CN116425995B - 一种金属有机框架材料及其配体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金属有机框架材料及其配体和应用，属于生物传感器技术领域。本发明制备了一种配体结构，并将其应用于新型金属有机框架材料的合成，该MOF材料可作为制备PEC传感器的原料使用，经测试使用该金属有机框架材料制备的PEC传感器对VEGF165的检测具有较高的选择性和高灵敏度，线性范围为10~1×108 fM，最低检测限值为0.18 fM。而且对于α‑胎蛋白（AFP）和癌胚抗原（CEA）两种干扰物质的响应电流值只是轻微的变化，是目前金属有机框架材料在VEGF165检测的相关报道中灵敏度最高，抗干扰性最好的PEC传感器材料。
Description
技术领域
本发明涉及一种金属有机框架材料及其配体和应用，属于生物传感器技术领域。
背景技术
肿瘤的血管生成是肿瘤细胞生长、增殖和转移所必需的，而血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）作为血管生成的关键调节因子，可以有效反映肿瘤的发生和发展情况，所以通过测量血清中VEGF的含量，可以达到肿瘤早期筛查的目的。VEGF165作为VEGF的亚型之一，经常在癌细胞中过表达，影响淋巴管生成和肿瘤转移，导致癌细胞异常快速生长和分裂。因此，探索一种高度准确、敏感的VEGF165检测方法对肿瘤的临床诊断具有重要意义。常见的检测方法有酶联免疫吸附法、免疫组化法、荧光光谱法等，但是这些方法面临检测成本高，操作复杂等问题，而光电化学生物传感器凭借着具有低成本、快速读取和操作简单等优势，已然成为VEGF165检测的强力候选者。
光电化学（Photoelectrochemical,PEC）生物传感器作为一种新兴的生物标志物检测技术，继承了电化学生物传感器独特的性质，具有激发源和检测信号完全分离的特点，并以光源作为激发信号，利用处于激发态的半导体光电材料与待测物之间发生的电子传递，来达到对待测物的定性或定量分析的。但是由于早期的PEC传感器灵敏度低，抗干扰性差，使得PEC传感器的发展受到一定限制。因此，开发灵敏度更高、抗干扰力更强的PEC生物传感器是十分必要的。
发明内容
本发明为了解决现有PEC传感器灵敏度低，抗干扰性差的问题，提供一种对VEGF165具有优异的选择性以及高灵敏度的PEC传感器用金属有机框架材料及其配体。
本发明的技术方案：
本发明的目的之一是提供一种金属有机框架材料，该材料简称为MOF-ET21，化学式为[Nd(L)2]，式中L为C88H82N8O8。
本发明的目的之二是提供一种制备上述金属有机框架材料的配体，该配体的结构为：
。
本发明的目的之三是提供一种上述金属有机框架材料的应用，具体的该金属有机框架材料用于PEC传感器的制备。
进一步限定，该应用方法为：
将cDNA和适配体稀释至2 μM，90℃保存5 min，然后逐渐冷却至37℃，最后，将混合物在37℃下孵育2 h，以形成dsDNA。然后将玻碳电极（GCE）（5 cm × 0.4 cm）依次放入丙酮、乙醇和纯水中超声清洗15 min，后用氮气吹干；接着用氟化密封带固定GCE电极的有效面积为0.16 cm2；将MOF-ET21分散液滴涂到GCE电极表面，并在37 ℃的电加热恒温培养箱中干燥5 h，然后将1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合溶液（EDC/NHS）滴涂在到MOF-ET21/GCE上，并在25℃下活化2 h。经EDC/NSH活化后，将dsDNA涂覆在MOF-ET21/GCE上，在25℃的条件下孵育20 min，MOF-ET21/GCE的羧基与dsDNA的氨基反应，形成dsDNA/MOF-ET21/ GCE。然后将dsDNA/MOF-ET21/GCE浸在0.25 wt%牛血清白蛋白（BSA）中25 min，得到有dsDNA/BSA/MOF-ET21/GCE结构，再将碱性磷酸酶（ALP）添加到dsDNA/BSA/ MOF-ET21/GCE表面，在4℃下放置2 h，通过生物素−链霉亲和素系统获得ALP-dsDNA/BSA/MOF-ET21/GCE，最后ALP-dsDNA/BSA/MOF-ET21/GCE加入到含有三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）缓冲液中，孵育完成后，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）冲洗电极，即成功构建了PEC传感器。
进一步限定，cDNA的序列为：5'-Biotin-AAACCCGTCAACCACTCTTGAGTGCAGGGGGGTTAATCTTT-C6-NH2-3'。
进一步限定，适配体的序列为：5'-GGGACGTGAGACACAGACCTTCTGCCCTTT-3'。
进一步限定，制备得到的PEC传感器用于检测VEGF165。
本发明具有以下有益效果：
本发明制备了一种配体结构，并将其应用于新型金属有机框架材料的合成，该MOF材料可作为制备PEC传感器的原料使用，经测试使用该金属有机框架材料制备的PEC传感器对VEGF165的检测具有较高的选择性和高灵敏度，线性范围为10~1×108fM，最低检测限值为0.18 fM。而且对于α-胎蛋白（AFP）和癌胚抗原（CEA）两种干扰物质的响应电流值只是轻微的变化，是目前金属有机框架材料在VEGF165检测的相关报道中灵敏度最高，抗干扰性最好的PEC传感器材料。此外，本发明提供的金属有机框架材料合成方法还具有工艺简单、条件温和等优点。
附图说明
图1为用于制备金属有机框架材料的配体的合成路线；
图2为实施例1制备的中间体1的1H-NMR谱图；
图3为实施例1制备的中间体1的13C-NMR谱图；
图4为实施例1制备的中间体1的质谱图；
图5为实施例1制备的中间体2的1H-NMR谱图；
图6为实施例1制备的中间体2的13C-NMR谱图；
图7为实施例1制备的中间体2的质谱图；
图8为实施例1制备的配体的1H-NMR谱图；
图9为实施例1制备的配体的13C-NMR谱图；
图10为实施例1制备的配体的质谱图；
图11为实施例1制备的金属有机框架材料MOF-ET21的X射线结构表征图；
图12为实施例1制备的PEC传感器对不同的物质的选择性测试结果图；
图13为实施例1制备的PEC传感器对不同浓度的VEGF165的光电流响应测试结果图；
图14为实施例1制备的PEC传感器对VEGF165测定的校准曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
下述实施例使用的cDNA的序列为：5'-Biotin-AAACCCGTCAACCACTCTTGAGTGCAGGGGGGTTAATCTTT-C6-NH2-3'；适配体的序列为：5'-GGGACGTGAGACACAGACCTTCTGCCCTTT-3'。
下述实施例元素分析使用德国Elementar UNICUBE元素分析仪进行。
实施例1：
本实施例制备金属有机框架材料MOF-ET21的过程如下：
（1）如图1所示，合成配体：
①合成中间体1：
向三口瓶中加入4-甲酰基苯硼酸（7.67 g，51.15 mmol，原料2 CAS：87199-17-5）、碳酸钾（19.67 g，142 mmol）和四(三苯基膦)钯（1.34 g，1.16 mmol），然后在氮气保护的条件下加入151 mL的N,N-二甲基甲酰胺和2-氨基-4-溴苯甲酸甲酯（10.7 g，46.5 mmol，原料1 CAS：135484-83-2），将得到的混合物在80℃下加热搅拌反应20 h，反应结束后，将反应混合物缓慢冷却至25℃，再用二氯甲烷和水萃取，然后将所得到的有机相用硫酸镁干燥，然后以正己烷/二氯甲烷（体积比为3：7）为洗脱剂进行硅胶柱层析，得到12.01 g棕色固体，即为中间体1，收率为92%。
对获得的中间体1进行结构表征：
<1>核磁表征鉴定结果：
氢谱：1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ9.94 (s, 1 H), 8.01(d, 2 H), 7.96(s, 1H), 7.86(d, 2 H), 7.25(d, 1 H), 6.98(d, 1 H), 4.00(s, 3 H), 3.83(s, 2 H)，如图2所示。
碳谱：13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ191.99, 169.05, 150.35, 144.30, 142.68,138.48, 131.32, 128.93, 127.10, 118.65, 116.46, 109.87, 52.08，如图3所示。
<2>质谱表征结果：
ESI(m/z): [M+H]+理论计算 C15H13NO3, 255.27；实际测量 256.15。如图4所示。
<3>元素分析测试结果：
理论计算 C15H13NO3, C, 70.58, H, 5.13, O, 18.80；实际测量 C, 71.32, H,6.01, O, 19.65。
综上可知，获得的中间体1的结构如下：
。
②合成中间体2：
将中间体1（3.06 g，12 mmol）溶解在100 mL丙酸中，将得到的反应混合物氮气脱气20 min，然后在25℃下加热搅拌并逐渐升温至130℃，保温反应6 h，反应结束后，加入3,4-二乙基吡咯（1.48 mg，12 mmol，原料3 CAS：16200-52-5）和2 mL丙酸，在黑暗中搅拌反应12 h。反应结束后，将反应溶液缓慢冷却至25℃，过滤收集红色固体，将粗产物以二氯甲烷为洗脱剂进行硅胶柱层析纯化，得到1.19 g固体，即为中间体2，收率为26%。
对获得的中间体2进行结构表征：
<1>核磁表征鉴定结果：
氢谱：1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ8.72 (s, 1 H), 8.21(s, 1 H), 8.02(m, 4H), 7.63(m, 16 H), 7.21(m, 4 H), 7.02(m, 4 H), 4.02(s, 12 H), 3.80(s, 8 H),2.69(s, 8 H), 2.06(m, 8 H), 1.26(m, 6 H), 1.18(m, 18 H)，如图5所示。
碳谱：13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ169.05, 165.08, 156.58, 150.35, 146.39,144.30, 140.46, 138.36, 138.15, 136.85, 136.35, 135.84, 132.97, 128.89,127.70, 127.10, 118.65, 116.46, 113.87, 112.09, 109.87, 52.08, 18.58, 18.54,14.62, 14.21，如图6所示。
<2>质谱表征结果：
ESI(m/z): [M+H]+理论计算 C92H90N8O8, 1435.78；实际测量 1436.67。如图7所示。
<3>元素分析测试结果：
理论计算 C92H90N8O8, C, 76.96, H, 6.32, O, 8.91；实际测量 C, 77.85, H,7.23, O, 9.77。
综上可知，获得的中间体2的结构如下：
。
③合成配体：
将中间体2（0.43 g，0.3 mmol）溶解在120 mL四氢呋喃和甲醇（体积比为2：1）混合溶剂中，并向其中加入氢氧化钾（8.0 g，142.9 mmol）和32 mL水，然后将反应混合物回流12h，反应结束后，将反应溶液冷却至25℃，旋转蒸发去除有机溶剂，再用50 mL水稀释所得反应混合物，用醋酸酸化至pH值为4，过滤收集紫色固体，然后用水洗涤3次，每次100 mL，最后将紫色固体在真空中干燥，得到0.26 g固体，即为配体，收率为62%。
对获得的配体进行结构表征：
<1>核磁表征鉴定结果：
氢谱：1H NMR (400 MHz, DMSO):δ8.26 (m, 4H), 7.68 (m, 8H), 7.61 (m,8H), 7.35 (m, 4H), 7.21 (m, 4H), 5.25 (s, 8H), 2.55 (m, 8H), 1.97 (m, 8H),1.17 (m, 6H), 1.11 (m, 6H), 1.04 (m, 12H)，如图8所示。
碳谱：13C NMR (100 MHz, DMSO):δ170.77 , 165.08 , 156.58, 147.22 ,146.39, 143.96, 140.46 , 138.36 , 138.15, 136.85, 136.35, 135.84, 132.97 ,128.89, 128.04, 127.70, 118.98, 114.25, 113.87, 112.09, 111.84, 18.56, 14.62,14.21，如图9所示。
<2>质谱表征结果：
ESI(m/z): [M+H]+理论计算 C88H82N8O8, 1379.67；实际测量 1380.59。如图10所示。
<3>元素分析测试结果：
理论计算 C88H82N8O8, C, 76.61, H, 5.99, O, 9.28；实际测量 C, 77.57, H,6.77, O, 9.97。
综上可知，获得的配体的结构如下：
。
（2）合成金属有机框架材料MOF-ET21：
将配体（0.26 g，0.30 mmol）溶解在30 mL N,N-二甲基甲酰胺、8 mL乙醇和14 μL三乙胺的混合物中，然后将反应混合物加热至120℃，并向其中加入10 mL含有五水合氯化钕（0.27 g，0.62 mmol）的N,N-二甲基甲酰胺。然后再将混合物搅拌反应2 h，得到黑色纳米颗粒。将黑色的纳米颗粒分散在20 mL的N-甲基吡咯烷酮和蒽（0.1 g，0.56 mmol）进行插层，最后在超声处理4 h，成功制备了MOF-ET21。
对获得的MOF-ET21进行结构表征：
<1>将合成的MOF-ET21晶体存在玻璃毛细管中，采用单晶体X射线进行了晶体结构的测试，仪器为Bruker-ApexⅡ型CCD探测器，用Cu Kα (λ=1.54178Å )X射线源采集。数据是SADABS程序对吸收进行校正，没有对消光或衰变进行校正。用SHELXTL软件包直接求解，测试结果见图11。
本实施例使用上述得到的金属有机框架材料MOF-ET21制备PEC传感器，具体的制备过程如下：
将cDNA（50 μL，20 μM）和适配体（50 μL，20 μM）稀释至2 μM，90℃保存5 min。然后，逐渐冷却至37℃。最后，将混合物在37℃下孵育2 h，以形成dsDNA。然后将玻碳电极（GCE）（5 cm × 0.4 cm）依次放入丙酮、乙醇和纯水中超声清洗15 min，后用氮气吹干；接着用氟化密封带固定GCE电极（有效面积为0.16 cm2）；将10 μL的MOF-ET21分散液（0.75mg‧mL-1）滴涂到GCE电极表面，并在37 ℃的电加热恒温培养箱中干燥5 h，然后将10 μL的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS）混合溶液（10 mg‧mL-1/20 mg‧mL-1）滴涂在到MOF-ET21/GCE上，并在25℃下活化2 h。经NSH/EDC活化后，将10μL的dsDNA涂覆在MOF-ET21
/GCE上，在25℃的条件下孵育20 min，MOF-ET21/GCE的羧基与dsDNA的氨基反应，形成dsDNA/MOF-ET21/GCE。然后将dsDNA/ MOF-ET21/GCE浸在0.25 wt %牛血清白蛋白（BSA）中25 min，得到dsDNA/BSA/MOF-ET21/GCE结构。再将碱性磷酸酶（ALP）（8 μL，0.5 mg‧mL−1）添加到dsDNA/BSA/MOF-ET21/GCE表面，在4℃下放置2 h，通过生物素−链霉亲和素系统获得ALP-dsDNA/BSA/MOF-ET21/GCE。最后，将ALP-dsDNA/BSA/MOF-ET21/GCE加入到含有3mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）缓冲液中，孵育完成后，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）冲洗电极，即成功构建了PEC传感器。
对获得的PEC传感器的性能进行测试，测试过程以及结果如下：
第一、对VEGF165选择性测试
将α-胎蛋白（AFP）和癌胚抗原（CEA）作为潜在的干扰剂，利用PEC传感器分别对10fM的VEGF165、10 fM的AFP、10 fM的CEA这三种物质进行选择性测试。
测试结果如图12所示，PEC传感器只有在VEGF165存在时才表现出显著的光电流响应。对于α-胎蛋白（AFP）和癌胚抗原（CEA）两种干涉体，光电流的变化只是有轻微的变化。结果表明，PEC传感器对VEGF165的检测具有较高的选择性。
第二、对不同浓度的VEGF165的光电流响应测试
在偏置电压为0.1 V的条件下，利用PEC传感器对10 fM，100 fM，1×103fM，1×104fM，1×105fM，1×106fM，1×107fM，1×108fM不同浓度的VEGF165进行光电流响应测试。
测试结果如图13所示，随着VEGF165浓度的增加，更多的VEGF165从传感界面分离，电荷转移电阻降低，促进了光生电子−空穴对的分离，PEC信号随着浓度在10-1×108fM范围内增加而逐渐增加。
此外，在10~1×108fM之间的变化范围内，VEGF165（ΔI=I-I 0）特异性识别前后的光电流变化与其浓度的对数呈线性相关，如图14所示，线性关系的公式如下：ΔI=0.189lgc VEGF165-0.038（R2=0.998），得到检测限为0.18 fM（S/N=3）。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (3)
1.一种金属有机框架材料，其特征在于，该材料简称为MOF-ET21，化学式为[Nd(L)2]，式中L为C88H82N8O8；所述的金属有机框架材料的配体结构为：
2.一种权利要求1所述的金属有机框架材料的应用，其特征在于，用于PEC传感器的制备。
3.根据权利要求2所述的金属有机框架材料的应用，其特征在于，PEC传感器用于检测VEGF165。
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