CN116240157A - 一种l-酪氨酸高效生产菌株的定向改造方法及生产菌株 - Google Patents

一种l-酪氨酸高效生产菌株的定向改造方法及生产菌株 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种L‑酪氨酸高效生产菌株的定向改造方法及生产菌株，首先进行酪氨酸常规的生产发酵，并分别在其发酵生产进行至22、28、34h时，通过耦连的连续蝶式离心机对其发酵体系中的菌体、酪氨酸等固形物进行祛除，再用去除掉固形物的发酵上清液依次(22h→28h→34h)对现有L‑酪氨酸生产菌株进行适应性进化，在经过36h的定向改造培养后，进行稀释涂布、分离，最终得到一株对菌体发酵后期生长环境高适应力的菌株，所得菌株能更好的适应发酵后期的菌体生长环境，极大的提高了发酵后期的菌体活力、产酸能力，同时也提高了L‑酪氨酸的产酸周期，其L‑酪氨酸产量可达55.0g/L，转化率可达24％。

Description

一种L-酪氨酸高效生产菌株的定向改造方法及生产菌株
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，尤其是一种L-酪氨酸高效生产菌株的定向改造方法及生产菌株。
背景技术
L-酪氨酸又称L-β-对羟苯基-β-丙氨酸，是三大芳香族氨基酸之一，也是重要的必须氨基酸之一。在常温下，L-酪氨酸呈现白色或浅棕色结晶性粉末，微溶于水，易溶于无机酸和碱溶液。在医药、食品、饲料、化工、农业和化妆品等行业广泛应用。
L-酪氨酸的生产方法有提取法、化学法、酶催化法和生物发酵法。发酵法是现有生产方法中最主流的方法，但目前的生产菌株存在产量较低、转化率较低、产酸周期短、菌株活力下降较快等问题。因此，定向改造获得L-酪氨酸高效生产菌株具有非常重要的生产实践意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种L-酪氨酸高效生产菌株的定向改造方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述定向改造方法获得的L-酪氨酸高效生产菌株。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种L-酪氨酸高效生产菌株的定向改造方法，分别正常发酵培养L-酪氨酸生产菌株至22、28、34h，然后通过耦连的碟式离心机去除菌体及部分培养基中的固形物，然后再分别添加2g/L的酵母粉及5g/L的蛋白胨，所生成的培养基用于L-酪氨酸生产菌株的定向改造，定向改造分三个阶段：首先用22h经过离心处理并添加2g/L的酵母粉及5g/L的蛋白胨的培养基，先对L-酪氨酸生产菌株进行第一步的定向改造，培养15h后；然后进行第二步的改造，用上一步改造的菌液作为此次改造的种子液，以20mL的接种量接入28h经过处理的培养基中继续定向改造，再培养15h后；最后进行第三部的改造，用上一步改造的菌液作为此次改造的种子液，以20mL的接种量接入34h经过处理的培养基中继续培养15h，即得。
可通过稀释涂布→挑选单菌落→菌株发酵性能验证等操作确定L-酪氨酸生产性能较好的生产菌株，该L-酪氨酸生产菌株E.coli GHLTYR-168的发酵培养基为用于菌株性能验证的培养基。
优选的，上述L-酪氨酸高效生产菌株的定向改造方法，所述L-酪氨酸生产菌株为L-酪氨酸生产菌株E.coli GHLTYR-168。
优选的，上述L-酪氨酸高效生产菌株的定向改造方法，所述L-酪氨酸生产菌株E.coli GHLTYR-168正常发酵培养方法的具体步骤如下：
(1)菌种活化：将E.coli GHLTYR-168从甘油保菌管中接入斜面培养基中进行活化培养(活化两代)，温度维持在34-36℃；所述斜面培养基成分及含量为：葡萄糖1g/L，氯化钠2.5g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉2g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，VH 2mg/L，琼脂粉25g/L，其余为水；
(2)种子培养：将200mL无菌水于超净台火焰附近倒入上述茄形瓶中，使用接种环将菌落刮至无菌水中并打散制备菌悬液，利用火圈无菌接种入发酵种子培养罐中，培养过程pH维持在6.7-7.0，温度维持在36.8-37.2℃，溶氧维持在35％-50％；所述种子培养基为：葡萄糖30g/L，酵母粉8g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 3g/L，甲硫氨酸0.5g/L，蛋白胨5g/L，组氨酸0.5g/L，VB1 2mg/L、VB3 2mg/L、VB5 2mg/L、VB12 2mg/L，VH 2mg/L，硫酸铵8g/L，苯丙氨酸0.5g/L，消泡剂1g/L，其余为水；
(3)发酵培养：按20％的接种量将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵初期pH维持在6.7-7.0，发酵中后期(菌体OD生长缓慢)发酵pH维持在6.4-6.7，温度维持在36.8-37.2℃，溶氧维持在30％-50％，在发酵后期，由于产物的大量生成、副产物的积累，还有各种蛋白的积累，会造成菌株的生存环境处于一个高渗透压的环境，所述发酵培养基成分为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4·3H2O 4g/L，MgSO4·7H2O2g/L，柠檬酸2g/L，甲硫氨酸1g/L，苯丙氨酸0.5g/L，谷氨酸0.5g/L，FeSO4·7H2O 30mg/L，MnSO4·H2O 10mg/L，VH 1mg/L，VB13 mg/L、VB33 mg/L、VB53 mg/L、VB12 3mg/L，微量元素混合液1.5mL/L，其余为水，pH 7.0-7.2，115℃湿热灭菌15min。
优选的，上述L-酪氨酸高效生产菌株的定向改造方法，所述微量元素混合液组分含量为：钼酸铵0.28mg/L，硼酸5mg/L，CoCl2·6H2O 1.4mg/L，MnSO4·H2O 0.5mg/L，CuSO4·7H2O 0.5mg/L，ZnSO4·7H2O 0.6mg/L，上述成分称量固体后溶解于1L水中，在4℃保存。
优选的，上述L-酪氨酸高效生产菌株的定向改造方法，培养过程中通过流加80％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵过程。
优选的，上述L-酪氨酸高效生产菌株的定向改造方法，所述耦连的碟式离心机与发酵系统耦连的管路及管式离心机均使用蒸汽灭菌。
优选的，上述L-酪氨酸高效生产菌株的定向改造方法，所述用于菌株定向改造的培养体系均为3L体系。
一种L-酪氨酸高效生产菌株，是由L-酪氨酸生产菌株E.coli
GHLTYR-168通过上述定向改造方法制备得到的，命名为E.coli
GHLTYR-168-1。
有益效果：
上述L-酪氨酸高效生产菌株的定向改造方法，首先进行酪氨酸常规的生产发酵，并分别在其发酵生产进行至22、28、34h时，通过耦连的蝶式离心机对其发酵体系中的菌体、酪氨酸等固形物进行祛除，再用去除掉固形物的培养基依次(22h→28h→34h)对现有L-酪氨酸生产菌株进行适应性进化，在经过36h的定向改造培养后，进行稀释涂布、分离，最终得到一株对菌体发酵后期生长环境高适应力的菌株，所得菌株能更好的适应发酵后期的菌体生长环境，极大的提高了发酵后期的菌体活力、产酸能力，同时也提高了L-酪氨酸的产酸周期，其产酸周期从以前的35h提高到了40h；经5L发酵罐发酵验证，其L-酪氨酸产量可达55.0g/L，转化率可达24％。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例1
Ⅰ第一批定向改造培养基的制备方法：
1.首先将L-酪氨酸生产菌株E.coli GHLTYR-168(购自天津科技大学生物工程学院代谢工程实验室)从甘油管中接至菌种活化培养基中进行活化培养，总计活化两代(一代为试管斜面培养基、二代为茄子瓶斜面培养基)，每代活化培养12-14h，菌种活化培养基为：葡萄糖1g/L，氯化钠2.5g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉2g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，VH 2mg/L，琼脂粉25g/L；
2.然后通过无菌水将活化好的茄子瓶斜面菌株(1个)接入种子培养基中，培养9-11h，期间pH控制在6.7-7.0，溶解氧含量控制在40％-60％，温度维持在37℃，所述种子培养基为：葡萄糖30g/L，酵母粉8g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 3g/L，甲硫氨酸0.5g/L，蛋白胨5g/L，组氨酸0.5g/L，VB1、VB3、VB5、VB12 2mg/L，VH 2mg/L，硫酸铵8g/L，苯丙氨酸0.5g/L，消泡剂1g/L；3.之后按照发酵体系20％的比例接入发酵培养基中进行发酵培养，期间pH控制在6.7-7.0，溶解氧浓度控制在40％-60％，温度维持在37℃，所述发酵培养基为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4·3H2O 4g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，柠檬酸2g/L，甲硫氨酸1g/L，苯丙氨酸0.5g/L，谷氨酸0.5g/L，FeSO4·7H2O 30mg/L，MnSO4·H2O 10mg/L，VH 1mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12 3mg/L，微量元素混合液1.5mL/L；最后，培养至22h时通过耦连的蝶式离心机将发酵培养基中的菌体及其他固形物进行祛除，所的上清液通过离心泵泵入储液罐中进行储存，再添加经过灭菌处理的蛋白胨6g和酵母粉15g；所得培养基即为酪氨酸生产菌株定向改造的第一批定向改造培养基。
Ⅱ定向改造的种子液的制备方法：
1.将L-酪氨酸生产菌株E.coli GHLTYR-168(购自天津科技大学生物工程学院代谢工程实验室)从甘油管中接至菌种活化培养基中进行活化培养，总计活化两代(一代为试管斜面培养基、二代为茄子瓶斜面培养基)，每代活化培养12-14h，所述菌种活化培养基为：葡萄糖1g/L，氯化钠2.5g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉2g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，VH 2mg/L，琼脂粉25g/L；
2.之后通过无菌水将活化好的茄子瓶斜面菌株(1个)接入发酵培养基中，培养18-20h，期间pH控制在6.7-7.0，溶解氧含量控制在40％-60％，温度维持在37℃，所述发酵培养基为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4·3H2O 4g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，柠檬酸2g/L，甲硫氨酸1g/L，苯丙氨酸0.5g/L，谷氨酸0.5g/L，FeSO4·7H2O 30mg/L，MnSO4·H2O 10mg/L，VH 1mg/L，Vb(1.3.5.12)各3mg/L，微量元素混合液1.5mL/L；所得菌液即为定向改造的第一代种子液。
3.第二批定向改造培养：将用于定向改造的第一代种子液以20mL的接种量接入第一批定向改造的培养基中，培养15h，期间温度维持在37℃，pH控制在6.7-7.0，溶解氧浓度控制在40-60％。所得的菌液为第二批定向改造培养的种子液。
实施例2
第二批定向改造培养基的制备参照实施例1，不同的是：培养时间由22h变成了28h。
第二批定向改造培养的种子液参照实施例1，不同的是：所接入的种子液变成了实施例1中第一批定向改造的菌液。
实施例3
第三批定向改造培养基的制备参照实施例1，不同的是：培养时间由22h变成了34h。
第三批定向改造培养的种子液参照实施例1，不同的是：所接入的种子液为实施例2中第二批定向改造的菌液，培养之后的菌液作为第三代定向改造的菌液用于最终高产菌种的改造。
菌种定向改造：将第三代定向改造所得的菌液，通过稀释涂布的方法得到单菌落；将所得单菌落接种至试管斜面培养基中，扩培活化12h，所述菌种活化培养基为：葡萄糖1g/L，氯化钠2.5g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉2g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，VH 2mg/L，琼脂粉25g/L；之后接种到摇瓶中进行培养35h，培养基与原始发酵培养基相同(并添加2％的苯酚红指示剂)，期间通过观察培养基颜色变化并通过添加氨水来调节酸碱，通过添加60％的糖液来补充碳源。
通过适应性定向改造，最终以产量、转化率和菌体量作为参考指标，得到一株生产性能较优的L-酪氨酸生产菌株，命名为E.coli GHLTYR-168-1。通过5L发酵罐放大验证，最终测得其L-酪氨酸的产量和转化率分别为55g/L和24％，较原始菌株42g/L的产量与19％的转化率均有了较大的提升。
由上述实施例可知，本发明提供的L-酪氨酸定向改造方法，能够有效获得L-酪氨酸高效生产菌株，提高现有生产菌株的生产效能，降低L-酪氨酸的生产成本。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，本发明菌株的构建步骤不分先后顺序，本技术领域技术人员以本发明的方法或以本方法为基础进行的菌种改造等改进和润饰均视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种L-酪氨酸高效生产菌株的定向改造方法，其特征在于：分别正常发酵培养L-酪氨酸生产菌株至22、28、34h，然后通过耦连的碟式离心机去除菌体及部分培养基中的固形物，然后再分别添加2g/L的酵母粉及5g/L的蛋白胨，所生成的培养基用于L-酪氨酸生产菌株的定向改造，定向改造分三个阶段：首先用22h经过离心处理并添加2g/L的酵母粉及5g/L的蛋白胨的培养基，先对L-酪氨酸生产菌株进行第一步的定向改造，培养15h后；然后进行第二步的改造，用上一步改造的菌液作为此次改造的种子液，以20mL的接种量接入28h经过处理的培养基中继续定向改造，再培养15h后；最后进行第三部的改造，用上一步改造的菌液作为此次改造的种子液，以20mL的接种量接入34h经过处理的培养基中继续培养15h，即得。
2.根据权利要求1所述的L-酪氨酸高效生产菌株的定向改造方法，其特征在于：所述L-酪氨酸生产菌株为L-酪氨酸生产菌株E.coliGHLTYR-168。
3.根据权利要求1所述的L-酪氨酸高效生产菌株的定向改造方法，其特征在于：所述L-酪氨酸生产菌株E.coliGHLTYR-168正常发酵培养方法的具体步骤如下：
(1)菌种活化：将E.coli GHLTYR-168从甘油保菌管中接入斜面培养基中进行活化培养，温度维持在34-36℃；所述斜面培养基成分及含量为：葡萄糖1g/L，氯化钠2.5g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉2g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，VH 2mg/L，琼脂粉25g/L，其余为水；
(2)种子培养：将200mL无菌水于超净台火焰附近倒入上述茄形瓶中，使用接种环将菌落刮至无菌水中并打散制备菌悬液，利用火圈无菌接种入发酵种子培养罐中，培养过程pH维持在6.7-7.0，温度维持在36.8-37.2℃，溶氧维持在35％-50％；所述种子培养基为：葡萄糖30g/L，酵母粉8g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 3g/L，甲硫氨酸0.5g/L，蛋白胨5g/L，组氨酸0.5g/L，VB1 2mg/L、VB3 2mg/L、VB5 2mg/L、VB12 2mg/L，VH 2mg/L，硫酸铵8g/L，苯丙氨酸0.5g/L，消泡剂1g/L，其余为水；
(3)发酵培养：按20％的接种量将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵初期pH维持在6.7-7.0，发酵中后期发酵pH维持在6.4-6.7，温度维持在36.8-37.2℃，溶氧维持在30％-50％，所述发酵培养基成分为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4·3H2O 4g/L，
MgSO4·7H2O 2g/L，柠檬酸2g/L，甲硫氨酸1g/L，苯丙氨酸0.5g/L，谷氨酸0.5g/L，FeSO4·7H2O 30mg/L，MnSO4·H2O 10mg/L，VH 1mg/L，VB13mg/L、VB33 mg/L、VB53 mg/L、VB123mg/L，微量元素混合液1.5mL/L，其余为水，pH 7.0-7.2，115℃湿热灭菌15min。
4.根据权利要求3所述的L-酪氨酸高效生产菌株的定向改造方法，其特征在于：所述微量元素混合液组分含量为：钼酸铵0.28mg/L，硼酸5mg/L，CoCl2·6H2O 1.4mg/L，MnSO4·H2O0.5mg/L，CuSO4·7H2O 0.5mg/L，ZnSO4·7H2O0.6mg/L，上述成分称量固体后溶解于1L水中，在4℃保存。
5.根据权利要求1所述的L-酪氨酸高效生产菌株的定向改造方法，其特征在于：培养过程中通过流加80％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵过程。
6.根据权利要求1所述的L-酪氨酸高效生产菌株的定向改造方法，其特征在于：所述耦连的碟式离心机与发酵系统耦连的管路及管式离心机均使用蒸汽灭菌。
7.根据权利要求1所述的L-酪氨酸高效生产菌株的定向改造方法，其特征在于：所述用于菌株定向改造的培养体系均为3L体系。
8.一种L-酪氨酸高效生产菌株，其特征在于：是由L-酪氨酸生产菌株E.coli GHLTYR-168通过权利要求1所述定向改造方法制备得到的。
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