CN116391838A - 一种免煮冲泡陈皮及其制备方法与应用 - Google Patents

一种免煮冲泡陈皮及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种免煮冲泡陈皮及其制备方法与应用。本发明利用红曲霉、酿酒酵母、鼠李糖乳杆菌和枯草芽孢杆菌混菌发酵制备发酵陈皮，发酵后的陈皮的可溶性游离态活性成分含量显著提高，香气风味保留完好。相较于现有的陈皮加工方法，本发明通过益生菌发酵释放陈皮组织绑定的有效成分，提高陈皮游离态活性成分含量及温水溶出率，实现免煮冲泡，避免了煮沸冲泡饮用复杂操作，同时增强了制备陈皮的抗氧化活性，陈皮风味、药用和食用价值更佳。通过前述制备方法得到的免煮冲泡陈皮用途广泛，可用于食品领域或保健品领域。

Description

一种免煮冲泡陈皮及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于功能食品领域，特别涉及一种免煮冲泡陈皮及其制备方法与应用。
背景技术
陈皮是芸香科植物橘“Citrus reticulata Blanco”及其栽培变种的干燥成熟果皮，是我国传统道地药材。根据柑橘品种及产地，陈皮主要有浙陈皮(温州蜜柑)、建陈皮(福橘)、川陈皮(大红袍)、赣陈皮(南丰蜜橘)以及广陈皮(茶枝柑)等，其中广陈皮质量为优。民间认为陈皮陈化年份越高，质量越高，故有“千年人参，百年陈皮”，“百年陈皮胜黄金”之说。陈皮具有极高的食用价值和药用价值，在日常食用和临床中的应用十分广泛。中药学认为陈皮具有化痰止咳、顺气理中的功效。现代药理学发现陈皮富含黄酮、多糖、挥发油、生物碱等多种化学物质，其中黄酮和挥发油是两大主要功效成分，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抑菌等多种药理功效。
此外，陈皮因其特殊风味和健康功能，已成为民间深受欢迎的保健食品，被广泛用于烹饪调料、食品添加剂以及茶饮料等领域，特别是陈皮茶，已成为人们养生首选产品之一。然而，陈皮植物组织结构复杂，纤维素、半纤维素、木质素是陈皮细胞壁刚性结构的主要成分，果胶主要存在于陈皮内表面白皮层，通常与纤维素结构交联，它们共同组成一种化学海绵体，通过化学键将黄酮、挥发油等成分交联吸附，极大的阻碍了活性成分的释放。因此，陈皮泡茶前通常需高温煮沸以破坏植物组织结构，促进活性成分释放。但是高温加热会破坏热敏性活性成分结构，降低其药理功效，同时还会增加难闻的气味，极大的影响茶汤的风味。因此，如何避免高温煮沸冲泡陈皮，保留陈皮茶汤风味和功效极为关键。
目前，陈皮加工技术多以物理法为主，通过调控陈皮存放的环境条件(如温度，湿度，光照)，影响陈皮活性成分的物理化学反应，从而改变陈皮活性成分的组成。这类方法虽能一定程度上提高陈皮质量，但是对环境要求极为苛刻，且加工方法耗时长，步骤繁琐，陈皮易霉变，阻碍了其推广。基于微生物发酵的生物法是一种绿色安全、温和友好的现代生物加工技术，已被广泛应用于食品及中草药天然产物深加工领域中。微生物发酵不仅可促进中草药有效成分的释放与转化，提高药理功效，降低中药毒副作用，还可产生多种游离氨基酸、有机酸等味道成分以及醇、醛、酯等挥发性香气成分，改善食品或中草药感官风味。然而，适用于陈皮发酵的微生物种质资源极为匮乏，陈皮发酵策略非常稀少。此外，现有陈皮加工方法获得的陈皮仍无法避免煮沸浸泡，药用、食用价值损失严重，急需开发一种绿色、安全、高效的新型陈皮深加工工艺方法。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种免煮冲泡陈皮的制备方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的免煮冲泡陈皮。
本发明的再一目的在于提供上述免煮冲泡陈皮的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种免煮冲泡陈皮的制备方法，包括如下步骤：
(1)将陈皮洗净，整片或切丝、切粒沥干；
(2)将步骤(1)处理后的陈皮和天然辅料灭菌，混合，得到固态发酵基质；
(3)向步骤(2)得到的固态发酵基质中加入水以及复合益生菌菌液，进行固态发酵，得到发酵陈皮；
(4)将步骤(3)得到发酵陈皮干燥，得到免煮冲泡的陈皮。
步骤(1)中所述的陈皮包括任何陈化年份的陈皮；优选为4～8年份的陈皮。
步骤(1)中所述的洗净的方式为采用室温～50℃的自来水或纯净水浸没，空气鼓泡浴5～20min，然后继续在空气鼓泡浴下冲洗1～15min；优选为采用室温～50℃的自来水或纯净水浸没，空气鼓泡浴15min，然后继续在空气鼓泡浴下冲洗5～15min。
步骤(2)中所述的天然辅料用于提供碳源和氮源中的至少一种；优选为大米、马铃薯淀粉、玉米、葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、鱼粉和酵母膏中的至少一种；更优选为大米和玉米的复配物、马铃薯淀粉和蔗糖的复配物或大米和鱼粉的复配物。
所述的大米和玉米的复配物优选为大米和玉米按质量比1～2：1得到的复配物。
所述的马铃薯淀粉和蔗糖的复配物优选为马铃薯淀粉和蔗糖按质量比1～2：1得到的复配物。
所述的大米和鱼粉的复配物优选为大米和鱼粉按质量比2～4：1得到的复配物；更优选为大米和鱼粉按质量比3：1得到的复配物。
步骤(2)中所述的陈皮的灭菌条件为将陈皮的白色内皮层和外皮层分别用紫外照射0.5～2h；更优选为将陈皮的白色内皮层和外皮层分别用紫外照射1.5h。
步骤(2)中所述的天然辅料的灭菌条件为115～121℃高压灭菌15～20min。
步骤(2)中所述的固态发酵基质为陈皮和天然辅料按质量比1～4：0～2复合得到；优选按质量比2～4：1复合得到。
步骤(3)中所述的水的添加量占陈皮固态发酵基质质量的50％～80％；更优选为占陈皮固态发酵基质质量的60％～70％。
步骤(3)中所述的复合益生菌菌液由红曲霉种子液、酿酒酵母种子液、鼠李糖乳杆菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液复合得到；优选按体积比为1～3：1～5：1～3：1～4复合得到；更优选由红曲霉种子液、酿酒酵母种子液、鼠李糖乳杆菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液按体积比为2：1～2：1～3：1～4复合得到。
所述的红曲霉种子液的浓度为2×106～2×108CFU/mL。
所述的红曲霉优选为红曲霉(Monascus anka)GIM 3.592。
所述的酿酒酵母种子液的浓度为2×106～2×108/mL。
所述的酿酒酵母优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC2.3857。
所述的鼠李糖乳杆菌种子液的浓度为2×106～2×108/mL。
所述的鼠李糖乳杆菌优选为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC1.2467。
所述的枯草芽孢杆菌种子液的浓度为2×106～2×108/mL。
所述的枯草芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.504。
所述的红曲霉种子液通过如下步骤制备得到：将红曲霉菌接种于液体培养基A中，在28～30℃、150～200rpm条件下培养，得到红曲霉种子液；
液体培养基A的组成如下：酵母膏5g/L，葡萄糖25g/L，蛋白胨10g/L，氯化钾0.1g/L，硫酸亚铁0.02g/L和磷酸二氢钾4g/L，余量为水。
所述的培养的时间优选为20～28h。
所述的酿酒酵母种子液通过如下步骤制备得到：取酿酒酵母接种于已灭菌的液体培养基B中，在28～30℃、150～200rpm条件下培养，得到酿酒酵母种子液；
液体培养基B的组成如下：蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0～7.5，用水定容。
所述的培养的时间优选为12～20h。
所述的鼠李糖乳杆菌种子液通过如下步骤制备得到：取鼠李糖乳杆菌接种于已灭菌的液体培养基C中，在28～30℃、150～200rpm条件下培养，得到鼠李糖乳杆菌种子液。
液体培养基C的组成如下：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，葡萄糖20g/L，吐温80 1mL/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，pH 6.2～6.4，用水定容。
所述的培养的时间优选为12～22h；优选为15～22h。
所述的枯草芽孢杆菌种子液通过如下步骤制备得到：取枯草芽孢杆菌接种于液体培养基B中，在28～30℃、150～200rpm条件下培养，得到枯草芽孢杆菌种子液；
所述的培养的时间优选为12～20h；优选为15～20h。
所述的种子液的浓度可通过接种量的调整、培养时间的调整，或者最终得到的种子液中的培养基的加入和去除进行调整。
步骤(3)中所述的复合益生菌菌液的接种量优选按其体积为固态发酵基质质量比5～30％计算；更优选按其体积为固态发酵基质质量比15～20％计算。
步骤(3)中所述的固态发酵的条件为：在温度为25～35℃，湿度为60～80％的条件下发酵8～15天；更优选为：在温度为28～30℃，湿度为60～80％的条件下发酵10～15天。
步骤(3)中所述的干燥的方式为35～50℃烘干、50℃以下真空或抽湿干燥、冷冻干燥。
步骤(3)中所述的干燥的时间为干燥直至恒重。
一种免煮冲泡陈皮，通过上述制备方法得到。
上述免煮冲泡陈皮在食品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：
(1)本发明首次科学的利用红曲霉、酿酒酵母、鼠李糖乳杆菌和枯草芽孢杆菌混菌发酵制备发酵陈皮，陈皮的可溶性游离态活性成分含量显著提高，香气风味保留完好，且无需煮沸冲泡。
(2)相较于现有的陈皮加工方法，本发明提出的方法操作简单，生产周期短，绿色安全，在提高温水中陈皮活性成分含量的同时增强了陈皮的抗氧化活性。
(3)本发明中利用红曲霉、酿酒酵母、鼠李糖乳杆菌和枯草芽孢杆菌均为国际允许使用的可食用微生物发酵益生菌，无食品安全风险。红曲霉可分泌极为丰富的水解酶系，包括果胶酶、纤维素酶、淀粉酶、丹宁酶、α-鼠李糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等。其中，纤维素酶和果胶酶可破坏陈皮组织中由木质纤维素和果胶形成的网状交联结构，降低其阻碍效果，促进游离态次级代谢产物(黄酮类、萜烯类)的释放；淀粉酶、葡萄糖苷酶、纤维素酶可裂解植物多糖和结合态多酚黄酮类成分之间的共价键，从而促进陈皮中不溶性-结合态活性成分释放；丹宁酶可水解陈皮中丹宁类苦涩物质，提高陈皮的口感；α-鼠李糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等糖苷酶可水解大分子黄酮糖苷类成分之间的糖苷键，将其转化成小分子黄酮苷元，提高活性成分在温水中的溶解度。此外，红曲霉还可产生γ-氨基丁酸，莫纳克林K，红曲红色素等额外活性物质，进一步增强陈皮茶汤的食用价值。酿酒酵母是改变食品香气风味的重要微生物菌种，其含有的多种萜烯合酶、萜烯转化酶、酯酶可将陈皮中柠檬烯、松油烯、芳樟醇、松油醇、香茅醛等挥发性香气成分进行转化，丰富陈皮香气组成，改善陈皮风味。鼠李糖乳杆菌不仅可发酵单糖产生乳酸等多种有机酸，增强陈皮口感，同时可作为肠道益生菌提高人体免疫力。枯草芽孢杆菌不仅生长速度快，适应能力强，还可分泌α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，可极大的缩短陈皮发酵时间，增强陈皮发酵效果。因此，本发明科学的组合上述四种微生物进行混菌发酵，不仅可优势互补，还能有效避免单菌发酵过程中引起的代谢产物抑制现象，提高了陈皮发酵效果。总的来说，红曲霉、酿酒酵母、鼠李糖乳杆菌和枯草芽孢杆菌的混菌发酵模式可破坏陈皮组织结构，促进陈皮中小分子可溶性活性成分释放与转化，提高陈皮活性成分含量及温水溶出率，实现免煮冲泡，同时改善其香气组成，增强其抗氧化活性。
附图说明
图1是不同实施例、对比例和对照组中陈皮水提液的游离态黄酮和陈皮残渣结合态黄酮含量的测定结果图；其中，对照组-泡表示对照组陈皮在100℃水中冲泡2min，对照组-煮表示对照组陈皮在水中煮沸10min。
图2是实施例1和对照组陈皮水提液游离态黄酮含量的测定结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
液体培养基A的配方为：酵母膏5g/L，葡萄糖25g/L，蛋白胨10g/L，氯化钾0.1g/L，硫酸亚铁0.02g/L和磷酸二氢钾4g/L，用蒸馏水定容至1L。
液体培养基B的配方为：蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，氯化钠10g/L，用蒸馏水定容至1L，pH 7.0～7.5。
液体培养基C的配方为：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，葡萄糖20g/L，吐温80 1mL/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，用蒸馏水定容至1L，pH 6.2～6.4。
实施例1
选取6g成色完好、无霉变、无虫洞的陈化5年份的陈皮，采用室温～50℃的自来水或纯净水浸没空气鼓泡浴15min，然后继续在空气鼓泡浴下冲洗10min，随后沥干、切丝或切粒；将大米、玉米按质量比1:1比例混合，得到天然辅料复合物1；将陈皮的白色内皮层在紫外线下灭菌1.5h，随后翻转将外皮层在紫外线下灭菌1.5h；将天然辅料复合物在121℃条件下灭菌20min；将灭菌后的陈皮和灭菌后的天然辅料复合物按质量比3:1的比例混合构成陈皮固态发酵基质1；将活化好的红曲霉菌GIM 3.592(已在文献“Improving bioactivitiesof polyphenol extracts from Psidium guajava L.leaves through co-fermentationof Monascus anka GIM 3.592and Saccharomyces cerevisiae GIM 2.139”公开)洗脱后接种于已灭菌的液体培养基A中，在30℃、180rpm条件下培养20h，得到浓度为2×106CFU/mL的红曲霉种子液；将活化好的酿酒酵母CGMCC 2.3857(可从中国普通微生物菌种保藏管理中心购买得到)接种于已灭菌的液体培养基B中，在30℃、180rpm条件下培养12h，得到浓度为2×106/mL的酿酒酵母种子液；将活化好的鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.2467(可从中国普通微生物菌种保藏管理中心购买得到)接种于已灭菌的液体培养基C中，在30℃、180rpm条件下培养15h，得到浓度为2×106/mL的鼠李糖乳杆菌种子液；将活化好的枯草芽孢杆菌CGMCC1.504(可从中国普通微生物菌种保藏管理中心购买得到)接种于已灭菌的液体培养基B中，在30℃、180rpm条件下培养15h，得到浓度为2×106/mL的枯草芽孢杆菌种子液；将红曲霉、酿酒酵母、鼠李糖乳杆菌和枯草芽孢杆菌种子液按体积比2:1:1:1的比例混合得到复合益生菌菌液1；按陈皮固态发酵基质1质量的15％(复合益生菌菌液体积占固态发酵基质质量的百分比)加入复合益生菌菌液1，再按陈皮固态发酵基质1质量的60％(水的质量占固态发酵基质质量的百分比)加入水，混合均匀后置于30℃、70％湿度的环境条件下固态发酵10天，得到发酵陈皮1；将发酵陈皮1在冷冻干燥条件下干燥15h，得到免煮冲泡陈皮1。
实施例2
选取6g成色完好、无霉变、无虫洞的陈化8年份的陈皮，采用室温～50℃的自来水或纯净水浸没空气鼓泡浴15min，然后继续在空气鼓泡浴下冲洗15min，随后沥干、切丝或切粒；将马铃薯淀粉、蔗糖按质量比1:1比例混合，得到天然辅料复合物2；将陈皮的白色内皮层在紫外线下灭菌1.5h，随后翻转将外皮层在紫外线下灭菌1.5h；将天然辅料复合物2在121℃条件下灭菌20min；将灭菌后的陈皮和灭菌后的天然辅料复合物按质量比4:1的比例混合构成陈皮固态发酵基质2；将活化好的红曲霉菌GIM 3.592洗脱后接种于已灭菌的液体培养基A中，在30℃、180rpm条件下培养24h，得到浓度为2×107CFU/mL的红曲霉种子液；将活化好的酿酒酵母CGMCC 2.3857接种于已灭菌的液体培养基B中，在30℃、180rpm条件下培养18h，得到浓度为2×107/mL的酿酒酵母种子液；将活化好的鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.2467接种于已灭菌的液体培养基C中，在30℃、180rpm条件下培养18h，得到浓度为2×107/mL的鼠李糖乳杆菌种子液；将活化好的枯草芽孢杆菌CGMCC 1.504接种于已灭菌的液体培养基B中，在30℃、180rpm条件下培养18h，得到浓度为2×107/mL的枯草芽孢杆菌种子液；将红曲霉、酿酒酵母、鼠李糖乳杆菌和枯草芽孢杆菌种子液按体积比2:2:1:1的比例混合得到复合益生菌菌液2；按陈皮固态发酵基质2质量的20％(复合益生菌菌液体积占固态发酵基质质量的百分比)加入复合益生菌菌液2，再按陈皮固态发酵基质2质量的70％(水的质量占固态发酵基质质量的百分比)加入水，混合均匀后置于28℃、75％湿度的环境条件下固态发酵14天，得到发酵陈皮2；将发酵陈皮2在冷冻干燥条件下干燥12h，得到免煮冲泡陈皮2。
实施例3
选取6g成色完好、无霉变、无虫洞的陈化6年份的陈皮，采用室温～50℃的自来水或纯净水浸没空气鼓泡浴15min，然后继续在空气鼓泡浴下冲洗5min，随后沥干、切丝或切粒；将大米、玉米按质量比2:1比例混合，得到天然辅料复合物3；将陈皮的白色内皮层在紫外线下灭菌1.5h，随后翻转将外皮层在紫外线下灭菌1.5h；将天然辅料复合物在121℃条件下灭菌20min；将灭菌后的陈皮和灭菌后的天然辅料复合物按质量比2:1的比例混合构成陈皮固态发酵基质3；将活化好的红曲霉菌GIM 3.592洗脱后接种于已灭菌的液体培养基A中，在30℃、180rpm条件下培养28h，得到浓度为2×108CFU/mL的红曲霉种子液；将活化好的酿酒酵母CGMCC 2.3857接种于已灭菌的液体培养基B中，在30℃、180rpm条件下培养20h，得到浓度为2×108/mL的酿酒酵母种子液；将活化好的鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.2467接种于已灭菌的液体培养基C中，在30℃、180rpm条件下培养22h，得到浓度为2×108/mL的鼠李糖乳杆菌种子液；将活化好的枯草芽孢杆菌CGMCC 1.504接种于已灭菌的液体培养基B中，在30℃、180rpm条件下培养18h，得到浓度为2×107/mL的枯草芽孢杆菌种子液；将红曲霉、酿酒酵母、鼠李糖乳杆菌和枯草芽孢杆菌种子液按体积比2:1:3:4的比例混合得到复合益生菌菌液3；按陈皮固态发酵基质3质量的20％(复合益生菌菌液体积占固态发酵基质质量的百分比)加入复合益生菌菌液3，再按陈皮固态发酵基质3质量的65％(水的质量占固态发酵基质质量的百分比)加入水，混合均匀后置于30℃、60％湿度的环境条件下固态发酵15天，得到发酵陈皮3；将发酵陈皮3在冷冻干燥条件下干燥10h，得到免煮冲泡陈皮3。
实施例4
选取6g成色完好、无霉变、无虫洞的陈化4年份的陈皮，采用室温～50℃的自来水或纯净水浸没空气鼓泡浴15min，然后继续在空气鼓泡浴下冲洗10min，随后沥干、切丝或切粒；将大米、鱼粉按质量比3:1比例混合，得到天然辅料复合物4；将陈皮的白色内皮层在紫外线下灭菌1.5h，随后翻转将外皮层在紫外线下灭菌1.5h；将天然辅料复合物在121℃条件下灭菌20min；将灭菌后的陈皮和灭菌后的天然辅料复合物按质量比4:1的比例混合构成陈皮固态发酵基质4；将活化好的红曲霉菌GIM 3.592洗脱后接种于已灭菌的液体培养基A中，在30℃、180rpm条件下培养28h，得到浓度为2×108CFU/mL的红曲霉种子液；将活化好的酿酒酵母CGMCC 2.3857接种于已灭菌的液体培养基B中，在30℃、180rpm条件下培养20h，得到浓度为2×108/mL的酿酒酵母种子液；将活化好的鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.2467接种于已灭菌的液体培养基C中，在30℃、180rpm条件下培养18h，得到浓度为2×107/mL的鼠李糖乳杆菌种子液；将活化好的枯草芽孢杆菌CGMCC 1.504接种于已灭菌的液体培养基B中，在30℃、180rpm条件下培养20h，得到浓度为2×108/mL的枯草芽孢杆菌种子液；将红曲霉、酿酒酵母、鼠李糖乳杆菌和枯草芽孢杆菌种子液按体积比2:1:3:4的比例混合得到复合益生菌菌液4；按陈皮固态发酵基质4质量的30％(复合益生菌菌液体积占固态发酵基质质量的百分比)加入复合益生菌菌液4，再按陈皮固态发酵基质4质量的60％(水的质量占固态发酵基质质量的百分比)加入水，混合均匀后置于30℃、70％湿度的环境条件下固态发酵12天，得到发酵陈皮4；将发酵陈皮4在冷冻干燥条件下干燥15h，得到免煮冲泡陈皮4。
对比例1
同实施例1，区别在于，以等量的无菌水代替微生物种子液复合物。
选取6g成色完好、无霉变、无虫洞的陈化5年份的陈皮，采用室温～50℃的自来水或纯净水浸没空气鼓泡浴15min，然后继续在空气鼓泡浴下冲洗10min，随后沥干、切丝或切粒；将大米、玉米按质量比1:1比例混合，得到天然辅料复合物1；将干燥后的陈皮的白色内皮层在紫外线下灭菌1.5h，随后翻转将外皮层在紫外线下灭菌1.5h；将天然辅料复合物在121℃条件下灭菌20min；将灭菌后的陈皮和灭菌后的天然辅料复合物按质量比3:1的比例混合构成陈皮固态发酵基质1；按陈皮固态发酵基质1质量的15％(种子液复合物体积占固态发酵基质质量的百分比)加入无菌水，再按陈皮固态发酵基质1质量的60％(水的质量占固态发酵基质质量的百分比)加入水，混合均匀后置于30℃、70％湿度的环境条件下固态发酵10天，得到陈皮；将陈皮在冷冻干燥条件下干燥15h，得到干燥陈皮。
对比例2
同实施例1，区别在于，以植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)代替枯草芽孢杆菌。
选取6g成色完好、无霉变、无虫洞的陈化5年份的陈皮，采用室温～50℃的自来水或纯净水浸没空气鼓泡浴15min，然后继续在空气鼓泡浴下冲洗10min，随后沥干、切丝或切粒；将大米、玉米按质量比1:1比例混合，得到天然辅料复合物1；将干燥后的陈皮的白色内皮层在紫外线下灭菌1.5h，随后翻转将外皮层在紫外线下灭菌1.5h；将天然辅料复合物在121℃条件下灭菌20min；将灭菌后的陈皮和灭菌后的天然辅料复合物按质量比3:1的比例混合构成陈皮固态发酵基质1；将活化好的红曲霉菌GIM 3.592洗脱后接种于已灭菌的液体培养基A中，在30℃、180rpm条件下培养20h，得到浓度为2×106CFU/mL的红曲霉种子液；将活化好的酿酒酵母CGMCC 2.3857接种于已灭菌的液体培养基B中，在30℃、180rpm条件下培养12h，得到浓度为2×106/mL的酿酒酵母种子液；将活化好的鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.2467接种于已灭菌的液体培养基C中，在30℃、180rpm条件下培养15h，得到浓度为2×106/mL的鼠李糖乳杆菌种子液；将活化好的植物乳杆菌CGMCC 1.2469(可从中国普通微生物菌种保藏管理中心购买得到)接种于已灭菌的液体培养基B中，在30℃、180rpm条件下培养12h，得到浓度为2×106/mL的植物乳杆菌种子液；将红曲霉、酿酒酵母、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌种子液按体积比2:1:1:1的比例混合得到复合益生菌菌液5；按陈皮固态发酵基质1质量的15％(复合益生菌菌液体积占固态发酵基质质量的百分比)加入复合益生菌菌液5，再按陈皮固态发酵基质1质量的60％(水的质量占固态发酵基质质量的百分比)加入水，混合均匀后置于30℃、70％湿度的环境条件下固态发酵10天，得到发酵陈皮；将发酵陈皮在冷冻干燥条件下干燥15h，得到干燥发酵陈皮。
对比例3
同实施例1，区别在于，以黑曲霉(Aspergillus niger)代替红曲霉。
选取6g成色完好、无霉变、无虫洞的陈化5年份的陈皮，采用室温～50℃的自来水或纯净水浸没空气鼓泡浴15min，然后继续在空气鼓泡浴下冲洗10min，随后沥干、切丝或切粒；将大米、玉米按质量比1:1比例混合，得到天然辅料复合物1；将干燥后的陈皮的白色内皮层在紫外线下灭菌1.5h，随后翻转将外皮层在紫外线下灭菌1.5h；将天然辅料复合物在121℃条件下灭菌20min；将灭菌后的陈皮和灭菌后的天然辅料复合物按质量比3:1的比例混合构成陈皮固态发酵基质1；将活化好的黑曲霉CGMCC 3.7206(可从中国普通微生物菌种保藏管理中心购买得到)洗脱后接种于已灭菌的液体培养基A中，在30℃、180rpm条件下培养20h，得到浓度为2×106CFU/mL的黑曲霉种子液；将活化好的酿酒酵母CGMCC 2.3857接种于已灭菌的液体培养基B中，在30℃、180rpm条件下培养12h，得到浓度为2×106/mL的酿酒酵母种子液；将活化好的鼠李糖乳杆菌CGMCC1.2467接种于已灭菌的液体培养基C中，在30℃、180rpm条件下培养15h，得到浓度为2×106/mL的鼠李糖乳杆菌种子液；将活化好的枯草芽孢杆菌CGMCC1.504接种于已灭菌的液体培养基B中，在30℃、180rpm条件下培养15h，得到浓度为2×106/mL的枯草芽孢杆菌种子液；将红曲霉、酿酒酵母、鼠李糖乳杆菌和枯草芽孢杆菌种子液按体积比2:1:1:1的比例混合得到复合益生菌菌液6；按陈皮固态发酵基质1质量的15％(复合益生菌菌液体积占固态发酵基质质量的百分比)加入复合益生菌菌液6，再按陈皮固态发酵基质1质量的60％(水的质量占固态发酵基质质量的百分比)加入水，混合均匀后置于30℃、70％湿度的环境条件下固态发酵10天，得到发酵陈皮；将发酵陈皮在冷冻干燥条件下干燥15h，得到干燥发酵陈皮。
对比例4
同实施例1，区别在于，仅接种红曲霉种子液进行陈皮固态发酵。
选取6g成色完好、无霉变、无虫洞的陈化5年份的陈皮，采用室温～50℃的自来水或纯净水浸没空气鼓泡浴15min，然后继续在空气鼓泡浴下冲洗10min，随后沥干、切丝或切粒；将大米、玉米按质量比1:1比例混合，得到天然辅料复合物1；将干燥后的陈皮的白色内皮层在紫外线下灭菌1.5h，随后翻转将外皮层在紫外线下灭菌1.5h；将天然辅料复合物在121℃条件下灭菌20min；将灭菌后的陈皮和灭菌后的天然辅料复合物按质量比3:1的比例混合构成陈皮固态发酵基质1；将活化好的红曲霉菌GIM 3.592洗脱后接种于已灭菌的液体培养基A中，在30℃、180rpm条件下培养20h，得到浓度为2×106CFU/mL的红曲霉种子液；按陈皮固态发酵基质1质量的15％(种子液体积占固态发酵基质质量的百分比)加入红曲霉种子液，再按陈皮固态发酵基质1质量的60％(水的质量占固态发酵基质质量的百分比)加入水，混合均匀后置于30℃、70％湿度的环境条件下固态发酵10天，得到发酵陈皮；将发酵陈皮在冷冻干燥条件下干燥15h，得到干燥发酵陈皮。
对比例5
同实施例1，区别在于，仅接种酿酒酵母和枯草芽孢杆菌进行陈皮固态发酵。
选取6g成色完好、无霉变、无虫洞的陈化5年份的陈皮，采用室温～50℃的自来水或纯净水浸没空气鼓泡浴15min，然后继续在空气鼓泡浴下冲洗10min，随后沥干、切丝或切粒；将大米、玉米按质量比1:1比例混合，得到天然辅料复合物1；将干燥后的陈皮的白色内皮层在紫外线下灭菌1.5h，随后翻转将外皮层在紫外线下灭菌1.5h；将天然辅料复合物在121℃条件下灭菌20min；将灭菌后的陈皮和灭菌后的天然辅料复合物按质量比3:1的比例混合构成陈皮固态发酵基质1；将活化好的酿酒酵母CGMCC 2.3857接种于已灭菌的液体培养基B中，在30℃、180rpm条件下培养12h，得到浓度为2×106/mL的酿酒酵母种子液；将活化好的枯草芽孢杆菌CGMCC 1.504接种于已灭菌的液体培养基B中，在30℃、180rpm条件下培养15h，得到浓度为2×106/mL的枯草芽孢杆菌种子液；将酿酒酵母和枯草芽孢杆菌种子液按体积比1:1的比例混合得到复合益生菌菌液7；按陈皮固态发酵基质1质量的15％(复合益生菌菌液体积占固态发酵基质质量的百分比)加入复合益生菌菌液7，再按陈皮固态发酵基质1质量的60％(水的质量占固态发酵基质质量的百分比)加入水，混合均匀后置于30℃、70％湿度的环境条件下固态发酵10天，得到发酵陈皮；将发酵陈皮在冷冻干燥条件下干燥15h，得到干燥发酵陈皮。
对比例6
选取6g成色完好、无霉变、无虫洞的陈化5年份的陈皮，采用室温～50℃的自来水或纯净水浸没空气鼓泡浴15min，然后继续在空气鼓泡浴下冲洗10min，随后沥干、切丝或切粒，随后置于湿度90％，温度50℃条件下存放2天，取出后再置于湿度60％，温度30℃条件下存放2天，如此交替反复，共持续12天，随后冷冻干燥条件下干燥10h，得到干燥陈皮。
对照组
自然陈化5年份的陈皮。
检测方法
(1)游离态总黄酮和结合态黄酮含量测定
准确称取1g实施例、对比例和对照组中的陈皮样品于15mL离心管中，加入20mL100℃蒸馏水浸没样品，搅拌冲泡2min。另取1g对照组陈皮样品，加入20mL蒸馏水煮沸10min。样品提取液用0.45μm孔径滤膜过滤，收集的滤液即为陈皮游离态黄酮粗提液，每个样品提取工序均执行三次。将上述游离态提取物过滤的残渣置于烘箱，在60℃下干燥10h，称量每个样品干渣的重量。称取0.5g干渣，加入50mL 4mol/L NaOH溶液水解4h。水解完成后，用5mol/L盐酸调整其水解液pH为2。所得水解液用乙酸乙酯萃取三次。通过真空旋转蒸发仪在35℃下将合并萃取液浓缩干燥，除去乙酸乙酯。将浓缩干燥物重新溶解于10mL的水中，所获液体即为结合态黄酮粗提液。取稀释的不同形态黄酮提取液100μL置于2mL离心管中，用蒸馏水定容至500μL，依次加入5％ NaNO2 30μL，摇匀后静置5min，加入10％(w/w)AlCl3溶液30μL，摇匀后静置6min，依次加入4％(w/w)的NaOH溶液200μL，摇匀后，继续添加240μL水定容至1mL，静置20min，于波长为510nm处测吸光值。用0.01-0.1mg/mL芦丁作为标准黄酮化合物，绘制芦丁的标准曲线(R2＝0.9997)。样品中总黄酮含量用每g陈皮干重(DM)相当于芦丁的毫克数表示(mg RE/g DM)。所有样品测试均执行三次。
试验结果如图1所示。
(2)陈皮水提液游离态黄酮含量
准确称取1g陈皮样品于15mL离心管中，加入20mL不同温度(30℃～100℃)蒸馏水浸没样品，搅拌冲泡2min。样品提取液用0.45μm孔径滤膜过滤，收集的滤液即为陈皮游离态黄酮粗提液，每个样品提取工序均执行三次，测定提取液中黄酮含量。
试验结果如图2所示。
(3)橙皮苷、川陈皮素、橘皮素含量测定
橙皮苷、川陈皮素、橘皮素含量测定通过高效液相色谱法测定。具体参数为：色谱柱：C18(5μm，4.6×250nm)柱；流动相：0.1％磷酸-水(A)：乙腈(B)，梯度洗脱程序：0-15min，5-10％B；15-25min，10-20％B；25-40min，20-40％B；40-55min，40-90％B；56-61min，5％B；柱温：30℃；流速：0.8mL/min；进样体积：10μL；波长：283nm和330nm；检测器：PDA检测器。
试验结果如表1所示。
表1实施例、对比例和对照组陈皮橙皮苷、橙皮素、川陈皮素、橘皮素含量
样品 橙皮苷(％) 橙皮素(％) 川陈皮素(％) 橘皮素(％)
实施例1 3.22 0.14 0.48 0.38
实施例2 2.89 0.12 0.39 0.34
实施例3 3.02 0.11 0.46 0.35
实施例4 3.15 0.12 0.44 0.35
对比例1 4.35 0.082 0.25 0.20
对比例2 4.28 0.061 0.23 0.21
对比例3 4.39 0.064 0.21 0.28
对比例4 4.18 0.071 0.25 0.24
对比例5 4.38 0.085 0.24 0.22
对比例6 4.26 0.072 0.22 0.21
对照组-泡 4.92 0.04 0.18 0.18
对照组-煮 5.32 0.06 0.24 0.24
(4)感官评价试验
邀请15名味觉灵敏的大学生志愿者(男性8名，女性7名，年龄均为20-25周岁)对以上实施例、对比例和对照组制备得到的陈皮样品进行感官评价，评价时实施例和对比例中的陈皮取1g加40mL 100℃的开水冲泡2min，对照组中的陈皮取1g加40mL水煮沸10min，志愿者从茶水的色泽、香气、滋味3个方面进行综合评分。每品尝一种样品休息5min，并用纯净水漱口。具体评分标准见表2，评价结果以均值表示，详见表3：
表2感官评分标准
指标 标准 分值
色泽 茶汤澄清透明，呈棕红色 30分
香气 清香怡人，香气浓厚 30分
滋味 口感甘香、醇厚、无刺激 40分
表3感官评价结果
样品 感官评价得分
实施例1 94
实施例2 92
实施例3 93
实施例4 93
对比例1 85
对比例2 83
对比例3 81
对比例4 84
对比例5 85
对比例6 84
对照组-泡 84
对照组-煮 70
(5)抗氧化活性测试
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)抗氧化活性测试：50μL样品提取液(0-5mg DW/mL)和400μL DPPH甲醇溶液(60μM)混合后，在30℃的黑暗条件下反应30分钟，随后在515nm处测量反应液的吸光度。
2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)抗氧化活性测试：ABTS(7mM)和过硫酸钾(2.45mM)在30℃的黑暗条件下反应16h，得到ABTS自由基阳离子。使用前用水稀释ABTS自由基阳离子溶液使其在734nm处的吸光值为0.70±0.05。50μL样品提取液(0-0.5mgDW/mL)和400μL ABTS溶液混合后，在30℃的黑暗条件下反应10min，随后在734nm处测量反应溶的吸光度。
Trolox用作阳性对照，结果以IC50值表示，代表清除50％自由基所需的样品量，单位为mg TE/g DW，代表每克陈皮干重(DM)相当于Trolox的毫克数。
试验结果如表4所示。
表4
样品 DPPH抗氧化活性(mg TE/g DW) ABTS抗氧化活性(mg TE/g DW)
实施例1 19.32 50.36
实施例2 17.83 48.25
实施例3 18.44 49.12
实施例4 18.61 49.54
对比例1 13.51 39.12
对比例2 13.65 38.64
对比例3 13.62 39.34
对比例4 13.91 38.12
对比例5 13.45 39.02
对照组-泡 12.84 38.52
对照组-煮 14.64 42.98
分析图1-2，表1、3和4内数据发现，实施例、对比例和对照组陈皮经冲泡后，实施例茶汤内游离态黄酮含量相较于对比例和对照组显著提高，而陈皮残渣中结合态黄酮含量较对比例和对照组显著降低，表明陈皮经本发明提供的方法加工后，陈皮组织中结合态黄酮类成分被有效转化为游离态形式释放出来，提高了茶汤中活性成分含量，从而实现免煮冲泡。此外，60℃～100℃水冲泡均能有效溶解实施例1中陈皮的活性成分，而对照组陈皮需在80℃～100℃水冲泡条件下才能溶出大量活性成分，且整体含量均低于实施例1，这表明本发明提供的方法制备的陈皮用60℃～100℃水冲泡均能有效发挥其药用、食用价值，进一步体现了本发明技术的优越性。在主要的几种黄酮类成分中，实施例中陈皮的川陈皮素、橘皮素、橙皮素小分子成分含量较对比例和对照组高，大分子橙皮苷含量则较低，表明陈皮经本发明提供的方法加工后，大分子活性成分在微生物的作用下向小分子成分发生了明显的转化，人体更易吸收。此外，对比例中提供的方法虽对陈皮的感官风味有一定的改善，但提升效果远不如由红曲霉、酿酒酵母、鼠李糖乳杆菌和枯草芽孢杆菌组合得到的复合益生菌。在药理功效方面，本发明中的复合益生菌可显著提高陈皮茶汤的抗氧化活性，而对比例中的方法却没有此效果。
综上所述，本发明提供了一种免煮冲泡陈皮的制备方法，该方法选用红曲霉、酿酒酵母、鼠李糖乳杆菌和枯草芽孢杆菌作为混合发酵益生菌菌种，通过固态发酵，促进了陈皮不同形态活性成分的释放与转化，提高了陈皮活性成分含量及温水溶出率，改善了陈皮的香气、色泽和滋味，增强了茶汤的抗氧化活性，避免了煮沸冲泡对陈皮风味、药用和食用价值的影响。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种免煮冲泡陈皮的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将陈皮洗净，整片或切丝、切粒沥干；
(2)将步骤(1)处理后的陈皮和天然辅料灭菌，混合，得到固态发酵基质；
(3)向步骤(2)得到的固态发酵基质中加入水以及复合益生菌菌液，进行固态发酵，得到发酵陈皮；
(4)将步骤(3)得到发酵陈皮干燥，得到免煮冲泡的陈皮；
步骤(3)中所述的复合益生菌菌液由红曲霉种子液、酿酒酵母种子液、鼠李糖乳杆菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液复合得到。
2.根据权利要求1所述的免煮冲泡陈皮的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的洗净的方式为采用室温～50℃的自来水或纯净水浸没，空气鼓泡浴5～20min，然后继续在空气鼓泡浴下冲洗1～15min。
3.根据权利要求1所述的免煮冲泡陈皮的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的天然辅料为大米、马铃薯淀粉、玉米、葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、鱼粉和酵母膏中的至少一种；
步骤(2)中所述的陈皮的灭菌条件为将陈皮的白色内皮层和外皮层分别用紫外照射0.5～2h；
步骤(2)中所述的天然辅料的灭菌条件为115～121℃高压灭菌15～20min；
步骤(2)中所述的固态发酵基质为陈皮和天然辅料按质量比1～4：0～2复合得到。
4.根据权利要求1所述的免煮冲泡陈皮的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的复合益生菌菌液由红曲霉种子液、酿酒酵母种子液、鼠李糖乳杆菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液按体积比为1～3：1～5：1～3：1～4复合得到；
所述的红曲霉种子液的浓度为2×106～2×108CFU/mL；
所述的酿酒酵母种子液的浓度为2×106～2×108/mL；
所述的鼠李糖乳杆菌种子液的浓度为2×106～2×108/mL；
所述的枯草芽孢杆菌种子液的浓度为2×106～2×108/mL。
5.根据权利要求4所述的免煮冲泡陈皮的制备方法，其特征在于：
所述的红曲霉为红曲霉(Monascus anka)GIM 3.592；
所述的酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC 2.3857；
所述的鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC1.2467；
所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.504。
6.根据权利要求4所述的免煮冲泡陈皮的制备方法，其特征在于：
所述的红曲霉种子液通过如下步骤制备得到：将红曲霉菌接种于液体培养基A中，在28～30℃、150～200rpm条件下培养，得到红曲霉种子液；
液体培养基A的组成如下：酵母膏5g/L，葡萄糖25g/L，蛋白胨10g/L，氯化钾0.1g/L，硫酸亚铁0.02g/L和磷酸二氢钾4g/L，余量为水；
所述的酿酒酵母种子液通过如下步骤制备得到：取酿酒酵母接种于已灭菌的液体培养基B中，在28～30℃、150～200rpm条件下培养，得到酿酒酵母种子液；
液体培养基B的组成如下：蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0～7.5，用水定容；
所述的鼠李糖乳杆菌种子液通过如下步骤制备得到：取鼠李糖乳杆菌接种于已灭菌的液体培养基C中，在28～30℃、150～200rpm条件下培养，得到鼠李糖乳杆菌种子液；
液体培养基C的组成如下：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，葡萄糖20g/L，吐温80 1mL/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，pH 6.2～6.4，用水定容；
所述的枯草芽孢杆菌种子液通过如下步骤制备得到：取枯草芽孢杆菌接种于液体培养基B中，在28～30℃、150～200rpm条件下培养，得到枯草芽孢杆菌种子液。
7.根据权利要求1所述的免煮冲泡陈皮的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的复合益生菌菌液的接种量按其体积为固态发酵基质质量比5～30％计算；
步骤(3)中所述的固态发酵的条件为：在温度为25～35℃，湿度为60～80％的条件下发酵8～15天；
步骤(3)中所述的干燥的方式为35～50℃烘干、50℃以下真空或抽湿干燥、冷冻干燥。
8.一种免煮冲泡陈皮，其特征在于：通过权利要求1～7任一项所述的制备方法得到。
9.权利要求8所述的免煮冲泡陈皮在食品中的应用。
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