CN116327708A - 纳米颗粒的制备方法以及纳米载药颗粒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了工艺简单可控、能够将聚谷氨酸和单宁酸复合为纳米颗粒的纳米颗粒的制备方法以及纳米载药颗粒的制备方法。用于载药的纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：获取第一溶液，所述第一溶液包括聚谷氨酸、单宁酸、水和N,N‑二甲基甲酰胺；获取第二溶液，所述第二溶液包括羧基催化剂和水；向第一溶液中加入第二溶液，反应一段时间后生成固液混合物，再经固液分离处理即得到纳米颗粒。纳米载药颗粒的制备方法，包括以下步骤：在上述的制备方法中的第一溶液或第二溶液中加入药物；在纳米颗粒的生成过程中使药物原位负载在纳米颗粒上，即得到纳米载药颗粒。优选地，所述药物为带有苯环和正电基团的水溶性抗生素药物。
Description
技术领域
本发明涉及纳米载药技术的技术领域，具体而言，涉及纳米颗粒的制备方法以及纳米载药颗粒的制备方法。
背景技术
纳米载药技术的发展具有极高的重要意义，它可能大幅提高现有药物的效力，并且允许开发出传统药物递送方法不能实现的新药物。最近几年，纳米载药系统在治疗癌症、心血管疾病和感染疾病等多种疾病方面的研究已经迅速增长。通过将药物封装在纳米级的小颗粒中，具有多项优势：药物的溶解性和稳定性得到了提高，从而使疗效增强，副作用降低；药物可以靶向递送到特定的细胞或组织，减少了全身的副作用；药物的释放可以得到控制，从而减少用药频率并提高患者的依从性。通过减少全身的副作用，可以提高接受治疗的患者的生活质量。药物的靶向递送到特定的细胞或组织可以大大提高治疗效率，减少药物使用量并最小化全身毒性的风险。
聚谷氨酸的衍生物和其复合材料在生物医学领域的应用受到了广泛关注，聚谷氨酸基复合材料已经被开发为抗菌复合物、药物载体和癌症治疗材料，也被用于医疗设备和炎症再生领域。单宁酸是一种常见的多酚物质，具有抗氧化作用、抗炎作用、抗肿瘤作用和抗微生物作用，多种生物活性使得它在生物医药等领域研究广泛。但是，现有技术中尚无将聚谷氨酸和单宁酸化学复合为纳米颗粒并应用于载药的技术方案。
发明内容
本发明的主要目的在于提供工艺简单可控、能够将聚谷氨酸和单宁酸复合为纳米颗粒的纳米颗粒的制备方法以及纳米载药颗粒的制备方法。
为了实现上述目的，本发明首先提供了用于载药的纳米颗粒的制备方法，技术方案如下：
用于载药的纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：获取第一溶液，所述第一溶液包括聚谷氨酸、单宁酸、水和N,N-二甲基甲酰胺；获取第二溶液，所述第二溶液包括羧基催化剂和水；向第一溶液中加入第二溶液，反应一段时间后生成固液混合物，再经固液分离处理即得到纳米颗粒。
作为上述的制备方法的进一步改进：纳米颗粒的粒度为80～200nm，纳米颗粒呈球状。
作为上述的制备方法的进一步改进：所述第一溶液的制备包括步骤：首先将聚谷氨酸和单宁酸溶解于水中；然后加入N,N-二甲基甲酰胺，在3～5℃下搅拌20～40min，即得到第一溶液。
作为上述的制备方法的进一步改进：所述第一溶液中，水和N,N-二甲基甲酰胺的体积比为(5～7)：1。
作为上述的制备方法的进一步改进：所述聚谷氨酸为γ-聚谷氨酸；所述羧基催化剂为4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐。
作为上述的制备方法的进一步改进：γ-聚谷氨酸、单宁酸和4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐的质量比为1：(0.2～0.3)：(0.75～1.25)；所述第一溶液和第二溶液的体积比为(8～12)：1。
作为上述的制备方法的进一步改进：将第二溶液以0.05～0.05mL/s的速率滴加到第一溶液中，滴加完成后反应6～10h。
为了实现上述目的，本发明其次提供了两种纳米载药颗粒的制备方法，技术方案如下：
第一种纳米载药颗粒的制备方法，包括以下步骤：获取上述的制备方法制备得到的纳米颗粒；将纳米颗粒和药物分散于水中，即得到含有纳米载药颗粒的分散液。优选地，所述药物为带有苯环和正电基团的水溶性抗生素药物。
第二种纳米载药颗粒的制备方法，包括以下步骤：在上述的制备方法中的第一溶液或第二溶液中加入药物；在纳米颗粒的生成过程中使药物原位负载在纳米颗粒上，即得到纳米载药颗粒。优选地，所述药物为带有苯环和正电基团的水溶性抗生素药物。
本发明的制备方法以及制备得到的纳米颗粒和纳米载药颗粒具有以下优点：
(1)工艺简单可控，与物理结合的聚谷氨酸和单宁酸相比，化学复合的纳米颗粒的各项性能更加优异。
(2)所得颗粒的尺寸为纳米级，比表面积大，可以显著提升载药量。
(3)经验证，纳米颗粒带负电荷且带有苯环，能够实现多种载药方式，尤其适合于负载带有苯环和正电基团的水溶性抗生素药物。
(4)纳米载药颗粒可参与人体的血液循环和正常代谢。
(5)纳米载药颗粒可以实现药物缓慢释放，毒副作用降低，有助于提升治疗效果。
(6)所采用的原材料均是天然化合物，对人体无毒副作用。
(7)纳米颗粒和纳米载药颗粒无毒，具有良好的生物相容性。
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的说明。本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来辅助对本发明的理解，附图中所提供的内容及其在本发明中有关的说明可用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为纳米颗粒的SEM照片。
图2为纳米颗粒的Zeta电位分布图。
图3为纳米颗粒、γ-PGA和TA的紫外吸收曲线。
图4为DLNPs和FreeDCH的药物释放曲线。
图5为不同浓度的纳米颗粒的体外细胞毒性试验结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行清楚、完整的说明。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。在结合附图对本发明进行说明前，需要特别指出的是：
本发明中在包括下述说明在内的各部分中所提供的技术方案和技术特征，在不冲突的情况下，这些技术方案和技术特征可以相互组合。
此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
关于本发明中术语和单位。本发明的说明书和权利要求书及有关的部分中的术语“包括”、“具有”以及它们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。
本发明的用于载药的纳米颗粒的制备方法的具体实施方式为包括以下步骤：
(1)获取第一溶液，所述第一溶液包括聚谷氨酸(PGA)、单宁酸(TA)、水和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)；
具体地，首先将PGA和TA溶解于水中，然后加入DMF，在4℃下搅拌30min，即得到第一溶液。
由于TA外部的酚羟基亲水，内部的环状结构疏水，在水溶液中溶解缓慢，因此，采用DMF在体系中作为辅助溶剂，既可以与水互溶，又可辅助TA的溶解。当水和N,N-二甲基甲酰胺的体积比为(5～7)：1时，可以获得溶解效果最佳的第一溶液。
优选地，所述PGA为γ-聚谷氨酸(γ-PGA)。γ-PGA作为一种氨基酸的聚合物，具有良好的生物相容性。
(2)获取第二溶液，所述第二溶液包括羧基催化剂和水；
所述羧基催化剂为4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)，DMTMM是能够有效活化羧基，从而促进γ-PGA的羧基与TA发生反应。
当γ-PGA、TA和DMTMM的质量比为1：(0.2～0.3)：(0.75～1.25)、第一溶液和第二溶液的体积比为(8～12)：1时，催化反应充分，所得纳米颗粒的粒度分布均匀。
(3)向第一溶液中加入第二溶液，反应一段时间后生成固液混合物，再经固液分离处理即得到纳米颗粒；
优选使第二溶液以0.067mL/s的速率滴加到第一溶液中且滴加完成后再反应8h，这样可以使得反应更为彻底。
一种最佳的工艺参数为：第一溶液由0.2gγ-PGA、0.05gTA、17mL水和3mLDMF构成，第二溶液由0.2gDMTMM和2mL水构成，即γ-PGA、TA和DMTMM的质量比为1：0.25：1，水和N,N-二甲基甲酰胺的体积比为5.67：1，第一溶液和第二溶液的体积比为10：1。
图1为纳米颗粒的SEM照片。
从图1可以看出，纳米颗粒呈球形，颗粒的直径为80～200nm。
图2为所得纳米颗粒的Zeta电位分布图。
如图2所示，纳米颗粒电位为-57.3±0.95mV。
图3为纳米颗粒、γ-PGA和TA的紫外吸收曲线。
从图3可以看出，γ-PGA在290nm处有最强吸收峰，TA在325nm处有最强吸收峰，在将两种原料合成为纳米颗粒后，由于γ-PGA是纳米颗粒中的主要成分，使得纳米颗粒的最强吸收峰在315nm，介于两种原料的吸收峰之间，这说明了那么颗粒中含有聚谷氨酸与单宁酸，证明了聚谷氨酸与单宁酸被成功化学复合。
本发明的纳米载药颗粒的制备方法的第一实施例为包括以下步骤：将上述的制备方法制备得到的纳米颗粒和药物分散于水中，即得到含有纳米载药颗粒的分散液。分散液再经固液分离即可得到纳米载药颗粒。
本发明的纳米载药颗粒的制备方法的第二实施例为：在上述纳米颗粒的制备方法的基础上，在第一溶液或第二溶液中加入药物，其余步骤保持不变，即可在纳米颗粒的生成过程中使药物原位负载在纳米颗粒上，即得到纳米载药颗粒。
与第一实施例相比，第二实施例的纳米载药颗粒中药物与纳米颗粒的结合力更强，能够显著提升靶向释药效果和缓释效果。
在上述两种实施例中，药物的投加质量应当≤TA的质量，否则会造成药物的浪费。优选地，TA与药物的质量比为(1.5～2):1，此时可以使纳米载药颗粒中药物的质量分数达到30％，实现高载药量。
药物的选择最好具有一定水溶性，同时具有静电吸附和ΠΠ堆叠作用。由于纳米颗粒的Zeta电位为-57.3±0.95mV，且带有苯环，因此，所述药物优选为带有苯环和正电基团的水溶性抗生素药物，例如但是不限于为盐酸多西环素(Doxycyclinehydrochloride，DCH)。
以下为第二实施例的纳米载药颗粒的药物释放试验结果。
试验方法为：准备两个容积为80mL的离心管，向离心管中加入60mLPBS。将1mL载药纳米颗粒的分散液(标记为DLNPs)和1mLDCH溶液(标记为FreeDCH)分别装入到透析袋(MWCO＝5000Da)中，FreeDCH与DLNPs含有等量的盐酸多西环素。将两个透析袋分别浸没在两个离心管中，置于恒温摇床(37℃，100rpm)孵育。在预设时间节点每次取600μL溶液，再补充600μL干净的PBS。利用紫外分光光度计测试所取溶液中盐酸多西环素的含量，最终通过统计盐酸多西环素的累计释放率来对比DLNPs和FreeDCH的药物释放情况。
图4为DLNPs和FreeDCH的药物释放曲线。
如图4所示，DLNPs的药物释放速率明显小于FreeDCH的药物释放速率，说明本发明的纳米载药颗粒能够显著提升治疗效果。
以下为纳米颗粒的体外细胞毒性试验结果。
使用MTT比色法对纳米颗粒进行体外细胞毒性实验，评价了纳米颗粒对小鼠成纤维细胞(L929)的毒性，具体为：
将L929细胞按照密度2×103/孔接种到96孔板中，孵育16h后细胞贴壁生长至孔板密度接近50-60％，再向每个孔中加入100μLDMEM培养基和不同浓度(5、20、80μg/mL)的纳米颗粒分散液与L929细胞共培养。设置空白对照，即使用相同体积的生理盐水代替纳米颗粒分散液。其中，DMEM培养基为青霉素/链霉素抗生素和胎牛血清(质量分数10％)混合改良的培养基。
分别在共培养后的第1、4、7天观察细胞的存活和增殖情况，培养结束后用PBS缓冲液沿孔壁缓慢洗涤，加入200μLDMEM培养基与20μL(5.0mg/mL)MTT至每个孔，将孔板置于细胞培养箱继续孵育4h，结束后移除孔内培养基，然后加入100μL二甲基亚砜并振荡混合均匀。使用酶标仪测定孔板内溶液在570nm处的吸光度值，并通过吸光度值绘制细胞存活与增殖图像。
图5为不同浓度的纳米颗粒的体外细胞毒性试验结果示意图。
如图5所示，在第1、4、7天的细胞存活率测试中，各不同浓度实验组与空白对照组无显著差异，无细胞毒性，且各实验组的细胞增殖情况均与空白对照组相似，即使在80μg/mL高浓度下，细胞的增殖仍无明显影响。由此可见，本发明的聚谷氨酸和单宁酸复合而成的纳米颗粒具有良好的细胞相容性。
以上对本发明的有关内容进行了说明。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。基于本发明的上述内容，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
Claims (10)
1.用于载药的纳米颗粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
获取第一溶液，所述第一溶液包括聚谷氨酸、单宁酸、水和N,N-二甲基甲酰胺；
获取第二溶液，所述第二溶液包括羧基催化剂和水；
向第一溶液中加入第二溶液，反应一段时间后生成固液混合物，再经固液分离处理即得到纳米颗粒。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：纳米颗粒的粒度为80～200nm，纳米颗粒呈球状。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述第一溶液的制备包括步骤：首先将聚谷氨酸和单宁酸溶解于水中；然后加入N,N-二甲基甲酰胺，在3～5℃下搅拌20～40min，即得到第一溶液。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述第一溶液中，水和N,N-二甲基甲酰胺的体积比为(5～7)：1。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述聚谷氨酸为γ-聚谷氨酸；所述羧基催化剂为4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：γ-聚谷氨酸、单宁酸和4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐的质量比为1：(0.2～0.3)：(0.75～1.25)；所述第一溶液和第二溶液的体积比为(8～12)：1。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：将第二溶液以0.05～0.05mL/s的速率滴加到第一溶液中，滴加完成后反应6～10h。
8.纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
获取权利要求1-7之一所述的制备方法制备得到的纳米颗粒；
将纳米颗粒和药物分散于水中，即得到含有纳米载药颗粒的分散液。
9.纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
在权利要求1-7之一所述的制备方法中的第一溶液或第二溶液中加入药物；
在纳米颗粒的生成过程中使药物原位负载在纳米颗粒上，即得到纳米载药颗粒。
10.如权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于：所述药物为带有苯环和正电基团的水溶性抗生素药物。
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