CN116297934A - 芡实及其制剂特征图谱的构建方法及用途 - Google Patents

芡实及其制剂特征图谱的构建方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药检测技术领域，具体提供了芡实及其制剂特征图谱及其构建方法，所述芡实及其制剂特征图谱的构建方法中，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲酸的水溶液‑乙腈为流动相，梯度洗脱，发现仅使用2个洗脱程序即可得到9个共有特征峰，并实现了这些共有特征峰的很好分离，洗脱程序简单，得到的特征图谱基线平稳，噪音干扰较小，特征峰峰形好、分离度高，该方法可将芡实与其混淆品进行区分，为芡实及其制剂的质量检测和控制提供依据，实现对芡实及其制剂整体成分表征，重现性稳定。

Description

芡实及其制剂特征图谱的构建方法及用途
技术领域
本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种芡实及其制剂特征图谱的构建方法及用途。
背景技术
芡实为睡莲科植物芡Euryale ferox Salisb.的干燥成熟种仁。呈类球形，多为破粒，完整者直径5～8mm。表面有棕红色或红褐色内种皮，一端黄白色，约占全体1/3，有凹点状的种脐痕，除去内种皮显白色。质较硬，断面白色，粉性。气微，味淡。分布于从黑龙江至云南、广东等地。具有益肾固精，补脾止泻，除湿止带之功效。常用于遗精滑精，遗尿尿频，脾虚久泻，白浊，带下。
《中国药典》2020年版仅收载了性状鉴别以及薄层色谱鉴别，至今尚无明确化学成分指标评价芡实药材，简单测定一个或几个有效成分的量已不能全面反映药材的质量。中药配方颗粒是由中药饮片加水提取，并以提取、减压浓缩、喷雾干燥、制粒等工艺生产制成，其临床疗效应当和汤剂保持一致。标准汤剂为衡量中药配方颗粒是否与汤剂基本一致的物质基准。但是不管是标准汤剂还是中药颗粒剂，均失去了原药材、饮片所具有的显微与性状鉴别特征，即无法从药材的形状、大小、色泽、表面、质地等进行检查和鉴别。因此，有必要建立一种快速鉴别芡实及其制剂特征图谱的方法，为有效控制和科学评价芡实及其制剂的质量提供依据。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种芡实及其制剂特征图谱的构建方法及用途，该方法根据芡实及其药物制剂(标准汤剂或者配方颗粒)的特点，建立该品种的特征图谱，实现各特征峰的有效分离，提高特征峰的个数，同时缩短检测分析时间，提高分离效果，能够快速、有效地鉴别芡实药物制剂正品和易混品，为全面建立芡实药物制剂的质量控制标准提供科学依据。
本发明提供的一种芡实及其制剂特征图谱的构建方法，包括以下步骤，
(1)芡实供试品溶液的制备；
(2)取芡实供试品溶液采用高效液相色谱法检测，得到供试品的特征图谱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲酸的水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→3分钟→38分钟，流动相中乙腈的体积百分比为1％→1％→20％-24％。
进一步的，步骤(1)包括：
1)取芡实供试品，加溶剂提取，得到提取液；
2)将提取液固液分离，取液体，即为供试品溶液。
进一步的，步骤(1)满足如下A-C中的任意一项或者多项：
A、步骤1)中，芡实供试品溶液的提取溶剂选自30％-70％的甲醇水溶液，加入30-100倍量的溶剂；
B、步骤1)中，提取方式为超声提取或者回流提取，提取时间为30min-1h；
C、步骤2)中，所述固液分离独立地选自离心或者过滤。
进一步的，步骤(2)高效液相色谱法的色谱条件还包括：检测波长为308-312nm，流速为0.25-0.32ml/min，柱温23-27℃，进样量为2-5μl；
优选的，甲酸的水溶液中甲酸的体积百分数为0.48-0.52％。
进一步的，所述的构建方法还包括采用没食子酸加溶剂制备对照品溶液的步骤，以及按照上述任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品参照图谱的步骤，优选的，溶剂选自30％-70％的甲醇水溶液，优选的，每1mL对照品溶液中含10-100μg的没食子酸。
进一步的，所述对照品溶液的制备方法，包括如下步骤：所述的构建方法还包括采用芡实对照药材经水提、干燥后得到的残渣再按照上述任一所述的构建方法得到对照药材参照物溶液，以及按照上述任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照药材参照图谱的步骤。
进一步的，所述芡实及其制剂的特征图谱具有9个特征峰，峰1与没食子酸对照品参照物峰保留时间相对应，以没食子酸对照品参照峰相对应的峰为S峰，各特征峰与S峰的相对保留时间在规定值的±10％范围内，规定值为：1.26(峰2)、2.11(峰3)、3.21(峰4)、3.57(峰5)、4.81(峰6)、5.81(峰7)、7.41(峰8)、7.62(峰9)，峰7、峰9与S峰的相对峰面积在规定值范围内，规定值为：不得大于0.68(峰7)、0.45(峰9)。
本发明还提供了上述任一项所述的芡实及其制剂特征图谱的构建方法在芡实产品与伪品的鉴别或者在芡实产品的质量检测中的用途。
本发明还提供了一种芡实产品与伪品的鉴别方法，包括将待鉴别产品的特征图谱与芡实及其制剂的对照特征图谱进行比较的步骤；所述待鉴别产品的特征图谱为使用待鉴别芡实产品为供试品按照上述任一所述的构建方法得到，所述芡实及其制剂的对照特征图谱选自如下(1)-(4)中的任意一项：
(1)其具有9个共有特征峰，峰1与没食子酸对照品参照物峰保留时间相对应，以没食子酸对照品参照峰相对应的峰为S峰，各特征峰与S峰的相对保留时间在规定值的±10％范围内，峰2-峰9的相对保留时间的规定值分别为：1.26、2.11、3.21、3.57、4.81、5.81、7.41、7.62，峰7与S峰的相对峰面积不大于0.68，优选的，峰9与S峰的相对峰面积不大于0.45；
(2)使用单批次或者多批次芡实供试品按照上述任一所述的构建方法得到的芡实特征图谱；
(3)使用多批次芡实供试品按照上述任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照特征图谱。
本发明还提供了一种芡实及其制剂的质量检测方法，其特征在于，包括将待测芡实产品的特征图谱与芡实及其制剂的对照特征图谱进行比较的步骤；所述待测芡实产品的特征图谱为使用待测芡实产品为供试品按照上述任一所述的构建方法得到，所述芡实及其制剂的对照特征图谱选自如下(1)-(4)中的任意一项：
(1)其具有9个共有特征峰，各特征峰的保留时间与以下各特征峰的保留时间的规定值的RSD<5.0％，各各特征峰的保留时间的规定值分别为3.976min、5.025min、8.405min、12.767min、14.195min、19.112min、23.119min、29.476min和30.304min；
(2)其具有9个共有特征峰，峰1与没食子酸对照品参照物峰保留时间相对应，以没食子酸对照品参照峰相对应的峰为S峰，各特征峰与S峰的相对保留时间在规定值的±10％范围内，峰2-峰9的相对保留时间的规定值分别为：1.26、2.11、3.21、3.57、4.81、5.81、7.41、7.62，峰7与S峰的相对峰面积不大于0.68，优选的，峰9与S峰的相对峰面积不大于0.45；
(3)使用单批次或者多批次芡实供试品按照上述任一所述的构建方法得到的芡实特征图谱；
(4)使用多批次芡实供试品按照上述任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照特征图谱。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的芡实及其制剂特征图谱的构建方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲酸的水溶液-乙腈为流动相，发现仅使用2个洗脱程序即可得到9个共有特征峰，并实现了这些共有特征峰的很好分离，得到的特征图谱基线平稳，特征峰峰形好、分离度高、检测时间短，为芡实及其制剂的质量检测和控制提供依据，实现对芡实及其制剂整体成分表征，重现性稳定。
通过上述构建方法不仅适用于芡实药材层面的鉴别，而且可以针对芡实药物制剂正品与伪品进行鉴别，能够更加全面的对芡实配方颗粒进行质量监控。
2.本发明提供的芡实及其制剂特征图谱的构建方法，特征峰的峰形和分离度较好及特征峰的重复性较好，具有更好的分离效率、峰容量和灵敏度；该方法工作效率高，具有简便、稳定、精密度高、重复性好的优点，能适用于芡实不同的制剂类型，能够控制芡实制剂质量的一致性，快速实现不同类型芡实制剂的质量控制。
本发明提供的芡实制剂的检测方法，通过控制色谱条件可以更好的反应表征出芡实制剂中化学成分整体性物质成分的种类和数目的特征峰，从而能根据各个特征峰的相对保留时间，实现对芡实制剂的质量控制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例4得到的没食子酸对照品图谱；
图2为实施例4得到的芡实配方颗粒供试品图谱；
图3为实施例4得到的芡实对照药材特征图谱；
图4为实验例1梯度1的色谱图；
图5为实验例1梯度2的色谱图；
图6为实验例1梯度3的色谱图；
图7为实验例1梯度4的色谱图；
图8为流速0.25ml/min色谱图；
图9为流速0.30ml/min色谱图；
图10为流速0.32ml/min色谱图；
图11为柱温23℃考察色谱图；
图12为柱温25℃考察色谱图；
图13为柱温27℃考察色谱图；
图14为0.48％甲酸浓度考察色谱图；
图15为0.5％甲酸浓度色谱图；
图16为0.52％甲酸浓度色谱图；
图17为3批芡实配方颗粒特征图谱；
图18为18批芡实标准汤剂冻干粉特征图谱；
图19为芡实配方颗粒对照特征图谱；
图20为仪器精密度色谱图；
图21为重复性色谱图；
图22为中间精密度色谱图；
图23为稳定性色谱图；
图24芡实与莲子特征图谱比较图，S1：芡实；S2-S4：莲子；
图25芡实与白高粱、红高粱特征图谱比较图，S1：芡实；S2-S4：白高粱；S5-S7：红高粱。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。芡实饮片采用芡实药材按照《中国药典》的方法制备。％甲酸溶液或者％甲酸水表示甲酸水溶液中甲酸的体积百分数。芡实饮片标准汤剂冻干粉和芡实配方颗粒按照本领域常规方法制得，例如本发明中的芡实饮片标准汤剂冻干粉和芡实配方颗粒分别通过下述实施例1和实施例2方法制得。
实施例1芡实饮片标准汤剂冻干粉
本实施例提供了一种芡实饮片标准汤剂冻干粉的制备方法，包括如下步骤：取芡实药材，《中国药典》规定除去杂质并破碎后，砂锅煎煮2次，第一次加入8重量倍量的水浸泡30分钟，先武火煮沸，再文火煎煮30分钟，过滤，第二次加入6重量倍量的水武火煮沸后，再文火煎煮20分钟，过滤，合并滤液，滤液浓缩(60℃)至相对密度为1.08～1.12g/ml的浓浸膏，置于冷冻干燥机中冷冻干燥，粉碎成粉末，即得。
实施例2芡实配方颗粒
本实施例提供了一种芡实配方颗粒的制备方法，包括如下步骤：
取芡实药材，《中国药典》规定除去杂质并破碎后，加热回流提取2次，第一次加入8重量倍量的水浸泡30分钟，加热回流提取30分钟，过滤，第二次加入6重量倍量的水提取20分钟，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.00g/ml～1.10g/ml，加辅料适量，干燥，加辅料适量，制粒，即得。
实施例3
本实施例提供了一种芡实饮片标准汤剂冻干粉特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取实施例1制得的芡实饮片标准汤剂冻干粉约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇20ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)参照物溶液的制备：取芡实对照药材2g，加水100ml，加热回流45分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加50％甲醇20ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，放冷，摇匀，滤过，作为对照药材参照物溶液。取没食子酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含没食子酸40μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
(3)超高效液相色谱法检测：分别精密吸取供试品溶液和参照物溶液3μl，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：
Figure BDA0004102428600000041
BEH C18(柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm)；以乙腈为流动相A，0.5％甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml，柱温为25℃，检测波长为310nm。理论板数按没食子酸峰计算应不低于5000。
表1梯度洗脱条件
Figure BDA0004102428600000042
实施例4
本实施例提供了一种芡实配方颗粒特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取实施例2制得的芡实配方颗粒约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇20ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)参照物溶液的制备：与实施例3步骤(2)相同。
(3)超高效液相色谱法检测：与实施例3步骤(3)相同。
结果见图1-3所示，芡实配方颗粒的特征图谱具有9个特征峰，其中峰1与没食子酸对照品参照物峰保留时间相对应。以没食子酸对照品参照峰相对应的峰为S峰，各特征峰与S峰的相对保留时间为：1.27(峰2)、2.13(峰3)、3.24(峰4)、3.60(峰5)、4.85(峰6)、5.87(峰7)、7.48(峰8)、7.69(峰9)。计算峰7、峰9与S峰的相对峰面积，其相对峰面积为0.26(峰7)、0.16(峰9)。
表2芡实配方颗粒和对照品溶液的系统适应性参数
Figure BDA0004102428600000043
Figure BDA0004102428600000051
实验例1色谱条件的优化
1、仪器：
色谱仪:Waters ACQUITY UPLC I-Class色谱系统，包括四元溶剂管理器(ACQ-QSM)、自动进样器(ACQ-FTN)、原装进口色谱柱温箱(ACQ-CM)、二极管阵列紫外检测器(ACQ-TUV)、Empower色谱管理系统；
电子分析天平：Mettler Toledo NewClassic MS十万分之一、Jing TianFA2044A。
色谱柱：
色谱柱：
Figure BDA0004102428600000056
BEH C18(柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm)。
2、试药：
没食子酸对照品(批号：110831-201906，购于中国食品药品检定研究院)；
芡实对照药材：购于中国食品药品检定研究院，批号121421-201804。
芡实配方颗粒：按照实施例2方法制备，批号：2205001Y、2205002Y、2205003Y。甲醇(天地)、乙腈(天地)、甲酸(CNW)、醋酸(Chengdu Chron Chemical Co.,Ltd)、磷酸(ChengduChron Chemical Co.,Ltd)。
3、UPLC方法优化
(1)流动相梯度的选择
表3UPLC特征图谱色谱梯度1
Figure BDA0004102428600000052
表4UPLC特征图谱色谱梯度2
Figure BDA0004102428600000053
表5UPLC特征图谱色谱梯度3
Figure BDA0004102428600000054
表6UPLC特征图谱色谱梯度4
Figure BDA0004102428600000055
Figure BDA0004102428600000061
结果见图4-7所示，由梯度1优化到梯度2，10-13分钟的色谱峰分离效果较好，可分离得到较多的色谱峰；由梯度2优化到梯度3，24-28分钟色谱峰分离得到的较大改善；由峰3优化到峰4，峰4色谱峰得到了分离，12分钟到14分钟之间得到了两个分离度良好的色谱峰，由此可知，相比于梯度1，梯度2-4能够明显提高色谱峰的分离个数，尤其是采用梯度4可以实现更多色谱峰的有效分离。
(2)不同流速的考察
取同一份实施例4制备的芡实配方颗粒供试品溶液，按实施例4的色谱条件，分别于0.25、0.30、0.32mL/min流速进样分析，记录色谱图，分析各特征峰的分离效果，结果见下表和图8-10所示，当流速发生变化时，各特征峰分离度均大于1.5，其中峰4、5和峰9分离效果有所影响，因此优选的方案中建议固定流速为每分钟0.3ml。
表7芡实饮片标准汤剂(冻干粉)不同流速色谱图参数
Figure BDA0004102428600000062
Figure BDA0004102428600000071
(3)不同柱温的考察
取同一份实施例4制备的芡实配方颗粒供试品溶液，按实施例4的色谱条件，分别于不同柱温下进样分析，记录色谱图，分析各特征峰的分离效果，结果见下表和图11-13所示，当柱温发生变化时，各特征峰分离度均大于1.5，其中峰4、5、7分离效果有所受到影响，因此优选的方案中建议固定柱温为25℃。
表8芡实饮片标准汤剂(冻干粉)不同柱温色谱图参数
Figure BDA0004102428600000072
(4)不同甲酸浓度的考察
取同一份实施例4制备的芡实配方颗粒供试品溶液，按实施例4的色谱条件，分别于不同甲酸浓度下进样分析，记录色谱图，分析各特征峰的分离效果，结果见下表和图14-16所示，当甲酸浓度发生变化时，各特征峰分离效果受到影响较小，说明0.48％-0.52％的甲酸溶液均可行。
表9芡实饮片标准汤剂(冻干粉)不同甲酸浓度色谱图参数
Figure BDA0004102428600000081
实验例2芡实配方颗粒特征图谱的建立
1、仪器与试药
同实验例1。
2、多批次特征图谱的构建
取3个批次的芡实配方颗粒样品(按照实施例2方法制得，批号：2205001Y、2205002Y、2205003Y)分别按照实施例4的高效液相色谱检测得到3批芡实配方颗粒特征图谱，见图17所示。
取芡实药材和18个批次的芡实饮片标准汤剂冻干粉样品(按照实施例1方法制得，批号：2103001Y、2103002Y、2103003Y、2103004Y、2103005Y、2103006Y、2103007Y、2103008Y、2103009Y、2103010Y、2103011Y、2103012Y、2103013Y、2103014Y、2103015Y、210801Y、210802Y、210803Y)分别按照实施例3的超高效液相色谱检测得到18批芡实饮片标准汤剂冻干粉特征图谱和芡实对照药材特征图谱，见图18所示。采用药典委员会编制的特征图谱相似度评价软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，生成对照特征图谱，见图19所示。
测定结果表明18批芡实饮片标准汤剂(冻干粉)及3批芡实配方颗粒特征图谱共有9个特征峰，其中与没食子酸参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，各特征峰的相对保留时间均在规定值的±10％之内。
表10 18批芡实饮片标准汤剂(冻干粉)和3批颗粒特征图谱测定相对保留时间结果
Figure BDA0004102428600000091
表11 18批芡实饮片标准汤剂(冻干粉)和3批颗粒特征图谱测定相对峰面积结果
Figure BDA0004102428600000101
3、规定值
根据研究结果确定：芡实配方颗粒特征图谱供试品色谱中应呈现9个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的9个特征峰的保留时间相对应，其中峰1应与没食子酸对照品参照物峰保留时间相对应。计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围内，规定值为：1.26(峰2)、2.11(峰3)、3.21(峰4)、3.57(峰5)、4.81(峰6)、5.81(峰7)、7.41(峰8)、7.62(峰9)。所得芡实配方颗粒对照特征图谱和芡实对照药材特征图谱相对保留时间及相对峰面积结果如下述表格。
对照图谱的拟合方式采用Mark峰拟合。
表12芡实配方颗粒对照图谱相对保留时间
Figure BDA0004102428600000111
表13芡实配方颗粒对照图谱相对峰面积
Figure BDA0004102428600000112
表14芡实对照药材特征图谱相对保留时间
Figure BDA0004102428600000113
表15芡实对照药材特征图谱相对峰面积
Figure BDA0004102428600000114
实验例4方法学验证
1、仪器精密度
取同一份实施例4制备的芡实配方颗粒供试品溶液，按实施例4的色谱条件，重复进样6次，记录色谱图，测定6个特征峰的相对保留时间、相对峰面积，并进行分析，结果见下表和图20所示，特征峰的相对保留时间及相对峰面积RSD均较小，表明精密度良好。
表16精密度相对保留时间试验结果
Figure BDA0004102428600000115
表17精密度相对峰面积试验结果
Figure BDA0004102428600000116
/>
Figure BDA0004102428600000121
2、重复性
取同一份芡实配方颗粒，按实施例4的方法制备供试品溶液并进样分析，记录色谱图，测定9个特征峰的相对保留时间、相对峰面积，并进行分析，结果见下表和图21所示，特征峰的相对保留时间及相对峰面积RSD均较小，表明重复性良好。
表18重复性相对保留时间试验结果
Figure BDA0004102428600000122
表19重复性相对峰面积试验结果
Figure BDA0004102428600000123
/>
Figure BDA0004102428600000131
3、中间精密度(不同操作人员)
分别由两名检验员在不同的时间，用同一台设备，按实施例4项下方法和色谱条件测定同一批号的芡实配方颗粒，分别测定9个共有峰的相对保留时间及相对峰面积、并进行分析，结果见图22和下表，相对保留时间及相对峰面积RSD均较小，说明该方法中间精密度良好。
表20中间精密度相对保留时间试验结果
Figure BDA0004102428600000132
表21中间精密度相对峰面积试验结果
Figure BDA0004102428600000133
4、稳定性考察
取同一份实施例4制备的芡实配方颗粒供试品溶液，按实施例4的色谱条件，分别于0、4、8、12、18、24h进样分析，记录色谱图，测定9个特征峰的相对保留时间、相对峰面积，并进行分析，结果见图23和下表，各特征峰相对保留时间及相对峰面积RSD均较小，说明该方法稳定性良好，可满足测定的需要。
表22稳定性相对保留时间试验结果
Figure BDA0004102428600000141
表23稳定性相对峰面积试验结果
Figure BDA0004102428600000142
实施例5芡实及其制剂特征图谱的构建方法在检测芡实及其制剂中的应用
本实施例提供了一种芡实及其制剂的质量检测方法，其中，采用实施例4的方法测定了不同批次的芡实配方颗粒，构建待测芡实配方颗粒产品的特征图谱，然后与实验例3构建的对照特征图谱对比，待测芡实配方颗粒产品的特征图谱具有9个共有特征峰，峰1与没食子酸对照品参照物峰保留时间相对应，以没食子酸对照品参照峰相对应的峰为S峰，各特征峰与S峰的相对保留时间在规定值的±10％范围内，规定值为：1.26(峰2)、2.11(峰3)、3.21(峰4)、3.57(峰5)、4.81(峰6)、5.81(峰7)、7.41(峰8)、7.62(峰9)，峰7、峰9与S峰的相对峰面积在规定值范围内，规定值为：不大于0.68(峰7)不大于、0.45(峰9)。因此，可以判断此批次芡实配方颗粒质量合格。
实验例6芡实及其制剂特征图谱的构建方法在鉴别芡实及其制剂中的应用
芡实的主要伪品是红高粱、白高粱、莲子，但性味、功能各不相同，不宜混用。
本实施例提供了一种鉴别芡实及其制剂的方法，包括如下步骤：分别以待鉴别的红高粱饮片标准汤剂冻干粉、白高粱饮片标准汤剂冻干粉、莲子饮片标准汤剂冻干粉为供试品，按照实施例3的方法制备供试品溶液，并在实施例3的色谱条件下检测，结果见下表所示。其中不同批次的红高粱饮片标准汤剂冻干粉(红高粱1-3)、白高粱饮片标准汤剂冻干粉(白高粱1-3)、莲子饮片标准汤剂冻干粉(莲子1-3)为分别取三批次的红高粱药材、白高粱药材和莲子药材根据药典规定除去杂质并破碎后按照实施例1的制备方法制得。
表24莲子、白高粱、红高粱饮片标准汤剂特征图谱测定相对保留时间结果
Figure BDA0004102428600000151
表25莲子、白高粱、红高粱饮片标准汤剂特征图谱测定相对峰面积结果
Figure BDA0004102428600000152
Figure BDA0004102428600000161
测试结果分析，采用上述方法构建特征图谱并与实验例3构建的对照特征图谱对比，见图24-25所示，莲子饮片标准汤剂在12分钟及18-19分钟出现较大的色谱峰，同时，莲子饮片标准汤剂中没食子酸峰特征峰面积明显低于芡实，故各特征峰与没食子酸峰的相对峰面积均较大，这与芡实可形成明显的区分。
白高粱标准汤剂、红高粱标准汤剂在17-18分钟，20-21分钟，25分钟左右均出现较大的色谱峰。没食子酸峰特征峰面积明显低于芡实，故各特征峰与没食子酸峰的相对峰面积均较大，峰7在白高粱及红高粱中较高，峰9在白高粱中未检出，而在红高粱中检出较高。
结合以上区分，通过规定峰7相对峰面积将芡实与莲子、红高粱、白高粱进行区分，通过规定峰9相对峰面积将芡实与莲子、红高粱进行区分，结果见下表所示。
表26峰7和峰9的相对峰面积
相对峰面积 芡实 莲子 红高粱 白高粱
峰7 0.111-0.525 45.093-89.284 3.364-4.224 9.867-25.575
峰9 0.117-0.348 4.910-13.191 4.346-11.302 /
由以上数据可知，芡实的峰7、峰9与S峰(没食子酸)的相对峰面积与伪品相差较大，规定峰7相对峰面积不得高于0.68(0.525×1.3＝0.682)，峰9相对峰面积不得高于0.45(0.348×1.3＝0.452)。
由此证实，该方法可以用此方法用于区分红高粱、白高粱、莲子和芡实。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种芡实及其制剂特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤，
(1)芡实供试品溶液的制备；
(2)取芡实供试品溶液采用高效液相色谱法检测，得到供试品的特征图谱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲酸的水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→3分钟→38分钟，流动相中乙腈的体积百分比为1％→1％→20％-24％。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)包括：
1)取芡实供试品，加溶剂提取，得到提取液；
2)将提取液固液分离，取液体，即为供试品溶液。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)满足如下A-C中的任意一项或者多项：
A、步骤1)中，芡实供试品溶液的提取溶剂选自30％-70％的甲醇水溶液，加入30-100倍量的溶剂；
B、步骤1)中，提取方式为超声提取或者回流提取，提取时间为30min-1h；
C、步骤2)中，所述固液分离独立地选自离心或者过滤。
4.根据权利要求1-3中任一所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)高效液相色谱法的色谱条件还包括：检测波长为308-312nm，流速为0.25-0.32ml/min，柱温23-27℃，进样量为2-5μl；
优选的，甲酸的水溶液中甲酸的体积百分数为0.48-0.52％。
5.根据权利要求1-4中任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括采用没食子酸加溶剂制备对照品溶液的步骤，以及按照权利要求1-4中任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品参照图谱的步骤，优选的，溶剂选自30％-70％的甲醇水溶液，优选的，每1mL对照品溶液中含10-100μg的没食子酸。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备方法，包括如下步骤：所述的构建方法还包括采用芡实对照药材经水提、干燥后得到的残渣再按照权利要求1-4中任一所述的构建方法得到对照药材参照物溶液，以及按照权利要求1-4中任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照药材参照图谱的步骤。
7.根据权利要求1-6中任一所述的构建方法，其特征在于，所述芡实及其制剂的特征图谱具有9个特征峰，峰1与没食子酸对照品参照物峰保留时间相对应，以没食子酸对照品参照峰相对应的峰为S峰，各特征峰与S峰的相对保留时间在规定值的±10％范围内，峰2-峰9的相对保留时间的规定值分别为：1.26、2.11、3.21、3.57、4.81、5.81、7.41、7.62，峰7、峰9与S峰的相对峰面积分别为：不大于0.68、不大于0.45。
8.权利要求1-7中任一项所述的芡实及其制剂特征图谱的构建方法在芡实产品与伪品的鉴别或者在芡实产品的质量检测中的用途。
9.一种芡实产品与伪品的鉴别方法，其特征在于，包括将待鉴别产品的特征图谱与芡实及其制剂的对照特征图谱进行比较的步骤；所述待鉴别产品的特征图谱为使用待鉴别芡实产品为供试品按照权利要求1-7中任一所述的构建方法得到，所述芡实及其制剂的对照特征图谱选自如下(1)-(3)中的任意一项：
(1)其具有9个共有特征峰，峰1与没食子酸对照品参照物峰保留时间相对应，以没食子酸对照品参照峰相对应的峰为S峰，各特征峰与S峰的相对保留时间在规定值的±10％范围内，峰2-峰9的相对保留时间的规定值分别为：1.26、2.11、3.21、3.57、4.81、5.81、7.41、7.62，峰7与S峰的相对峰面积不大于0.68，优选的，峰9与S峰的相对峰面积不大于0.45；
(2)使用单批次或者多批次芡实供试品按照权利要求1-7中任一所述的构建方法得到的芡实特征图谱；
(3)使用多批次芡实供试品按照权利要求1-7中任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照特征图谱。
10.一种芡实及其制剂的质量检测方法，其特征在于，包括将待测芡实产品的特征图谱与芡实及其制剂的对照特征图谱进行比较的步骤；所述待测芡实产品的特征图谱为使用待测芡实产品为供试品按照权利要求1-7中任一所述的构建方法得到，所述芡实及其制剂的对照特征图谱选自如下(1)-(4)中的任意一项：
(1)其具有9个共有特征峰，各特征峰的保留时间与以下各特征峰的保留时间的规定值的RSD<5.0％，各特征峰的保留时间的规定值分别为3.976min、5.025min、8.405min、12.767min、14.195min、19.112min、23.119min、29.476min和30.304min；
(2)其具有9个共有特征峰，峰1与没食子酸对照品参照物峰保留时间相对应，以没食子酸对照品参照峰相对应的峰为S峰，各特征峰与S峰的相对保留时间在规定值的±10％范围内，峰2-峰9的相对保留时间的规定值分别为：1.26、2.11、3.21、3.57、4.81、5.81、7.41、7.62，峰7与S峰的相对峰面积不大于0.68，优选的，峰9与S峰的相对峰面积不大于0.45；
(3)使用单批次或者多批次芡实供试品按照权利要求1-7中任一所述的构建方法得到的芡实特征图谱；
(4)使用多批次芡实供试品按照权利要求1-7中任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照特征图谱。
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