CN116267614B - 一种金叶凤梨鼠尾草的组培快繁方法 - Google Patents
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- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
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Abstract
本发明公开了一种金叶凤梨鼠尾草组培快繁方法，属于植物快繁技术领域。本申请以金叶凤梨鼠尾草嫩枝外植体为材料，将金叶凤梨鼠尾草嫩茎，消毒后切割成带有2至3个叶腋的茎段；将茎段接种到WPM+NAA0.1mg/L+BA0.5mg/L培养基中进行初代培养；将初代培养的组培苗转入WPM+NAA0.05mg/L培养基中进行继代培养；将继代培养的组培苗转入WPM+NAA0.05mg/L培养基中进行生根培养；将生根培养的组培苗转入培养瓶中炼苗后得到金叶凤梨鼠尾草幼苗，获得的金叶凤梨鼠尾草组培苗诱导率、增殖系数和生根率最高，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于植物快繁技术领域，更具体地说，涉及一种金叶凤梨鼠尾草的组培快繁方法。
背景技术
鼠尾草含有多种次生代谢产物，例如一些苦味元素、黄酮类、单宁等，具有抗菌、防疫和防腐作用。在欧洲，早在中世纪，它就被用来预防和治疗流行疾病。鼠尾草也是一种芳香蔬菜，在欧美的家庭饮食中被作为美味食用。鼠尾草叶片含有大量活性物质，经常食用，可以增进身体健康、抗衰老和延年益寿。因此，鼠尾草具有很好的科学研究和市场开发价值。
一些学者对鼠尾草属的多种不同物种开展了组织培养研究，目前见到蓝花鼠尾草、贵州鼠尾草、芡欧鼠尾草、药用鼠尾草、芡欧鼠尾草、新疆鼠尾草、林荫鼠尾草、粉萼鼠尾草等的组织培养研究的文献报道，但未见到金叶凤梨鼠尾草(Salvia elegans′GoldenDelicious′)的文献报道，为此我们开展了金叶凤梨鼠尾草的组织快繁研究，为有效促进鼠尾草植物的规模化生产，充分挖掘鼠尾草资源奠定了基础。金叶凤梨鼠尾草通过种子自然繁殖发芽率低，现在普遍采用扦插繁殖，繁殖系数低，而且繁殖受到季节性影响。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种金叶凤梨鼠尾草的组培快繁方法，解决现有技术中金叶凤梨鼠尾草缺乏的问题。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种金叶凤梨鼠尾草的组培快繁方法，包括：
将金叶凤梨鼠尾草嫩茎，消毒后切割成带有2至3个叶腋的茎段；将茎段接种到初代培养基中进行初代培养；将初代培养的组培苗转入继代培养基中进行继代培养；将继代培养的组培苗转入生根培养基中进行生根培养；将生根培养的组培苗转入培养瓶中炼苗后得到金叶凤梨鼠尾草幼苗。
进一步地，所述的消毒方法为：将金叶凤梨鼠尾草嫩枝用蒸馏水冲洗后，用70％酒精浸泡10-30s，然后用0.1％升汞浸泡5min，最后用无菌水冲洗3次。
进一步地，所述的初代培养基为WPM+NAA0.1mg/L+BA0.5mg/L。
进一步地，所述的继代培养基为WPM+NAA0.05mg/L。
进一步地，所述的生根培养基为WPM+NAA0.05mg/L。
进一步地，全程的培养条件为：培养温度为25-28℃，光照时数为12h/d，光照强度30001x。
进一步地，所述的继代培养次数为1-2次，每次继代培养时长3-4周。
进一步地，所述的炼苗方法为：将金叶凤梨鼠尾草生根组培苗的培养瓶的封口膜逐渐打开，第一天将封口膜稍微抬起，与瓶口之间保留2-3mm的缝隙，并在瓶子里倒入干净的自来水，水面高度在10mm以上；第3天再增加2-3mm的缝隙；第5天再增加2-3mm的缝隙；第7天将生根组培苗拔出，洗去根部的固体培养基，得到金叶凤梨鼠尾草幼苗。
进一步地，具体步骤包括：
1)取金叶凤梨鼠尾草嫩茎，在自来水龙头下冲洗干净，先用75％浸泡20秒左右，然后用0.1％氯化汞浸泡灭菌5分钟，无菌蒸馏水洗涤3次；
2)将消毒后的茎段接种于WPM+NAA0.1mg/L+BA0.5mg/L培养基中，温度25-28℃，光照12h/d，光照强度3000lx，进行初代培养；
3)将初代培养后的组培苗转入WPM+NAA0.05mg/L培养基中，温度25-28℃，光照12h/d，光照强度3000lx，进行继代培养；
4)将继代培养后的组培苗转入WPM+NAA0.05mg/L培养基中，温度25-28℃，光照12h/d，光照强度30001x，进行生根培养；
5)将生根培养的组培苗转入培养瓶中，培养瓶的封口膜逐渐打开，第一天将封口膜稍微抬起，与瓶口之间保留2-3mm的缝隙，并在瓶子里倒入干净的自来水，水面高度在10mm以上；第3天再增加2-3mm的缝隙；第5天再增加2-3mm的缝隙；第7天将生根组培苗拔出，洗去根部的固体培养基，得到金叶凤梨鼠尾草幼苗。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明提供的金叶凤梨鼠尾草组培快繁方法，解决了金叶凤梨鼠尾草通过种子和扦插繁殖受季节影响大、繁殖效率低的问题，具有繁殖速度快、繁殖系数大，繁殖后代整齐一致，移栽成活率高的优点。
附图说明
图1为外植体消毒后的初代培养情况图(a：茎段接种在培养基上、b：外植体萌发)；
图2为金叶凤梨鼠尾草的初代培养结果图(a：芽逐渐伸长、b：长成小苗)；
图3为金叶凤梨鼠尾草的继代培养结果图(a：继代培养初始、b：继代培养新芽萌发)；
图4为金叶凤梨鼠尾草的生根培养结果图(a：组培苗生根侧面照、b：组培苗生根底面照)；
图5为金叶凤梨鼠尾草生根苗炼苗图；
图6为金叶凤梨鼠尾草生根的组培苗移栽至盆钵图；
图7为金叶凤梨鼠尾草移栽的组培苗长大后开花图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1、不同灭菌剂对金叶凤梨鼠尾草外植体消毒的效果
取金叶凤梨鼠尾草盆栽苗的顶部嫩茎，在自来水龙头下冲洗干净，先用75％浸泡20秒左右，然后分别用0.1％氯化汞、84消毒液、7％过氧化氢浸泡灭菌5分钟，无菌蒸馏水洗涤3次，接种于MS+NAA0.1mg/L+BA2.0mg/L的培养基上(图1a)，一周后观察灭菌效果。
结果如表1所示，0.1％氯化汞灭菌效果最好，污染率为零；84消毒液和7％过氧化氢灭菌效果较差，污染率分别达到26.7％和33.3％。
表1不同灭菌剂对外植体消毒的效果
| 灭菌剂 | 灭菌时间 | 接种外植体瓶数 | 染菌瓶数 | 污染率％ |
| 0.1％氯化汞 | 5min | 30 | 0 | 0 |
| 84消毒液 | 5min | 30 | 8 | 26.7 |
| 7％过氧化氢 | 5min | 30 | 10 | 33.3 |
2、金叶凤梨鼠尾草新芽的诱导
将灭好菌的金叶凤梨鼠尾草嫩茎在无菌培养皿上切割成带2个叶腋的茎段，横向摆放在含不同营养成分的固体培养基的表面。
结果如表2所示，在4种不同配方的培养基上百分之百的茎段都能从叶腋诱导出新芽(图1b)，但是不同配方的培养基诱导出的新芽数量存在明显差异，诱导新芽数量最多的是MS+NAA0.1mg/L+BA2.0mg/L配方的培养基，每个茎段能够诱导出4.2个新芽；诱导出新芽数最少的是WPM+NAA0.1mg/L+BA0.5mg/L配方的培养基，每个茎段能够诱导出2.0个新芽。接种后2-3周可见新芽逐渐伸长(图2a)，4-6周可见新芽长成小苗(图2b)。同时还观察到，在WPM+NAA0.1mg/L+BA0.5mg/L配方的培养基上，新芽诱导阶段产生的新芽不会玻璃化，而其它3个处理产生的新芽则有玻璃化的苗头，因此WPM+NAA0.1mg/L+BA0.5mg/L配方的培养基更为合适。
表2不同培养基成分对诱导新芽效果的影响
3、金叶凤梨鼠尾草组培苗继代培养过程中的玻璃化及其逆转培养
将初代培养诱导出的没有玻璃化的组培苗接种到4种培养基上继代培养，结果如表3所示，均有高频率的玻璃化，即使玻璃化频率最低的培养基，其组培苗玻璃化频率也达到86.7％，而玻璃化频率高的处理，可以达到100％。因此，继代培养不宜继续在上述含有细胞分裂素的培养基上进行。
表3不同培养基成分对继代培养组培苗玻璃化的影响
| 培养基 | 接种芽数 | 玻璃化芽数 | 玻璃化率％ |
| MS+NAA0.1mg/L+BA0.5mg/L | 30 | 28 | 93.3 |
| MS+NAA0.1mg/L+BA2.0mg/L | 30 | 30 | 100.0 |
| WPM+NAA0.1mg/L+BA0.5mg/L | 30 | 26 | 86.7 |
| WPM+NAA0.1mg/L+BA2.0mg/L | 30 | 30 | 100.0 |
为了探索玻璃化苗逆转为非玻璃化苗的可能性，使用另外3种培养基培养4周，结果如表4所示，绝大多数玻璃化苗上长出了非玻璃化的新芽和新叶，将新长出的正常的新枝切下接种到适当的培养基上，能够正常生长。其中以WPM+NAA0.05mg/L配方的培养基逆转的效果最好，由玻璃化苗转化为正常苗的频率达到93.3％；WPM不加任何生长调节剂的培养基次之，为86.7％；1/2MS+NAA0.3mg/L配方的培养基最低，为76.7％。因此，在含有细胞分裂素的培养基上诱导出来的新芽和长大的小苗可以在WPM+NAA0.05mg/L配方的培养基上进行继代培养，在此无细胞分裂素的培养基上长大的苗可以再次转换到含有细胞分裂素的培养基上继代培养(图3)，然后又换到不含细胞分裂素的培养基上继代培养，如此轮换继代培养。或者一直在WPM+NAA0.05mg/L配方的培养基上进行继代培养。
表4不同培养基成分对玻璃化苗转化为非玻璃化苗的效果
| 培养基 | 接种玻璃化苗数 | 获得非玻璃化苗数 | 转化率％ |
| WPM | 30 | 26 | 86.7 |
| WPM+NAA0.05mg/L | 30 | 28 | 93.3 |
| 1/2MS+NAA0.3mg/L | 30 | 23 | 76.7 |
4、金叶凤梨鼠尾草组培苗生根培养
结果如表5所示，以WPM为基本培养基+各生长调节剂的组合最终的生根率普遍高于以1/2MS为基本培养基+各生长调节剂的组合，其中在WPM+NAA0.05mg/L培养基上生根效果最好，生根频率达到百分之百。接种到生根培养基2-3周后可以见到组培苗生根(图4)。
表5不同培养基成分对生根的影响
| 培养基 | 接种苗数 | 生根苗数 | 生根率％ |
| 1/2MS+NAA0.05mg/L | 30 | 22 | 73.3 |
| 1/2MS+NAA0.3mg/L | 30 | 24 | 80.0 |
| 1/2MS+IBA0.05mg/L | 30 | 21 | 70.0 |
| WPM | 30 | 26 | 86.7 |
| WPM+NAA0.05mg/L | 30 | 30 | 100.0 |
| WPM+NAA0.3mg/L | 30 | 25 | 83.3 |
| WPM+IBA0.05mg/L | 30 | 29 | 96.7 |
使用WPM+NAA0.05mg/L配方的生根培养基，培养采用不同切割方式得到的组培苗，8天后统计对生根的影响数据。
结果如表6所示，切除叶片的处理不管是否带顶芽，其生根率均低于带叶的处理；切除顶芽的处理，生根率均低于带顶芽的处理。其中带叶带顶芽的处理生根频率最高，为100％；根长也最长，达到7.7mm。4周后再统计，各处理生根率均能达到百分之百，处理之间的差别仅仅是生根时间先后的区别。
表6组培苗不同切割方式对生根的影响
| 切割方式 | 接种苗数 | 生根苗数 | 生根率％ | 根长mm |
| 切叶无顶芽 | 30 | 7 | 23.3 | 0.2 |
| 切叶带顶芽 | 30 | 11 | 36.7 | 0.8 |
| 带叶无顶芽 | 30 | 23 | 76.7 | 2.8 |
| 带叶带顶芽 | 30 | 30 | 100.0 | 7.7 |
5、金叶凤梨鼠尾草的离体快繁
将组培苗切割成带有2至3个叶腋的茎段，接种在WPM+NAA0.05mg/L培养基上，4周后统计对对繁殖系数的影响数据，结果如表7所示，不带叶茎段平均新生叶数为2.4张叶，带叶茎段平均新生叶数为4.6张叶，显然带叶茎段处理更优。将带叶茎段上长出新生叶片的新枝的茎段切下，转接至WPM+NAA0.1mg/L+BA0.5mg/L培养基上4周后获得跟新生叶片相同数量的新生枝，即每2个月的繁殖系数为4.6。综合了玻璃化和减少变异的因素，用WPM+NAA0.05mg/L培养基与WPM+NAA0.1mg/L+BA0.5mg/L培养基轮流接种进行金叶凤梨鼠尾草的离体快繁较为稳妥。
表7组培苗茎段切割方式对繁殖系数的影响
| 切割方式 | 茎段数 | 新生叶数 | 平均新生叶数 |
| 不带叶茎段 | 30 | 72 | 2.4 |
| 带叶茎段 | 30 | 139 | 4.6 |
6、金叶凤梨鼠尾草生根组培苗的炼苗和移栽
将金叶凤梨鼠尾草生根组培苗的培养瓶的封口膜逐渐打开，第一天将封口膜稍微抬起，与瓶口之间保留2-3mm的缝隙，并在瓶子里倒入干净的自来水，水面高度在10mm以上；第3天再增加2-3mm的缝隙；第5天再增加2-3mm的缝隙(图5)，炼苗时间应根据生根组培苗的苗龄灵活调整，越老的苗炼苗时间越短，越嫩的苗炼苗时间越长。通常第7天将生根组培苗拔出，洗去根部的固体培养基，栽入装满蛭石0-5：土壤0-5比例基质的盆钵中栽培(图6)，刚刚移栽的2-3周内避免强烈阳光照射，及时浇水。移栽后3个月可见金叶凤梨鼠尾草现蕾开花(图7)。
Claims (6)
1.一种金叶凤梨鼠尾草的组培快繁方法，其特征在于，包括：
将金叶凤梨鼠尾草嫩茎，消毒后切割成带有2至3个叶腋的茎段；将茎段接种到初代培养基中进行初代培养；将初代培养的组培苗转入继代培养基中进行继代培养；将继代培养的组培苗转入生根培养基中进行生根培养；将生根培养的组培苗转入培养瓶中炼苗后得到金叶凤梨鼠尾草幼苗；
所述的初代培养基为WPM+NAA0.1mg/L+BA0.5mg/L；
所述的继代培养基为WPM+NAA0.05mg/L；
所述的生根培养基为WPM+NAA0.05mg/L。
2.根据权利要求1所述的金叶凤梨鼠尾草的组培快繁方法，其特征在于，所述的消毒方法为：将金叶凤梨鼠尾草嫩枝用蒸馏水冲洗后，用75%酒精浸泡20s，然后用0.1%升汞浸泡5min，最后用无菌水冲洗3次。
3.根据权利要求1所述的金叶凤梨鼠尾草的组培快繁方法，其特征在于，全程的培养条件为：培养温度为25-28℃，光照时数为12 h/d，光照强度3000 lx。
4.根据权利要求1所述的金叶凤梨鼠尾草的组培快繁方法，其特征在于，所述的继代培养次数为1-2次，每次继代培养时长3-4周。
5.根据权利要求1所述的金叶凤梨鼠尾草的组培快繁方法，其特征在于，所述的炼苗方法为：将金叶凤梨鼠尾草生根组培苗的培养瓶的封口膜逐渐打开，第一天将封口膜稍微抬起，与瓶口之间保留2-3mm的缝隙，并在瓶子里倒入干净的自来水，水面高度在10mm以上；第3天再增加2-3mm的缝隙；第5天再增加2-3mm的缝隙；第7天将生根组培苗拔出，洗去根部的固体培养基，得到金叶凤梨鼠尾草幼苗。
6.根据权利要求1-5任一所述的金叶凤梨鼠尾草的组培快繁方法，其特征在于，具体步骤包括：
1）将金叶凤梨鼠尾草嫩枝用蒸馏水冲洗后，先用75%酒精浸泡20秒，然后用0.1%升汞浸泡5min，最后用无菌水冲洗3次；
2）将消毒后的茎段接种于WPM+NAA0.1mg/L+BA0.5mg/L培养基中，温度25-28℃，光照12h/d，光照强度3000 lx，进行初代培养；
3）将初代培养后的组培苗转入WPM+NAA0.05mg/L培养基中，温度25-28℃，光照12 h/d，光照强度3000 lx，进行继代培养；
4）将继代培养后的组培苗转入WPM+NAA0.05mg/L培养基中，温度25-28℃，光照12 h/d，光照强度3000 lx，进行生根培养；
5）将生根培养的组培苗转入培养瓶中，培养瓶的封口膜逐渐打开，第一天将封口膜稍微抬起，与瓶口之间保留2-3mm的缝隙，并在瓶子里倒入干净的自来水，水面高度在10mm以上；第3天再增加2-3mm的缝隙；第5天再增加2-3mm的缝隙；第7天将生根组培苗拔出，洗去根部的固体培养基，得到金叶凤梨鼠尾草幼苗。
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Citations (5)
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| SU1688808A1 (ru) * | 1989-06-14 | 1991-11-07 | Научно-производственное объединение по эфиромасличным культурам и маслам "Эфирмасло" | Питательна среда дл культивировани зародышей шалфе IN VIтRо |
| US5908771A (en) * | 1997-01-31 | 1999-06-01 | R. J. Reynolds Tobacco Company | Method for regeneration of salvia species |
| CN101120654A (zh) * | 2007-09-07 | 2008-02-13 | 湖南农业大学 | 一种芡欧鼠尾草的组织培养方法 |
| CN113207692A (zh) * | 2021-05-31 | 2021-08-06 | 上海应用技术大学 | 一种鼠尾草种苗的繁育方法 |
| CN114303951A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-04-12 | 上海应用技术大学 | 一种深蓝鼠尾草种苗的繁育方法 |
-
2023
- 2023-03-23 CN CN202310293586.4A patent/CN116267614B/zh active Active
Patent Citations (5)
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