CN116287378A - ‘豆绿’牡丹的内参基因及其引物和应用 - Google Patents

‘豆绿’牡丹的内参基因及其引物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及‘豆绿’牡丹的内参基因及其引物和应用，属于生物技术领域，本发明以绿色牡丹‘豆绿’为试验材料，分析9个候选内参基因的表达稳定性，结果表明UBC和MBF1A在‘豆绿’不同组织中最稳定；GAPDH和ACT在‘豆绿’不同发育时期瓣化雄蕊中最稳定。本发明构建了稳定可靠的‘豆绿’定量检测体系，为‘豆绿’牡丹中的基因表达分析及‘豆绿’花型及花色形成分子机理研究提供了依据，为延长‘豆绿’花朵着色时间，提高其观赏品质提供技术支持，并为其他品种绿花牡丹的持绿研究提供参考，还可以为后续培育牡丹绿色花新品种提供理论依据。

Description

‘豆绿’牡丹的内参基因及其引物和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及园林、园艺、分子育种领域，具体涉及‘豆绿’牡丹的内参基因及其引物和应用。
背景技术
实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)技术是分子生物学中检测相关基因表达情况的最普遍的技术方法之一。qRT-PCR技术操作简便、特异性好、灵敏度高、高效快捷，目前已经成为基因功能研究必需的基础检测手段。
在利用qRT-PCR技术进行基因表达情况分析时，为了消除不同RNA样品之间可能对实验结果造成的误差，需要利用适合的内参基因对实验结果进行校正。理想的内参基因应该表达水平较高，在不同的组织、不同的生长发育阶段、不同的处理条件下均能稳定表达。筛选合适的内参基因是获得可靠qRT-PCR分析结果的前提。
牡丹(Paeonia suffruticosa)起源于我国，是名贵的观赏和药用植物，属于芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)牡丹组(Sect.Moutan DC)，以硕大的花朵以及丰富多彩的颜色著称，有“花中之王”的美誉。牡丹栽培品种在培育过程中经历反复杂交，遗传背景不清。Lv等对牡丹品种‘洛神晓春’进行了基因组测序，获得了13.79Gb的基因组序列。‘洛神晓春’的转录组数据和基因组数据匹配率只有73.2％。其余4个公开报道的牡丹转录组数据和‘洛神晓春’基因组的匹配率更低，仅有0.04％-68.41％，说明不同牡丹品种之间存在高度的遗传多样性(Lv et al.，2020)，导致牡丹内参基因缺乏通用性。不同的牡丹品种适用的内参基因差异明显，甚至同一牡丹品种、不同组织、不同处理条件适用的内参基因都各不相同。β-actin和b-tubulin在‘鲁菏红’花芽休眠解除过程中最稳定(张玉喜等，2011)；CYC和EF2α是滇牡丹种子中最稳定的内参基因组合(潘沫晗等，2020)。ubiquitin和GAPDH是‘洛阳红’不同实验条件下最稳定的内参基因组合(王彦杰等，2012)。Li Jian等在3个牡丹品种6个发育时期的花瓣中检测了10个候选内参基因的稳定性，研究结果表明GAPDH和UBC在‘凤丹’和‘西施’中最稳定，EF-1α和UBC在‘雀好’中最稳定(Li et al.，2016)。刘洪峰等研究了‘凤丹’、‘西施’、‘雀好’3个品种共33份样本，对16个候选内参基因进行了筛选分析。在‘凤丹’、‘西施’、‘雀好’3个品种不同发育阶段的花瓣中，ERVTP和PP2CFP最稳定；在‘凤丹’不同花色梯度的花瓣中，RPS9和ARFA1C最稳定；在‘凤丹’不同组织中，AMPDS和PUF1639最稳定；在‘凤丹’不同发育时期的种子中，RPS9和PUF1639最稳定(刘洪峰等，2015)。以上结果说明内参基因在不同牡丹品种中的稳定性差异极大，牡丹内参基因在不同品种、不同组织、不同处理条件下不能通用。在进行牡丹的基因表达分析时，需要对适合的内参基因组合进行筛选。
全世界牡丹品种超过2000种，中国就拥有1000多种。鲜艳的花色是牡丹的观赏焦点。牡丹野生品种花色较为单一，经过漫长的自然选择以及人工选择，花色逐渐丰富，目前已发展出红、粉、黄、紫、绿、白、黑、蓝、复色九大色系，各色系又派生出不同的过渡色、近似色。绿色花朵是由于花瓣组织中合成了叶绿素。很多植物的花朵在发育早期含有叶绿素，花朵开放后，花瓣组织中的叶绿素含量急剧降低。在自然界，绿色花朵不显眼，无法吸引传粉者，不利于植物繁殖后代，一般无法顺利繁衍。在观赏园艺植物中，绿色花作为一种珍贵罕有的性状，被选育及发展，并形成了稳定的品种。目前，牡丹、芍药、菊花、月季、兰花、百合等少数花卉种类已培育出绿色花品种，但关于绿色花的着色机理研究还不够深入。
目前，牡丹中已培育出十多种绿花品种，但都不能长久持绿，花朵均随开花进程逐渐褪绿，开花中后期变为绿白相间(‘翡翠’)、白色(‘翠幕’、‘绿幕’、‘绿幕隐玉’、‘青香球’)或粉色(‘豆绿’、‘翡翠球’、‘荷花绿’、‘绿香球’、‘绽绿’)，严重影响了其观赏品质，也不符合广大赏花群众对“绿牡丹”的期望。对绿花牡丹的研究主要集中在遗传分类、常规育种和栽培技术上，对其着色机制的研究还未见报道。
‘豆绿’是中国最大的牡丹种群——中原牡丹中的绿色珍品，也是牡丹四大名品之一，历史悠久，享誉海外。‘豆绿’在花器官发育的早期，呈鲜翠的绿色。随着花器官发育成熟，花瓣松散，盛开时颜色变为白中带粉。开放过程绿色褪去，严重影响了‘豆绿’的观赏品质。‘豆绿’花朵为皇冠型或绣球型，雄蕊、雌蕊完全瓣化，瓣化雄蕊是其花器官的主体部分，也是研究牡丹花型形成机理的良好材料。
‘豆绿’是绿花牡丹中最著名，最典型的品种，对其着色机理的研究对其他绿花牡丹品种非常具有参考价值，也是研究牡丹花型形成机理的良好材料，但现有已报道的所有其他牡丹品种内参基因均不适用于‘豆绿’，无法准确可靠地检测‘豆绿’相关基因的表达情况，成为制约其理论研究和分子育种的瓶颈。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种检测‘豆绿’牡丹不同花器官组织或不同发育时期瓣化雄蕊中基因表达的定量PCR体系，构建的体系稳定可靠，能批量、快速、简便地检测绿色牡丹‘豆绿’相关基因的相对表达情况，为后续的基因功能研究及绿色牡丹新品种培育提供重要依据。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
定量PCR检测‘豆绿’牡丹不同花器官组织中基因表达的内参基因，所述内参基因为UBC和MBF1A；所述UBC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示；所述MBF1A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示。
优选地，所述‘豆绿’牡丹不同花器官组织包括萼片、花瓣、瓣化雄蕊和瓣化雌蕊。
用于扩增上述内参基因的特异性引物，扩增内参基因UBC的引物如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示；扩增内参基因MBF1A的引物如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。
一种‘豆绿’牡丹不同花器官组织定量PCR检测体系，使用UBC和MBF1A作为内参基因，扩增内参基因UBC的引物如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示；扩增内参基因MBF1A的引物如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。
上述内参基因、特异性引物或定量PCR检测体系在‘豆绿’牡丹不同花器官组织基因表达检测中的应用。
定量PCR检测‘豆绿’牡丹不同发育时期瓣化雄蕊中基因表达的内参基因，所述内参基因为GAPDH和ACT；所述GAPDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示；所述ACT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。
进一步地，所述‘豆绿’牡丹瓣化雄蕊的不同发育时期包括露色期(I)、绽口期(II)、初开期(III)、半开期(IV)、盛开期(V)和始衰期(VI)。
用于扩增上述内参基因的特异性引物，扩增内参基因GAPDH的引物如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；扩增内参基因ACT的引物如SEQ ID NO:01和SEQ ID NO:02所示。
一种‘豆绿’牡丹不同发育时期瓣化雄蕊定量PCR检测体系，使用GAPDH和ACT作为内参基因，扩增内参基因GAPDH的引物如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；扩增内参基因ACT的引物如SEQ ID NO:01和SEQ ID NO:02所示。
上述内参基因、特异性引物或定量PCR检测体系在‘豆绿’牡丹不同发育时期瓣化雄蕊中基因表达检测中的应用。
有益效果：本发明只需普通常规的分子生物学仪器和试剂就能批量、快速、简便、可靠地检测绿色牡丹‘豆绿’相关基因的相对表达情况，体系简便可靠，操作性强，适合进行大批量筛选，可以为后续的园艺、化学方法调控牡丹花型提供靶位点，还可以利用洛阳丰富的牡丹资源库，批量筛选花型相关的突变基因，构建牡丹花型突变基因库；本发明为延长‘豆绿’花朵着色时间，提高其观赏品质提供依据，并为其他品种绿花牡丹的持绿研究提供参考，还可以为后续培育牡丹绿色花新品种提供支持；为后续的理论研究、牡丹品种分子育种提供基因资源和依据。
附图说明
图1是‘豆绿’表型图；‘豆绿’初开时为绿色，盛开后褪绿变为白色。‘豆绿’雄蕊、雌蕊瓣化，瓣化雄蕊是其花器官的主体部分。
图2是‘豆绿’候选内参基因琼脂糖凝胶电泳图谱。
图3是候选内参基因熔解曲线图。
图4是geNorm软件分析候选内参基因表达稳定值(M值)和配对变异值(V值)；其中，A：‘豆绿’不同组织内参基因M值；B：‘豆绿’不同组织内参基因V值；C：‘豆绿’不同发育时期瓣化雄蕊内参基因M值；D：‘豆绿’不同发育时期瓣化雄蕊内参基因V值。
图5是PsCUC3基因在‘豆绿’牡丹不同花器官中的表达情况图。
图6是PsNAC5基因在‘豆绿’牡丹不同花器官中的表达情况图。
图7是PsNAC24基因在‘豆绿’牡丹不同花器官中的表达情况图。
图8是PsCLH基因在‘豆绿’牡丹不同发育时期瓣化雄蕊中的表达情况图。
图9是PsPAO基因在‘豆绿’牡丹不同发育时期瓣化雄蕊中的表达情况图。
图10是PsNAC24基因在‘豆绿’牡丹不同发育时期瓣化雄蕊中的表达情况图。
具体实施方式
本发明以绿色牡丹‘豆绿’为试验材料，利用普通PCR、qRT-PCR以及geNorm、NormFinder和BestKeeper软件分析9个候选内参基因的表达稳定性，结果表明UBC和MBF1A在‘豆绿’不同花器官组织中最稳定；GAPDH和ACT在‘豆绿’不同发育时期瓣化雄蕊中最稳定。本发明构建了稳定可靠的‘豆绿’定量检测体系，为‘豆绿’牡丹中的基因表达分析及‘豆绿’花型及花色形成分子机理研究提供了依据。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。若未特别提及，下述实施例中，所用试剂均为常规市售试剂，所用操作均为常规技术手段。
实施例1
一、定量PCR引物筛选
1、‘豆绿’牡丹不同花器官组织、不同时期瓣化雄蕊cDNA获得
该部分可根据需要采用各个实验室惯用的试剂及体系。分别在露色期(I)、绽口期(II)、初开期(III)、半开期(IV)、盛开期(V)、始衰期(VI)采集‘豆绿’瓣化雄蕊，并取‘豆绿’花瓣、瓣化雌蕊及萼片，液氮速冻后用去多糖多酚RNA提取试剂盒分别提取RNA(样本多糖成分含量高，必须用去多糖多酚RNA提取试剂盒)，琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取效果，如果RNA条带清晰明亮，即测定RNA浓度，使用反转录试剂盒合成cDNA，反转录时调整RNA浓度为1000ng/20μl反转录体系。推荐使用宝生物公司的去多糖多酚RNA提取试剂盒TaKaRaMiniBEST Plant RNA Extraction Kit及反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)。合成的cDNA保存于-20℃冰箱待用。
2、‘豆绿’牡丹候选内参基因的选择及引物设计
根据‘鲁荷红’(张玉喜等，2011)、滇牡丹(潘沫晗等，2020)、‘凤丹’、‘西施’、‘雀好’(纪思羽，2013；刘洪峰等，2015；Li et al.，2016)、‘洛阳红’(王彦杰等，2012；刘传娇等，2015)等牡丹品种中的内参基因研究结果，选择了9个候选内参基因(表1)：肌动蛋白基因(Actin，ACT)、微管蛋白基因(β-Tubulin，TUB)、泛素结合酶基因(ubiquitinconjugating enzyme，UBC)、泛素基因(ubiquitin，UBQ)、泛素蛋白连接酶基因(ubiquitinprotein ligase，UPL)、蛋白磷酸酶2A基因(protein phosphatase 2A，PP2A)、蛋白磷酸酶2C基因(protein phosphatase 2C，PP2C)、多蛋白桥接因子1A基因(multiproteinbridging factor 1A，MBF1A)、甘油醛-3磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)，根据同源比对，从‘豆绿’转录组数据中blast出相应基因序列(SEQID NO:19-27)。
利用Primer Premier 5.0设计定量PCR引物，引物长度20～25bp，扩增产物长度140～233bp。PP2C引物序列参考刘洪峰等的结果(刘洪峰等，2015)。引物由上海生工合成，见表1。
表1定量PCR引物信息
Figure BDA0004058693080000071
3、候选内参基因的普通PCR分析及扩增效率检测
候选基因的普通PCR分析以稀释10倍的‘豆绿’混合cDNA为模板，反应体系为：2×Taq PCR MasterMix 10μL，cDNA 1.0μL，正向引物和反向引物(10μmol/L)各0.5μL，加ddH2O补充至20.0μL。遵循以下程序：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，共35个循环；72℃延伸5min。反应完成后1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物扩增情况。结果如图2所示。
如图2所示，UPL未出带，其他8个内参基因的PCR产物在100～250bp之间，与预期结果一致。PCR产物条带单一，无引物二聚体，可用于后续分析。
4、候选内参基因扩增效率检测
将‘豆绿’混合cDNA模板依次稀释5～6个梯度，每个梯度稀释5倍，分别是1、5、52、53、54、55倍稀释。反应体系为TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa)5μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.5μL，‘豆绿’不同稀释倍数混合cDNA 1μL，ddH2O 3μL，总计10μL。定量PCR反应采用两步法，95℃预变性60s；95℃变性10s，60℃延伸30s，共40个循环。循环结束后95℃10s，65℃60s，缓慢升温至97℃，绘制熔解曲线检测定量PCR产物特异性。每个样品3次重复，绘制标准曲线，并计算每对引物的扩增效率，公式如下：E＝[10(1/-斜率)-1]×100％(Pfaffl.，2001)。如图3所示，扩增产物都是单峰，阴性对照没有扩增出峰，初步满足定量PCR分析条件。
所有标准曲线的R2值均大于0.99(表2)。QRT-PCR实验要求引物扩增效率在90％～105％之间，PP2A的扩增效率为165.38％，大于105％，不符合要求，其余7对引物符合要求，可用于后续分析(表2)。
表2定量PCR扩增效率和R2。
Figure BDA0004058693080000081
5、‘豆绿’候选内参基因的表达稳定性分析。
(1)geNorm
geNorm软件通过计算候选内参基因的M值(Expression stability,表达稳定值)来评判内参基因的稳定性，要求M值小于1.5，M值越小，内参基因越稳定。geNorm还可以计算不同数目内参基因组合的V值(Pairwise variation value，配对变异值)来确定所需的内参基因数目，默认的V值为0.15，如果Vn/Vn+1值小于0.15，则最适内参基因的数目是n个。如图4，A所示，在‘豆绿’不同组织中(萼片、花瓣、瓣化雄蕊、瓣化雌蕊)中，稳定性最好的是MBF1A和UBC。如图4，B所示，在‘豆绿’不同组织中，配对变异值V2/3为0.080，小于0.15，所以2个基因作为‘豆绿’不同组织的内参基因组合可以满足要求。瓣化雄蕊是‘豆绿’花器官的主体部分，决定了其花色变化，因此，又分析了瓣化雄蕊中的内参基因表达情况。如图4，C所示，在露色期、绽口期、初开期、半开期、盛开期、始衰期瓣化雄蕊中，稳定性最好的是GAPDH和UBC。如图4，D所示，在不同发育时期瓣化雄蕊中，配对变异值V2/3为0.147，小于0.15，所以2个基因作为‘豆绿’不同发育时期瓣化雄蕊的内参基因组合可以满足要求。
(2)NormFinder
NormFinder软件和geNorm软件一样，都是通过计算表达稳定值来筛选内参基因。表达稳定值越小，候选内参基因越稳定，但NormFinder只能筛选出一个最佳的内参基因。如表3所示，在‘豆绿’不同花器官组织中，UBC的稳定性最好；如表4所示，在‘豆绿’不同发育时期瓣化雄蕊中，GAPDH稳定性最好。
表3NormFinder软件分析‘豆绿’不同花器官组织中候选内参基因的稳定性。
Figure BDA0004058693080000091
表4NormFinder软件分析‘豆绿’不同时期瓣化雄蕊中候选内参基因的稳定性。
Figure BDA0004058693080000092
(3)BestKeeper
BestKeeper软件不需要计算相对表达量，只需将定量PCR实验获得的Cq值直接输入软件，就可以自动计算出候选内参基因之间产生配对的相关系数(r)、标准差(SD)以及变异系数(CV)。当SD大于1时，该候选内参基因不稳定；当SD小于1时，r越大、SD和CV越小，内参基因的稳定性越好。通过分析比较各个值的大小，确定稳定性好的内参基因。由表5所示，在‘豆绿’不同花器官组织中，UBQ和PP2C的相关系数r分别为-0.315和0.034，TUB的标准差SD为1.74，大于1，因此在后续分析中不再考虑以上三个基因。在‘豆绿’不同组织中，UBC的标准差SD最小，稳定性最好。
表5BestKeeper软件分析‘豆绿’不同花器官组织中候选内参基因的稳定性。
Figure BDA0004058693080000101
由表6所示，在‘豆绿’不同发育时期瓣化雄蕊中，PP2C和TUB的标准差SD均大于1，后续评估不再考虑；MBF1A的标准差SD最小，稳定性最好。
表6BestKeeper软件分析‘豆绿’不同时期瓣化雄蕊中候选内参基因的稳定性。
Figure BDA0004058693080000102
(4)geNorm、NormFinder和BestKeeper综合评估
对geNorm、NormFinder和BestKeeper的分析结果计算几何平均数，对内参基因稳定性进行综合评估。如图4B所示，在‘豆绿’不同花器官组织中，2个内参基因的组合可以满足要求。如表7所示，稳定性最好的是UBC和MBF1A。在‘豆绿’不同发育时期瓣化雄蕊中，2个内参基因的组合可以满足要求(图4D)，如表8所示，稳定最好的是GAPDH和ACT。
综上所述，UBC和MBF1A是‘豆绿’不同花器官组织中的最佳内参基因组合；GAPDH和ACT是‘豆绿’不同发育时期瓣化雄蕊中的最佳内参基因组合。
表7‘豆绿’不同花器官组织候选内参基因稳定性综合分析
Figure BDA0004058693080000103
Figure BDA0004058693080000111
表8‘豆绿’不同发育时期瓣化雄蕊中候选内参基因稳定性综合分析
Figure BDA0004058693080000112
二、‘豆绿’牡丹不同花器官组织定量PCR检测体系
根据筛选结果，在‘豆绿’不同花器官组织中，使用UBC和MBF1A作为内参基因，可以满足定量PCR分析要求，相关引物信息为：
表9‘豆绿’牡丹不同花器官组织定量PCR引物信息
Figure BDA0004058693080000113
反应体系为普通定量PCR体系，可使用实验室惯用的定量PCR试剂，推荐使用宝生物公司TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)：
将前述步骤合成的‘豆绿’牡丹萼片、花瓣、瓣化雄蕊、瓣化雌蕊cDNA，分别稀释20倍作为模板进行定量PCR反应。反应体系如下：
Figure BDA0004058693080000114
总计：10μl
定量引物合成后，将引物干粉按要求加水溶解后，等比例混合，作为定量反应的引物。
以UBC和MBF1A作为内参基因。每个组织样本设置2个生物重复，3个技术重复。
将定量PCR仪设置如下：95℃60s；95℃5s，60℃30s，共40个循环；循环结束后95℃10s，65℃60s，缓慢升温至97℃，绘制熔解曲线。
定量PCR反应结束后读取Cq值，根据以下公式进行计算：
ΔCt＝目的基因Cq-内参基因Cq
ΔΔCt＝ΔCt-花瓣样本ΔCt平均值(将花瓣样本设为对照)
相对表达量＝2-ΔΔCt
目的基因相对表达量为以UBC和MBF1A作为内参基因计算值的平均值。
三、‘豆绿’牡丹花器官主体(瓣化雄蕊)定量PCR检测体系
根据筛选结果，在‘豆绿’不同发育时期瓣化雄蕊中，使用GAPDH和ACT可以满足定量PCR分析要求，相关引物信息为：
表10‘豆绿’牡丹花器官主体(瓣化雄蕊)定量PCR引物信息
Figure BDA0004058693080000121
反应体系为普通定量PCR体系，可使用实验室惯用的定量PCR试剂，推荐使用宝生物公司TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)。将前述步骤合成的‘豆绿’露色期(I)、绽口期(II)、初开期(III)、半开期(IV)、盛开期(V)、始衰期(VI)瓣化雄蕊cDNA，分别稀释20倍作为模板进行定量PCR反应。反应体系如下：
Figure BDA0004058693080000122
总计：10μl
定量引物合成后，将引物干粉按要求加水溶解后，等比例混合，作为定量反应的引物。
以GAPDH和ACT作为内参基因。每个组织样本设置2个生物重复，3个技术重复。
将定量PCR仪设置如下：95℃60s；95℃5s，60℃30s，共40个循环；循环结束后95℃10s，65℃60s，缓慢升温至97℃，绘制熔解曲线。
定量PCR反应结束后读取Cq值，根据以下公式进行计算：
ΔCt＝目的基因Cq-内参基因CqΔΔCt＝ΔCt-露色期瓣化雄蕊ΔCt平均值(将露色期瓣化雄蕊样本设为对照)
相对表达量＝2-ΔΔCt
目的基因相对表达量为以GAPDH和ACT作为内参基因计算值的平均值。
实施例2
一、‘豆绿’牡丹不同花器官组织定量PCR检测
1、PsCUC3基因
根据转录组序列信息，使用Primer Premier 5.0设计PsCUC3基因的定量PCR引物，前引物序列为：5'TGCTGGTTCGTCTGGCTTG 3'，后引物序列为：5'AGGTGAAAACGAGGGCTGGAG3'。
以UBC和MBF1A作为内参，检测PsCUC3基因在‘豆绿’不同花器官中的表达水平。QRT-PCR反应条件及程序如上述。设置2个生物重复，3次技术重复，采用2-ΔΔCt法计算PsCUC3基因的相对表达量。
如图5所示，PsCUC3基因在‘豆绿’牡丹瓣化组织(花瓣、瓣化雄蕊和瓣化雌蕊)中的表达量较高。
2、PsNAC5基因
根据转录组序列信息，使用Primer Premier 5.0设计PsNAC5基因的定量PCR引物，前引物序列为：5'CCATGCATTGTGGGTATCAGC 3'，后引物序列为：5'TCGTCTTCACCATCTTTGGAGTC 3'。
以UBC和MBF1A作为内参，检测PsNAC5基因在‘豆绿’不同花器官中的表达水平。QRT-PCR反应条件及程序如上述。设置2个生物重复，3次技术重复，采用2-ΔΔCt法计算PsNAC5基因的相对表达量。
如图6所示，PsNAC5基因在‘豆绿’牡丹萼片和瓣化雌蕊中的表达量较高。
3、PsNAC24基因
根据转录组序列信息，使用Primer Premier 5.0设计PsNAC24基因的定量PCR引物，前引物序列为：5'GAGGTTAGCAATGGTTCGTCTTC 3'，后引物序列为：5'TTCCTTGAGTTTGAGCCTGTCC 3'。
以UBC和MBF1A作为内参，检测PsNAC24基因在‘豆绿’不同花器官中的表达水平。QRT-PCR反应条件及程序如上述。设置2个生物重复，3次技术重复，采用2-ΔΔCt法计算PsNAC24基因的相对表达量。
如图7所示，PsNAC24基因在‘豆绿’牡丹花瓣中的表达量最高。
二、‘豆绿’牡丹花器官主体(瓣化雄蕊)定量PCR检测
1、PsCLH基因
根据转录组序列信息，使用Primer Premier 5.0设计PsCLH基因的定量PCR引物，前引物序列为：5'TATTTGGAAGGCAATGGTG 3'，后引物序列为：5'CCGTATAGCTAACTGGATCA 3'。
以GAPDH和ACT作为内参，检测PsCLH基因在‘豆绿’不同发育时期瓣化雄蕊中的表达水平。QRT-PCR反应条件及程序如上述。设置2个生物重复，3次技术重复，采用2-ΔΔCt法计算PsCLH基因的相对表达量。
如图8所示，PsCLH基因随‘豆绿’牡丹开花进程表达逐渐增强，在褪绿后变白的盛开期、始衰期瓣化雄蕊中的表达量较高。表明PsCLH基因与‘豆绿’花色变化有关。
2、PsPAO基因
根据转录组序列信息，使用Primer Premier 5.0设计PsPAO基因的定量PCR引物，前引物序列为：5'TTCATCATGTAGAGGAGCC 3'，后引物序列为：5'AGCTAAGATAATCCGCAAC 3'。
以GAPDH和ACT作为内参，检测PsPAO基因在‘豆绿’不同发育时期瓣化雄蕊中的表达水平。QRT-PCR反应条件及程序如上述。设置2个生物重复，3次技术重复，采用2-ΔΔCt法计算PsPAO基因的相对表达量。
如图9所示，PsPAO基因在褪绿后变白的始衰期瓣化雄蕊中的表达量较高。表明PsPAO基因与‘豆绿’花色变化有关。
3、PsNAC24基因
根据转录组序列信息，使用Primer Premier 5.0设计PsNAC24基因的定量PCR引物，前引物序列为：5'GAGGTTAGCAATGGTTCGTCTTC 3'，后引物序列为：5'TTCCTTGAGTTTGAGCCTGTCC 3'。
以GAPDH和ACT作为内参，检测PsNAC24基因在‘豆绿’不同发育时期瓣化雄蕊中的表达水平。QRT-PCR反应条件及程序如上述。设置2个生物重复，3次技术重复，采用2-ΔΔCt法计算PsNAC24基因的相对表达量。
如图10所示，PsNAC24基因随‘豆绿’牡丹开花进程表达逐渐增强，在褪绿后变白的盛开期、始衰期瓣化雄蕊中的表达量较高。表明PsNAC24基因与‘豆绿’花色变化有关。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.定量PCR检测‘豆绿’牡丹不同花器官组织中基因表达的内参基因，所述内参基因为UBC和MBF1A；所述UBC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示；所述MBF1A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示。
2.根据权利要求1所述的内参基因，其特征在于：所述‘豆绿’牡丹不同花器官组织包括萼片、花瓣、瓣化雄蕊和瓣化雌蕊。
3.用于扩增权利要求1所述内参基因的特异性引物，其特征在于：扩增内参基因UBC的引物如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示；扩增内参基因MBF1A的引物如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。
4.一种‘豆绿’牡丹不同花器官组织定量PCR检测体系，其特征在于：使用UBC和MBF1A作为内参基因，扩增内参基因UBC的引物如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示；扩增内参基因MBF1A的引物如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。
5.权利要求1所述的内参基因、权利要求3所述的特异性引物或权利要求4所述的定量PCR检测体系在‘豆绿’牡丹不同花器官组织中基因表达检测中的应用。
6.定量PCR检测‘豆绿’牡丹不同发育时期瓣化雄蕊中基因表达的内参基因，其特征在于：所述内参基因为GAPDH和ACT；所述GAPDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示；所述ACT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。
7.根据权利要求6所述的内参基因，其特征在于：所述‘豆绿’牡丹瓣化雄蕊的不同发育时期包括露色期、绽口期、初开期、半开期、盛开期和始衰期。
8.用于扩增权利要求6所述内参基因的特异性引物，其特征在于：扩增内参基因GAPDH的引物如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；扩增内参基因ACT的引物如SEQ ID NO:01和SEQ ID NO:02所示。
9.一种‘豆绿’牡丹不同发育时期瓣化雄蕊定量PCR检测体系，其特征在于：使用GAPDH和ACT作为内参基因，扩增内参基因GAPDH的引物如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；扩增内参基因ACT的引物如SEQ ID NO:01和SEQ ID NO:02所示。
10.权利要求6所述的内参基因、权利要求8所述的特异性引物或权利要求9所述的定量PCR检测体系在‘豆绿’牡丹不同发育时期瓣化雄蕊中基因表达检测中的应用。
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