WO2022139418A1 - 지방산 도입 고분자 나노 입자 및 이의 용도 - Google Patents

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WO2022139418A1
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fatty acid
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adipocytes
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이근용
이혜원
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(주)슈퍼노바 바이오
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    • A61K2800/412—Microsized, i.e. having sizes between 0.1 and 100 microns

Definitions

  • the present invention relates to fatty acid-introduced polymer nanoparticles and uses thereof.
  • Examples of procedures to reduce subcutaneous fat include liposuction in which a cannula is inserted into the subcutaneous fat to suck out fat, a freezing procedure in which a cooling pad is attached to the skin surface to cool and necrosis the subcutaneous fat, and radiofrequency or ultrasound is applied to the subcutaneous fat tissue.
  • a thermal heating procedure that removes subcutaneous fat by irradiating and heating and a carboxytherapy procedure that removes fat by gradually injecting carbon dioxide (CO 2 ) into the subcutaneous fat with an injection needle to promote blood circulation and lymph circulation in adipose tissue , and mesotherapy, which injects drugs for the treatment of obesity into subcutaneous fat.
  • CO 2 carbon dioxide
  • Liposuction which is known to be the most effective among procedures, has disadvantages in the pain accompanying the procedure and future management. Typically, there is bleeding during liposuction and pain during the procedure. This can cause pain even after the procedure, so it may be necessary to take painkillers depending on the individual. In addition, compression garments must be worn for at least a week after the suction operation, and management is required for about a month after the procedure.
  • the freezing procedure is simple, but has a disadvantage in that the treatment effect is low.
  • Korean Patent Application Laid-Open No. 10-2011-0119640 an invasive procedure in which a probe cooled by circulating a refrigerant inside is inserted into the subcutaneous fat was used.
  • the procedure time is shortened compared to the non-invasive cooling procedure, it has a disadvantage in that it requires a considerably long procedure time to prevent necrosis of the subcutaneous fat due to cooling.
  • carboxytherapy is a procedure that intensively treats areas where fat is excessively accumulated.
  • mesotherapy and carboxytherapy were performed parametrically to increase fat removal efficiency.
  • the patent uses a separate syringe needle for each procedure, the internal structure is complicated and a separate incision is made by each needle.
  • Belkyra a drug approved as a lipolysis supplement, kills fat cells by destroying the cell membrane of local fat cells.
  • Belkyra has the disadvantage that it can be used only for double chin surgery.
  • these drugs non-specifically destroy cell membranes, it is reported that the risk of breast cancer or colorectal cancer increases because it has a large effect on surrounding cells as well as adipocytes, and may have adverse effects on surrounding tissues.
  • the present invention is to provide polymer nanoparticles for decomposing local fat and uses thereof.
  • the present invention provides nanoparticles comprising calcium carbonate crystals, biocompatible polymers and fatty acids, wherein the calcium carbonate is incorporated inside the nanoparticles, and the fatty acids are exposed on the surface of the nanoparticles do.
  • the existing local lipolysis procedure it is a method of treatment by directly injecting a drug into the area where fat has accumulated with an injection needle.
  • the nerve When the nerve is touched, there is a problem of numbness or the risk of nerve damage.
  • the present inventors use nanoparticles containing calcium carbonate crystals, biocompatible polymers and fatty acids to specifically enter the interior of fat cells by fatty acids exposed on the surface of nanoparticles. The present invention was completed by confirming that particles can be introduced.
  • calcium carbonate (Calcium Carbonate) crystals is distinguished from precipitated calcium carbonate produced by chemical processing, and generally refers to those prepared by mechanically grinding and classifying high-purity crystalline limestone. .
  • the nanoparticles of the present invention have a form in which the calcium carbonate crystals are embedded in the biocompatible polymer, which is a hard shell formed by the biocompatible polymer. It means a solid colloidal structure that is evenly embedded without significant difference in distribution probability from the center of the spherical structure to the outer surface.
  • nanoparticles of the present invention in an acidic environment, calcium carbonate crystals embedded in the particles cause a reaction to generate carbon dioxide gas.
  • the nanoparticles of the present invention are not in the form of a core-shell containing calcium carbonate in the layered membrane structure, but in the form in which the calcium carbonate crystals are embedded in the solid crystals filled inside. That is, when the calcium carbonate crystals embedded in the nanoparticles generate carbon dioxide gas to be differentiated from the structure in which the gas generated inside leaks out at the same time as the gas is generated, the internal pressure of the nanoparticles gradually increases, Finally, it induces the explosion of nanoparticles. Due to these properties, it is possible to simultaneously achieve the effect of releasing carbon dioxide gas bubbles and hitting the cells by the explosion of nanoparticles.
  • the biocompatible polymer of the present invention is surface-modified with a fatty acid.
  • the fatty acid is mixed with the biocompatible polymer to form the spherical structure, and the fatty acid has a form exposed on the surface of the structure.
  • Fatty acids of the present invention may include saturated fatty acids and unsaturated fatty acids, preferably C 12 to C 20 saturated or unsaturated fatty acids.
  • the fatty acids exposed to the surface of the nanoparticles of the present invention have adipocyte targeting directivity.
  • the fatty acid on the surface of the nanoparticles reacts with fatty acid transporter proteins present in the cell membrane of adipocytes so that the nanoparticles are introduced into the adipocytes by intracellular absorption. Therefore, the nanoparticles surface-modified with fatty acids are selectively absorbed/accumulated into adipocytes or adipose tissue, and generate carbon dioxide gas in adipocytes to transform and destroy the nanoparticle structure, rapidly ejected, and physically attach to adipocytes. Adipose tissue can be reduced by decomposing it or causing necrotic necrosis.
  • the biocompatible polymer of the present invention means a polymer having tissue compatibility and blood compatibility that does not destroy tissue or coagulate blood in contact with living tissue or blood, and the emulsion method of the present invention As long as it can form a solid structure in which calcium carbonate crystals are incorporated, it can be appropriately selected without any particular limitation.
  • the biocompatible polymer of the present invention is polylactide (PLA), polyglycolide (PGA), polylactide-polyglycolide copolymer (PLGA), starch, glycogen, chitin, pepti Doglycan, lignosulfonate, tannic acid, lignin, pectin, polyethylene glycol, polyethylene oxide, polyvinyl alcohol, polyethylene oxide-polypropylene oxide block copolymer, cellulose, hemicellulose, heparin, hyaluronic acid, dextran or alginate It is a polymer with a structure.
  • polylactide-polyglycolide copolymer (PLGA) may be used.
  • the diameter of the nanoparticles of the present invention may be 100-300 nm, preferably 120-290 nm, more preferably 150-280 nm, even more preferably 200-260 nm can be In the above diameter range, it is possible to maximize the cell striking effect that can induce necrotic death of fat cells.
  • the weight ratio of the fatty acid and the biocompatible polymer may be 0.01:1 to 0.5:1 (fatty acid: polymer). Preferably, it may be 0.05:1 to 0.15:1. Within this weight ratio, targeting to adipocytes and cell viability can be increased. When the content of fatty acid is greater than the above range, the diameter of the nanoparticles may increase, but a lot is lost due to the low temperature of the manufacturing process, and the stability of the prepared nanoparticles may be deteriorated.
  • the weight ratio of the calcium carbonate crystals and the biocompatible polymer may be 0.001:1 to 1:1 (calcium carbonate: polymer).
  • the weight ratio of the calcium carbonate crystals to the biocompatible polymer is 0.01:1 to 0.8:1, more preferably 0.1:1 to 0.6:1.
  • the calcium carbonate crystals and the biocompatible polymer corresponding to the above weight ratio can maximize the fat cell reduction effect.
  • the ratio of calcium carbonate crystals to the biocompatible polymer does not significantly affect the diameter of the gas-generating nanoparticles produced.
  • the present invention provides a composition for decomposing fat comprising the nanoparticles described above.
  • the composition for lipolysis of the present invention has the effect of specifically releasing carbon dioxide from the environment within the fat cells, and unlike the conventional local lipolysis treatment, it is possible to target adipose tissue.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity comprising the above-described nanoparticles and / or a composition comprising the same.
  • the present invention provides a method for producing nanoparticles comprising the steps of:
  • step (b) mixing the emulsion of step (a) and the second aqueous phase to form a water-in-oil-in-water double emulsion (w/o/w);
  • step (c) solidifying the double emulsion of step (b).
  • the "first aqueous phase” is an aqueous solvent (pH 7.0-8.0) containing a calcium carbonate slurry, specifically, for example, distilled water in which calcium carbonate crystals are suspended, physiological saline (PBS), An aqueous PVA solution or the like may be used.
  • the "oil phase” of step (a) of the present invention may use a fatty acid and a biocompatible polymer dissolved in a hydrophobic and volatile organic solvent that is immiscible with an aqueous phase.
  • a fatty acid and a biocompatible polymer in methylene What is dissolved in chloride, chloroform, dimethylformamide, ethyl acetate, acetone, acetonitrile, tetrahydrofuran, dimethyl sulfoxide, or a mixed solvent thereof can be used.
  • Mixing of the first aqueous phase and oil phase in step (a) of the present invention may be preferably carried out using mechanical stirring, for example, it may be carried out using an ultrasonic crusher, a homomixer, a stirrer, and the like.
  • the single emulsion (w/o) prepared through step (a) of the present invention is mixed with the second aqueous phase to form a double emulsion (w/o/w).
  • aqueous surfactant solution such as polyvinyl alcohol, poloxamer, or polyvinylpyrrolidone may be used.
  • the resulting double emulsion can be solidified through evaporation or extraction of an organic solvent.
  • the weight ratio of the fatty acid and the biocompatible polymer may be 0.01:1 to 0.2:1 (fatty acid: polymer). Preferably, it may be 0.05:1 to 0.15:1.
  • the calcium carbonate crystal and the biocompatible polymer may have a weight ratio of 0.001:1 to 1:1 (calcium carbonate: polymer), preferably 0.01:1 to 0.8:1, more preferably 0.1:1 to 0.6 It can be :1.
  • the present invention nanoparticle manufacturing method relates to a method for manufacturing nanoparticles, which is another aspect of the present invention, and overlapping content with nanoparticles will be omitted to avoid excessive complexity in the description of the present specification.
  • the high-rich nanoparticles according to the present invention can decompose fat through adipocyte necrosis by specifically incorporating adipocytes while circulating in the body to generate carbon dioxide in the cells.
  • a ligand fatty acid
  • the effect on surrounding tissues and cells can be minimized, and by doing so, side effects to drugs can be minimized, and safer procedures are possible.
  • Possible product development is possible.
  • the nanoparticles can be generally applied to areas such as the chin, thigh, arm, and stomach, where the frequency of treatment is high.
  • the nanoparticles according to the present invention can be manufactured as an injectable preparation, and are applied to the field of diet beauty and obesity treatment, and are a local lipolysis supplement, formulation corrector, or diet cosmetic product that decomposes local fat through necrosis of local fat. etc. can be used.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the incorporation process of fatty acid-introduced nanoparticles (a), fatty acid (b), and fatty acid-introduced nanoparticles (b) into adipocytes according to an example of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing the size distribution of (a) PNP, (b) GNP, (c) PA-GNP2, and (d) PA-GNP10 measured by DLS.
  • FIG 3 shows SEM images of (a) PNP, (b) GNP, (c) PA-GNP2 and (d) PA-GNP10.
  • Figure 4 shows the 1H NMR spectrum of the nanoparticles according to the palmitic acid concentration.
  • FIG. 10 shows confocal microscopy images of 3T3-L1 adipocytes treated with PNP and PA-PNP conjugated with alexa 488 cadaverine.
  • FIG. 11 shows confocal microscopy images of 3T3-L1 adipocytes treated with alexa 488 cadaverine-conjugated PNP and various types of FA-PNP.
  • Poly(DL-lactide-co-glycolide) (PLGA, Mw 6400, 50:50, 0.15-0.25 dL/g, carboxylate terminus) was purchased from Lactel Absorbable Polymers (Birmingham, AL, USA).
  • Poly(vinyl alcohol) (PVA, Mw 30000-70000, 87-90 % hydrolyzed), dichloromethane (methylene chloride, MC), calcium carbonate (CaCO 3 ), palmitic acid (PA), oil red O, hydroxide Sodium (NaOH), hydrochloride (HCl), sodium acetate (anhydrous), acetic acid, dimethylsulfoxide (DMSO), 3-isobutyl-1-methyl-xanthine (IBMX), insulin, dexamethasone, Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), penicillin-streptomycin glutamine, and 10% formalin solution were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
  • 2-propanol (isopropanol, 99.5%) was purchased from Samcheon (Gangnam, Seoul).
  • CellTiter 96 ® Aqueous One Solution (MTS assay) was purchased from Promega (Madison, WI, USA).
  • Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, 4.5 g/L, D-glucose) was purchased from Wellgene (Gyeongsan, Gyeongbuk).
  • Fetal bovine serum (FBS) and bovine calf serum (CS) were purchased from Gibco (Grand Island, NY, USA). Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid and Hoechst 33342 were purchased from Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA).
  • Alexa fluorTM 488 cadaverine sodium salt and lysotracker red DND-99 were purchased from Invitrogen (Eugene, OR, USA).
  • VECTASHIELD ® Antifade mounting medium was purchased from Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA). Water was distilled and deionized using a Milli-Q (R) System (Millipore; Billerica, Massachusetts, USA) and purified RO MAX (Human Science; Hanam, Gyeonggi, Korea). Mouse C57BL/6 was purchased from Orient (Seongnam, Gyeonggi).
  • Fatty acid modified gas-generating PLGA nanoparticles were prepared by water-in-oil-in-water (W/O/W) double emulsion and solvent evaporation methods. Fatty acids physically modified the GNP surface. A fatty acid solution dissolved in 10 % w/v dichloromethane was mixed with a PLGA solution (5 % w/v) for at least 4 hours (FA-PLGA solution).
  • Another emulsion (W 1 /O/W 2 ) was made by pouring this emulsion (W 1 /O) into a 4% PVA solution used as a suspension polymerization aid and emulsifying it with a sonicator at 35 W output for 2 minutes. The complete double emulsion was added to the 1% PVA solution and stirred overnight to evaporate the remaining dichloromethane. Unloaded CaCO 3 was removed by ultracentrifugation at 4000 g for 1 minute. Thereafter, the supernatant was ultracentrifuged at 31,000 g for 30 minutes to collect nanoparticles and washed 4 times with deionized water.
  • FA-GNP was stored at 4 °C after freeze-drying (Ilshin Biobase freeze dryer, Dongducheon-si, Gyeonggi-do).
  • FA-PLGA nanoparticles (FA-PNP) without CaCO 3 were prepared in the same manner and used as a control.
  • PLGA nanoparticles containing calcium carbonate were prepared by a W/O/W double emulsification method and used as gas generating nanoparticles (GNPs).
  • PLGA nanoparticles containing no calcium carbonate were also prepared and used as a control.
  • the loading content of CaCO 3 in GNPs was 55.0% (CaCO 3 /PLGA; wt/wt%)
  • the average diameter of GNPs was 246.8 nm.
  • PDI polydispersity index
  • the morphology of nanoparticles was observed with a scanning electron microscope (SEM) (S-4800 U field emission scanning electron microscope, Hitachi, Tokyo, Japan).
  • SEM scanning electron microscope
  • NMR and py-GC/MS were used for the qualitative analysis of palmitic acid. Spectra were acquired using NMR spectroscopy. For all samples DMSO was used as solvent and diluted to an equivalent concentration of 2 mg/mL.
  • Spectra were also acquired using py-GC/MS and 4 mg was used for all samples.
  • PA-GNP was dissolved in 1M NaOH solution for 1 hour and neutralized with 1M HCl solution.
  • the CaCO 3 concentration percentage of the nanoparticle solution was estimated using a calcium colorimetric analysis kit from Bio Vision (Palo Alto, CA, USA) and calculated as a weight fraction.
  • Palmitic acid a saturated fatty acid commonly found in animals, was selected and used for surface modification of PLGA nanoparticles because it is less sensitive to light, air and heat than oleic acid, another abundant fatty acid in animals. PA was physically bound to PLGA nanoparticles in various weight ratios for enhanced adipocyte uptake. Palmitic acid-modified gas-generating PLGA nanoparticles (PA-GNP) were prepared by self-assembly between PA and PLGA nanoparticles in the O phase during emulsification. The number after PA-GNP indicates the supply ratio of palmitic acid and PLGA (Table 1). PLGA itself and unmodified nanoparticles (GNPs) were used as controls.
  • PA Palmitic acid
  • GNP unmodified nanoparticles
  • PA-PNP The morphology of PA-PNP was also observed by scanning electron microscopy. Even when palmitic acid was added, PA-PNP was still spherical compared to PNP and there was no significant change in size ( FIGS. 3c and 3d ). The size change under acidic conditions was similar to that of GNPs even when palmitic acid was attached. Through the above results, it was confirmed that the surface modification by palmitic acid did not significantly affect the physical properties such as the size, shape, and gas generating ability of GNPs.
  • NIH-3T3 cells fibroblasts
  • ATCC American Type Culture Collection
  • PS penicillin and streptomycin
  • C2C12 cells myocytes
  • 3T3-L1 adipocytes were purchased from ATCC and maintained in 10% CS medium at 37° C. and 5% CO 2 condition.
  • adipocyte differentiation was initiated by culturing in growth medium (MDI medium) for 2 days. Cells were cultured for 2 days in DMEM medium containing 10% FBS and 0.1% insulin. Finally, the differentiated cells were cultured in DMEM medium containing 10% FBS, and the medium was replaced every other day.
  • IBMX 0.5 mM
  • insulin 1 ⁇ g/mL
  • dexamethasone 1 ⁇ M
  • Oil Red O staining was used to determine the degree of adipocyte differentiation and mark lipid droplets.
  • Oil Red O stock solution was prepared by dissolving 0.7 g of Oil Red O powder in 200 mL of isopropane, stirring overnight, filtration through a 0.22 ⁇ m syringe filter, and storing at 4°C.
  • An Oil Red O working solution was prepared by mixing the stock solution and deionized water in a 3:2 ratio, left at room temperature (RT) for 20 minutes, and filtered through a 0.22 ⁇ m syringe filter before use. Cells were washed with 10% formalin for 5 min at RT and fixed with 10% formalin for 1 h at RT.
  • Oil Red O working solution was added for 10 minutes. Residues of the Oil Red O stock solution were removed by washing the cells at least 4 times with deionized water. After photographing under a microscope, it was completely dried again. Oil Red O was eluted with 100% isopropanol by pipetting up and down several times, followed by measurements at 500 nm using an ultraviolet/visible spectrophotometer (SpectraMax ABS, Molecular Devices, San Jose, CA, USA).
  • GNP did not affect the cell viability of all other cell lines such as adipocytes, adipocytes, stem cells, fibroblasts and myoblasts. This suggests that the cells cannot only uptake GNPs and that carbon dioxide gas production does not occur at biological pH.
  • PA-GNP when PA-GNP was used, the presence of PA did not significantly affect the other cell lines, but the viability was particularly reduced in adipocytes. Based on these results, it was found that PA-GNP is effective in adipocytes, where fatty acids are most absorbed. In addition, it was confirmed that the acidic state of endocytosis generated in the process of absorbing fatty acids promotes carbon dioxide gas production and greatly reduces cell viability.
  • the labeled nanoparticles were collected by ultracentrifugation at 31,000 g for 15 minutes and washed three times with deionized water.
  • Alexa 488 cadaverine-PA-PNP was stored at 4°C after freeze-drying.
  • 3T3-L1 adipocytes were seeded into confocal dishes at the recommended seeding density of 8 ⁇ 10 4 cells and differentiated as described in the section above. Lysotracker red (50 nM) and alexa 488 cadaverine-PA-PNP (0.5 mg/mL) containing medium were treated with adipocytes for 24 hours. After that, the adipocytes were washed 3 times with DPBS to remove the remaining nanoparticles and treated with HOECHST (1 ⁇ g/mL) for 15 minutes to stain the nucleus.
  • 3T3-L1 preadipocytes were cultured in CS medium and differentiated into adipocytes in FBS medium. Lipid droplets were observed in the cytoplasm after adipocyte differentiation and detected by Oil Red O staining (Fig. 7). The accumulation of lipid droplets was investigated in stages from before differentiation to 12 days after differentiation.
  • the cytotoxicity of nanoparticles was evaluated through MTS analysis of 3T3-L1 adipocytes.
  • untreated cells were used, and cells treated with PNP, GNP, PA-PNP2, and PA-PNP10 did not show a significant change according to the sample concentration ( FIG. 8 ).
  • PLGA, PA and CaCO 3 used for nanoparticle production do not have appreciable toxicity.
  • the concentration of PA increased, the cell viability of the cells treated with PA-GNP decreased ( FIG. 9 ). This was considered to be of significant significance and was used for further experiments.
  • the cell viability tended to be the lowest when the PA/PLGA ratio was 1, but the properties of nanoparticles were too oily for the experiment, so they were excluded from the experimental group.
  • the specific cellular uptake of PA-PLGA nanoparticles into 3T3-L1 adipocytes was examined by confocal microscopy using an Alexa 488 cadaverine-PA-PNP.
  • Cellular uptake of PA-PNP into 3T3-L1 adipocytes was clearly observed compared with nanoparticles with unmodified surface (Fig. 10).
  • the lysotracker probe used in this experiment is partially neutralized at neutral pH and has a weak base that can freely penetrate cell membranes. It is also highly selective for organelles with acidity. Therefore, in this experiment, the lysosomes showing the acidic pH inside the cell are selectively stained and appear red.
  • nanoparticles whose surface has been modified with the green label of Alexa 488 cadaverine are absorbed by various mechanisms, enter endosomes, and eventually lead to co-localization with lysosomes. Therefore, when lysosomes and nanoparticles meet, yellow color indicates successful absorption. And this could also be expected in the future due to the generation of carbon dioxide gas in PA-GNPs and apoptosis of adipocytes.
  • FA-PLGA nanoparticles (FA-PNP) without CaCO 3 were prepared using fatty acids having various lengths of carbon chains, and endocytosis of adipocytes was evaluated.
  • FA-PLGA nanoparticles were prepared using fatty acids and PLGA.

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Abstract

본 발명은 지방산 도입 고분자 나노입자 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에서는 생체친화성 고분자 및 지방 세포 표적 리간드(지방산)을 이용하여 탄산칼슘 결정이 함입된 나노입자를 형성함으로써 지방 세포 이외의 주변 세포 및 조직으로 전달을 최소화하고 지방 세포 내로의 나노 입자의 함입을 최대화할 수 있다. 본 발명에 따른 나노 입자는 주사 가능한 제제로 제작 가능하고, 국소 지방을 분해하는 국소 지방 분해 보완재 또는 다이어트 미용 제품으로 적용될 수 있다.

Description

지방산 도입 고분자 나노 입자 및 이의 용도
본 발명은 지방산 도입 고분자 나노 입자 및 이의 용도에 관한 것이다.
피부의 표피와 진피 아래에 존재하는 피하지방의 감소는 미용 처리의 가장 중요한 분야 중 하나이며, 이러한 미용 처리의 목적을 위해 다양한 시술 방법이 사용되고 있다.
피하지방 감소를 위한 시술로는 피하지방에 캐뉼라(cannula)를 삽입하여 지방을 흡입하는 지방 흡입술, 냉각 패드를 피부표면에 부착하여 피하지방을 냉각 괴사시키는 냉동 시술, 고주파 또는 초음파를 피하지방 조직에 조사하여 가열에 의해 피하지방을 제거하는 열적 가열 시술, 이산화탄소(CO2)를 주사바늘로 피하지방에 서서히 주입하여 지방조직의 혈류 순환 및 림프 순환을 촉진함으로써 지방을 제거하는 카복시테라피(Carboxytherapy) 시술, 피하지방에 비만 치료용 약물을 주입하는 메조테라피(Mesotherapy) 시술 등이 있다.
시술 중 가장 효과가 높다고 알려진 지방 흡입술은 시술시 동반되는 고통 및 향후 관리에서 단점을 가진다. 대표적으로 지방 흡입시 출혈이 있으며, 시술 시 통증을 동반한다. 이는 시술 이후에도 통증을 유발하여 개개인에 따라 진통제를 복용해야하는 경우도 생기게 된다. 이와 더불어 흡입 수술 이 후 압박복을 일주일 이상 착용해야하며, 시술 후 한달 정도의 관리를 필요로 한다.
또한, 냉동 시술은 시술이 간편하지만 시술 효과가 낮은 단점을 가진다. 한국 공개특허 제10-2011-0119640호에서는 냉매를 내부로 순환시켜 냉각되는 프로브를 피하지방에 삽입하는 침습적 시술을 사용하였다. 하지만, 침습적 냉각 시술을 사용할 경우 시술 시간이 비침습적 냉각 시술보다 단축되기는 하지만, 냉각에 의한 피하지방의 괴사를 방지하기위해 상당히 긴 시술 시간을 요하는 단점을 가진다.
한편, 카복시테라피는 지방이 과도하게 축적된 부위를 집중적으로 치료하는 시술로서, 한국 등록특허 제10-0772961에서는 메조테라피 시술과 카복시테라피 시술을 모수 수행하여 지방 제거 효율을 높였다. 그러나, 상기 특허는 각 시술에 대해 별도의 주사기 바늘을 사용하고 있어, 내부 구조가 복잡하고 각각의 바늘에 의해 별도의 절개창이 생기는 단점을 가진다.
현재 식품의약품안전처의 허가가 완료된 국소 지방분해 보완재는 용도가 매우 한정적이고, 현재 시중에서는 오프라벨 시술이 빈번하게 시행되고 있는 실정이다. 이러한 오프라벨 시술은 안전성 및 유효성에 대한 근거가 부족하고, 비급여 영역이기 때문에 안전 사용관리의 사각지대에 놓여있으며, 제도적인 관리가 미흡하다.
지방 분해 보완재로 허가를 받은 약물로 국소 지방세포의 세포막을 파괴함으로써 지방세포를 사멸시키는 벨카이라가 있다. 그러나, 벨카이라는 이중 턱 시술에만 한정적으로 이용 가능하다는 단점을 가진다. 또한, 이러한 약물은 비특이적으로 세포막을 파괴하므로 지방세포만이 아닌 주변 세포에 대한 영향이 커서, 주변 조직에 부작용을 미칠 수 있기 때문에 현재 유방암 또는 대장암의 위험성이 증가한다고 보고되고 있다.
본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위하여, 국소 지방을 분해하는 고분자 나노입자 및 이의 용도를 제공하고자 한다.
본 발명은 탄산 칼슘(Calcium Carbonate) 결정, 생체적합성 고분자 및 지방산을 포함하는 나노 입자로, 상기 탄산칼슘은 나노 입자의 내부에 합입되어 있고, 지방산은 나노 입자의 표면에 노출되어 있는 나노 입자를 제공한다.
기존 국소 지방 분해 시술의 경우, 주사 바늘로 지방이 축적된 해당 부위에 직접 약물을 주입하여 치료하는 방식에 해당하고, 비특이적 약물을 사용하기 때문에 주사 위 주변의 다른 세포도 파괴할 가능성이 있고, 근처 신경을 건드릴 경우 무감각이나 신경손상의 위험성의 문제점이 있었다. 본 발명자들은 이를 해결해결 하기 위해 탄산 칼슘(Calcium Carbonate) 결정, 생체적합성 고분자 및 지방산을 포함하는 나노 입자를 이용함으로써, 나노 입자의 표면에 노출되어 있는 지방산에 의해 지방 세포의 내부로 특이적으로 나노 입자의 도입할 수 있음을 규명하여 본 발명을 완성하였다.
본 명세서 상의 용어 "탄산칼슘(Calcium Carbonate) 결정"은 화학적 가공에 의해 제조된 침강성 탄산칼슘(Precipitated Calcium Carbonate)과 구분되는 것으로서 일반적으로 고순도의 결정질 석회석을 기계적으로 분쇄하고 분급하여 제조한 것을 의미한다.
본 발명인 나노 입자는 상기 탄산칼슘 결정이 생체적합성 고분자 내부에 함입되어 있는 형태를 갖는데, 이는 생체적합성 고분자가 형성하는 경질- 피막(hard shell)의 구형상 구조체 내부에 탄산칼슘 결정이 유동없이 박혀있는 형태이며, 상기 구형상 구조체의 중심으로부터 외부 표면에 이르기까지 분포 확률 상의 유의한 차이가 없이 고르게 박혀있는 고체 구조(solid colloidal structure)를 의미한다.
본 발명의 나노 입자는 산성 환경에서 파티클 내부에 함입된 탄산칼슘 결정이 이산화탄소 기체를 생성하는 반응을 일으키게 된다. 본 발명의 나노 입자는 층상의 막구조 내부에 탄산칼슘을 함유하는 코어-쉘(core-shell) 형태가 아닌 속이 채워진 고체 결정의 내부에 탄산칼슘 결정이 박혀있는 형태이다. 즉, 내부에서 발생한 기체가 기체 발생과 동시에 외부로 새어나오는(leaked) 구조와 차별화되게, 나노 입자에 함입된 탄산칼슘 결정이 이산화탄소 기체를 발생시키는 경우, 나노 입자의 내부 압력이 점진적으로 증가하여, 최종적으로 나노 입자의 폭발을 유도하게 된다. 이러한 특성으로 인해, 이산화탄소 기체 방울 방출 및 나노 입자의 폭발에 의한 세포 타격 효과를 동시에 달성하게 된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 생체적합성 고분자는 지방산에 의해 표면 개질되어 있다. 구체적으로, 상기 지방산은 생체적합성 고분자와 혼합되어 상기 구형상의 구조체를 형성하며, 지방산은 상기 구조체의 표면에 노출된 형태를 가진다. 본 발명의 지방산은 포화 지방산 및 불포화 지방산을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 C12 내지 C20의 포화 또는 불포화 지방산 일 수 있다. 본 발명의 나노 입자 표면에 노출된 지방산은 지방 세포 표적 지향성을 갖는다. 구체적으로, 나노 입자 표면의 지방산은 지방 세포(adipocyte)의 세포막에 존재하는 지방산 트랜스포터 단백질 등과의 반응을 통해서 나노 입자가 지방 세포로 세포 내 흡수의 방법으로 도입되도록 한다. 따라서 지방산으로 표면개질된 나노 입자는 지방 세포 또는 지방 조직 내로 선택적으로 흡수/축적되고, 지방 세포 내에서 이산화탄소 기체를 생성시켜 나노 입자의 구조를 변형, 파괴시키고, 급격하게 분출되며, 지방 세포에 물리적으로 타격을 주어 분해하거나 네크로시스성 괴사를 일으키게 하여 지방 조직을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 생체적합성 고분자는 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직을 파괴시키거나 혈액을 응고시키지 않는 조직적합성(tissue compatibility) 및 항응혈성(blood compatibility)을 갖는 고분자를 의미하며, 본 발명의 에멀젼 공법에 의해 탄산칼슘 결정이 합입된 고체 구조를 형성할 수 있는 것이라면 특별한 제한이 없이 적절히 선택 가능하다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 생체적합성 고분자는 폴리락타이드(PLA), 폴리글리콜라이드(PGA), 폴리락타이드-폴리글리콜라이드 공중합체(PLGA), 녹말, 글리코겐, 키틴, 펩티도글리칸, 리그노 설포네이트, 탄닌산, 리그닌, 펙틴, 폴리에틸렌글라이콜, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 블록 공중합체, 셀룰로오스, 헤미 셀룰로오스, 헤파린, 히아루론산, 덱스트란 또는 알지네이트 구조를 갖는 중합체이다. 바람직하게는 폴리락타이드-폴리글리콜라이드 공중합체(PLGA)를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 나노 입자의 직경은 100-300 nm일 수 있으며, 바람직하게는 120-290 nm, 더 바람직하게는 150-280 nm, 더욱 더 바람직하게는 200-260nm일 수 있다. 상기 직경의 범위에서 지방 세포의 네크로시스성 사멸을 유도할 수 있는 세포 타격효과를 극대화시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 지방산 및 생체적합성 고분자의 중량비가 0.01:1 내지 0.5:1(지방산: 고분자)일 수 있으며. 바람직하게는 0.05:1 내지 0.15:1일 수 있다. 상기 중량비 내에서 지방 세포로의 표적화 및 세포 생존성을 높일 수 있다. 지방산의 함량이 상기 범위보다 많아지는 경우 나노 입자의 직경이 커질 수 있으나, 제조 과정의 낮은 온도로 인해 많이 손실되며 제조된 나노 입자의 안정성이 떨어지는 단점이 발생할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 탄산칼슘 결정과 생체적합성 고분자는 중량비가 0.001:1 내지 1:1(탄산 칼슘: 고분자)일 수 있다. 바람직하게는 탄산칼슘 결정과 생체적합성 고분자의 중량비가 0.01:1 내지 0.8:1, 더 바람직하게는 0.1:1 내지 0.6:1이다. 상기 중량비에 해당하는 탄산칼슘 결정과 생체적합성 고분자는 지방 세포 감소 효과 극대화시킬 수 있다. 탄산칼슘 결정과 생체적합성 고분자의 비율은 생성되는 가스-생성 나노파티클의 직경에는 유의한 영향을 주지 않는다. 표 2에 나타난 바와 같이, 탄산칼슘 결정의 함유량이 증가할수록 함유 효율이 크게 낮아지는 것으로 보아, 상기 범위보다 높은 함유는 기대하기 어렵고, 생체적합성 고분자에 의한 경질-피막(hard-shell) 구조 또한 상대적으로 견고하지 못할 수 있다. 한편 상기 범위보다 탄산칼슘이 더욱 적게 포함되는 경우에는 발생되는 기체의 양이 지방 세포 타격 효과를 얻기에 부족할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 탄산칼슘, 생체적합성 고분자 및 지방산의 상기 중량비 내에서 제조한 나노 입자를 이용하는 경우 in vitro에서 유의한 지방 감소 효과를 도출하였다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 나노 입자를 포함하는 지방 분해용 조성물을 제공한다. 본 발명의 지방 분해용 조성물은 지방 세포 내 환경에서 특이적으로 이산화탄소를 방출하는 효과를 가지며, 또한, 종래의 지방 분해 국소 치료법과 달리, 지방 세포 조직 표적화가 가능하다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 나노 입자 및/또는 이를 포함하는 조성물을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 나노 입자의 제조방법을 제공한다:
(a) 탄산칼슘 결정을 포함하는 제1 수상(water phase)과 지방산 및 생체적합성 고분자를 포함하는 유상(oil phase)을 혼합하여 유중 수형의 단일 에멀젼(w/o)을 형성하는 단계;
(b) 단계(a)의 에멀젼과 제2 수상을 혼합하여 수중유중수형의 이중 에멀젼(w/o/w)을 형성하는 단계; 및
(c) 단계(b)의 이중 에멀젼을 고형화시키는 단계.
본 발명인 나노 입자의 제조방법에 있어서, "제1 수상"은 탄산칼슘 슬러리를 포함하는 수성 용매 (pH 7.0-8.0), 구체적으로 예를 들면 탄산칼슘 결정이 현탁된 증류수, 생리 식염수(PBS), 수성 계면활성액(aqueous PVA solution) 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 단계(a)의 "유상"은 지방산 및 생체적합성 고분자를 수상과 섞이지 않는 소수성 및 휘발성이 강한 유기용매 내에서 용해한 것을 이용할 수 있으며, 구체적으로 예를 들면, 지방산 및 생체 적합성 고분자를 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 디메틸포름아미드, 에틸 아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴, 테트라하이드로푸란, 디메틸설폭사이드 및 이들의 혼합 용매 등에 용해한 것을 이용할 수 있다. 본 발명의 단계 (a)의 제1수상과 유상의 혼합은 바람직하게는 기계적 교반을 이용하여 실시할 수 있고, 예를 들어 초음파파쇄기, 호모믹서, 교반기 등을 이용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 단계(a)를 통해 제조한 단일 에멀젼(w/o)은 제2 수상과 혼합하여 이중 에멀젼(w/o/w)을 형성시킨다. 제2 수상은 구체적으로 예를 들면, 폴리비닐알콜, 폴록사머, 폴리비닐피로리돈 등의 수성 계면활성액을 사용할 수 있다. 생성된 이중 에멀젼은 유기 용매의 증발 또는 추출 방법을 통해 고형화 시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 단계(a)의 단일 에멀젼은 상기 지방산 및 생체적합성 고분자의 중량비가 0.01:1 내지 0.2:1(지방산: 고분자)일 수 있으며. 바람직하게는 0.05:1 내지 0.15:1일 수 있다. 또한, 상기 탄산칼슘 결정과 생체적합성 고분자는 중량비가 0.001:1 내지 1:1(탄산 칼슘: 고분자)일 수 있으며, 바람직하게는 0.01:1 내지 0.8:1, 더 바람직하게는 0.1:1 내지 0.6:1일 수 있다.
본 발명인 나노 입자 제조방법은 본 발명의 다른 일 양태인 나노 입자를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 나노 입자와 중복되는 내용에 대하여는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
본 발명에 따른 고부자 나노입자는 체내에서 순환하다가 지방 세포 특이적으로 합입되어 세포 내에서 이산화탄소를 발생시킴으로써, 지방 세포 괴사를 통해 지방을 분해시킬 수 있다. 특히, 본 발명에서는 리간드(지방산)를 사용하여 지방 세포로의 표적이 가능하므로, 주변 조직 및 세포에 대한 영향을 최소화할 수 있으며, 이를 틍해 약물에 대한 부작용을 최소화할 수 있고, 더욱 안전한 시술이 가능한 제품 개발이 가능하다. 상기 나노 입자는 일반적으로 시술 빈도가 높은 턱, 허벅지, 팔, 배 등의 부위에 적용이 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 나노 입자는 주사 가능한 제제로 제작가능하고, 다이어트 미용 분야 및 비만치료제 분야에 적용되어 국소 지방의 괴사를 통해 국소 지방을 분해하는 국소 지방 분해 보완재, 제형 교정제 또는 다이어트 미용 제품 등으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일례에 따른 지방산 도입 나노 입자(a)와 지방산(b) 및 지방산 도입 나노 입자(b)의 지방 세포 내로의 함입 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 DLS로 측정한 (a) PNP, (b) GNP, (c) PA-GNP2 및 (d) PA-GNP10의 크기 분포를 나타낸 도면이다.
도 3은 (a) PNP, (b) GNP, (c) PA-GNP2 및 (d) PA-GNP10의 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 4는 팔미트산 농도별 나노입자의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 팔미트산 농도별 나노입자의 py-GC/MS 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6은 GNP, PA-GNP2 및 PA-GNP10 ([CaCO3] = 0.5mg/mL)로 처리한 세포의 시험관 내 생존률을 나타낸 것이다.
도 7은 (a) 3T3-L1 지방 전구 세포, (b) 6일째 3T3-L1 지방 세포, (c) 10일째 3T3-L1 지방 세포, (d) 배양 후 12일째 3T3-L1 지방 세포의 오일레드 O 염색 이미지 및 (e) 시간에 따른 3T3-L1 지방 전구 세포 및 지방 세포에서 용출된 오일레드 O의 광학 밀도 값의 변화를 나타낸 것이다.
도 8은 다양한 농도의 PNP, GNP, PA-PNP2 and PA-PNP10로 처리한 3T3-L1 지방 세포의 시험관 내 생존률을 나타낸 것이다.
도 9는 (a) GNP, PA-GNP2 및 PA-GNP10 ([CaCO3] = 0.5 mg/mL)로 처리된 3T3-L1 지방 세포의 시험관 내 생존률 및 (b) 다양한 농도의 CaCO3가 함유된 PA-GNP10로 처리된 3T3-L1 지방 세포의 시험관 내 생존률을 나타낸 것이다.
도 10은 alexa 488 카다베린이 컨쥬게이션된 PNP 및 PA-PNP로 처리된 3T3-L1 지방 세포의 공 초점 현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 11은 alexa 488 카다베린이 컨쥬게이션된 PNP 및 다양한 종류의 FA-PNP로 처리된 3T3-L1 지방 세포의 공 초점 현미경 이미지를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
참고 실험 재료
폴리(DL-락타이드-코-글리콜라이드) (PLGA, Mw 6400, 50:50, 0.15-0.25 dL/g, 카르복실 레이트말단기)는 Lactel Absorbable Polymers (Birmingham, AL, USA)에서 구입하였다. 폴리(비닐 알코올) (PVA, Mw 30000-70000, 87-90 % 가수분해됨), 다이클로로메탄 (메틸렌클로라이드, MC), 탄산 칼슘 (CaCO3), 팔미트산 (PA), 오일 레드 O, 수산화 나트륨 (NaOH), 염산염 (HCl), 아세트산 나트륨 (무수), 아세트산, 다이메틸설폭사이드 (DMSO), 3-아이소부틸-1-메틸-크산틴 (IBMX), 인슐린, 덱사메타손, 둘베코 인산염 완충 식염수 (DPBS), 페니실린-스트렙토마이신 글루타민, 10% 포르말린 용액은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 2-프로판올 (아이소프로판올, 99.5 %)은 삼천 (서울 강남)에서 구입하였다. CellTiter 96® Aqueous One Solution (MTS 분석)은 Promega (Madison, WI, USA)에서 구입하였다. 둘 베코의 개량 이글 배지 (DMEM, 4.5g/L, D-포도당)는 웰진 (경북 경산)에서 구입하였다. 소 태아 혈청 (FBS) 및 송아지 소 혈청 (CS)은 Gibco (미국 뉴욕 주 그랜드 아일랜드)에서 구입하였다. 트립신-에틸렌다이아민테트라아세트산 및 Hoechst 33342는 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)에서 구입하였다. Alexa fluor™ 488 카다베린 나트륨염 및 lysotracker red DND-99는 Invitrogen (Eugene, OR, USA)에서 구입하였다. VECTASHIELD® Antifade 마운팅 배지는 Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA)에서 구입하였다. 물은 Milli-Q (R) System (Millipore; 미국 메사추세츠 주 Billerica)과 정수 RO MAX (Human Science; Hanam, Gyeonggi, Korea)를 사용하여 증류 및 탈 이온화되었다. 마우스 C57BL/6은 오리엔트 (경기 성남)에서 구입하였다.
실시예 1. 팔미트산(palmitic acid)으로 개질된 기체 생성 나노 입자(PA-GNPs)의 제조
지방산 개질 가스 생성 PLGA 나노 입자 (FA-GNP)는 수중유중수 (W/O/W) 이중 에멀젼 및 용매 증발 방법으로 제조되었다. 지방산은 GNP 표면을 물리적으로 개질하였다. 10 % w/v 다이클로로 메탄에 용해한 지방산 용액을 PLGA 용액 (5 % w/v)과 최소 4 시간동안 혼합하였다 (FA-PLGA 용액). (FA-PLGA 용액, 탈 이온수 중 25 % w/v 탄산 칼슘 (포함) 및 4% PVA 용액은 사용할 때까지 얼음 욕조에 고정되었다.) 탄산 칼슘 (CaCO3)을 탈 이온수 (DW) 와 함께 25W 출력에서 90초 동안 초음파기 (Branson Digital Sonifier®; Danbury, CT, USA)를 사용하여 고르게 분산시켰다 (W1). 나노 입자에 CaCO3를 로드하기 위해 CaCO3 분산 용액을 FA-PLGA 용액(O)에 첨가하고 25W 출력에서 90초 동안 초음파 처리기로 유화하였다. 이 에멀젼 (W1/O)을 현탁 중합 보조제로 사용하는 4% PVA 용액에 붓고 초음파 처리기로 2분 동안 35W 출력으로 유화하여 다른 에멀젼 (W1/O/W2)을 만들었다. 완전한 이중 에멀젼을 1% PVA 용액에 첨가하고 밤새 교반하여 남은 다이클로로 메탄을 증발시켰다. 언로드된 CaCO3는 4000g에서 1분 동안 초 원심 분리하여 제거하였다. 그 후 상층액을 31,000g에서 30분간 초 원심 분리하여 나노 입자를 수집하고 탈 이온수로 4회 세척하였다. FA-GNP는 동결 건조 (경기 동두천시 일신 바이오베이스 동결 건조기) 후 4℃에서 보관하였다. CaCO3가 없는 FA-PLGA 나노 입자 (FA-PNP)도 동일한 방법으로 제조하여 대조군으로 사용하였다.
탄산 칼슘을 함유한 PLGA 나노 입자는 W/O/W 이중 유화법으로 제조되어 가스 발생 나노 입자(GNP)로 사용하였다. 탄산 칼슘 (PNP, 가스 발생 없음)이 함유되지 않은 PLGA 나노 입자도 준비하여 대조군으로 사용하였다. GNP에서 CaCO3의 로딩 함량이 55.0% (CaCO3/PLGA; wt/wt%)일 때, GNP의 평균 직경은 246.8 nm이었다. 탄산칼슘 함량 변화에 따른 PNP의 평균 직경에 유의한 변화는 관찰되지 않았다 (표 1). 이것은 2.5 다분산지수 (PDI) 값에서 나타났으며 중성 pH 조건 (pH 7.4)에서 좁은 크기 분포를 나타내었다 (도 2a, 2b). SEM 이미지는 CaCO3가 존재하더라도 나노 입자가 구형을 형성한다는 것을 나타내었다 (도 3a, 3b). pH 의존적 크기 분포 변화는 다음과 같이 측정되었다. PNP는 pH에 따른 크기 차이도 나타나지 않았다. 흥미롭게도 GNP는 산성 조건 (pH 5.5)에서 크기가 크게 증가했을 뿐만 아니라 크기 분포도 넓어짐을 확인하였다 (도 2). 이 결과는 GNP가 산성 pH 조건에 반응하여 이산화탄소 가스를 생성함을 시사할 수 있다.
Figure PCTKR2021019527-appb-img-000001
실험예 1. 팔미트산(palmitic acid)으로 개질된 기체 생성 나노 입자(PA-GNPs)의 특성
나노 입자의 형태는 주사 전자 현미경(SEM) (S-4800 U 전계 방출 주사 전자 현미경, Hitachi, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. PA-GNP의 평균 크기 및 크기 분포는 pH 7.4 (탈 이온수) 및 pH5.5 (아세트산) ([NPs]=0.5mg/ml)에서 동적 광산란 (DLS) (Nano ZS, Malvern 기기, 영국)에 의해 결정되었다. NMR 및 py-GC/MS는 팔미트산 정성 분석에 사용되었다. NMR 분광기를 사용하여 스펙트럼을 획득하였다. 모든 샘플에 대해 DMSO를 용매로 사용하고 2 mg/mL의 등가 농도로 희석하였다. 스펙트럼은 또한 py-GC/MS를 사용하여 획득했으며 모든 샘플은 4mg을 사용하였다. CaCO3의 로딩 함량을 결정하기 위해 PA-GNP를 1M NaOH 용액에 1시간 동안 용해시키고 1M HCl 용액으로 중화시켰다. 나노 입자 용액의 CaCO3 농도 백분율은 Bio Vision (Palo Alto, CA, USA)의 칼슘 비색 분석 키트를 사용하여 추정하고 중량 분율로 계산하였다. PA-GNP에서 생성된 이산화탄소 가스의 양은 칼슘 비색 분석 키트로 측정할 수 있으며 칼슘 이온의 몰수 (Ca2+/CO2=1mol/mol)를 결정하여 계산할 수 있었다. 나노 입자를 인산염 완충액 (pH.7.4 또는 pH.5.5, [CaCO3]=1mg/mL)에 현탁하고 이 용액을 15분 동안 31,000g에서 초 원심 분리하였다.
동물에서 흔히 볼 수 있는 포화 지방산인 팔미트산 (PA)은 동물에서 또 다른 풍부한 지방산인 올레산보다 빛, 공기 및 열에 크게 민감하지 않기 때문에 PLGA 나노 입자의 표면 개질에 선택되어 사용되었다. PA는 향상된 지방 세포 흡수를 위해 다양한 중량비로 PLGA 나노 입자에 물리적으로 결합되었다. 팔미트산으로 개질된 가스 생성 PLGA 나노 입자 (PA-GNP)는 유화 과정에서 O상에서 PA와 PLGA 나노 입자 사이의 자가조립에 의해 제조되었다. PA-GNP 뒤의 숫자는 팔미트산과 PLGA의 공급 비율을 나타낸다 (표 1). PLGA 자체와 비 변형 나노 입자 (GNP)가 대조군으로 사용되었다.
팔미트산과 탄산 칼슘의 첨가로 팔미트산의 첨가량에 따른 나노 입자의 평균 직경에 큰 변화는 없었다 (표 1). 표면에 부착된 PA의 양은 NMR과 py-GC/MS를 통해 정성적으로 분석하였다. PNP 및 PA-PNP 스펙트럼에서 5 및 1.5 ppm의 피크는 PLGA로 식별되었다. PA-PNP의 경우 2.2ppm (-O-CO-CH2, CH2 근처 -COOH), 1.35ppm (-(CH2)n-) 및 0.85ppm (-CH3)에서 PA에 해당하는 새로운 피크가 관찰되었다(도 4). 지방산의 공급비가 증가하면 표면 개질 효율이 감소하였다 (표 2). 초 원심 분리 공정 중 저온 (10℃)은 지방산 손실에 영향을 미칠 것으로 추정되었다. 7.5-7.8분 사이에 관찰된 팔미트산 피크를 바탕으로 7.5-7.8분에 PNP에서는 해당 피크가 나타나지 않는 것을 확인했다 (도 5). 그리고 팔미트산이 첨가된 PA-PNP에서는 팔미트산의 농도에 따라 피크의 정도가 달라졌다. 팔미트산 피크 면적은 나노 입자에 부착된 팔미트산의 양을 계산하기 위해 적분값으로 계산되었다. 나노 입자 제조 과정에서 팔미트산의 손실을 고려해 보면 실제로 팔미트산의 양은 5배가 아니라 6.59배로 차이가 있는 것으로 나타났다. 이러한 1H NMR 및 py-GC/MS의 결과는 PA가 나노 입자 표면에 성공적으로 결합되었음을 나타내었다.
PA-PNP의 형태는 주사 전자 현미경으로도 관찰되었다. 팔미트산을 첨가한 경우에도 PNP에 비해 PA-PNP는 여전히 구형이고 크기에 큰 변화가 없었다 (도 3c, 3d). 산성 조건에서의 크기 변화는 팔미트산이 부착된 경우에도 GNP와 유사하였다. 이상의 결과를 통해 팔미트산에 의한 표면 개질이 GNP의 크기, 형태, 가스 발생 능력 등의 물성에 큰 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2021019527-appb-img-000002
실험예 2. 나노 입자 처리된 세포 생존력 분석
세포 배양 및 3T3-L1 지방 세포 분화
NIH-3T3 세포 (섬유 아세포)는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입했으며 세포는 10% CS 및 1% 페니실린 및 스트렙토마이신 (PS)을 포함하는 DMEM 완전 성장 배지에서 37℃, 5% CO2 조건에서 유지되었다 (10% CS medium). C2C12 세포 (근원세포)는 ATCC에서 구입하여 37℃에서 5% CO2 조건 하에서 10% FBS 및 1% PS (10 % FBS 배지)가 포함된 DMEM 완전 성장 배지에서 유지되었다. 3T3-L1 지방 전구 세포는 ATCC에서 구입하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 10% CS 배지에서 유지하였다. 3T3-L1 지방 전구 세포가 confluency에 도달한 지 2일 후, 세포는 10% FBS에 혼합된 1% IBMX (0.5mM), 0.1% 인슐린 (1μg/mL), 0.1% dexamethasone (1μM)을 포함하는 성장 배지 (MDI 배지)에서 2 일 동안 배양하여 지방 세포 분화를 개시하였다. 세포는 10% FBS와 0.1% 인슐린을 포함하는 DMEM 배지에서 2일 동안 배양되었다. 마지막으로 분화된 세포를 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 배양하고 격일로 배지를 교체하였다.
오일 레드 O 염색
지방 세포 분화 정도를 결정하고 지질 액적을 표시하기 위해 Oil Red O 염색을 사용하였다. Oil Red O 저장액은 Oil Red O 분말 0.7g을 아이소프로판 200 mL에 녹여 밤새 교반하고 0.22μm 시린지 필터로 여과하여 4℃에서 보관하여 제조하였다. 원액과 탈 이온수를 3:2 비율로 혼합하여 Oil Red O 워킹 용액을 제조하고, 실온 (RT)에서 20분간 방치한 후 0.22μm 시린지 필터로 여과하여 사용하였다. 세포를 RT에서 5분 동안 10% 포르말린으로 세척하고 RT에서 1시간 동안 10 % 포르말린으로 고정하였다. 고정 후 세포를 60% 아이소프로판올로 세척하고 완전히 건조시켰다. 그 다음, Oil Red O 워킹 용액을 10분간 첨가하였다. 세포를 탈 이온수로 4회 이상 세척하여 Oil Red O 스톡 용액의 잔류물을 제거하였다. 현미경으로 촬영한 후 다시 완전히 건조시켰다. Oil Red O를 위 아래로 여러 번 피펫팅하여 100% 아이소프로판올로 용출한 다음, 자외선/가시 분광 광도계 (SpectraMax ABS, Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 500nm에서 측정하였다.
PA-GNP의 전달 능력과 그에 따른 in vitro 처리 효과를 확인하기 위해 다양한 세포주를 대상으로 생존력 실험을 MTS로 분석하고 평가하였다. 경쟁 그룹으로 NIH-3T3 섬유 아세포, C2C12 근원세포 및 3T3-L1 지방 전구 세포, 3T3-L1 지방 세포를 사용하였다 (도 6). 대부분의 세포는 지방산을 흡수하여 에너지원으로 사용하기 때문에 지방 세포에 의해 얼마나 특이적으로 흡수되는지 확인하고자 하였다.
GNP는 지방 세포, 지방 전구 세포, 줄기 세포, 섬유 아세포 및 근원세포와 같은 다른 모든 세포주의 세포 생존력에 영향을 미치지 않았다. 이것은 세포가 GNP만 흡수할 수 없고 이산화탄소 가스 생성도 생물학적 pH에서 나타나지 않음을 시사한다. 흥미롭게도 PA-GNP를 사용했을 때 다른 세포주에서는 PA의 존재가 크게 영향을 미치지 않았지만 지방 세포의 경우 생존력이 특히 감소하였다. 이러한 결과를 바탕으로 PA-GNP는 지방산이 가장 많이 흡수되는 지방 세포에 효과적이라는 것을 알 수 있었다. 또한 지방산을 흡수하는 과정에서 발생하는 세포 내 이입의 산성 상태는 이산화탄소 가스 생성을 촉진하고 세포 생존력을 크게 감소시킴을 확인하였다.
실험예 3. 나노 입자의 지방 세포로의 특이적 흡수 및 지방 세포 사멸 능력 분석
3T3-L1 지방 세포로의 PA-PNP의 흡수는 공 초점 레이저 스캐닝 현미경 (TCS SP5, Leica Microsystems, Germany)를 통해 확인하였다. 우선, Alexa fluor™ 488 카다베린을 MES 완충액에 용해시키고 어두운 조건에서 밤새 PA-PNP와 반응시켜 alexa 488 카다베린-PA-PNPs를 제조하였다 (Alexa 488 카다베린/폴리머=1/50, w/w). 표지된 나노 입자는 31,000g에서 15분 동안 초 원심 분리하여 수집하고 탈 이온수로 3회 세척하였다. Alexa 488 카다베린-PA-PNP는 동결 건조 후 4℃에서 보관되었다.
3T3-L1 지방 전구 세포를 공 초점 접시에 권장 접종 밀도 8×104 세포로 시드하고 상기 섹션에서 설명한 대로 분화시켰다. Lysotracker red (50nM) 및 alexa 488 카다베린-PA-PNP (0.5 mg/mL) 함유 배지를 24시간 동안 지방 세포에 처리하였다. 그 후 지방 세포를 DPBS로 3회 세척하여 남아있는 나노 입자를 제거하고 HOECHST (1μg/mL)를 15분 동안 처리하여 핵을 염색하였다. 세포를 10% 포르말린으로 15분 동안 고정하고 안티패이드 마운팅 배지 (VECTASHIELD®, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 사용하여 장착하고 공 초점 현미경으로 분석하였다. 모든 프로세스는 어두운 조건에서 수행되었다.
3T3-L1 지방 전구 세포(preadipocytes)는 CS 배지에서 배양되었고 FBS 배지에서 지방 세포로 분화되었다. 지방 세포 분화 후 세포질에서 지질 액적이 관찰되었고 Oil Red O 염색으로 검출되었다 (도 7). 분화 전부터 분화 후 12일까지 단계별로 지질 액적의 축적을 조사하였다.
3T3-L1 지방 세포의 MTS 분석을 통해 나노 입자의 세포 독성을 평가하였다. 대조군으로는 처리하지 않은 세포를 사용하였으며, PNP, GNP, PA-PNP2, PA-PNP10을 처리한 세포는 시료 농도에 따라 큰 변화를 보이지 않았다 (도 8). 이것은 또한 나노 입자 생산에 사용되는 PLGA, PA 및 CaCO3가 눈에 띄는 독성이 없음을 시사할 수 있다. 반면 PA의 농도가 증가함에 따라 PA-GNP를 처리한 세포의 세포 생존율은 감소하였다 (도 9). 이것은 중요한 의미가 있는 것으로 간주되어 추가 실험에 사용되었다. 도면에는 표시되지 않았지만 PA/PLGA 비율이 1일 때 세포 생존율이 가장 낮은 경향이 있었으나 나노 입자의 특성이 실험하기에 너무 기름져 실험군에서 제외되었다.
3T3-L1 지방 세포로의 PA-PLGA 나노 입자의 특정 세포 흡수는 Alexa 488 카다베린- PA-PNP를 사용하여 공 초점 현미경으로 검사되었다. PA-PNP의 3T3-L1 지방 세포로의 세포 흡수는 표면이 개질되지 않은 나노 입자와 비교하여 명확하게 관찰되었다 (도 10). 이 실험에 사용된 lysotracker 프로브는 중성 pH에서 부분적으로 중화되고 세포막을 자유롭게 관통할 수 있는 약한 염기를 가지고 있다. 또한 산도가 있는 세포 기관에 대해 매우 선택적이다. 따라서 이 실험에서 세포 내부의 산성 pH를 나타내는 리소좀은 선택적으로 염색되어 빨간색으로 나타난다. 이 연구에서 가정된 바와 같이, 표면이 Alexa 488 카다베린의 녹색 표지로 개질된 나노 입자는 다양한 메커니즘에 의해 흡수되어 엔도좀으로 들어가고 결국 리소좀과의 공동 국소화로 이어진다. 따라서 리소좀과 나노 입자가 만나면 노란색이 나타나는 것은 성공적인 흡수를 의미한다. 그리고 이것은 또한 향후 PA-GNP에서 이산화탄소 가스가 생성되어 지방 세포 사멸을 예상할 수 있다.
실험예 4. 다양한 지방산에 의해 개질된 나노 입자의 지방 세포로의 흡수능 분석
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 다양한 길이의 탄소사슬을 갖는 지방산을 이용하여 CaCO3가 없는 FA-PLGA 나노 입자 (FA-PNP)를 제조하여 지방 세포 내 이입 여부를 평가하였다.
구체적으로, 포화 지방산인 Myristic acid(MA, C14), Palmitic acid(PA, C16) 및 Stearic acid(SA, C18)과 불포화 지방산인 Oleic acid(OA, C18)를 사용하였고, 하기 표 3의 비율로 지방산 및 PLGA를 사용하여 FA-PLGA 나노 입자 (FA-PNP)를 제조하였다.
Figure PCTKR2021019527-appb-img-000003
그리고, 실험예 3과 동일한 방법으로 제조된 FA-PNP의지방 세포로의 흡수능을 분석하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 팔미트산 뿐만 아니라, 다른 탄소수를 가진 포화 지방산 및 불포화 지방산을 사용한 경우에도 나노입자의 지방 세포로의 흡수능이 향상되었음을 확인할 수 있었다.

Claims (13)

  1. 탄산 칼슘(Calcium Carbonate) 결정, 생체적합성 고분자 및 지방산을 포함하는 나노 입자로, 상기 탄산칼슘은 나노 입자의 내부에 합입되어 있고, 지방산은 나노 입자의 표면에 노출되어 있는 나노 입자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 나노 입자는 산성 환경에서 이산화탄소를 방출하는 나노 입자.
  3. 제1항에 있어서,
    제 1 항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 폴리락타이드(PLA), 폴리글리콜라이드(PGA), 폴리락타이드-폴리글리콜라이드 공중합체(PLGA), 녹말, 글리코겐, 키틴, 펩티도글리칸, 리그노 설포네이트, 탄닌산, 리그닌, 펙틴, 폴리에틸렌글라이콜, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 블록 공중합체, 셀룰로오스, 헤미 셀룰로오스, 헤파린, 히아루론산, 덱스트란 또는 알지네이트 구조를 갖는 중합체인 나노 입자.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 나노 입자의 직경은 100-300 nm인 나노 입자.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 지방산은 포화 지방산 또는 불포화 지방산인 나노 입자.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 지방산 및 생체적합성 고분자는 중량비가 0.01:1 내지 0.2:1인 나노 입자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 나노 입자를 포함하는 지방 분해용 조성물.
  8. 제7항의 지방 분해용 조성물을 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  9. 하기의 단계를 포함하는 제 1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 나노 입자의 제조 방법:
    (a) 탄산칼슘 결정을 포함하는 제1 수상(water phase)과 지방산 및 생체적합성 고분자를 포함하는 유상(oil phase)을 혼합하여 유중 수형의 단일 에멀젼(W/O)을 형성하는 단계;
    (b) 단계(a)의 에멀젼과 제2 수상을 혼합하여 수중유중수형의 이중 에멀젼(W/O/W)을 형성하는 단계; 및
    (c) 단계(b)의 이중 에멀젼을 고형화시키는 단계.
  10. 제1항에 있어서,
    제 9항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 폴리락타이드(PLA), 폴리글리콜라이드(PGA), 폴리락타이드-폴리글리콜라이드 공중합체(PLGA), 녹말, 글리코겐, 키틴, 펩티도글리칸, 리그노 설포네이트, 탄닌산, 리그닌, 펙틴, 폴리에틸렌글라이콜, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 블록 공중합체, 셀룰로오스, 헤미 셀룰로오스, 헤파린, 히아루론산, 덱스트란 또는 알지네이트 구조를 갖는 중합체인 나노 입자의 제조 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 방법에 의해 제조된 나노 입자의 직경은 100-300 nm인 나노 입자의 제조 방법.
  12. 제 9항에 있어서, 상기 지방산은 포화 지방산 또는 불포화 지방산인 나노 입자의 제조 방법.
  13. 제 9항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자 및 지방산은 중량비가 0.01:1 내지 0.2:1로 혼합된 것인 나노 입자의 제조 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116327708A (zh) * 2023-03-31 2023-06-27 西南交通大学 纳米颗粒的制备方法以及纳米载药颗粒的制备方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992002587A1 (en) * 1990-08-06 1992-02-20 Pfizer Inc. Calcium carbonate treated with fatty acids, manufacture and use
KR20070084319A (ko) * 2004-10-18 2007-08-24 올레오일-에스트론 디벨롭먼츠 에스엘 포유동물의 체중 감소를 위한 에스트로겐의 지방산에스테르 및 열발생 화합물의 사용 방법 및 이를 함유하는조성물
KR100772961B1 (ko) 2006-08-07 2007-11-02 (주)엠큐어 메조테라피／카복시테라피 시술용 복합기
KR20110119640A (ko) 2008-12-22 2011-11-02 마이오우사이언스, 인크. 냉매 공급원과 전원이 통합된 한랭수술 시스템
KR101613606B1 (ko) * 2014-06-13 2016-04-20 한양대학교 산학협력단 가스-생성 나노파티클
WO2020010059A1 (en) * 2018-07-02 2020-01-09 Aptamir Therapeutics, Inc. Targeted delivery of therapeutic agents to human adipocytes
KR102112702B1 (ko) * 2019-12-19 2020-05-19 (주)슈퍼노바 바이오 표면 개질된 가스-생성 나노입자를 이용한 지방 분해용 조성물
JP2020178709A (ja) * 2014-07-31 2020-11-05 アモーフィカル リミテッド． カプセル化された非晶質炭酸カルシウム組成物

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992002587A1 (en) * 1990-08-06 1992-02-20 Pfizer Inc. Calcium carbonate treated with fatty acids, manufacture and use
KR20070084319A (ko) * 2004-10-18 2007-08-24 올레오일-에스트론 디벨롭먼츠 에스엘 포유동물의 체중 감소를 위한 에스트로겐의 지방산에스테르 및 열발생 화합물의 사용 방법 및 이를 함유하는조성물
KR100772961B1 (ko) 2006-08-07 2007-11-02 (주)엠큐어 메조테라피／카복시테라피 시술용 복합기
KR20110119640A (ko) 2008-12-22 2011-11-02 마이오우사이언스, 인크. 냉매 공급원과 전원이 통합된 한랭수술 시스템
KR101613606B1 (ko) * 2014-06-13 2016-04-20 한양대학교 산학협력단 가스-생성 나노파티클
JP2020178709A (ja) * 2014-07-31 2020-11-05 アモーフィカル リミテッド． カプセル化された非晶質炭酸カルシウム組成物
WO2020010059A1 (en) * 2018-07-02 2020-01-09 Aptamir Therapeutics, Inc. Targeted delivery of therapeutic agents to human adipocytes
KR102112702B1 (ko) * 2019-12-19 2020-05-19 (주)슈퍼노바 바이오 표면 개질된 가스-생성 나노입자를 이용한 지방 분해용 조성물

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116327708A (zh) * 2023-03-31 2023-06-27 西南交通大学 纳米颗粒的制备方法以及纳米载药颗粒的制备方法

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