CN116332766A - 一种从金银花中提取纯化绿原酸的工艺及纯化绿原酸 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从金银花中提取纯化绿原酸的工艺及利用该工艺提取的纯化绿原酸，属于天然活性成分提取技术领域。本发明包括纯化的绿原酸粗品的提取、纯化的绿原酸粗品经酸性水溶液‑乙酸乙酯‑碱性水溶液纯化、绿原酸经水‑乙酸乙酯‑水进一步纯化和绿原酸经乙醇‑乙酸乙酯混合溶剂蒸发结晶。本发明最终制备得到的纯化绿原酸的纯度可达90％以上，其仅使用了水、乙醇、乙酸乙酯三种试剂，且所使用的乙醇和乙酸乙酯都可以通过本发明的工艺进行闭环重复利用，几乎不产生废液，无需后续废液处理，产生了良好的经济效益和环保效益。
Description
技术领域
本发明涉及天然活性成分提取技术领域，尤其涉及一种从金银花中提取纯化绿原酸的工艺及利用该工艺提取的纯化绿原酸，特别涉及将该纯化绿原酸应用于食品安全技术领域。
背景技术
食源性致病菌是食品安全的重大隐患，是引起食源性疾病的主要原因。常见的抗菌成分包括无机抗菌成分、合成有机抗菌成分以及天然有机抗菌成分等几大类。无机抗菌成分以具有抗菌活性的金属离子为典型代表。金属离子虽然有着抗菌效率高、抗菌范围广等优点，但是研究显示金属离子及金属基纳米粒子普遍存在细胞毒性问题。对合成有机抗菌成分研究比较多的有苯酚类、双胍类、卤胺类化合物等，虽然此类抗菌成分具有广谱高效的抗菌活性，但是通常存在自身毒性强或易分解生成有毒物质等缺点。天然抗菌成分来源广泛、类别丰富，具有良好的应用前景，目前国内外研究比较多的包括壳聚糖、植物精油、抗菌肽、溶菌酶、噬菌体、细菌素、有机酸、黄酮类以及多酚类等。
金银花是忍冬科忍冬属植物，广泛分布于我国河南、山东等地区。作为一种重要的中药材，金银花具有清热解毒、消炎退肿等功效,是连花清瘟胶囊、银翘解毒片、双黄连口服液、银黄颗粒等中成药中的主要成分。金银花中的主要活性成分是绿原酸。绿原酸是一种有机酸，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、清除自由基、降血压、降血脂等作用。作为一种天然抗菌剂，绿原酸在食品安全领域具有巨大的应用潜力。
目前，从金银花中提取绿原酸的方法主要有水提法、乙醇提取法、超声或微波辅助提取法、酶解法等，绿原酸纯化的方法主要有大孔树脂法、膜分离法、乙酸乙酯法、凝胶柱层析法、高速逆流色谱法等。然而，目前很多提取纯化方法存在纯度低下以及环境污染等问题，同时，提取所消耗的用品以及所产生的废弃物较多，不利于绿色和可持续性发展。例如，乙醇提取法需要消耗大量的有机溶剂，需要后续处理；大孔树脂法需要定期对树脂进行再生，再生过程中需要用到酸、碱、有机溶剂等，耗时长，产生的废弃物需要后续处理。因此，研发环保、可持续的绿原酸提取纯化工艺，具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，一方面，为解决现有技术中的提取纯化方法存在纯度低下、环境污染以及产生废弃物较多的技术问题，本发明提供了一种从金银花中提取纯化绿原酸的工艺，其最终制备得到的纯化绿原酸的纯度可达90％以上，其仅使用了水、乙醇、乙酸乙酯三种试剂，且所使用的乙醇和乙酸乙酯都可以通过本发明的工艺进行闭环重复利用，几乎不产生废液，无需后续废液处理，产生了良好的经济效益和环保效益。
为实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
一种从金银花中提取纯化绿原酸的工艺，包括如下步骤：
步骤(1)、将金银花叶子或者枝干磨成粉末状，得到金银花粉末；
步骤(2)、对步骤(1)中的金银花粉末进行水提；
步骤(3)、水提结束后过滤，初步去除不溶性杂质，得金银花沉淀和上清液，将上清液进一步去除不溶性杂质，得澄清上清液；
步骤(4)、对步骤(2)中得到的澄清上清液进行干燥，可初步得到纯化的绿原酸粉末粗品；
步骤(5)、取步骤(4)中得到的纯化的绿原酸粉末粗品，加入酸性水溶液，配置成绿原酸水溶液粗品；
步骤(6)、向步骤(5)中得到的绿原酸水溶液粗品中加入乙酸乙酯，振荡萃取，使绿原酸从水中迁移到乙酸乙酯中，得到混合液一；
步骤(7)、对步骤(6)中得到的混合液一进行分液静置，待上层的乙酸乙酯层和下层的水层完全分离后，取上层乙酸乙酯，向乙酸乙酯中加入碱性水溶液，振荡萃取，使绿原酸从乙酸乙酯中迁移到水中，得到混合液二；
步骤(8)、对步骤(7)中的混合液二进行分液静置，待上层的乙酸乙酯层和下层的绿原酸水溶液完全分离后，取下层的绿原酸水溶液进行干燥，可得到纯化的绿原酸粉末；
步骤(9)、取步骤(8)制得的纯化的绿原酸粉末，加入纯水，配置成绿原酸水溶液并向绿原酸水溶液中加入乙酸乙酯，振荡萃取，使绿原酸从水中迁移到乙酸乙酯中，经过干燥，可得到进一步纯化的绿原酸粉末；
步骤(10)、取步骤(9)中制得的进一步纯化的绿原酸粉末，加入乙醇-乙酸乙酯混合试剂，进行振荡提取和抽滤，得滤液和滤渣；
步骤(11)、取步骤(10)得到的滤液进行蒸发浓缩结晶，待观察到大量悬浮物出现时，停止蒸发，抽滤，得滤渣，干燥，即为最终纯化的绿原酸粉末。
优选地，步骤(8)之后步骤(9)之前还包括步骤(81)：
重复步骤(6)-(8)。
优选地，步骤(9)之后步骤(10)之前还包括步骤(91)：
重复步骤(7)-(81)。
优选地，将步骤(7)中的碱性水溶液替换为纯水。
优选地，还包括重复步骤(5)。
优选地，还包括步骤(12)，重复步骤(11)。
优选地，还包括步骤(13)，将步骤(10)得到的滤渣重复提取，重复结晶，将制得的最终纯化的绿原酸粉末合并。
优选地，还包括步骤(14)，将步骤(11)-(13)得到的滤液残留合并，重复结晶，将制得的最终纯化的绿原酸粉末合并。
优选地，步骤(6)中的乙酸乙酯为全新的分析纯乙酸乙酯；
步骤(6)之后采用的乙酸乙酯为之前用过的乙酸乙酯。
另一方面，本发明提供了一种纯化绿原酸，根据上述从金银花中提取纯化绿原酸的工艺制备得到，其纯度可达90％以上。
本发明相对于现有技术，具有如下的有益效果：
本发明提供的从金银花中提取纯化绿原酸的工艺，其最终制备得到的纯化绿原酸的纯度可达90％以上，其仅使用了水、乙醇、乙酸乙酯三种试剂，且所使用的乙醇和乙酸乙酯都可以通过本发明的工艺进行闭环重复利用，几乎不产生废液，无需后续废液处理，产生了良好的经济效益和环保效益。
关于本发明的其他的有益效果，将在下述的具体实施方式部分进行详细说明。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图；
图2为金银花枝干和叶子水提液HPLC谱图；
图3为绿原酸HPLC标准曲线；
具体实施方式
如图1所示，本发明提供了一种从金银花中提取纯化绿原酸的工艺，包括如下步骤：
步骤(1)、将金银花叶子或者枝干磨成粉末状，得到金银花粉末，金银花粉末粒度优选为40-200目；
步骤(2)、向步骤(1)中的金银花粉末中加入水，加热搅拌，金银花粉末和水的比例优选为1:8～1:40(按重量计)，更优选为1:15-1:20，温度优选为30-100度，更优选为60-80度，提取时间优选为15分钟-3小时，更优选为45分钟到1小时；
步骤(3)、步骤(2)水提取结束后，用50-300目滤网过滤，初步去除不溶性杂质，得金银花沉淀和上清液，将上清液进一步去除不溶性杂质(优选选用以下的方法)，得澄清上清液；
采用如下的3种方法将上清液进一步去除不溶性杂质：
方法1：使用1微米或者5微米PP棉进一步过滤，但对PP棉消耗量较大，且不可再生；
方法2：向上清液中加入1％PAC絮凝剂，缓慢加入，搅拌边观察溶液变化，待出现明显颗粒物，停止加入，停止搅拌，静置，可得澄清上清液；
方法3：将上清液离心，转速4500-12000rpm，离心时间3-5分钟，离心次数1-3次，可得澄清上清液。
更优选方法2和方法3，其中，方法3中优选转速10000-12000rpm，离心次数2-3次。将上述金银花沉淀继续加水提取，重复提取次数为2-4次，所得上清液并入第一次提取的上清液中；
步骤(4)、对步骤(2)中得到的澄清上清液通过喷雾干燥机进行干燥，可初步得到纯化的绿原酸粉末粗品；
优选通过高效液相色谱仪对纯化的绿原酸粉末粗品的含量进行检测。其中，喷雾干燥机的参数优选设置为：风机100％，温度160-220度，温度更优选为160-180度，蠕动泵20-60％，蠕动泵更优选为30-50％。
步骤(5)、取步骤(4)中得到的纯化的绿原酸粉末粗品，加入酸性水溶液，配置成绿原酸水溶液粗品。其中，纯化的绿原酸粉末粗品和酸性水溶液的比例优选为1:4-1:11(以重量计)，更优选为1:5-1:8，酸性水溶液pH优选为0-5更优选为0-2。酸性水溶液由盐酸和纯水配制而成。
步骤(6)、向步骤(5)中得到的绿原酸水溶液粗品中加入乙酸乙酯，振荡萃取，使绿原酸从水中迁移到乙酸乙酯中，得到混合液一(可称为绿原酸水溶液)。其中，绿原酸水溶液粗品和乙酸乙酯的比例优选为为1:1到1:5(以体积计)，更优选为1:1.5到1:2.5(以体积计)，萃取时间优选为10-60分钟，更优选为10-15分钟，振荡速度优选为50-300rpm，更优选为150-200rpm，萃取温度优选为10-70度，更优选为15-35度；
步骤(7)、萃取过程结束后，将步骤(6)中得到的混合液一移入分液漏斗中，静置，待上层的乙酸乙酯层和下层的水层完全分离后，此时，水层中含有一定量的绿原酸，取上层乙酸乙酯，向乙酸乙酯中加入碱性水溶液，振荡萃取，使绿原酸从乙酸乙酯中迁移到水中，得到混合液二(绿原酸碱性水溶液)。其中，碱性水溶液的pH优选为8-13，更优选为10-12，碱性水溶液由氢氧化钠和纯水配制而成，乙酸乙酯萃取液和碱性水溶液的比例优选为5:1到1:1(以体积计)，更优选为2:1到1:1(以体积计)，提取时间优选为10-60分钟，更优选为10-15分钟，振荡速度优选为50-300rpm，更优选为150-200rpm，提取温度优选为10-70度，更优选为15-35度。
其中，上述步骤(6)-(7)的原理如下：
绿原酸是一种有机酸，在酸性条件下，绿原酸解离受到限制，主要是分子形式存在，倾向于从水中迁移到乙酸乙酯中；在碱性条件下，绿原酸和碱反应变成离子形式(酸根)，倾向于从乙酸乙酯中迁移到水中。
步骤(8)、上述萃取过程结束后，对步骤(7)中的混合液二移入分液漏斗中，静置，待水层(下层)和乙酸乙酯层(上层)完全分离后，取下层绿原酸水溶液，通过喷雾干燥机进行干燥，可得到纯化的绿原酸粉末，通过高效液相色谱仪对其含量进行检测；
为进一步提高绿原酸的回收率，本发明中，还包括步骤(81)：
重复步骤(6)-(8)，具体为：
步骤(6)之后的水层中还含有大量的绿原酸，按照步骤(6)的参数向已经萃取过1次的绿原酸水溶液粗品中加入乙酸乙酯进行2次萃取，得到含有绿原酸的乙酸乙酯溶液，按照步骤(7)的参数向含有绿原酸的乙酸乙酯溶液加入碱性水溶液进行萃取，得到含有绿原酸的水溶液，按照步骤(8)进行喷雾干燥，得到进一步纯化的绿原酸粉末，与步骤(8)所得的纯化的绿原酸粉末合并，视为同一批次产品。
其中，除首次萃取采用全新的分析纯乙酸乙酯外，接下来的萃取采用之前用过的乙酸乙酯(步骤(6)第一次振荡萃取用过的乙酸乙酯)，以此形成闭合工艺，可最大限度地避免或减少乙酸乙酯废液的产生。
实验结果表明，使用之前用过的乙酸乙酯并不会对最终绿原酸产品的纯度造成不良的影响(通过以下的实施例和对比例进行说明)。
步骤(6)经过多次萃取后的水溶液中仍然含有绿原酸，作为优选，参考步骤(5)向其中继续添加绿原酸粉末粗品(取步骤(4)中得到的纯化的绿原酸粉末粗品，加入酸性水溶液，配置成绿原酸水溶液粗品；步骤(6)经过多次萃取后的水溶液中仍然含有绿原酸(此时仍然是含有绿原酸的酸性水溶液)，不能浪费里面的绿原酸，但是，由于经过了多次萃取，里面的绿原酸含量已经比较低，所以，再向里面加入步骤(4)中得到的纯化的绿原酸粉末粗品，可以增大酸性水溶液中的绿原酸浓度，以便于后续更高效的重复萃取)，以此形成闭合工艺，可最大限度地避免或减少酸性废液的产生，同时，可最大限度地减少绿原酸的损失。
现有技术提取之后的水溶液中还剩下绿原酸，基本上里面的绿原酸被浪费掉了，而且由于是酸性溶液，还要进行废液处理，不环保，也提高了成本。虽然有的现有技术经过3次萃取，水溶液中的绿原酸已经所剩无几，但是，经过我们几百次的实验数据，现有技术中的报道可能并不真实；鉴于此，我们充分利用了剩余的含有绿原酸的水溶液，通过向其中再次加入绿原酸粉末粗品，形成了一个动态的、可持续的、不间断的萃取工艺，可避免废液的产生以及绿原酸的浪费。
实验结果表明，向多次萃取后的水溶液中继续加入绿原酸粉末并不会对最终绿原酸产品的纯度造成不良的影响(通过以下的实施例和对比例进行说明)。
步骤(9)、取步骤(8)制得的纯化的绿原酸粉末，加入纯水，配置成绿原酸水溶液并向绿原酸水溶液中加入乙酸乙酯，振荡萃取，使绿原酸从水中迁移到乙酸乙酯中，经过干燥，可得到进一步纯化的绿原酸粉末。其中，纯化的绿原酸粉末和水的比例优选为1:4-1:8(以重量计)，更优选为1:5-1:6，绿原酸水溶液和乙酸乙酯的比例优选为1:1到1:5(以体积计)，更优选为1:1.5到1:2.5(以体积计)，萃取时间优选为10-30分钟，更优选为10-15分钟，振荡速度优选为100-200rpm，更优选为150-200rpm，萃取温度优选为10-50度，更优选为15-35度。
同样为进一步提高回收率，本发明中还包括步骤(91)，具体为：
重复上述步骤(7)-(81)，区别在于，将步骤(7)中的碱性水溶液替换为纯水。经过喷雾干燥机进行干燥，可得到进一步纯化的绿原酸粉末，通过高效液相色谱仪对其含量进行检测；
步骤(10)、取步骤(9)中制得的进一步纯化的绿原酸粉末，加入乙醇-乙酸乙酯混合试剂，进行振荡提取和抽滤，得滤液和滤渣。其中，乙醇和乙酸乙酯的混合比例优选为1:1至1:9(按体积计)，更优选为1:2至1:4(按体积计)，振荡速度优选为50-300rpm，更优选为150-200rpm，提取时间优选为5-60分钟，更优选为5-15分钟，提取温度优选为10-80度，更优选为20-40度。
该步骤中，我们优选加入乙醇-乙酸乙酯混合试剂，虽然甲醇-乙酸乙酯混合试剂也可以，但是，我们通过大量的实验发现，使用乙醇的效果更好。而且，乙醇使用起来更加安全。甲醇的毒性相对较高。现有技术中常规使用的是甲醇-乙酸乙酯混合体系。
步骤(11)、取步骤(10)得到的滤液进行蒸发浓缩结晶，待观察到大量悬浮物出现时，停止蒸发，抽滤，得滤渣，干燥，即为最终纯化的绿原酸粉末。其中，蒸发结晶选用的温度优选为20-100度，更优选为60-80度，选用的设备优选为旋转蒸发仪和通风橱。
在本发明中，还包括步骤(12)，重复步骤(11)1-4次，重复蒸发结晶优选2-3次。
在本发明，还包括步骤(13)，将步骤(10)得到的滤渣重复提取，优选2-6次，重复结晶，将制得的最终纯化的绿原酸粉末合并，视为同一批次产品。将最后一次提取剩下的滤渣并入绿原酸1-4，进行回收利用，可最大限度地减少绿原酸的损失。实验结果表明，将含有绿原酸的滤渣并入未提取过的绿原酸粉末中并不会对最终绿原酸产品的纯度造成不良的影响(通过以下的实施例和对比例进行说明)。
在本发明，还包括步骤(14)，将步骤(11)-(13)得到的滤液残留合并，重复结晶，将制得的最终纯化的绿原酸粉末合并，视为同一批次产品。
另一方面，本发明提供了一种纯化绿原酸，根据上述从金银花中提取纯化绿原酸的工艺制备得到，其纯度可达90％以上。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚详细的说明。
如图2所示，金银花枝干和叶子水提液HPLC谱图
分别取金银花枝干和叶子2克，磨成粉末，加入28克水，37度，200rpm，振荡提取30分钟。用300目滤网过滤，将滤液以10000rpm的速度离心3分钟，得上清液，测HPLC。HPLC参数如下：(1)流动相为0.5％磷酸水溶液和甲醇，二者比例为：0-16min为25％甲醇和75％0.5％磷酸水溶液；16min之后为55％甲醇和45％0.5％磷酸水溶液；(2)进样量为10微升；(3)流速为0.8mL/min；(4)检测波长351nm；(5)HPLC柱为C18柱，5um，4.6×150mm。根据上述参数条件得到附图2。
如图3所示，绿原酸HPLC标准曲线绘制
取绿原酸标准品20mg，加纯水10g，配置成浓度为2mg/mL的绿原酸标准水溶液。用纯水将其稀释，配置成浓度分别为0.5mg/mL，0.4mg/mL，0.3mg/mL，0.2mg/mL，0.1mg/mL，0mg/mL的标准溶液，测量HPLC(柱子规格：C18，5-Micron，4.6×150mm；仪器型号：安捷伦高效液相色谱仪1290)，根据峰高和峰面积值绘制标准曲线，得出绿原酸浓度和峰高的关系式为y＝1815.5x，绿原酸浓度和峰面积的关系式为y＝17351x。
实施例1
纯化的绿原酸粗品的提取
取金银花叶4730克，磨成粉末，加水50kg，搅拌加热至80度，提取1小时后冷却至室温，过滤，4500rpm离心5分钟，喷雾干燥(风机100％，温度180度，蠕动泵40％)。提取3次，共得纯化的绿原酸粗品1048克，得率22％。测HPLC，根据峰高计算其含量为3.3％。重复该步骤，最终收集到纯化的绿原酸粗品10千克左右，便于后续流程的进行。
纯化的绿原酸粗品经酸性水溶液-乙酸乙酯-碱性水溶液纯化
取纯化的绿原酸粗品200克，磨成粉末，加pH＝1的酸性水溶液1000克，搅拌溶解，之后加入2000克乙酸乙酯，15度、200rpm振荡萃取10分钟，静置分层，取上层乙酸乙酯，加入1400克pH＝11的氢氧化钠水溶液，15度、200rpm振荡萃取10分钟，静置分层，收集下层绿原酸碱性水溶液。向乙酸乙酯萃取后的绿原酸酸性水溶液中继续加入1700克乙酸乙酯，15度、200rpm振荡萃取10分钟，静置分层，取上层乙酸乙酯，加入1500克pH＝11的氢氧化钠水溶液，15度、200rpm振荡萃取10分钟，静置分层，收集下层绿原酸碱性水溶液。合并下层绿原酸碱性水溶液，喷雾干燥，得绿原酸粉末4.14克。测HPLC，根据峰高计算其含量为47.8％。重复该步骤，最终收集到纯化的绿原酸粉末100克左右，便于后续流程的进行。
绿原酸经水-乙酸乙酯-水进一步纯化
取经乙酸乙酯纯化后的绿原酸粉末18克，磨成粉末，加纯水180克，搅拌溶解，之后加入900克乙酸乙酯，20度、300rpm振荡萃取10分钟，静置分层，取下层绿原酸水溶液，继续加入900克乙酸乙酯，20度、300rpm振荡萃取10分钟，静置分层，取下层绿原酸水溶液，继续加入1100克乙酸乙酯，20度、300rpm振荡萃取10分钟，静置分层，汇集3次萃取后的上层乙酸乙酯，加入600克水，20度、300rpm振荡萃取10分钟，静置分层，取上层乙酸乙酯，继续加入600克水，20度、300rpm振荡萃取10分钟，静置分层。合并下层绿原酸水溶液，喷雾干燥，得进一步纯化的绿原酸粉末0.77克。测HPLC，根据峰高计算其含量为67.0％。重复该步骤，最终收集到进一步纯化的绿原酸粉末10克左右，便于后续流程的进行。
绿原酸经乙醇-乙酸乙酯混合溶剂蒸发结晶
将乙醇和乙酸乙酯按照体积比1比3混合，配置成混合溶剂。取经水-乙酸乙酯-水进一步纯化的绿原酸粉末2.5克，加入混合溶剂5000毫升，20度、300rpm振荡提取10分钟，抽滤，将滤液加入旋转蒸发仪中，40度浓缩，待到出现大量白色悬浮物后，将混合溶液抽滤，取滤渣，洗涤干燥得绿原酸粉末。向提取过1次的绿原酸滤渣中继续加入混合溶剂5000毫升，重复上述步骤，将收集到的绿原酸粉末合并。取蒸发结晶后的绿原酸粉末，重复上述步骤，进行二次重结晶和三次重结晶。将三次重结晶后收集到的绿原酸粉末测HPLC，根据峰高计算其含量为91.2％。
实施例2
使用之前用过的乙酸乙酯并不会对最终绿原酸产品的纯度造成不良的影响，具体如下：
纯化的绿原酸粗品经酸性水溶液-使用过的乙酸乙酯-碱性水溶液纯化
取实施例1中纯化的绿原酸粗品100克，磨成粉末，加pH＝2的酸性水溶液800克，搅拌溶解，之后加入1600克使用过的乙酸乙酯，20度、200rpm振荡萃取12分钟，静置分层，取上层乙酸乙酯，加入1100克pH＝12的氢氧化钠水溶液，20度、200rpm振荡萃取12分钟，静置分层，收集下层绿原酸碱性水溶液。向使用过的乙酸乙酯萃取后的绿原酸酸性水溶液中继续加入1200克使用过的乙酸乙酯，20度、200rpm振荡萃取12分钟，静置分层，取上层乙酸乙酯，加入1000克pH＝12的氢氧化钠水溶液，20度、200rpm振荡萃取12分钟，静置分层，收集下层绿原酸碱性水溶液。合并下层绿原酸碱性水溶液，喷雾干燥，得绿原酸粉末2.56克。测HPLC，根据峰高计算其含量为48.2％。重复该步骤，最终收集到纯化的绿原酸粉末50克左右，便于后续流程的进行。
绿原酸经水-使用过的乙酸乙酯-水进一步纯化
取经使用过的乙酸乙酯纯化后的绿原酸粉末13克，磨成粉末，加纯水130克，搅拌溶解，之后加入650克使用过的乙酸乙酯，20度、200rpm振荡萃取12分钟，静置分层，取下层绿原酸水溶液，继续加入520克乙酸乙酯，20度、200rpm振荡萃取12分钟，静置分层，取下层绿原酸水溶液，继续加入780克乙酸乙酯，20度、200rpm振荡萃取12分钟，静置分层，汇集3次萃取后的上层乙酸乙酯，加入500克水，20度、200rpm振荡萃取12分钟，静置分层，取上层乙酸乙酯，继续加入500克水，20度、200rpm振荡萃取12分钟，静置分层。合并下层绿原酸水溶液，喷雾干燥，得进一步纯化的绿原酸粉末0.84克。测HPLC，根据峰高计算其含量为68.7％。
绿原酸经乙醇-使用过的乙酸乙酯混合溶剂蒸发结晶
将乙醇和使用过的乙酸乙酯按照体积比1比3混合，配置成混合溶剂。取经水-使用过的乙酸乙酯-水进一步纯化的绿原酸粉末0.6克，加入混合溶剂1200毫升，20度、200rpm振荡提取12分钟，抽滤，将滤液加入旋转蒸发仪中，65度浓缩，待到出现大量白色悬浮物后，将混合溶液抽滤，取滤渣，洗涤干燥得绿原酸粉末。向提取过1次的绿原酸滤渣中继续加入混合溶剂1000毫升，重复上述步骤，将收集到的绿原酸粉末合并。取蒸发结晶后的绿原酸粉末，重复上述步骤，进行二次重结晶和三次重结晶。将三次重结晶后收集到的绿原酸粉末测HPLC，根据峰高计算其含量为92.8％。
对比例2
纯化的绿原酸粗品经酸性水溶液-全新的乙酸乙酯-碱性水溶液纯化
同实施例2，不同之处在于，将实施例2中的使用过的乙酸乙酯换成未使用过的全新乙酸乙酯，其余相同。得绿原酸粉末2.12克。测HPLC，根据峰高计算其含量为47.3％。重复该步骤，最终收集到纯化的绿原酸粉末50克左右，便于后续流程的进行。
绿原酸经水-全新的乙酸乙酯-水进一步纯化
同实施例2，不同之处在于，将实施例2中的使用过的乙酸乙酯换成未使用过的全新乙酸乙酯，其余相同。得进一步纯化的绿原酸粉末0.84克。测HPLC，根据峰高计算其含量为67.4％。
绿原酸经乙醇-全新的乙酸乙酯混合溶剂蒸发结晶
同实施例2，不同之处在于，将实施例2中的使用过的乙酸乙酯换成未使用过的全新乙酸乙酯，其余相同。将三次重结晶后收集到的绿原酸粉末测HPLC，根据峰高计算其含量为92.1％。
实施例2和对比例2绿原酸含量
由上述表格的内容可知，使用之前用过的乙酸乙酯并不会对最终绿原酸产品的纯度造成不良的影响。
实施例3
向多次萃取后的水溶液中继续加入绿原酸粉末并不会对最终绿原酸产品的纯度造成不良的影响
取萃取过3次的绿原酸水溶液，继续加入绿原酸粉末
取萃取过3次的绿原酸水溶液800克，加入实施例1中纯化的绿原酸粗品100克，搅拌溶解，之后加入2000克乙酸乙酯，20度、200rpm振荡萃取15分钟，静置分层，取上层乙酸乙酯，加入1000克pH＝12的氢氧化钠水溶液，20度、200rpm振荡萃取15分钟，静置分层，收集下层绿原酸碱性水溶液。向乙酸乙酯萃取后的绿原酸酸性水溶液中继续加入1500克乙酸乙酯，20度、200rpm振荡萃取15分钟，静置分层，取上层乙酸乙酯，加入1000克pH＝12的氢氧化钠水溶液，20度、200rpm振荡萃取15分钟，静置分层，收集下层绿原酸碱性水溶液。继续向乙酸乙酯萃取后的绿原酸酸性水溶液中加入1000克乙酸乙酯，20度、200rpm振荡萃取15分钟，静置分层，取上层乙酸乙酯，加入1000克pH＝12的氢氧化钠水溶液，20度、200rpm振荡萃取15分钟，静置分层，收集下层绿原酸碱性水溶液。共计萃取3次。合并萃取的下层绿原酸碱性水溶液，喷雾干燥，得绿原酸粉末3.85克。测HPLC，根据峰高计算其含量为46.8％。重复该步骤，最终收集到纯化的绿原酸粉末50克左右，便于后续流程的进行。
绿原酸经水-乙酸乙酯-水进一步纯化
取上述经乙酸乙酯纯化后的绿原酸粉末15克，磨成粉末，加纯水160克，搅拌溶解，之后加入720克使用过的乙酸乙酯，30度、150rpm振荡萃取15分钟，静置分层，取下层绿原酸水溶液，继续加入580克乙酸乙酯，30度、150rpm振荡萃取15分钟，静置分层，取下层绿原酸水溶液，继续加入830克乙酸乙酯，30度、150rpm振荡萃取15分钟，静置分层，汇集3次萃取后的上层乙酸乙酯，加入600克水，30度、150rpm振荡萃取15分钟，静置分层，取上层乙酸乙酯，继续加入600克水，30度、150rpm振荡萃取15分钟，静置分层。合并下层绿原酸水溶液，喷雾干燥，得进一步纯化的绿原酸粉末1.22克。测HPLC，根据峰高计算其含量为69.4％。
绿原酸经乙醇-乙酸乙酯混合溶剂蒸发结晶
将乙醇和乙酸乙酯按照体积比1比4混合，配置成混合溶剂。取经水-使用过的乙酸乙酯-水进一步纯化的绿原酸粉末0.9克，加入混合溶剂1600毫升，15度、200rpm振荡提取15分钟，抽滤，将滤液加入旋转蒸发仪中，70度浓缩，待到出现大量白色悬浮物后，将混合溶液抽滤，取滤渣，洗涤干燥得绿原酸粉末。向提取过1次的绿原酸滤渣中继续加入混合溶剂1200毫升，重复上述步骤，将收集到的绿原酸粉末合并。取蒸发结晶后的绿原酸粉末，重复上述步骤，进行二次重结晶和三次重结晶。将三次重结晶后收集到的绿原酸粉末测HPLC，根据峰高计算其含量为93.5％。
对比例3
纯化的绿原酸粗品经酸性水溶液-乙酸乙酯-碱性水溶液纯化
将实施例3中的“取萃取过3次的绿原酸水溶液800克，加入纯化的绿原酸粗品100克”改成“取纯化的绿原酸粗品100克，磨成粉末，加pH＝2的酸性水溶液800克”，其余相同。得绿原酸粉末3.24克。测HPLC，根据峰高计算其含量为46.4％。重复该步骤，最终收集到纯化的绿原酸粉末50克左右，便于后续流程的进行。
绿原酸经水-乙酸乙酯-水进一步纯化
同实施例3。唯一区别在于使用的绿原酸粉末不一样。得到进一步纯化的绿原酸粉末1.15克。测HPLC，根据峰高计算其含量为67.2％。
绿原酸经乙醇-乙酸乙酯混合溶剂蒸发结晶
同实施例3。唯一区别在于使用的绿原酸粉末不一样。测HPLC，根据峰高计算其含量为93.0％。
实施例3和对比例3绿原酸含量
实施例4
将含有绿原酸的滤渣并入未提取过的绿原酸粉末中并不会对最终绿原酸产品的纯度造成不良的影响；
纯化的绿原酸粗品的提取
同实施例1。
纯化的绿原酸粗品经酸性水溶液-乙酸乙酯-碱性水溶液纯化
同实施例1。
绿原酸经水-乙酸乙酯-水进一步纯化
同实施例1。
绿原酸经乙醇-乙酸乙酯混合溶剂蒸发结晶
将乙醇和乙酸乙酯按照体积比1比2.5混合，配置成混合溶剂。取实施例1中经乙醇-乙酸乙酯提取过2次的含有绿原酸的滤渣1.9克，加入本实施例(实施例4)中经水-乙酸乙酯-水进一步纯化得到的绿原酸粉末2.1克，共计4.0克。加入混合溶剂3500毫升，40度、150rpm振荡提取15分钟，抽滤，将滤液加入旋转蒸发仪中，60度浓缩，待到出现大量白色悬浮物后，将混合溶液抽滤，取滤渣，洗涤干燥得绿原酸粉末。测HPLC，根据峰高计算其含量为94.7％。
对比例4
同实施例4。唯一区别在于将“取实施例1中经乙醇-乙酸乙酯提取过2次的含有绿原酸的滤渣1.9克，加入未提取过的绿原酸粉末2.1克，共计4.0克。”替换为“取本实施例(实施例4)中经水-乙酸乙酯-水进一步纯化得到的绿原酸粉末4.0克”。测HPLC，根据峰高计算其含量为94.5％。
实施例4和对比例4绿原酸含量
以上所述，仅为本发明较佳的实施例，但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变；都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种从金银花中提取纯化绿原酸的工艺，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)、将金银花叶子或者枝干磨成粉末状，得到金银花粉末；
步骤(2)、对步骤(1)中的金银花粉末进行水提；
步骤(3)、水提结束后过滤，初步去除不溶性杂质，得金银花沉淀和上清液，将上清液进一步去除不溶性杂质，得澄清上清液；
步骤(4)、对步骤(2)中得到的澄清上清液进行干燥，可初步得到纯化的绿原酸粉末粗品；
步骤(5)、取步骤(4)中得到的纯化的绿原酸粉末粗品，加入酸性水溶液，配置成绿原酸水溶液粗品；
步骤(6)、向步骤(5)中得到的绿原酸水溶液粗品中加入乙酸乙酯，振荡萃取，使绿原酸从水中迁移到乙酸乙酯中，得到混合液一；
步骤(7)、对步骤(6)中得到的混合液一进行分液静置，待上层的乙酸乙酯层和下层的水层完全分离后，取上层乙酸乙酯，向乙酸乙酯中加入碱性水溶液，振荡萃取，使绿原酸从乙酸乙酯中迁移到水中，得到混合液二；
步骤(8)、对步骤(7)中的混合液二进行分液静置，待上层的乙酸乙酯层和下层的绿原酸水溶液完全分离后，取下层的绿原酸水溶液进行干燥，可得到纯化的绿原酸粉末；
步骤(9)、取步骤(8)制得的纯化的绿原酸粉末，加入纯水，配置成绿原酸水溶液并向绿原酸水溶液中加入乙酸乙酯，振荡萃取，使绿原酸从水中迁移到乙酸乙酯中，经过干燥，可得到进一步纯化的绿原酸粉末；
步骤(10)、取步骤(9)中制得的进一步纯化的绿原酸粉末，加入乙醇-乙酸乙酯混合试剂，进行振荡提取和抽滤，得滤液和滤渣；
步骤(11)、取步骤(10)得到的滤液进行蒸发浓缩结晶，待观察到大量悬浮物出现时，停止蒸发，抽滤，得滤渣，干燥，即为最终纯化的绿原酸粉末。
2.根据权利要求1所述的一种从金银花中提取纯化绿原酸的工艺，其特征在于，步骤(8)之后步骤(9)之前还包括步骤(81)：
重复步骤(6)-(8)。
3.根据权利要求2所述的一种从金银花中提取纯化绿原酸的工艺，其特征在于，步骤(9)之后步骤(10)之前还包括步骤(91)：
重复步骤(7)-(81)。
4.根据权利要求3所述的一种从金银花中提取纯化绿原酸的工艺，其特征在于，将步骤(7)中的碱性水溶液替换为纯水。
5.根据权利要求1所述的一种从金银花中提取纯化绿原酸的工艺，其特征在于，还包括重复步骤(5)。
6.根据权利要求1所述的一种从金银花中提取纯化绿原酸的工艺，其特征在于，还包括步骤(12)，重复步骤(11)。
7.根据权利要求6所述的一种从金银花中提取纯化绿原酸的工艺，其特征在于，还包括步骤(13)，将步骤(10)得到的滤渣重复提取，重复结晶，将制得的最终纯化的绿原酸粉末合并。
8.根据权利要求7所述的一种从金银花中提取纯化绿原酸的工艺，其特征在于，还包括步骤(14)，将步骤(11)-(13)得到的滤液残留合并，重复结晶，将制得的最终纯化的绿原酸粉末合并。
9.根据权利要求1所述的一种从金银花中提取纯化绿原酸的工艺，其特征在于，步骤(6)中的乙酸乙酯为全新的分析纯乙酸乙酯；
步骤(6)之后采用的乙酸乙酯为之前用过的乙酸乙酯。
10.一种纯化绿原酸，其特征在于，根据权利要求1-9中任一项所述的一种从金银花中提取纯化绿原酸的工艺制备得到。
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