CN116359355A - 地榆皂苷i在枸骨叶样品质量检测中的应用以及相应的质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及地榆皂苷I在枸骨叶样品质量检测中的应用以及相应的质量检测方法。本发明提供了一种枸骨叶样品的质量检测方法，其包括如下步骤：对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、液相色谱检测和数据分析，其中，所述数据分析包括计算所述枸骨叶样品中地榆皂苷I的含量。本发明以地榆皂苷I为指标成分，为枸骨叶样品的质量检测提供新的分析手段，且操作简单，重现性、稳定性好，回收率可靠，检测成本低，检测效率高。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及地榆皂苷I在枸骨叶样品质量检测中的应用，以及利用地榆皂苷I对枸骨叶样品进行质量检测的方法。
背景技术
枸骨叶为一味传统中药，又名猫儿刺、枸骨刺、老虎刺、八角刺、鸟不宿、苦丁茶等，始载于《本草拾遗》，药用历史悠久[1,2]。《中国药典》(2020年版)一部收载枸骨叶为冬青科植物枸骨Ilex cornuta Lindl.ex Paxt.的干燥叶，其功能与主治为清热养阴、益肾、平肝，用于肺痨咯血，骨蒸潮热，头晕目眩[3]。在江浙一带，其嫩叶作为苦丁茶，《全国中草药汇编》记载具有治头痛、解热效能的功效[4]。现代研究表明，枸骨叶主要含三萜类、皂苷类、黄酮等类成分，具有免疫抑制、抗炎、杀菌、抗生育、心血管系统保护等活性[5～9]。
关于枸骨叶药材的质量控制，《中国药典》(2020年版)未收载含量测定项目[3]。香港中药材标准中以熊果酸和羽扇豆醇作为含量测定指标[10]，郭亚健、李颜等学者分别建立了枸骨叶中熊果酸和羽扇豆醇的含量测定方法[11,12]，洪艳平、蔡伟、施之琪和陈颖等学者分别建立枸骨叶中总黄酮和金丝桃苷、山柰素和绿原酸等多酚类化合物的含量测定方法[13～16]，王存琴、姚志容和周国莉等学者建立了枸骨叶中长梗冬青苷、冬青苷II和总皂苷的含量测定方法[17～19]。关于枸骨叶制剂的质量控制，仅有聂丽云等学者建立了枸骨叶提取物中异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷和芒柄花素的含量测定方法[20]。以上方法仅是对药材进行控制，或者仅是对提取物进行控制，缺少同一指标从药材到制剂这一全过程的控制。
关于枸骨叶质量控制的专利申请目前较少。特别是枸骨叶药材及饮片含量测定方面未见专利申请，枸骨叶制剂含量测定方面目前仅有1篇专利，即孙冬梅等申请的“枸骨叶配方颗粒及其制备方法和检测方法”[21]。该专利采用红外指纹图谱检测枸骨叶饮片和配方颗粒的质量，同时在原料药材控制中采用水解法测定指纹图谱来控制枸骨叶质量。但采用水解法测定的是水解产物，无法反映原料药材中原有成分，而采用红外光谱法又无法反映具体某一成分的含量情况。
作为枸骨叶制剂的一种，枸骨叶配方颗粒是在中医理论指导下，采用符合现行版《中国药典》标准的枸骨叶饮片，经水加热提取、分离、浓缩、干燥、制粒而成的颗粒。按照中医临床处方调配后，供患者冲服使用。枸骨叶配方颗粒具有与传统水煎剂基本相同的疗效和药理作用，同时还具有体积小、易于携带和保存等优点。由于采用了水提取，而熊果酸、羽扇豆醇等极性较小的三萜类成分的水溶性较差，因此不适用于枸骨叶配方颗粒的质量控制；金丝桃苷、山柰素和有机酸等成分虽然有一定水溶性，但在多种植物中均有分布，专属性较差。
地榆皂苷I(ziyuglycoside I,1-O-[(3β)-3-(α-L-Arabinopyranosyloxy)-19-hydroxy-28-oxours-12-en-28-yl]-β-D-glucopyranose)，为乌苏烷型五环三萜类皂苷，分子式：C41H66O13，CAS号：35286-58-9，其结构式如下：
在多个文献中均报道枸骨叶中含有地榆皂苷I[1,2,5～9]，但其含量测定方法未曾披露，亦未曾采用地榆皂苷I作为其质量控制手段。
参考文献：
[1]中药大辞典(第二版)编委会.中药大辞典(第二版)[M].上海:上海科技出版社,2005:784.
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[20]聂丽云,曹旭.HPLC同时测定枸骨叶提取物中异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷和芒柄花素的含量[J].药学研究,2017,36(3):142-144.
[21]孙冬梅,王洛临,施之琪等.枸骨叶配方颗粒及其制备方法和检测方法[P].CN103800399B,2016.08.17.
发明内容
发明要解决的问题
针对本领域中作为枸骨叶样品(例如生药、饮片、标准汤剂及制剂)质量评价指标的物质相对较少，以及目前针对枸骨叶样品质量检测方法相应匮乏等问题，为了丰富枸骨叶的质量控制手段，本发明提出将地榆皂苷I应用于枸骨叶样品的质量检测，并建立了枸骨叶样品中地榆皂苷I的含量测定方法，为枸骨叶样品的内在质量的控制提供新的分析手段，实现了枸骨叶药材、饮片、标准汤剂和配方颗粒的全过程控制。
用于解决问题的方案
[1].一种枸骨叶样品的质量检测方法，其包括如下步骤：对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、液相色谱检测和数据分析，其中，所述数据分析包括计算所述枸骨叶样品中地榆皂苷I的含量。
[2].根据[1]所述的质量检测方法，其特征在于，所述枸骨叶样品选自枸骨叶的药材、饮片、提取物、标准汤剂和配方颗粒的一种或多种。
[3].根据[1]或[2]所述的质量检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测采用的条件包括：色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为乙腈或甲醇，优选的流动相A为乙腈；流动相B为甲酸水溶液、醋酸水溶液、磷酸水溶液或水，优选的流动相B为浓度以甲酸的体积百分比计为0.2％的甲酸水溶液。
[4].根据[3]所述的质量检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测采用的条件还包括：利用所述流动相A与流动相B进行等度洗脱或梯度洗脱，优选为等度洗脱，更优选的流动相A与流动相B的体积比为15:85至50:50；流速为0.20-0.40mL/min；柱温为20-45℃；采用紫外检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器或电雾式检测器。
[5].根据[1]至[4]中任一项所述的质量检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备包括如下步骤：取枸骨叶样品粉末，精密称定，置容器中，精密加入提取溶剂，密塞，称定重量，提取后，放冷，再称定重量，用所述提取溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤，取二分之一体积的续滤液，蒸干，残渣加所述提取溶剂复溶，转移至定量容器中，加所述提取溶剂定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[6].根据[5]所述的质量检测方法，其特征在于，所述枸骨叶样品粉末与所述提取溶剂的质量体积比为1g:(15～800mL)。
[7].根据[5]或[6]所述的质量检测方法，其特征在于，所述提取溶剂为醇类或醇类水溶液；优选地，所述提取溶剂为甲醇或甲醇水溶液；更优选地，所述甲醇水溶液的浓度以甲醇的体积百分比计大于等于30％。
[8].根据[5]至[7]中任一项所述的质量检测方法，其特征在于，所述提取采用超声、加热回流或振摇的方式进行，所述提取的时间为5-60min。
[9].根据[1]至[7]中任一项所述的质量检测方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备包括如下步骤：取地榆皂苷I对照品，精密称定，加入溶剂，混匀至溶清，即得；其中，所述溶剂为醇类或醇类水溶液；优选地，所述溶剂为甲醇或甲醇水溶液；更优选地，所述甲醇水溶液的浓度以甲醇的体积百分比计大于等于30％。
[10].地榆皂苷I在枸骨叶样品质量检测中的用途，优选地，所述枸骨叶样品选自枸骨叶药材、饮片、提取物、标准汤剂、配方颗粒以及含有枸骨叶的经典名方物质基准和成品颗粒中的一种或多种。
发明的效果
通过上述技术方案的实施，本发明通过液相色谱法，并对色谱条件进行合理控制，建立枸骨叶样品中地榆皂苷I的含量测定方法，可以为枸骨叶样品的质量检测提供新的分析手段。
同时，本发明的方法以地榆皂苷I为指标成分，不仅适用于枸骨叶药材、饮片、标准汤剂和配方颗粒的质量检测，还适合于含有枸骨叶的其它产品的检测。
此外，本发明的方法操作简单，重现性、稳定性好，回收率可靠，检测成本低，检测效率高，以期为规范枸骨叶药材及制剂市场和合理开发提供依据。
附图说明
图1为地榆皂苷I对照品的超高效液相色谱图。
图2为采用不同溶剂提取的枸骨叶药材的超高效液相色谱图。
图3为采用不同方式提取的枸骨叶药材的超高效液相色谱图。
图4为采用不同体积溶剂提取的枸骨叶药材的超高效液相色谱图。
图5为采用不同时间提取的枸骨叶药材的超高效液相色谱图。
图6为地榆皂苷I对照品在超高效液相色谱中进样量的Ln值与峰面积的Ln值的线性关系图。
图7为枸骨叶药材含量测定专属性实验结果的超高效液相色谱图。
图8为不同流速考察结果的超高效液相色谱图。
图9为不同色谱柱温度考察结果的超高效液相色谱图。
图10为不同色谱柱考察结果的超高效液相色谱图。
图11为枸骨叶饮片含量测定专属性实验结果的超高效液相色谱图。
图12为枸骨叶标准汤剂含量测定专属性实验结果的超高效液相色谱图。
图13为枸骨叶配方颗粒含量测定专属性实验结果的超高效液相色谱图。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式进行说明，但本发明不限定于此。本发明不限于以下说明的各构成，在发明请求保护的范围内可以进行各种变更，而适当组合不同实施方式、实施例中各自公开的技术手段而得到的实施方式、实施例也包含在本发明的技术范围中。
除非另有定义，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。
在本发明中，使用“数值A～数值B”或“数值A-数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
在本发明中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
在本发明中，术语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”，也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
在本发明中，术语“约”可以表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因前述测试装置或方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本发明所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在某一特定数值或范围的±10％、±5％、±1％或±0.5％之内。
在本发明中，术语“包括”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含一系列步骤或单元的过程、方法或系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
在本发明中，“药材”或“生药”是指未经加工或未制成成品的中药原料。
在本发明中，“饮片”是指中药根据需要，经过炮制处理而形成的供配方用的中药，或可直接用于中医临床的中药。
在本发明中，“提取物”是指按规范化的生产工艺制得的符合一定质量标准的提取物，例如，醇(如甲醇、乙醇等)提物、水提物等。
在本发明中，“标准汤剂”是指以中医理论为指导、临床应用为基础，参考现代提取方法，经标准化工艺制备而成的单味中药饮片水煎剂。
在本发明中，“配方颗粒”是由单味中药饮片按传统标准炮制后经提取浓缩制成的、供中医临床配方用的颗粒。
在本发明中，“经典名方物质基准”是指以古代医籍中记载古代经典名方制备方法为依据制备而得的中药药用物质，除成型工艺外，其余制备方法应与古代医籍记载基本一致。
在本发明中，“经典名方成品颗粒”或“经典名方标准颗粒”是指由古代医籍中记载的古代经典名方经提取浓缩制成的、供中医临床配方用的颗粒。
在本发明中，“供试品”是指用作检测或鉴定的实验样品。
在本发明中，“对照品”是指用于鉴别、检查、含量测定和校正检定仪器性能的标准物质。
在本发明中，“液相色谱仪”是指一类以液体作为流动相的分析和分离仪器，可以分为高效液相色谱(通常被称为HPLC)和超高效液相色谱(通常被称为UPLC或UHPLC)。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方式”、“另一些具体/优选的实施式”、“实施方式”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方式有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方式中，并且可存在于其它实施方式中或者可不存在于其它实施方式中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方式中。
[枸骨叶样品]
在一些实施方式中，本发明的枸骨叶样品包括枸骨叶药材、饮片、提取物、标准汤剂、配方颗粒以及含有枸骨叶的经典名方物质基准和成品颗粒中的一种或多种。在一些具体的实施方式中，本发明的枸骨叶样品包括枸骨叶药材、饮片、提取物、标准汤剂和配方颗粒中的一种或多种。
[供试品溶液的制备]
在一些具体的实施方式中，本发明的供试品溶液的制备包括如下步骤：取枸骨叶样品粉末，精密称定，置容器(例如具塞锥形瓶)中，精密加入提取溶剂，密塞，称定重量，提取(例如超声、加热或振摇)后，放冷，再称定重量，用所述提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取二分之一体积的续滤液，蒸干，残渣加所述提取溶剂复溶，转移至定量容器(例如量瓶)中，加所述提取溶剂定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
在本发明中，提取溶剂可以是水、醇类，例如甲醇、乙醇、丁醇或戊醇等，也可以为醇类水溶液，例如甲醇水溶液。
在一些具体的实施方式中，本发明的供试品溶液的制备中，所述提取溶剂为醇类，例如甲醇。
在一些具体的实施方式中，本发明的供试品溶液的制备中，所述提取溶剂为醇类水溶液，例如甲醇水溶液；优选地，所述甲醇水溶液的浓度以甲醇的体积百分比计大于等于30％，甲醇的体积百分比过低则不利于成分的提取，具体可以为30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％等；为了进一步提高提取效率，优选所述甲醇水溶液的浓度为30％-70％，甚至更优选为50％-70％。
在一些实施方式中，本发明的供试品溶液的制备中，所述枸骨叶样品粉末与所述提取溶剂的质量体积比为1g:(15～800mL)；样品浓度太小或者太大，有可能超出线性关系范围。在一些具体的实施方式中，本发明的供试品溶液的制备中，所述枸骨叶样品粉末与所述提取溶剂的质量体积比为1g:(40～200mL)，具体可以为1g:40mL、1g:60mL、1g:80mL、1g:100mL、1g:120mL、1g:140mL、1g:160mL、1g:180mL或1g:200mL。在一些更具体的实施方式中，为了进一步优化提取效果和物料用量，所述枸骨叶样品粉末与所述甲醇水溶液的质量体积比为1g:(80～120mL)，具体可以为1g:100mL。
在一些具体的实施方式中，本发明的供试品溶液的制备中，可以采用超声、加热回流或振摇的方式来进行提取处理。在一些实施方式中，本发明的供试品溶液的制备中，提取的处理时间为5～60min，具体可以为5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min。在一些具体的实施方式中，本发明的供试品溶液的制备中，提取的处理时间为15～45min，时间过短则不利于成分的充分溶出，时间过长则降低分析工作的效率。为了使提取操作简便，可以优选采用超声处理的方式，超声的功率、频率对本发明影响不大。在一些优选的实施方式中，所述超声处理的功率为250W，频率为40kHz。为了进一步优化提取效果和处理周期，优选超声处理的时间为15～30min，具体可以为30min。
在一些优选的实施方式中，本发明的供试品溶液的制备包括如下步骤：取枸骨叶样品粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入浓度为30％～70％的甲醇水溶液，密塞，称定重量，超声或加热或振摇提取15-45min后，放冷，再称定重量，用所述甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取二分之一体积的续滤液，蒸干，残渣加所述甲醇水溶液复溶，转移至量瓶中，加所述甲醇水溶液定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得；其中，所述枸骨叶样品粉末与所述甲醇水溶液的质量体积比为1g:(40～200mL)。
[对照品溶液的制备]
在一些具体的实施方式中，本发明的对照品溶液的制备包括如下步骤：取地榆皂苷I对照品，精密称定，加入溶剂，混匀至溶清，即得。
在一些具体的实施方式中，本发明的对照品溶液的制备中，所述溶剂为醇类或醇类水溶液，例如甲醇或甲醇水溶液；优选地，为了简化实操步骤，制备对照品溶液所使用的溶剂可以与制备供试品溶液所使用的提取溶剂相同，所述甲醇水溶液的浓度以甲醇的体积百分比计大于等于30％，具体可以为30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％；相应地，也可以优选所述甲醇水溶液的浓度为30％-70％，甚至更优选为50％-70％。
在一些具体的实施方式中，本发明的对照品溶液的制备中，所述地榆皂苷I对照品在溶剂中的浓度为50μg/mL。
在一些具体的实施方式中，本发明的地榆皂苷I对照品为商品化的地榆皂苷I。
[液相色谱检测]
在一些具体的实施方式中，本发明地枸骨叶样品的质量检测方法采用液相色谱法。在一些优选的实施方式中，本发明地枸骨叶样品的质量检测方法采用超高效液相色谱法。
在一些具体的实施方式中，本发明的液相色谱检测采用的色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。
在一些具体的实施方式中，本发明的液相色谱检测采用的色谱柱柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm。
在一些具体的实施方式中，本发明的液相色谱检测采用的流动相A为乙腈或甲醇。在一些优选的实施方式中，本发明的液相色谱检测采用的流动相A为乙腈。
在一些具体的实施方式中，本发明的液相色谱检测采用的流动相B为甲酸水溶液、醋酸水溶液、磷酸水溶液或水。在一些优选的实施方式中，本发明的液相色谱检测采用的流动相B为甲酸水溶液。在一些更优选的实施方式中，本发明的液相色谱检测采用的流动相B为浓度以甲酸的体积百分比计为0.2％的甲酸水溶液。
在一些具体的实施方式中，本发明的液相色谱检测采用梯度洗脱。在另一些具体的实施方式中，本发明的液相色谱检测采用等度洗脱，所述流动相A与流动相B的体积比为15:85至50:50，优选为20:80至40:60，甚至更优选为25:75至35:65，具体可以为15:85、17:83、20:80、23:77、25:75、27:73、29:71、35:65、40:60、45:55或50:50等。
在一些具体的实施方式中，本发明的液相色谱检测采用的流动相流速为0.20-0.40mL/min，具体可以为20mL/min、25mL/min、30mL/min、35mL/min或40mL/min。在一些优选的实施方式中，本发明的液相色谱检测采用的流速为0.25-0.35mL/min。
在一些具体的实施方式中，本发明的超高效液相色谱检测采用的色谱柱柱温为20-45℃，具体可以为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃。在一些优选的实施方式中，本发明的超高效液相色谱检测采用的色谱柱柱温为25-35℃。
在一些具体的实施方式中，本发明的超高效液相色谱检测采用紫外检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器或电雾式检测器。在一些优选的实施方式中，本发明的超高效液相色谱检测采用电雾式检测器。
在一些具体的实施方式中，本发明的超高效液相色谱检测采用的条件为：色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为乙腈或甲醇，流动相B为甲酸水溶液、醋酸水溶液、磷酸水溶液或水，进行梯度洗脱或等度洗脱，流动相A与流动相B的体积比为15:85至50:50，流速为0.20-0.40mL/min；柱温为20-45℃；采用紫外检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器或电雾式检测器。
在一些优选的实施方式中，本发明的超高效液相色谱检测采用的条件为：色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为乙腈，流动相B为浓度以甲酸的体积百分比计为0.2％的甲酸水溶液，进行等度洗脱，流动相A与流动相B的体积比为29:71，流速为0.25-0.35mL/min；柱温为25-35℃；采用电雾式检测器。
在一些具体的实施方式中，本发明利用超高效液相色谱检测对照品溶液与供试品溶液中的地榆皂苷I的峰面积，根据进样量和峰面积的对数值以外表两点法对数方程计算得到供试品中地榆皂苷I的含量，以便进行枸骨叶样品的质量检测。
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。除非另有说明，本发明中使用的仪器、试剂、材料、实验动物等均可通过常规商业手段获得。
实施例1：枸骨叶药材含量测定方法的构建
1.仪器、试剂与样品
Thermo Vanquish超高效液相色谱仪；Thermo Vanquish电雾式检测器(CAD)；Chromeleam 7.2 SR4变色龙工作站；KQ-250E超声清洗机(昆山超声仪器有限公司)；METTLER TOLEDO XP6百万分之一天平(梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司)；ME204E/02型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；KQ-250B超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；纯水系统(Sartorius公司)；GKC114型控温水浴锅(南通华泰实验仪器有限公司)；AS165W型离心机(亚速旺(上海)商贸有限公司)。乙腈(色谱纯，Thermo Fisher公司)；水为超纯水；甲酸(色谱纯，aladdin公司)；其它试剂均为分析纯。
地榆皂苷I(编号：ST0820120MG)购于上海诗丹德生物技术有限公司，供含量测定用，含量以98.0％计，使用前无须处理。枸骨叶药材由江阴市天江药业有限公司提供。
2.对照品溶液的制备
取地榆皂苷I对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每lmL含50μg的溶液，即得。对其进行超高效液相色谱检测，结果见图1。
3.供试品溶液的制备
取本品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液25mL，蒸干，残渣加70％甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加70％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4.分析方法的确定
4.1色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm)；以乙腈-0.2％甲酸溶液(29：71)为流动相；电雾式检测器检测。理论板数按地榆皂苷I峰计算应不低于5000。精密吸取对照品溶液0.5μL、4.0μL，供试品溶液3μL，注入液相色谱仪，测定。以外表两点法对数方程计算，即得。
结果显示，检测基线平稳，目标成分分离度良好，检测时间12分钟内可完成。
4.2供试品溶液的制备
(1)提取溶剂的考察
结论：采用甲醇、70％甲醇、50％甲醇、30％甲醇、水作为提取溶剂时，发现水作为提取溶剂地榆皂苷I含量较低，70％甲醇和50％甲醇提取得到的含量均较高，考虑到操作中有溶剂蒸干的步骤，因此确定提取溶剂为70％甲醇，溶剂蒸干更快。
考察方法：取本品约0.5g，共5组，每组平行2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、70％甲醇、50％甲醇、30％甲醇、水50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再次称定重量，用相应的溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液25mL，蒸干，残渣加70％甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加70％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液3μL，注入液相色谱仪，按“4.1”项下色谱条件进样，计算地榆皂苷I含量，结果见表1，图2。
表1 不同提取溶剂的比较
(2)提取方式的考察
结论：当采用超声处理、加热回流、振摇提取时，地榆皂苷I的含量无显著差异，考虑到超声处理操作简便，因此选择超声处理。
考察方法：取本品约0.5g，共3组，每组平行2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50mL，密塞，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)、加热回流、振摇提取30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液25mL，蒸干，残渣加70％甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加70％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液3μL，注入液相色谱仪，按“4.1”项下色谱条件进样，计算地榆皂苷I含量。结果见表2，图3。
表2 提取方式的比较
(3)提取溶剂体积的考察
结论：当提取体积为20mL、50mL、100mL时，得到的地榆皂苷I含量相差不大，说明提取溶剂为20mL时已经提取较为充分。考虑到不同批次样品差异，为确保提取充分，因此溶剂加入量选择50mL。
考察方法：取本品约0.5g，共3组，每组平行2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％甲醇20mL、50mL、100mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，各取续滤液20mL、50mL、100mL，蒸干，残渣加70％甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加70％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液3μL，注入液相色谱仪，按“4.1”项下色谱条件进样，计算地榆皂苷I含量。结果见表3，图4。
表3 提取体积的比较
(4)提取时间的考察
结论：不同超声处理时间，得到的地榆皂苷I含量相差不大，说明提取时间为15分钟时已经提取较为充分。考虑到不同批次样品差异，为确保提取充分，提取时间采用30分钟。
考察方法：取本品约0.5g，共3组，每组平行2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50mL，密塞，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)15min、30min、45min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液25mL，蒸干，残渣加70％甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加70％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液3μL，注入液相色谱仪，按“4.1”项下色谱条件进样，计算地榆皂苷I含量。结果见表4，图5。
表4 提取时间的比较
最终确定供试品溶液的制备方法为：
取本品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液25mL，蒸干，残渣加70％甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加70％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(5)不同批次的检测
取不同批次样品10批，按“4.2”项下供试品溶液的制备方法制备样品，按“4.1”项下色谱条件进样分析，具体结果如下：
表5 不同批次枸骨叶中地榆皂苷I的含量
由上表可见，上述各批次枸骨叶药材中地榆皂苷I的含量在0.07％～0.21％之间，差异较大，可能是受到产地及采收等因素影响，说明该指标对于枸骨叶的质量评价具有一定的参考意义。
实施例2：含量测定构建方法的方法学验证
1.线性关系
结果表明：地榆皂苷I进样量在0.02972～0.59447μg范围内，其Ln值与峰面积的Ln值呈良好的线性关系。
精密吸取地榆皂苷I对照品溶液(浓度为99.078μg/mL)0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μL，注入液相色谱仪，按实施例1“4.1”项下色谱条件进样，以峰面积的Ln值为纵坐标，以进样量的Ln值为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程：Y＝0.8706x+1.958，R＝0.9993，结果见表6，图谱见图6。
表6 对照品峰面积积分值与进样量关系
2.精密度试验
2.1仪器精密度试验
结果：峰面积RSD为2.50％，仪器精密度试验良好。
精密吸取枸骨叶药材供试品溶液3μL，注入液相色谱仪，按实施例1“4.1”项下色谱条件进样，连续进样6次，记录地榆皂苷I峰面积的测量值，计算相对标准偏差，结果见表7。
表7 仪器精密度试验
2.2重复性试验
结果：峰面积RSD为1.97％，重复性试验良好。
取同一批次样品约0.5g，精密称定，平行6份，按实施例1“4.2”项下供试品溶液的制备方法制备样品，按实施例1“4.1”项下色谱条件进样分析，测得地榆皂苷I的峰面积，计算地榆皂苷I的含量及RSD值，结果见表8。
表8 枸骨叶药材样品含量的重复性试验
2.3中间精密度
结果：地榆皂苷I含量RSD为1.55％，中间精密度试验良好。
取同一批次样品3份，分别由不同实验员按实施例1“4.2”项下供试品溶液的制备方法制备样品，按实施例1“4.1”项下色谱条件分别于不同时间在相同仪器上分别进样3μL，测定地榆皂苷I峰面积值，并计算其含量及RSD，结果见表9。
表9中间精密度试验
3.准确度试验
结果：地榆皂苷I平均回收率为101.09％，RSD为1.99％，准确度试验良好。
取已知含量的样品(地榆皂苷I含量0.199％)0.25g，平行六份，精密称定，分别加入与0.25g样品所含地榆皂苷I相对应的对照品溶液，按实施例1“4.2”项下供试品溶液的制备方法制成加样回收供试品溶液，按实施例1“4.1”项下色谱条件进样，分别进样3μL，以下列公式计算回收率及RSD，结果见表10。
表10 准确度实验
4.专属性试验
结论：由结果可知，空白溶剂对地榆皂苷I的测定没有干扰，该方法专属性强。
取空白溶剂、地榆皂苷I对照品溶液、枸骨叶药材供试品溶液，按实施例1“4.1”项下色谱条件进样，结果见图7。
5.耐用性试验
5.1稳定性试验
结果：供试品溶液在24小时内稳定性良好(RSD％＜2.0％)。
取样品1份，按实施例1“4.2”项下供试品溶液的制备方法制备供试液，在0、2、4、6、10、12、14、16、18、20、24小时进样3μL，测定峰面积值，计算其RSD值。结果见表11。
表11稳定性试验测定结果
5.2不同流速考察
结果：流速0.25mL/min～0.35mL/min之间，测定结果无差异，耐用性良好。
取样品1份，按实施例1“4.2”项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，考察0.25mL/min、0.30mL/min、0.35mL/min三个流速下对色谱峰分离及含量结果的影响。结果见表12、图8。
表12 不同流速考察
5.3柱温考察
结果：柱温在25℃～35℃之间，测定结果无显著差异，耐用性良好。
取样品1份，按实施例1“4.2”项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，考察25℃、30℃、35℃三个温度，结果见表13、图9。
表13 不同柱温的考察
5.4色谱柱考察
结果：三种不同型号十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的分离效果均较好，保留时间适中，说明色谱柱对样品的测定结果影响较小。
取样品1份，按实施例1“4.2”项下供试品溶液的制备方法制备供试液，分别采用柱1：BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)、柱2：BEH Shield RP18(2.1mm×100mm，1.7μm)、柱3：Eclipse Plus RRHD C18(Agilent，2.1×100mm，1.8μm)三种色谱柱进行分析，结果见表14、图10。
表14 不同色谱柱的比较
实施例3：枸骨叶饮片中地榆皂苷I的含量测定的专属性试验
结论：由结果可知，溶剂对枸骨叶饮片中的地榆皂苷I测定没有干扰，该方法专属性强，适用于枸骨叶饮片的含量测定。
取枸骨叶饮片约0.5g，按实施例1“4.2”项下供试品溶液的制备方法制备饮片溶液，再取空白溶剂，分别按实施例1“4.1”项下色谱条件进样，结果见图11。
实施例4：枸骨叶标准汤剂中地榆皂苷I的含量测定的专属性试验
结论：由结果可知，溶剂对枸骨叶标准汤剂中的地榆皂苷I测定没有干扰，该方法专属性强，适用于枸骨叶标准汤剂的含量测定。
取枸骨叶标准汤剂0.2g，按实施例1“4.2”项下供试品溶液的制备方法制备饮片溶液，再取空白溶剂，分别按实施例1“4.1”项下色谱条件进样，结果见图12。
实施例5：枸骨叶配方颗粒中地榆皂苷I的含量测定的专属性试验
结论：由结果可知，辅料对枸骨叶配方颗粒中的地榆皂苷I测定没有干扰，该方法专属性强，适用于枸骨叶配方颗粒的含量测定。
枸骨叶配方颗粒中所添加的辅料为麦芽糊精、二氧化硅及硬脂酸镁，取枸骨叶配方颗粒及缺枸骨叶的阴性样品按实施例1“4.2”项下供试品溶液的制备方法分别制备配方颗粒溶液和阴性溶液，按实施例1“4.1”项下色谱条件进样，结果见图13。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方法，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所述权利要求为准。
Claims (10)
1.一种枸骨叶样品的质量检测方法，其包括如下步骤：对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、液相色谱检测和数据分析，其中，所述数据分析包括计算所述枸骨叶样品中地榆皂苷I的含量。
2.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，所述枸骨叶样品选自枸骨叶的药材、饮片、提取物、标准汤剂和配方颗粒的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的质量检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测采用的条件包括：色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为乙腈或甲醇，优选的流动相A为乙腈；流动相B为甲酸水溶液、醋酸水溶液、磷酸水溶液或水，优选的流动相B为浓度以甲酸的体积百分比计为0.2％的甲酸水溶液。
4.根据权利要求3所述的质量检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测采用的条件还包括：利用所述流动相A与流动相B进行等度洗脱或梯度洗脱，优选为等度洗脱，更优选的流动相A与流动相B的体积比为15:85至50:50；流速为0.20-0.40mL/min；柱温为20-45℃；采用紫外检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器或电雾式检测器。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的质量检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备包括如下步骤：取枸骨叶样品粉末，精密称定，置容器中，精密加入提取溶剂，密塞，称定重量，提取后，放冷，再称定重量，用所述提取溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤，取二分之一体积的续滤液，蒸干，残渣加所述提取溶剂复溶，转移至定量容器中，加所述提取溶剂定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
6.根据权利要求5所述的质量检测方法，其特征在于，所述枸骨叶样品粉末与所述提取溶剂的质量体积比为1g:(15～800mL)。
7.根据权利要求5或6所述的质量检测方法，其特征在于，所述提取溶剂为醇类或醇类水溶液；优选地，所述提取溶剂为甲醇或甲醇水溶液；更优选地，所述甲醇水溶液的浓度以甲醇的体积百分比计大于等于30％。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的质量检测方法，其特征在于，所述提取采用超声、加热回流或振摇的方式进行，所述提取的时间为5-60min。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的质量检测方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备包括如下步骤：取地榆皂苷I对照品，精密称定，加入溶剂，混匀至溶清，即得；其中，所述溶剂为醇类或醇类水溶液；优选地，所述溶剂为甲醇或甲醇水溶液；更优选地，所述甲醇水溶液的浓度以甲醇的体积百分比计大于等于30％。
10.地榆皂苷I在枸骨叶样品质量检测中的用途，优选地，所述枸骨叶样品选自枸骨叶药材、饮片、提取物、标准汤剂、配方颗粒以及含有枸骨叶的经典名方物质基准和成品颗粒中的一种或多种。
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| CN202111614013.4A Pending CN116359355A (zh) | 2021-12-27 | 2021-12-27 | 地榆皂苷i在枸骨叶样品质量检测中的应用以及相应的质量检测方法 |
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN101810705A (zh) * | 2009-05-26 | 2010-08-25 | 成都地奥集团天府药业股份有限公司 | 地榆皂苷ⅰ的含量测定方法 |
| CN102721773A (zh) * | 2009-05-26 | 2012-10-10 | 成都地奥制药集团有限公司 | 地榆皂苷i的含量测定方法 |
| CN109975437A (zh) * | 2017-12-27 | 2019-07-05 | 四川科瑞德制药股份有限公司 | 地榆或含有地榆的产品中地榆皂苷i的分析方法 |
-
2021
- 2021-12-27 CN CN202111614013.4A patent/CN116359355A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101810705A (zh) * | 2009-05-26 | 2010-08-25 | 成都地奥集团天府药业股份有限公司 | 地榆皂苷ⅰ的含量测定方法 |
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| Title |
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