂及其制备方法和应用 | |
| CN116426644A (zh) | 用于检测兔头鲀属河鲀鱼成分真实性的引物探针组、试剂盒及方法 | |
| CN115786541B (zh) | 鉴别布鲁氏菌疫苗株a19的snp分子标记、引物探针、试剂盒、方法和应用 | |
| CN110846424A (zh) | 出入境口岸微生物的快速检验检疫方法 | |
| CA2476581C (en) | Wheat detecting method | |
| Kuo et al. | Identification of ingredient in mullet roe products by the real-time PCR method | |
| JP5546165B2 (ja) | 非ジャポニカ種ウナギ検出に利用可能なプライマーセット、非ジャポニカ種ウナギ混入の検査方法およびウナギ種同定方法 | |
| CN109022597B (zh) | 用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的snp分子标记及其应用 | |
| KR102212379B1 (ko) | 포도에서 발생하는 3종의 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 바이러스 검출 방법 | |
| US10450618B2 (en) | Method for identifying variety of hop | |
| CN111394497B (zh) | 用于检测大麦成分的特异性引物、探针、试剂盒及方法 | |
| CN115323060B (zh) | 一种鱼类核基因分子标记引物、分子标记及分子标记数据库 | |
| CN114369678B (zh) | 一种检测甜菜转基因成分和转基因品系的引物组合、试剂盒、检测方法及应用 | |
| CN112111580B (zh) | 青峪猪源性成分的鉴别方法 | |
| CN114369675B (zh) | 一种检测马铃薯转基因成分和转基因品系的引物组合、试剂盒、检测方法及应用 | |
| CN116411114A (zh) | 用于检测食品中鹰嘴豆源性成分真实性的核酸组、试剂盒及方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |