CN109646403B - 一种无载体大环内酯类免疫抑制药物纳米粒的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种无载体大环内酯类免疫抑制药物纳米粒的制备方法。所述的无载体大环内酯类免疫抑制药物纳米粒通过溶剂交换法，自组装形成小分子无载体纳米颗粒，有效地改善了大环内酯类免疫抑制药物的水溶性，浓度依赖性抑制肿瘤细胞的生长。该方法操作方便，简单易行，制得的纳米颗粒粒径小，载药效率高，稳定性好，从而提高了大环内酯类免疫抑制药物的利用度。

Description

一种无载体大环内酯类免疫抑制药物纳米粒的制备方法

技术领域

本发明涉及生物材料与纳米技术领域，具体涉及疏水性药物自组装成无载体纳米药物的制备方法。

背景技术

2018年最新的全球肿瘤统计结果显示，全球估计有1819万癌症新增病例，960万癌症死亡病例。在中国，每天约有1万人确诊癌症，每分钟有7个人被确诊为癌症。因此，有效地治疗癌症已经成为医疗领域迫不及待需要解决的问题。

免疫抑制剂是指能够抑制机体免疫反应的药物，能抑制与免疫反应有关的巨噬细胞的增殖和功能，如T细胞和B细胞等，从而降低抗体免疫反应。免疫抑制剂目前主要用于器官移植后的抗排斥反应和自身免疫病如红斑狼疮、类风湿性关节炎、免疫性溶血贫血等。随着药物得不断地发现，目前已有4代免疫抑制剂，除了本身的抗免疫作用，这些药物的一些新作用新用途也被研究人员发现。

雷帕霉素，又名西罗莫司，是一种新型的大环内酯类免疫抑制剂，是最早发现的mTOR信号通路抑制剂。雷帕霉素目前已被证明具有免疫抑制、抑制新生血管生成，抑制肿瘤细胞生长的作用，如白血病、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、小细胞肺癌和肝癌等。1999年雷帕霉素被FDA批准为免疫抑制用于肾移植病人术后抗排异治疗，2015年又被FDA批准为孤儿药用于治疗罕见的淋巴管肌瘤，这是第一个获批准用在这类罕见病的药物，目前也被用于心脏药物洗脱支架。近年来，雷帕霉素一些新的药理作用被研究人员发现，如雷帕霉素能够使小鼠的寿命延长9 %到14 %；研究还表明雷帕霉素可以延缓肌腱硬化和肝脏功能退化速度，而这是衰老的两大指标。有研究人员通过动物实验表明雷帕霉素能够抑制皮瓣移植后的淋巴管形成，延缓切口愈合；另有研究人员通过体外实验证实雷帕霉素可以抑制淋巴管内皮细胞的管型形成能力。雷帕霉素在卡波西样淋巴血管瘤病、静脉淋巴混合畸形相关疾病的治疗中取得显著疗效。但由于因雷帕霉素自身低溶解性及现阶段的给药方式，极大地限制了其药效的发挥和应用。

溶剂交换法 （反溶剂法）是利用药物在两种不同溶剂中的溶解度不同来制备纳米粒，先将药物溶于良溶剂中，随后向不良溶剂混合，混合时会在不良溶剂里产生局部过饱和状态，从而引发成核、核增长，聚结和聚集等现象，最终聚沉形成纳米粒。在这个过程中很多因素如药物浓度、溶剂性质、不良溶剂／良性溶剂比例等因素会影响到最终粒子性质。该方法操作简单 、反应条件温和。

纳米药物载体可通过增强渗透和存留效应（enhanced permeation andretention effect, EPR）显著提高抗肿瘤药物在肿瘤组织和细胞内的药物浓度，达到靶向输送、缓释给药的目的，从而降低药物的毒副作用。现在研究的药物载体主要有脂质体，两亲性共聚物，固体脂质体、蛋白质，碳纳米管、粒径可控的介孔二氧化硅和金纳米粒子等。虽然纳米载体的制备取得了相当多的成果，可以通过载体的设计合成具有不同功能的纳米载药系统，但也存在许多问题。诸如载体的重量往往远高于装载的药物分子的重量，导致载药体系的载药量非常低。又如，这些载体基本的都是惰性的，仅仅起着运输工具的作用，虽然目前有报道指出大部分载体材料没有明显的毒性，但是载体在纳米载药体系中的大量蓄积，也会带来一定系统毒性和体内代谢行为。

CN 105193732 A 公开了一种雷帕霉素纳米缓释微球，其载药体为线性-树枝状大分子聚乙二醇单甲醚-树枝状-聚-L乳酸，该纳米微球最高载药量达到45%，包封率75%以上，但其载体的生物安全性未知。

CN 102871966 B 公开了一种用于改善雷帕霉素生物利用度的纳米载药颗粒及其制备方法，用确定量的聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸共聚物PEG-PLGA作为载体，通过乳化溶剂挥发法包裹雷帕霉素，得到纳米载药系统，但该纳米载药系统的载药量和包封率数据未知。

无载体纳米载药系统是由疏水的抗肿瘤药物通过自组装形成，使得药物即是载体又是缓释对象，避免了传统高分子或无机载体的使用，展示了高载药量和出色的抗肿瘤疗，具有极佳的生物相容性，也避免了许多传统载体的潜在毒性，为纳米科技应用于抗肿瘤药物传输提供了新途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无载体大环内酯类免疫抑制药物自组装纳米粒的制备方法，以解决现有纳米载药系统存在的载药量和包封率低、载体生物毒性不定，载体制备过程繁琐等问题。

基于以上问题，本发明采用的技术方案是：

所述的无载体大环内酯类免疫抑制药物纳米粒是由纯大环内酯类免疫抑制药物通过溶剂交换法自组装而成；大环内酯类免疫抑制药物为：他克莫司、雷帕霉素、依维莫司、替西罗莫司、唑他莫司、吡美莫司中的一种或多种混合。该纳米粒通过实体瘤的EPR效应（即高通透性和滞留效应）将药物运送到肿瘤部位，从而达到抑制肿瘤生长的作用。

所述的无载体大环内酯类免疫抑制药物纳米粒的制备方法，以雷帕霉素为例，包括以下步骤：

（1）将雷帕霉素溶于良性有机溶剂中，得到雷帕霉素有机溶液，所述的雷帕霉素浓度范围为50 μM ~10 mM，所述的有机溶剂为氯仿、二甲亚砜、甲醇、二氯甲烷、乙醇、丙酮、乙酸、乙醚或乙酸乙酯；

（2）将雷帕霉素有机溶液缓慢滴加至涡旋震荡下的不良溶剂中，持续震荡0.5 h~1h。不良溶剂为磷酸盐缓冲液、水、生理盐水或葡萄糖溶液；

（3）将上述溶液用纯氮气吹干有机溶剂，超声5 - 60 min；

（4）离心3000 rpm，10 min或透析除去游离的药物，即得到无载体的雷帕霉素纳米粒。

雷帕霉素有机溶液与水的体积比为1:2~1:20；雷帕霉素纳米粒浓度为50 μM~5000μM。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

本发明采用以上技术方案，用纯的疏水性的大环内酯类免疫抑制药物—雷帕霉素自组装形成高载药量的无载体纳米药物传输系统，有效地改善了大环内酯类免疫抑制药物的水溶性，浓度依赖性抑制肿瘤细胞的生长。该方法操作方便，简单易行，制得的纳米颗粒粒径小，载药效率高，稳定性好，提高了大环内酯类免疫抑制药物的利用度。更重要的是解决了传统纳米载体潜在毒性，为纳米科技应用于抗肿瘤药物传输提供了新途径。

附图说明

图1为雷帕霉素分子结构式；

图2为实施例1纳米粒比例优化粒径图（有机溶剂-水比例依次为：1:2、1:4、1:5、1:8、1:10、1:20）；

图3为实施例2纳米粒各比例载药量与包封率统计图（有机溶剂-水比例依次为：1:2、1:4、1:5、1:8、1:10、1:20）；

图4为实施例3纳米粒的AFM图；

图5为实施例4测定纳米粒稳定性的粒径图；

图6为实施例5纳米粒对A549细胞作用24 h后的增殖抑制作用；

图7为实施例5纳米粒对HeLa细胞作用24 h后的增殖抑制作用；

图8为实施例5纳米粒对MCF-7细胞作用24 h后的增殖抑制作用。

具体实施方式

下面结合具体实施案例对本发明所述的技术方案做进一步阐述，但本发明不限于此。

实施例1

无载体雷帕霉素自组装纳米粒的制备

精确称取雷帕霉素粉末0.004g ，共6份，分别溶于50 μL、100 μL、125 μL、200 μL、250 μL和500 μL的甲醇中，超声10 min溶解，逐滴加至涡旋震荡的1000μL的水中，持续震荡0.5 h~1 h。用纯氮气吹干有机溶剂，超声30 -60 min，离心3000 rpm，10 min除去游离的药物，得到有机溶剂-水比例分别为1:20、1:10、1:8、1:5、1:4和1:2的无载体雷帕霉素自组装纳米粒溶液。雷帕霉素的分子结构式如图1所示，得到的不同比例的无载体雷帕霉素自组装纳米粒溶液的粒径图如2所示。

当有机溶剂与水的比例从1:2至1:20时，粒径逐渐减小到稳定在130 nm左右，这是因为药物分子从有机相滴加到水相的过程会影响过饱和度，从而影响成核率和成核生长，影响粒径和PDI。合适的粒径和PDI利于制成的纳米粒进入肿瘤细胞发挥杀伤作用。

实施例2

无载体雷帕霉素自组装纳米粒的载药量及包封率的测定

将实施例1中制得的不同比例的无载体雷帕霉素自组装纳米粒溶液用紫外风光光度计测定，按照载药量=（纳米粒中的含药量/ 纳米粒总重量）× 100 %，包封率= （总药量-游离的药量）/总药量 × 100 % 计算得到各比例的载药量和包封率。结果如图3，各个比例都有较高的载药与包封率，优于传统的有机或无机纳米载药系统，且当有机溶剂-水比例为1:10时，粒径适中，载药量87.45 %和包封率95.53 %，为最佳比例。

实施例3

无载体雷帕霉素自组装纳米粒形态的测定

按照实施例1的方法制得的有机溶剂-水比例为1:10的无载体雷帕霉素自组装纳米粒，用水稀释 5倍，滴于表面平整且干净的云母片表面自然吸附20 min，然后用超纯水小心清洗云母片表面并立即用氮气吹干。所得样品置于型号为 Multimode 8（德国，布鲁克）的 AFM 仪器下在空气中通过智能模式扫描成像观察形貌。结果如图4所示，制得的无载体雷帕霉素自组装纳米粒为圆形结构、大小较均一的颗粒。

实施例4

无载体雷帕霉素自组装纳米粒水溶液及在培养基中稳定性的测定

按照实施例1的方法制得的有机溶剂-水比例为1:10的无载体雷帕霉素自组装纳米粒，将其与含10 % 胎牛的1640培养基和DMEM培养基按照1:1的比例混匀，测定其在0 h、24 h、48 h、72 h的粒径变化。同时也测定其在水溶液中7 d内的粒径变化。如图5所示，无载体雷帕霉素自组装纳米粒在7 d内粒径无明显变化（左图），在含10 % 胎牛的1640培养基和DMEM培养基中72 h内粒径变化不显著（右图），显示出无载体雷帕霉素自组装纳米粒的高稳定性，为后续的细胞毒性试验提供了实验基础。

实施例5

无载体雷帕霉素自组装纳米粒对三种癌细胞增殖抑制作用的测定

采用MTT法测定无载体雷帕霉素自组装纳米粒与游离雷帕霉素药物对宫颈癌细胞（HeLa）、非小细胞肺癌细胞（A549）和乳腺癌细胞（MCF-7）的增殖抑制作用。取对数生长期的HeLa细胞、A549细胞、MCF-7细胞，以每孔8000个细胞的密度铺于96孔板，置于培养箱培养24h。培养结束后吸去旧培养基，分别加入不同浓度梯度的无载体雷帕霉素自组装纳米粒与游离雷帕霉素药物，放入培养箱中作用24 h。作用结束后，移去含药培养基，加入100 μL 5mg/mL 的MTT，放入培养箱继续培养4 h。反应结束后，弃去上清，每空加入100 μL DMSO，置于平板震荡仪上100 R 10 min。用酶标仪检测各孔的吸光度值，计算三种细胞的存活率，采用GraphPad Prism软件作图分析，结果如6-8所示，雷帕霉素自组装纳米粒对A549、HeLa、MCF-7细胞IC50值分别是47.95 μM、13.89 μM、 51.98 μM，而游离雷帕霉素药物对 A549、HeLa、MCF-7细胞IC50值分别是122.2μM、15.13 μM、59.70μM，相较于游离的雷帕霉素药物，无载体雷帕霉素自组装纳米粒显示出较强的增殖抑制作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (2)

1.一种无载体大环内酯类免疫抑制药物纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的大环内酯类免疫抑制药物为雷帕霉素；

所述的制备方法包括以下具体步骤：

（1）将雷帕霉素溶于良性有机溶剂中，得到雷帕霉素有机溶液，所述的雷帕霉素浓度范围为50 μM ~10 mM，所述的有机溶剂为氯仿、二甲亚砜、甲醇、二氯甲烷、乙醇、丙酮、乙酸、乙醚或乙酸乙酯；

（2）将雷帕霉素有机溶液缓慢滴加至涡旋震荡下的不良溶剂中，持续震荡0.5 h~1 h；不良溶剂为水、生理盐水或葡萄糖溶液；

（3）将上述溶液用纯氮气吹干有机溶剂，超声5 - 60 min；

（4）离心3000 rpm，10 min或透析除去游离的药物，即得到无载体的雷帕霉素纳米粒；

雷帕霉素有机溶液与水的体积比为1:10。

2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，雷帕霉素纳米粒浓度为50 μM~5000 μM。

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