CN116497150A - 西南桦不同组织和ecm真菌定殖不同时期根系的荧光定量内参基因及其引物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系的荧光定量内参基因及其引物。本发明从多个候选内参基因中筛选出DnaJ基因，在ECM真菌定殖不同时期根系(采用无菌互作体系接种彩色豆马勃0、1、2、7d时的西南桦组培苗根尖)和西南桦不同组织(组培苗根、组培苗茎、组培苗叶、嫁接苗茎尖、嫁接苗幼茎、嫁接苗雄花序)中的表达稳定性强。即DnaJ基因在西南桦ECM真菌定殖不同时期根系以及不同组织中表达稳定，能够作为西南桦外生菌根形成过程及不同组织荧光定量PCR的内参基因。本发明还提供了DnaJ基因的qRT‑PCR引物，为西南桦外生菌根形成过程及不同组织基因表达的精确定量分析奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系的荧光定量内参基因及其引物。
背景技术
西南桦(Betula alnoides Buch.-Ham.ex D.Don)是我国热带、南亚热带地区的速生乡土珍贵树种。其木材材质优良、用途广泛，尤其是西南桦家具、木地板等深受市场青睐；树皮可入药，用于治疗眼疾、感冒、风湿和消化道疾病等。近20年来，西南桦人工林发展迅速，已成为该地区造林面积最大的乡土阔叶树种之一。由于其重要的经济价值和研究价值，西南桦的分子生物学研究逐渐受到重视。
利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析基因表达水平是现代分子生物学研究中的重要手段，因其定量准确、特异性强、灵敏度高及高通量的优点被广泛应用于基因表达分析。在qRT-PCR中，对目标基因相对表达量的分析主要通过内参基因的均一化来确定，因此，选择合适的内参基因非常关键。理想的内参基因应该在各种环境条件下、在不同的组织和细胞中都能恒定或相对稳定地表达。常用的内参基因有肌动蛋白家族(ACTIN)、核糖体蛋白基因(Ribosomal protein L,RPL)、转录延伸因子基因(Elongation factors 1alpha,EF-1α)、多聚泛素酶基因(ubiquitin,UBQ)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、β微管蛋白基因(tubulin,TUB)等。但这些广泛应用的内参基因在不同植物品种及不同实验条件下表达的稳定性差异很大，甚至可能截然相反，盲目地使用一种内参基因会影响试验结果的准确性。因此，选择何种内参基因对于定量PCR结果是否准确显得尤为重要。迄今为止，关于西南桦内参基因特别是在外生菌根(ECM)形成过程中内参基因的筛选几乎没有报道。因此，筛选出稳定的内参基因对西南桦基因表达分析乃至西南桦分子生物学研究至关重要。
发明内容
本发明之目的在于，提供西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系的荧光定量内参基因及其引物。
本发明根据前期的转录组测序数据，应用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和Delta CT四个分析软件对包括泛素接合酶基因(UBC1和UBC2)、转录延伸因子基因(EF-1α)、DEAD-box RNA解旋酶基因(DDX)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)、分子伴侣蛋白基因(DnaJ)、40S核糖体蛋白基因(40S RP)、肌动蛋白基因(ACT)和亲环蛋白基因(CYP)在内的九个候选内参基因在西南桦不同组织(组培苗根、组培苗茎、组培苗叶、嫁接苗茎尖、嫁接苗幼茎、嫁接苗雄花序)和ECM真菌定殖不同时期西南桦根系(采用无菌互作体系接种彩色豆马勃0、1、2、7d时的西南桦组培苗根尖)中的表达稳定性进行了分析。结果表明DnaJ基因在西南桦不同组织及ECM真菌定殖不同时期根系中稳定表达，即DnaJ基因能够作为qRT-PCR的内参基因对目标基因的表达水平进行归一化，解决了西南桦不同组织基因及参与ECM共生体形成基因的表达分析方面缺乏合适内参基因的问题。
本发明的第一个目的是提供DnaJ基因作为西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系的荧光定量内参基因的应用，所述的DnaJ基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
DnaJ基因在西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系中具有良好的稳定性，为准确定量分析西南桦功能基因转录表达水平奠定基础。
本发明的第二个目的是提供DnaJ基因的特异性引物对，作为西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系的荧光定量引物的应用，所述的DnaJ基因的特异性引物对包括上游引物和下游引物，上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQ ID NO.3所示。
优选，所述的应用是采用荧光定量PCR，每个20μL的反应体系中含有：10μL 2×FastReal qPCR PreMix，0.5nmol/L上游引物0.6μL，0.5nmol/L下游引物0.6μL，100ngcDNA，加ddH2O至20μL；荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性5s，60℃退火10s，72℃延伸15s，40个循环。
优选，所述的不同组织是组培苗根、组培苗茎、组培苗叶、嫁接苗茎尖、嫁接苗幼茎和嫁接苗雄花序；所述的ECM真菌定殖不同时期根系是接种彩色豆马勃0、1、2、7d时的西南桦组培苗根尖。
本发明取得的有益效果：
本发明提供的内参基因DnaJ来源于西南桦的转录组数据，与传统的同源比对方法获得的内参基因相比，通过转录组数据筛选到的内参基因具有高量表达和稳定表达的特性。
本发明还提供了DnaJ基因的特异性引物对，应用于西南桦不同组织及外生菌根共生体形成过程中基因转录表达水平的qRT-PCR检测，能够用于西南桦发育及共生体形成过程中关键基因的表达分析，能显著提高所得数据的精准性。本发明还提供了DnaJ基因的qRT-PCR引物对，所述引物对扩增产物特异性强，扩增效率高。
附图说明
图1为西南桦9个候选内参基因的熔解曲线；
图2为西南桦各候选内参基因引物在进行qRT-PCR时的标准曲线；
图3为西南桦候选内参基因在所有样品中qRT-PCR的Ct值。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：候选内参基因的筛选
1.西南桦候选内参基因的筛选
从转录组测序数据中选出表达量较高且表达一致的9个基因序列作为候选内参基因(表1)。
表1候选内参基因信息
2.西南桦不同组织的取样及总RNA提取
实验所用西南桦各样品采集于2022年，分别取组培苗根、组培苗茎、组培苗叶、嫁接苗茎尖、嫁接苗幼茎、嫁接苗雄花序以及采用无菌互作体系接种彩色豆马勃0、1、2、7d时的西南桦组培苗根尖。用清水仔细洗净根尖并用滤纸吸干水分后立即用液氮冷冻并保存于-80℃冰箱内。
取100mg上述西南桦不同样品，在液氮中迅速研磨成粉末，使用植物RNA提取试剂盒(天根)提取西南桦不同组织的RNA。取3μL RNA，应用1％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性；取1μL RNA，用微量紫外分光光度计(NanoDrop 2000)测定其纯度和浓度。将合格样品置于-80℃保存待用。
3.反转录(RT)
以西南桦各样品总RNA为模板，采用20μL的反转录体系。首先，加入1μg RNA、2μL5×gDNA Buffer和RNase-free H2O至10μL，简短离心，彻底混匀，置于42℃孵育3min；然后，置于冰上，再加入2μL 10×King RT Buffer、1μL FastKing RT Enzyme Mix、2μL FQ-RTPrimer Mix和5μL RNase-free H2O，充分混匀后，42℃孵育15min，95℃孵育3min；迅速将离心管放入冰浴中，加水稀释5倍后，-20℃保存。
实施例2：候选内参基因引物设计及qRT-PCR
通过转录组测序获得基因序列，然后利用Primer Premier 5.0设计特异性qPCR引物对，候选内参基因引物序列如表2所示。将10个样品(组培苗根、组培苗茎、组培苗叶、嫁接苗茎尖、嫁接苗幼茎、嫁接苗雄花序以及采用无菌互作体系接种彩色豆马勃0、1、2、7d时的西南桦组培苗根尖)的cDNA等量混合作为模板，按照10倍梯度稀释，即每个模板的浓度分别为10 -1、10-2、10-3、10-4、10-5，共5个梯度进行荧光定量PCR，绘制标准曲线(如图2所示)。利用ABI 7500实时荧光定量PCR仪进行qRT-PCR扩增反应，在20μL的反应体系中依次加入以下试剂：10μL 2×FastReal qPCR PreMix，0.5nmol/L上游引物0.6μL，0.5nmol/L下游引物0.6μL，100ng的cDNA，加ddH2O至20μL。PCR反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性5s，60℃退火10s，72℃延伸15s，40个循环。反应结束后，根据循环阈值(Ct值，如图3所示)，用2-ΔΔCt方法计算内参基因的相对表达量。结果显示，9个候选内参基因标准曲线相关系数R2＞0.99，溶解曲线(图1)均只产生单一熔解峰，无非特异性扩增干扰，因此各候选内参基因的线性分析符合要求。
由图3可知，9个候选内参基因的平均Ct值介于19.39(GAPDH)～29.15(40S RP)之间，表达丰度分布范围较广。在9个候选内参基因中，UBC1和DDX基因的表达水平在不同样品中较为集中，所有样本的平均Ct值分别是23.40和26.17；GAPDH基因的表达水平在不同样品中最为分散，最大是23.44，最小是19.39，平均Ct值是21.49。
表2候选内参基因定量引物
实施例3：候选内参基因稳定性分析
为了筛选最佳的内参基因，每个候选内参基因的稳定性都应用GeNorm、NormFinder、Bestkeeper和Delta CT四个软件进行分析评价。其中，GeNorm软件以Ct值为原始数据，通过计算候选内参基因在不同样品中的基因表达值(M)来判断其表达稳定性，M值越大，基因稳定性越低，相反，M值越小，基因稳定性越高。结果显示，9个候选基因中DnaJ最稳定，GAPDH最不稳定。
NormFinder软件与GeNorm类似，也是以Ct值为原始数据，通过计算候选内参基因的表达值(S)来判断表达稳定性的大小，S值越小越适合做内参基因。从NormFinder结果来看，也是DnaJ最为稳定，与GeNorm软件分析的结果基本一致。
Bestkeeper软件根据不同候选内参基因在样品中的平均Ct值计算两两基因之间产生配对的标准偏差(standard deviation,SD)和变异系数(coefficient of variation,CV)，通过比较各个值的大小，最终选择稳定性好的内参基因。标准偏差和变异系数越小，内参基因的稳定性就越好。当SD>1时，该内参基因的表达不稳定。Bestkeeper软件分析结果显示DnaJ最稳定，与GeNorm和NormFinder分析结果一致。
Delta CT软件则利用平均标准差mSD值来评估内参基因的表达稳定性。mSD值越低，内参基因表达稳定性越高，Delta CT软件分析结果显示DnaJ最稳定，与GeNorm、NormFinder和Bestkeeper分析结果一致(表3)。
表3四个软件的稳定性分析
综上所述，通过多种评价和分析方法，最终筛选出适用于西南桦不同组织基因及ECM真菌定殖不同时期根系基因表达分析的最佳内参基因为DnaJ基因(其核苷酸序列如SEQID NO.1所示)；对应的DnaJ基因的特异性引物对包括上游引物和下游引物，上游引物为F:ATTTGAGCACAACCAGCAGTACA(SEQ ID NO.2)，下游引物为R:ATCCTCCCTCTGATGACCACC(SEQ IDNO.3)。
Claims (4)
1.DnaJ基因作为西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系的实时荧光定量PCR内参基因的应用，其特征在于，所述的DnaJ基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的DnaJ基因的特异性引物对作为西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系的实时荧光定量PCR引物的应用，其特征在于，所述的DnaJ基因的特异性引物对包括上游引物和下游引物，上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用是采用实时荧光定量PCR，每个20μL的反应体系中含有：10μL 2×FastReal qPCR PreMix，0.5nmol/L上游引物0.6μL、0.5nmol/L下游引物0.6μL，100ng cDNA，加ddH2O至20μL；实时荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性5s，60℃退火10s，72℃延伸15s，40个循环。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的不同组织是组培苗根、组培苗茎、组培苗叶、嫁接苗茎尖、嫁接苗幼茎和嫁接苗雄花序；所述的ECM真菌定殖不同时期根系是接种彩色豆马勃0、1、2、7d时的西南桦组培苗根尖。
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