CN116235778A - 一种组培条件下提高海滨木槿种子发芽率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种组培条件下提高海滨木槿种子发芽率的方法，以海滨木槿成熟种子为外植体，通过对种子进行浓硫酸处理、无菌水浸泡过夜，然后进行消毒灭菌、无菌萌发最佳培养基筛选等步骤，达到简易高效迅速获得大量无菌苗的目的。本发明提供的方法，在加纱布的空白培养基上，种子3d开始露白，7d大面积萌发抽出子叶，萌发率高达94.4%，大大缩短出苗时间，提高出苗率，节约实验成本，为再生体系和遗传转化体系的构建奠定基础，提供保障。
Description
技术领域
本发明涉及提高海滨木槿种子发芽率，缩短海滨木槿种子发芽时间、节约发芽成本的方法，以满足后期再生体系和遗传转化体系建立的需求。该发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种提高海滨木槿种子发芽率的方法。
背景技术
海滨木槿（Hibiscushamabo Sieb.et Zucc.）是锦葵科木槿属落叶灌木或小乔木，具有观赏性高、适应性强的特性[1]。海滨木槿因其根系发达，耐干旱贫瘠，在高盐土壤也能旺盛生长[2]，同时树干和树枝韧皮纤维发达，使其具有一定的抗风能力，适合在沿海地区引种栽培[3]。我国有大面积的盐碱地，且有逐年增加的趋势，而海滨木槿是优良耐盐的绿化树种，在提高盐碱地和江滩地利用率方面具有较大的潜力[4]。
目前国内对海滨木槿的研究主要集中在抗逆性生理的研究以及干旱和盐胁迫下相关基因的表达分析[5,6]。海滨木槿无菌苗的获得是建立高效再生体系和遗传转化体系的前提，并为加速耐盐性新品种的选育提供基础。
由本人参与的申请号为201711090075.3的专利文件公开了一种获得海滨木槿无菌苗的方法[7]：以成熟种子为外植体，经过低温春化、浓硫酸处理、常规消毒再接种至MS培养基，该方法虽然能获得无菌苗，但发芽率仅仅12%（数据未放入专利），成本高且发芽率低，效果不理想。因此，找到一种高效、简单、低成本获得大量无菌苗的方法迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发芽率高、时间短、成本低的组培条件下提高海滨木槿种子发芽率的方法。本发明的优势在于将种子作为外植体，具有材料多、繁殖快及不受季节条件限制。
本发明的技术方案如下：
一种组培条件下提高海滨木槿种子发芽率的方法，它包括种子处理、种子消毒、适宜培养基筛选的三个主要步骤，其中，本发明先将采收回来的成熟种子烘干、低温春化、浓硫酸处理，再进行消毒，具体步骤如下：
①低温春化：将种子放置4℃冰箱低温春化1d；
②浓硫酸处理：将春化过的种子浸没至浓硫酸15 min，流水冲洗2h；
③浸泡过夜：将流水冲洗后的种子转移至超净工作台，在灭菌水中浸泡过夜；
④种子消毒：对种子进行酒精和升汞灭菌处理；
⑤固体培养基培养：将灭菌过的种子接种至4种固体培养基中，放至组培室进行培养。4种种子萌发的固体培养基为：a空白培养基（H2O+Agar）；b空白培养基+纱布；c 1/4MS培养基；d 1/4MS培养基+纱布。组培室的温度为25℃、光照强度为1800 lx左右，光暗周期为16h/8 h。
本发明先对成熟种子进行浓硫酸处理，再进行酒精升汞灭菌处理，接种至4种固体培养基中，3d后种子在空白培养基+纱布（b）上，开始大面积露白。该发明大大缩短出苗时间，节约成本，为后续再生体系和遗传转化体系的建立奠定基础。再者，前期用将种子浸泡在灭菌水中过夜可加快萌发速度。
与现有技术相比，本发明的优势为：
①本发明通过找到最适种子萌发的培养基配方，使得材料萌发率达到94.4%，显著高于常用培养基。
②本发明建立了快速高效的海滨木槿种子无菌萌发方法，大大缩短了萌发时间，节约了成本。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明。
图1是本发明方法处理后组培条件下海滨木槿种子在4种不同培养基的萌发情况。
其中图1-a 空白培养基（H2O+Agar），图1-b 空白培养基+纱布，图1-c 1/4MS培养基，图1-d 1/4MS +纱布培养基。
图2是本发明方法处理后组培条件下海滨木槿种子在最佳培养基（空白培养基+纱布）萌发10d 的情况图。
具体实施方式
下面结合附图，用本发明的具体实施例来进一步说明本发明的实质内容和技术特点，但并不以此来限定本发明。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：
①低温春化：挑选饱满、健康的海滨木槿种子，放置4℃冰箱进行低温春化1d。
②浓硫酸处理：将春化过的种子浸没至浓硫酸15 min，再用流水冲洗2h。
③浸泡过夜：将流水冲洗后的种子转移至超净工作台，在灭菌水中浸泡过夜；
④种子消毒：用75%的酒精灭菌2min，无菌水冲洗2遍，再用0.1%升汞灭菌20～25min，无菌水冲洗6～8遍。
⑤种子萌发培养：将消毒过的种子分别接种至4种固体培养基上，每瓶6粒，3个重复。
⑥最优种子萌发培养基的筛选：将种子分别接种在空白培养基（H2O+Agar）、空白培养基+纱布、1/4MS、1/4MS +纱布培养基上，各培养基含有琼脂5g/L，pH：5.8。光照培养3d后统计种子露白率，7d统计种子发芽率。培养温度为25℃、光照强度为1800 lx左右，光暗周期为16 h/8 h。
表1 海滨木槿种子无菌萌发培养基的筛选
对4种海滨木槿种子无菌萌发的培养基进行筛选，结果如表1，在加纱布的空白培养基上，种子播种3d露白率最高，达到61.1%，7d后的发芽率达到94.4%，比在常规的1/4MS培养基上发芽率高38.84%，可作为种子无菌萌发的最佳培养基。
以上所述仅为本发明的较优实施方式，凡是在本发明原理之内作出修改、改进的均在本发明所保护的范围之内。
参考文献
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Claims (8)
1.一种组培条件下提高海滨木槿种子发芽率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
低温春化：将成熟种子放置4℃冰箱低温春化1d；
浓硫酸处理：将春化过的种子浸没至浓硫酸15 min，随之用流水冲洗2h；
浸泡过夜：将流水冲洗后的种子转移至超净工作台，在灭菌水中浸泡过夜；
种子消毒：在超净工作台对种子进行消毒；
固体培养基培养：将消毒过的种子接种至4种固体培养基中，放至组培室进行培养。
2.4种种子萌发的固体培养基为：a空白培养基（H2O+Agar）；b空白培养基+纱布；c 1/4MS培养基；d 1/4MS培养基+纱布。
3.组培室的温度为25—28 ℃、光照强度为1800 lux左右，光照时间为16 h/d。
4.根据权利要求1所述的提高海滨木槿种子发芽率的方法，其特征在于选用健康饱满的种子作为外植体，先进行低温春化，再用浓硫酸浸泡15min，经流水冲洗2h后拿到超净工作台上，在灭菌水中浸泡过夜，在萌发前浸泡过夜利于种子迅速膨胀吸水，加快萌发进程，提高发芽率。
5.根据权利要求1所述的提高海滨木槿种子发芽率的方法，其特征在于经过前处理的种子在超净工作台上，用75%酒精消毒2min，无菌水冲洗2遍，再用0.1%升汞溶液（加1滴Trton-80）进行振荡消毒20～25min，无菌水冲洗6～8遍。
6.根据权利要求1所述的提高海滨木槿种子发芽率的方法，其特征在于将灭菌后的种子接种至加纱布的空白培养基萌发效果最佳，同时简化了萌发方式。
7.以往硬实种子发芽通常采用培养皿滤纸法，胚根突破种皮后，需及时转接至MS培养基中吸收水分和营养，此方法费时费力，而且在转接过程中容易造成污染。
8.根据权利要求1所述的提高海滨木槿种子发芽率的方法，此方法在2018年本人参与发表的专利“一种获得海滨木槿无菌苗的方法”的基础上进行改良优化，达到低成本、高效获得大量无菌苗的目的。
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| GR01 | Patent grant | ||
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