KR20130083233A

KR20130083233A - 진피의 발효, 효소 처리를 통한 항산화효과의 검증방법 및 발효진피고형차의 제조방법

Info

Publication number: KR20130083233A
Application number: KR1020120003897A
Authority: KR
Inventors: 허담; 김대익; 윤성란
Original assignee: (주)옴니허브
Priority date: 2012-01-12
Filing date: 2012-01-12
Publication date: 2013-07-22

Abstract

본 발명은 발효, 효소처리된 진피에서 항산화효과가 있음을 검증하고, 이를 근거로 진피를 이용하여 우리 몸속에서 항산화작용을 하는 음료제품을 상품화하고자 하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은 진피를 발효처리하고, 발효처리가 끝난 진피로부터 진피발효물을 추출하고, 상기 진피발효물로부터 동결건조된 진피고체발효분말을 얻고, 또다른 방법으로 진피를 효소처리하여 동결건조된 진피고체효소분말을 얻고, 상기 동결건조된 분말시료들을 이용, 항산화효과를 실험하여 이를 입증하고, 상기에서 입증된 자료를 이용하여 발효진피분말을 제조하고, 상기 발효진피분말에 여러가지 식품첨가물을 첨가하여 발효진피고형차를 제조하는 것이다.

Description

진피의 발효, 효소 처리를 통한 항산화효과의 검증방법 및 발효진피고형차의 제조방법{ANTIOXIDENT EFFECT VERIFICATION METHOD BY FERMENTATION/ENZYME MODIFIED CITRUS PEELS AND MANUFACTURING METHOD OF FERMENTATION CITRUS PEELS SOLID TEA}

본 발명은 발효, 효소처리된 진피가 항산화효과가 증가한다는 것을 실험을 통하여 확인하고, 이러한 실험을 근거로 발효, 효소처리된 진피를 이용하여 우리 몸속에서 항산화작용을 하는 음료용 제품을 상품화하고자 하는 것이다.

진피의 학명은 Citrus Aurantium L. Subsp, nobilis markino(C. nobilis Loun.)으로 운향과의 상록 관목이다. 귤껍질을 말린 것으로 한의에서는 오래묵은 것일수록 좋다고 하여 진피라고 한다.

진피에는 플라보노이드 배당체와 헤스페리딘(비타민P), 비타민C 등이 함유되어 있다. 또한 카로틴과 당질, 칼슘과 단백질, 지방질 등이 골고루 들어있다.

진피의 약리작용을 알아보면 진피의 쓴맛물질과 향기성분은 위액분비량을 조절하고 입맛을 돋우는 건위작용을 한다. 혈관벽에 작용하여 혈관을 넓히는 작용을 한다. 모세혈관의 투과성을 낮추고 동맥경화를 예방 치료한다. 진피의 성분은 포도상구균을 억제한다. 근래에는 항암물질을 추출하여 신약을 개발하였다고 메스컴에 오르기도 했다.

예로부터 한의에서는 진피는 몸을 따뜻하게 하고 감기와 기침 가래를 치료하며 몸의 기를 올려주는 약제로 사용하였다. 진피는 반하 백출과 함께 작용하여 위를 진정시켜 구토를 멈추고 위산을 조절하는 용도로 사용하여 왔다.

진피의 활용으로서는 진피달임약(귤피차)의 경우 4~10g을 물 200cc되게 달여서 하루 3번에 나누어 마시면 기침, 감기에 좋다.

진피는 다양한 한약처방에 들어가며 인단, 영신환을 만드는데로 사용된다.

그러나 아직까지 발효처리된 진피가 항산화효과가 있음을 입증한 결과는 보고된바 없다.

본 발명은 이러한 실정을 감안하여 발효, 효소처리된 진피에서 항산화효과가 있음을 검증하고, 이를 근거로 진피를 이용하여 우리 몸속에서 항산화작용을 하는 음료제품을 상품화하고자 하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은 진피를 발효처리하고, 발효처리가 끝난 진피로부터 진피발효물을 추출하고, 상기 진피발효물로부터 동결건조된 진피고체발효분말을 얻고, 또다른 방법으로 진피를 효소처리하여 동결건조된 진피고체효소분말을 얻고, 상기 동결건조된 분말시료들을 이용, 항산화효과를 실험하여 이를 입증하고, 상기에서 입증된 자료를 이용하여 발효진피분말을 제조하고, 상기 발효진피분말에 여러가지 식품첨가물을 첨가하여 발효진피고형차를 제조하였다.

본 발명은 발효, 효소처리된 진피에서 항산화효과가 증진함을 입증하고, 이를 근거로 진피로부터 항산화작용을 하는 음료를 개발, 제품화함으로서, 기업의 이윤추구는 물론, 소비자들이 건강증진과 기호에 맞는 양질의 음료제품을 제공할 수 있게 되는 등의 효과가 있다.

도 1 : 분말화한 각 시료의 총 페놀성 화합물의 함량을 표시한 그래프
도 2 : 분말화한 각 시료의 플라보노이드 함량을 표시한 그래프(히스페리딘 검출상태)
도 3 : 분말화한 각 시료의 플라보노이드 함량을 표시한 그래프(나린게닌 검출상태)
도 4 : 분말화한 각 시료의 플라보노이드 함량을 표시한 그래프(히스페레틴 검출상태)
도 5 : 분말화한 각 시료의 항산화효소의 단백질발현 결과사진(농도 1㎎/m1)
도 6 : 분말화한 각 시료의 항산화효소의 단백질발현 결과사진(농도 5㎎/m1)

이하 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다.

□ 진피의 발효, 효소처리

1. 진피의 발효방법

1) 유산균배양

본 연구에 이용한 미생물은 한국종균협회(KCCM, Korean Culture Center of Microorganism)에서 L. rhamnosus (KCCM 11320)를 분양받아 연구하였다. 진피(2010, 제주산)는 (주)옴니허브에서 구입하여 사용하였으며 발효를 진행하기 위해 절단하여 사용하였다.

진피를 121℃에서 20분간 고압멸균한 후 상온에서 냉각하였다. 미생물 L. rhamnosus는 MRS broth(Difco, USA)에 접종하여 37℃에서 48시간 동안 정치배양하였다. 배양하는 동안 12시간 간격으로 UV/VIS spectrophotometer(Optizen 1412V, Korea)를 사용하여 660nm에서 배양액의 흡광도를 측정하여 생육을 조사하였다.

2) 고체발효

37℃에서 배양된 L. rhamnosus 종균액을 10%(v/v)수준으로 귤피에 무균적으로 접종하였고, 접종 이후에는 멸균마개로 고정시켜 오염을 방지하고 발효는 37℃에서 3일 동안 진행하였다.

발효가 끝난 진피발효물은 추출하고 동결건조하였다. 진피발효물을 열수추출하기 위해 10배 volume의 증류수를 첨가하여 70℃에서 3h동안 냉각기가 연결된 환류 추출장치에서 추출하였다. 추출이 끝난 진피발효물은 여과하고 감압농축기로 농축하였다. 농축된 진피발효물은 -70℃에서 동결건조해서 진피고체발효분말을 제조하였다.

2. 진피의 효소처리방법

1) 효소처리

진피에 20배 volume의 증류수를 첨가하여 1% Viscozyme L을 이용하여 효소처리하였다. 40℃에서 18h동안 효소처리한 후 95℃, 2h동안 열수추출하고 여과한 후 동결건조하였다.

□ 진피의 발효, 효소처리를 통한 항산화효과검증

1. 실험방법

1) 총 페놀성 화합물 함량 측정

진피 추출물의 총 페놀성 화합물 함량은 Folin-Denis법에 따라 비색정량 하였다. 즉 동결건조 한 분말시료 1g을 증류수 100mL에 1시간 초음파 추출하여 advantec No.2로 여과한 후 그 추출액을 10배 희석한 검액 1 mL에 2배 희석한 Folin-ciocalteau 시약 1 mL를 가하여 혼합하고 3분 후 10% Na2CO3 1 mL를 넣어 진탕하였다. 시험액을 실온에서 1시간 방치하여 발색 시킨 후 700nm에서 흡광도를 측정하였으며, tannic acid를 표준물질로 하여 검량곡선에 의해 정량하였다.

2) 플라보노이드 함량 분석

동결건조 한 분말시료 1g을 취하여 메탄올 100mL를 가하여 1시간 초음파 추출하여 0.45㎛ filter로 여과한 후 그 추출액을 플라보노이드 함량 측정에 사용하였다.

플라보노이드의 함량을 측정하기 위하여 HPLC(Waters 2796, Waters Co., USA) 분석조건으로는 칼럼은 xBridge^TM 5 μm, 4.6 mm × 150 mm(Waters Co., USA), 유속 1.0 mL/min, 이동상으로는 A와 B 용매를 이용하여 용리구배로 용리하였다. A용매로 1% formic acid을, B 용매로 MeCN을 사용하였으며 용리구배 조건은 다음과 같다(0-2 min, 100% A: 0% B; 2-10 min, 80% A: 20% B; 10-15 min, 50% A: 50% B; 15-20 min, 30% A: 70% B; 20-30 min, 0% A: 100% B; 30-40 min, 100% A: 0% B). 그리고 검출은 UV 검출기를 사용하였고 280nm의 고정된 파장에서 수행하였다. 플라보노이드의 표준시료는 naringin(Sigma Co., USA), naringenin(Sigma Co., USA), hesperidin(Sigma Co., USA), hesperetin(Sigma Co., USA)을 구입하여 분석하였다.

3) 항산화효소 단백질발현분석( Western blotting )

H4IIE 세포는 랫드(Rat) hepatocyte derived cell line으로 American Type Cell Culture (ATCC, Rockville, MD)에서 구입하였다. 10% fetal bovine serum과 50 U/ml penicillin, 50g/ml streptomycin을 함유하는 Dulbeccos modified Eagels medium (DMEM)을 배지로 하여 1-2 x 10⁶ /ml이 되도록 37℃로 유지되는 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 실험 전 serum이 없는 MEM 배지에 최소 12시간 배양한 후 분말처리된 진피, 진피액체발효, 진피고체발효, 진피효소처리물을 1mg/ml로 stock하여 실험조건에 맞게 희석하여 H4IIE에 처리하여 실험하였다.

24시간동안 처리한 세포를 sterile phosphate-buffered saline으로 두 번 세척한 후 scrapping하였다. Lysis buffer(10mM Tris-Cl(pH 7.4), 100mM NaCl, 30mM Na. pyrophosphate, 0.2mM Na. orthovanavate, 1mM EGTA, 10% Glycerol, 1mM PMSF, 10μg/ml Leupeptin, 0.5% Triton X-100)에 1시간동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 4℃, 10,000g에서 10분간 원심분리시켜 상등액을 얻었다. 각 상등액의 단백질의 함량을 동일하게 맞추기 위해 Bradford법을 이용해서 단백질을 정량한 후 western blot을 위한 lysate sample을 제작하였다. 이것을 12% gel electrophoresis로 분리하여 nitrocellulose paper에 전이하고 skim milk로 blocking 시켰다. nitrocellulose paper는 anti-rat HO-1 antibody, anti-goat GST-ya, anti-mouse β-actin antibody와 1시간동안 incubation시킨 후 0.25% Tween PBS로 10분씩 3차례 washing했다. washing이 끝난 nitrocellulose paper는 secondary antibody로 1시간동안 incubation시키고 반응이 끝나면 0.25% Tween PBS로 10분씩 3차례 washing했다. ECL chemiluminescence system(Amersham, Buckinghamshire, England)으로 developing하여 단백질반현을 확인하였다.

2. 실험결과

1) 총 페놀성 화합물 함량 측정

각각의 분말화한 시료의 총 페놀성 화합물의 함량은 도 1과 같이 나타났다.

3가지 형태의 분말시료 중 효소 viscozyme L(1%)로 가수분해 하여 분말화한 시료에서 가장 높은 페놀함량을 나타내었으며 발효한 진피의 페놀함량은 효소 처리한 시료보다 조금 낮았으며 진피가 가장 적은 함량을 보였다.

2) 플라보노이드 함량

각각의 분말화한 시료의 플라보노이드의 함량은 도 2 내지 도 4에서와 같이 나타났다.

3가지 형태의 분말 모두에서 hesperidin이 검출 되었는데 그 함량은 발효처리 분말이 가장 높게 나타났으며 진피추출물 분말, 효소처리 분말 순으로 나타났다. 그러나 효소처리 분말에서는 naringenin 및 hesperetin이 검출된 반면 나머지 다른 2가지 형태의 분말에서는 나타나지 않았다. 이것은 효소처리함에 따라 당분해 효소(cellulase, β-glucosidase, pectinase) 등이 감귤에 함유된 배당체 형태 flavonoid 화합물들을 aglycone 형태로 전환시키는 가수분해를 통한 유효 생리활성 성분의 추출성을 증대시킨 것으로 사료된다.

산화적 손상에 대해 세포나 조직을 보호하는 역할을 하는 것으로 알려진 세포내 항산화 효소인 HO-1(heme oxygenase-)과 GST(Glutathione-S-transferase)-ya 단백질 발현을 확인해본 결과 도 5 및 도 6에서와 같이 진피의 경우 control에 비해 HO-1의 발현이 농도 1, 5mg/ml에서 증가하는 것을 확인하였고 GST-ya의 경우는 5mg/ml에서만 발현이 증가하는 것을 확인했다. 진피를 효소처리 한 경우에는 5mg/ml의 농도에서 HO-1과 GST-ya의 발현이 control에 비해 증가하는 것을 확인했다. 이에 비해 발효진피의 경우 1, 5mg/ml농도에서 HO-1과 GST-ya의 발현이 모두 증가한 것을 확인했다. House-keeping gene인 β-actin의 경우 단백질발현 변화가 없는 것을 확인했다.

이러한 결과를 통해 진피, 효소처리진피, 발효진피에서 항산화효소의 발현이 증가하는 것을 확인하였고 이러한 효소들의 발현을 통해 우리 몸속의 항산화작용을 나타내는 것을 알 수 있다.

□ 발효진피고형차 제조

1. 이상의 결과에서 확인한 결과 진피에 비해 발효처리나 효소처리를 통해 항산화효과가 더 좋아지는 것을 확인할 수 있었다.

이에 진피를 식용배지를 이용해서 발효처리하였고, 발효가 끝난 진피를 추출, 분무건조하여 발효진피 분말을 제조하였다.

2. 발효진피분말을 포함한 고형차 제조를 위해 여러가지 식품첨가물을 혼합/배합하여 고형차를 제조하였다. 발효진피농축분말 5~20%, 덱스트린 40~60%, 감귤농축혼합분말 5~20%, 효소처리스테비오사이드 1~3%, 아스파탐 1~3%, 구연산 3~5%, 비타민C 3~5%, 카테킨 0.5~2%, L-카르니틴 0.5~2%, 치커리식이섬유 1~3%, 자일리톨 1~3%, 솔비톨 1~3%를 혼합하여 발효진피고형차를 제조하였다.

Claims

멸균처리한 진피에 배양된 종균액을 무균적으로 접종하여 발효처리하고, 상기 발효처리된 진피로부터 진피발효물을 추출, 동결건조하고, 상기 진피발효물을 증류수에 첨가, 냉각기가 연결된 환류추출장치에서 추출하고, 추출이 끝난 진피발효물을 여과하고 농축하여, 농축된 진피발효물을 얻고, 상기 농축된 진피발효물을 동결건조하여 진피고체발효분말을 얻고, 또다른 방법으로 진피를 효소처리하여 동결건조된 진피고체효소분말을 얻고, 상기 진피고체발효, 효소분말을 시료로 하여, 진피의 항산화효과를 실험하기 위하여 페놀성 화합물 함량측정과, 플라보노이드 함량분석과, 항산화효소 단백질 발현분석을 실험하고, 상기 실험을 통하여 발효, 효소처리된 진피로부터 항산화효과가 상승되었음을 입증하고, 상기 실험을 결과로 진피로부터 항산화효과가 있는 음료제품을 상품화할 수 있게 하는 것을 특징으로 진피의 발효, 효소처리를 통한 항산화효과의 검증방법.
진피를 식용배지를 이용, 발효처리하고, 발효가 끝난 진피를 추출, 분무, 건조하여 발효진피분말을 제조하고, 상기 발효진피분말을 포함한 고형차 제조를 위해 여러가지 식품첨가물을 혼합/배합하여 고형차를 제조하였다. 발효진피농축분말 5~20%, 덱스트린 40~60%, 감귤농축혼합분말 5~20%, 효소처리스테비오사이드 1~3%, 아스파탐 1~3%, 구연산 3~5%, 비타민C 3~5%, 카테킨 0.5~2%, L-카르니틴 0.5~2%, 치커리식이섬유 1~3%, 자일리톨 1~3%, 솔비톨 1~3%를 혼합하여 제조함을 특징으로 하는 진피의 발효처리를 통한 발효진피고형차의 제조방법.