CN116223810A - EB病毒早期抗原IgA抗体检测试剂盒 - Google Patents

EB病毒早期抗原IgA抗体检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及EB病毒早期抗原IgA抗体检测试剂盒。本发明提供了一种EB病毒早期抗原IgA抗体检测试剂盒，其包括固相载体混悬液、酶结合物溶液以及样品稀释剂，所述固相载体混悬液中，固相载体表面包被有EB病毒早期抗原。所述样品稀释剂中包括表面活性剂，所述EB病毒早期抗原采用非离子表面活性剂对其进行活化处理。与现有EB病毒检测试剂盒相比，本发明提供的检测试剂盒稳定性好、灵敏度高、背景信号弱且特异性强，适宜推广使用。

Description

EB病毒早期抗原IgA抗体检测试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及EB病毒早期抗原IgA抗体检测试剂盒。
背景技术
EB病毒(Epstein Barr virus,EBV),又称人类疱疹病毒，它只能在B淋巴细胞中增殖,其感染与多种疾病有关。根据感染后是否产生有感染性的病毒子代,可分为增生性感染和非增生性感染:与增殖性感染相关的抗原有早期抗原、膜抗原和衣壳抗原,已确定的非增殖性感染抗原有核抗原和潜伏感染蛋白.研究EBV的抗原及抗体,对揭示EBV与鼻咽癌的关系以及鼻咽癌的早期诊断均有重要意义。
目前EB病毒感染检测方法包括病毒培养、免疫学检测、EBV DNA载量检测等。由于EBV存活需要宿主细胞，故病毒体外培养有一定的局限性，如取材一般需要急性期患者的唾液或淋巴细胞,培养的时间较长，阳性率低，一般在临床检测中较少应用。EBV以环状DNA形式存在于淋巴细胞胞浆中，90％的人为潜伏性感染，只有活动期的EBV可破坏淋巴细胞，进入血液循环,绝大多数的血浆游离DNA片段大小为82～181kb，因此可采用PCR检测血浆中游离DNA的含量。但是在早期诊断中灵敏度低，特异性较差。
目前EBV检测主要采用免疫学检测方法，通常用酶免疫法或免疫荧光技术检测不同感染阶段产生的抗体。目前的EB病毒检测中，由于样本检测时固相抗原与样本中干扰因子结合产生的非特异性吸附，所导致的背景信号杂乱、免疫诊断结果的假阳性检出率高且灵敏度低等问题尚待解决。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供EB病毒早期抗原IgA抗体检测试剂盒，本发明提供了稳定性好、灵敏度高且特异性强的EB病毒早期抗原IgA抗体检测试剂盒。
本发明提供了一种EB病毒早期抗原IgA抗体检测的试剂或试剂盒，包括：
固相载体混悬液、酶结合物溶液以及样品稀释剂；
所述固相载体混悬液中，固相载体表面包被有EB病毒早期抗原；
所述酶结合物溶液中，酶结合物为酶标记的抗人IgA抗体；
所述样品稀释剂包括小牛血清、蛋白稳定剂、P300和表面活性剂。
本发明所述样品稀释剂中，添加表面活性剂从而提高检测的灵敏性、稳定性和特异性。研究表明，表面活性剂的选择对试剂的检测效果产生影响。一些实施例中，样品稀释剂中的表面活性剂的浓度为0.08vol％～5vol％，其种类选自Trixton-100、聚乙烯亚胺、十六烷基三甲基溴化铵和聚二烯丙基二甲基氯化铵中的至少一种。进一步研究表明，与其他表明活性剂及蛋白稳定剂相比，所述样品稀释液中添加Trixton-100，更有利于与其他试剂配合，获得更优秀的检测效果。
本发明所述样品稀释剂中，蛋白稳定剂、P300和小牛血清能够辅助表面活性剂，使样本的靶标结合位点更好的暴露，获得更准确、灵敏的检测效果。一些实施例中，所述蛋白稳定剂为多羟基糖类，所述多羟基糖类选自蔗糖或海藻糖中的至少一种，具体为蔗糖。
一些具体实施例中，所述样品稀释剂中包括水、Trixton-100、小牛血清和P300。该样品稀释剂与EB病毒早期抗原及抗人IgA抗体的兼容性更高，抗干扰能力更强，从而获得更准确、更灵敏的技术效果。
在一些具体实施例中，所述样品稀释剂由水、20vol％～50vol％的小牛血清、1～5mg/mL的蔗糖、0.5vol％～3vol％的P300和0.1vol％～5vol％的Trixton-100组成。实验表明，在此组分及浓度下，所述样品稀释液的抗干扰能力最强，与抗体的兼容性最高。
本发明所述的固相载体混悬液中，包括表面包被有EB病毒早期抗原的固相载体和缓冲液。其中，表面包被有EB病毒早期抗原的固相载体的制备包括：采用含0.05vol％～0.1vol％表面活性剂的处理剂对EB病毒早期抗原进行活化后，与活化后的固相载体混合，经孵育、封闭获得表面包被有EB病毒早期抗原的固相载体，所述处理剂中的表面活性剂为非离子型表面活性剂。
非离子型表面活性剂的末端是非极性的亲水基团，作用较为温和，可以破坏蛋白-脂质、脂质-脂质等结合，但是对蛋白-蛋白的结合不起作用。因此，这种活性剂保留蛋白的天然构象，不使其发生变性，抗原和抗体的功能和相互作用正常。本发明中，在包被前对抗原进行活化预处理，并在活化剂中添加了表面活性剂，从而增加其亲水性及在水溶液中的溶解度，提高其包被效率。与其他抗原活化剂相比，本发明对添加的非离子型表面活性剂进行筛选，从而更好的打开蛋白的二硫键，暴露出更多的反应位点，提升检测的灵敏度。本发明实施例中，在抗原活化步骤中采用的非离子型表面活性剂包括L7600、吐温20、烷基葡糖苷、正-辛基谷氨酸、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯或Trixton-100中的至少一种。一些实施例中，活化抗原采用的表面活性剂为吐温20。在一些具体实施例中，EB病毒早期抗原的处理剂包括水和0.1vol％的吐温20。其中，所述EB病毒早期抗原的活化条件包括15～25℃反应1小时；
在使抗体包被到固相载体前，固相载体也经过活化。本发明中，所述固相载体的基质包括聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、衍生塑料、磁性微球、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜。在一些具体实施例中，本发明优选磁性微球作为固相载体的基质。本发明所述固相载体的活化试剂包括水、醋酸、EDC和NHS。其中，醋酸的浓度为0.1vol％～5vol％，EDC的浓度为0.5～1mg/ml，NHS的浓度为0.5～1mg/ml。所述固相载体的活化条件包括20～28℃反应1小时；
将活化后的抗原与固相载体混合后进行孵育，从而使抗原包被到固相载体上。所述孵育的条件为20℃，震荡孵育1小时；在包被过程中，所述EB病毒早期抗原的浓度为0.1vol％～5vol％。
在包被后，还需要对包被产物进行封闭，本发明中所述封闭的试剂为PEG8000。
封闭后的固相载体以缓冲液重悬制得固相载体混悬液。本发明所述固相载体混悬液中，包被有EB病毒早期抗原的固相载体的浓度为10uL/mL，缓冲液为含蛋白保护剂的Tris封闭液。其中，所述蛋白保护剂为蔗糖，其在缓冲液中的浓度为0.1vol％～5vol％，Tris在缓冲液中的浓度为0.5mol/L。
本发明中，包被有EB病毒早期抗原的固相载体负责捕获待测物中的抗体，而酶结合物用于检测被捕获的抗体。本发明中，所述酶结合物溶液包括酶结合物和缓冲液。其中，酶结合物为辣根过氧化物酶标记的抗人IgA抗体。所述酶结合物溶液中，辣根过氧化物酶标记的抗人IgA抗体的浓度为1:(1000～5000)，缓冲液为PBS溶液。
优选的，还包括校准品溶液，所述校准品包括校准品1和校准品2；
所述校准品1溶液中包括阴性人血清和PBS缓冲液，所述阴性人血清为未感染EB病毒的人血清，所述阴性人血清的S/CO值＜0.1；
所述校准品2溶液中包括阳性人血清和PBS缓冲液，所述阳性人血清为己灭活的抗人IgA抗体，所述阳性人血清的S/CO值为1.75～3.25。
本发明还提供了EB病毒早起抗原的检测方法，包括，采用本发明的EB病毒早期抗原IgA抗体检测的试剂或试剂盒对样本进行检测。所述样本包括血清/血浆。
本发明提供了一种EB病毒早期抗原IgA抗体检测试剂盒，其包括固相载体混悬液、酶结合物溶液以及样品稀释剂，所述固相载体混悬液中，固相载体表面包被有EB病毒早期抗原，所述EB病毒早期抗原采用非离子表面活性剂对其进行活化处理。与现有EB病毒检测试剂盒相比，本发明提供的检测试剂盒稳定性好、灵敏度高、背景信号弱且特异性强。经实验验证，该试剂盒在37℃下储存14天下阳性样本发光值变幅均在±20％以内；检测中抗干扰能力强，50～3000mg/dL的血红蛋白、甘油三酯和胆红素对试剂盒的假阳性与弱阳性样本检测无明显干扰。
具体实施方式
本发明提供了EB病毒早期抗原IgA抗体检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的试剂盒在包被前对抗原进行活化预处理，增加其亲水性及在水溶液中的溶解度，提高其包被效率。同时提供了一种用于免疫诊断试剂中固相抗原活化的处理剂，其中包括至少一种非离子型表面活性剂，可以打开蛋白的二硫键，暴露出更多的反应位点，提升检测的灵敏度。非离子型表面活性剂的末端是非极性的亲水基团，作用较为温和，可以破坏蛋白-脂质、脂质-脂质等结合，但是对蛋白-蛋白的结合不起作用。因此，这种活性剂保留蛋白的天然构象，不使其发生变性，抗原和抗体的功能和相互作用正常。
本发明提供了一种应用于临床血清/血浆样本稀释时添加的样本稀释剂，其中包括至少一种表面活性剂，可以减少样本检测时固相抗原与样本中干扰因子结合产生的非特异性吸附，降低背景信号和免疫诊断结果的假阳性检出率，提升检测方法的特异性。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
EB病毒早期抗原IgA抗体检测(磁性微球化学发光间接法)试剂盒的制备：
包括酶结合物溶液、样品稀释液、校准品1、校准品2，以及固相载体混悬液，其中，本实施例固相载体为磁性微球，所述磁性微球上包被有EB病毒早期抗原重组抗原。
一、固相载体混悬液的制备：
1、抗原活化：使用添加了0.1vol％的烷基葡糖苷(APG)活性剂的活化阶段处理剂对EB病毒早期抗原重组抗原进行活化,活化条件包括15～25℃反应1小时；
2、磁性微球活化：磁性微球含有羧基活性基团，每克(g)磁珠(干重)羧基含量约30μg，是均一粒子，粒子直径是1.5-3μm，取10μL磁性微球原液(30mg/mL)，使用PBS缓冲液洗涤羧基磁性微球3次，弃去上清。加入醋酸稀释的EDC和NHS溶液对磁性微球活化1小时，温度为20～28℃，活化后用MES缓冲液洗涤2次，弃去上清，活化试剂包括水、醋酸、EDC和NHS，其中，醋酸的浓度为0.1vol％～5vol％，EDC的浓度为0.5～1mg/mL，NHS的浓度为0.5～1mg/mL；
3、包被：将EB病毒早期抗原重组抗原用MES缓冲液稀释后，按50μL/mL包被到磁性微球的表面，在20℃下震荡，温育吸附1小时；
4、终止：弃去包被液，使用PEG 8000终止液按200μL/测试在20℃下震荡，终止1小时；
5、封闭：弃去终止液，用含蛋白保护剂的Tris封闭液按200μL/测试在20℃下震荡，封闭2次，每次10min；
6、定容及保存：使用含蛋白保护剂的Tris封闭液定容至1mL，密封保存；
二、样本稀释液的制备
样本稀释：所述样品稀释液为PBS缓冲液、使用添加了0.12vol％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)活性剂的样本稀释处理剂稀释样品，样品稀释液还包括体积分数为20％～50％的小牛血清、浓度为1mg/mL～5mg/mL的蛋白稳定剂和体积分数为0.5％～3％的防腐剂；所述蛋白稳定剂为多羟基糖类,多羟基糖类选自蔗糖或海藻糖中的至少一种，本实施例中选用蔗糖；防腐剂包括P300；
三、酶结合物的制备：
将辣根过氧化物酶标记的抗人IgA溶解于缓冲液，缓冲液为PBS缓冲液。
四、标准品的制备：
校准品1：缓冲液为PBS缓冲液，要求阴性人血清的S/CO值＜0.1。
校准品2：缓冲液为PBS缓冲液，包括己灭活EB病毒早期抗原lgA抗体阳性人血清，阳性人血清的S/CO值为1.75～3.25。
实施例2
活化阶段处理剂所含有的非离子型表面活性剂为L7600，浓度为0.05vol％。
样本稀释处理剂所含有的表面活性剂为(PEI)，浓度为0.08vol％。
固相载体的类型为聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂。
其他步骤同实施例1。
实施例3
活化阶段处理剂所含有的非离子型表面活性剂为烷基葡糖苷(APG)，浓度为0.08vol％。
样本稀释处理剂所含有的表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，浓度为0.1vol％。
固相载体的类型为磁性微球。
其他步骤同实施例1。
实施例4
活化阶段处理剂所含有的非离子型表面活性剂为维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)，浓度为0.1vol％。
样本稀释处理剂所含有的表面活性剂为聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)，浓度为0.15vol％。
固相载体的类型为硝酸纤维素膜(Nc)。
其他步骤同实施例1。
实施例5
对活化阶段处理剂中不同非离子活性剂的评估：以血清/血浆为样本，结合郑州安图生物工程股份有限公司生产的全自动化学发光仪AutoLumo A2000或AutoLumo A2000Plus或AutoLumo A2000 Plus B进行自动化分析，检测步骤包括：将待测样本、包被抗原的磁珠悬液和样本稀释液混合，37℃反应10～20min，然后以PBS缓冲液洗涤；加入酶标记物溶液，37℃反应10～20min，然后以PBS缓冲液洗涤；加入发光底物液A和发光底物液B于37℃反应5min检测发光值。根据发光值判断样本是否为阳性。样品、样品稀释液、磁微粒悬液、酶结合物的体积比为10：1：2：10；
其他步骤与实施例1相同，在活化阶段处理剂中分别加入L7600、Tween20(T-20)、烷基葡糖苷(APG)、正-辛基谷氨酸(OGP)、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)五种非离子型表面活性剂，以不添加表面活性剂和阴离子表面活性剂(SDS)的受试组作为对照。并利用开发的EB病毒早期抗原IgA抗体检测(磁性微球化学发光间接法)试剂盒检测10份EB早期抗原IgA阳性样本(P1-P10)以及10份EB早期抗原IgA阴性样本(N1-N10)。结果如表1所示：
表1.活化阶段处理剂中不同非离子活性剂的评估
Figure SMS_1
/>
Figure SMS_2
由表1可知，在其他参数不变的情况下，不添加表面活性剂和阴离子表面活性剂均不能达到良好的阴阳反差。使用T-20非离子型表面活性剂对抗原进行活化后，试剂盒的检测结果具有较大的阴阳反差P/N，这是评估试剂盒性能的一项重要指标。因此，认为T-20有较好的抗原活化能力。
实施例6
样本稀释处理剂除稀释样本外，产生的缓冲环境应有利于抗原抗体结合，为免疫诊断提供最佳的反应条件。为探究样本稀释处理剂中不同活性剂类型以及适合活性剂的浓度对临床检测的影响，我们研究了Trixton-100、聚乙烯亚胺(PEI)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)在样本稀释处理剂中的左右，并研究了添加不同浓度的活性剂Trixton-100。制备的EB病毒早期抗原IgA抗体检测(磁性微球化学发光间接法)试剂盒检测10份EB早期抗原IgA阳性样本(P1-P10)以及10份EB早期抗原IgA阴性样本(N1-N10)。结果如表2-1和2-2所示：
表2-1.样本稀释不同的活性剂对临床检测的影响
Figure SMS_3
/>
Figure SMS_4
表2-2.样本稀释处理剂中不同浓度的活性剂对临床检测的影响
Figure SMS_5
由表2-1和2-2可知，当添加1vol％Trixton-100时，阳性样本与阴性样本的平均比值升高，但随着Trixton-100添加量增加到1vol％，阳性样本以及阴性样本的平均比值下降。可以看出，合适的表面活性剂浓度对试剂盒的性能有较大影响。
效果例1
选择T-20活性剂制备抗原活化处理剂，样本稀释处理剂添加的Trixton-100浓度为0.1％，制备得到EB病毒早期抗原IgA抗体检测(磁性微球化学发光间接法)试剂盒，其他同实施例1。
1、试剂盒的稳定性评估：
以上述试剂盒对10份EB早期抗原IgA阳性样本(P1-P10)以及10份EB早期抗原阴性样本(N1-N10)进行检测，考核试剂盒在37℃分别放置7天，10天，14天之后的稳定性。结果用S/CO表示，如表3所示。对表3的结果进行处理，得到信号值的变化幅度，表4所示。
表3.试剂盒的稳定性检测结果
Figure SMS_6
表4.试剂盒的稳定性评估
Figure SMS_7
/>
Figure SMS_8
试剂盒的稳定性评估一般要求阳性样本发光值变幅在±20％以内，阴性样本不能出现阳性结果。由表3和表4的结果可以看出，试剂盒在37℃储存7天，10天，14天，阳性样本发光值变幅均在±20％以内，阴性样本未出现阳性。表明对抗原进行活化，在样本稀释时添加活性剂，对试剂盒的稳定性不产生不利影响。
2、试剂盒的特异性评估：
添加活性剂可能会对试剂盒的特异性产生干扰。因此，选用阴性和弱阳性两个样本，分别加入不同浓度的血红蛋白、甘油三酯和胆红素，考查试剂盒的特异性和抗干扰能力。结果如表5-7所示：
表5.血红蛋白干扰评估
Figure SMS_9
/>
Figure SMS_10
表6.甘油三酯干扰评估
Figure SMS_11
表7.胆红素干扰评估
Figure SMS_12
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Figure SMS_13
由表5可以看出，血红蛋白的添加浓度达到1000mg/dL时，阴性样本的结果仍然显示阴性，不产生假阳性结果。此外，1000mg/dL的血红蛋白对试剂盒的弱阳性样本检测无明显干扰。根据表6的检测结果，甘油三酯的添加浓度达到3000mg/dL时，阴性样本的结果仍然显示阴性，不产生假阳性结果。此外，3000mg/dL的甘油三酯对试剂盒的弱阳性样本检测无明显干扰。表7显示，胆红素的添加浓度达到50mg/dL时，阴性样本的结果仍然显示阴性，不产生假阳性结果，50mg/dL的胆红素对试剂盒的弱阳性样本检测无明显干扰。
试剂盒的抗干扰评估要求干扰样本与仅添加溶剂样本的检测结果偏差在±10％的范围内，三种干扰因子的评估均符合要求。表明对抗原进行活化，在样本稀释时添加活性剂，对试剂盒的特异性不产生不利影响。因此，本发明提供的抗原活化处理剂和样本稀释处理剂可以应用到病毒感染标志物的免疫诊断试剂盒中。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.EB病毒早期抗原IgA抗体检测的试剂或试剂盒，其特征在于，包括：
固相载体混悬液、酶结合物溶液以及样品稀释剂；
所述固相载体混悬液中，固相载体表面包被有EB病毒早期抗原；
所述酶结合物溶液中，酶结合物为酶标记的抗人IgA抗体；
所述样品稀释剂包括小牛血清、蛋白稳定剂、P300和表面活性剂，其中，所述蛋白稳定剂为多羟基糖类，所述多羟基糖类选自蔗糖或海藻糖中的至少一种，所述表面活性剂的浓度为0.08vol％～5vol％，所述表面活性剂选自Trixton-100、聚乙烯亚胺、十六烷基三甲基溴化铵和聚二烯丙基二甲基氯化铵中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液中的表面活性剂为Trixton-100，所述蛋白稳定剂为蔗糖。
3.根据权利要求1或2所述的EB病毒早期抗原IgA抗体检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述样品稀释剂由20vol％～50vol％的小牛血清、1～5mg/mL的蔗糖、0.5vol％～3vol％的P300和0.1vol％～5vol％的Trixton-100组成。
4.根据权利要求1～3任一项所述的试剂或试剂盒，其特征在于，表面包被有EB病毒早期抗原的固相载体的制备包括：采用含0.05vol％～0.1vol％表面活性剂的处理剂对EB病毒早期抗原进行活化后，与活化后的固相载体混合，经孵育、封闭获得表面包被有EB病毒早期抗原的固相载体，所述处理剂中的表面活性剂为非离子型表面活性剂。
5.根据权利要求4所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述非离子型表面活性剂包括L7600、吐温20、烷基葡糖苷、正-辛基谷氨酸、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯或Trixton-100中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的试剂或试剂盒，其特征在于，
EB病毒早期抗原的处理剂包括水和0.1vol％的吐温20；
所述固相载体的活化试剂包括水、0.1vol％～5vol％的醋酸、0.5～1mg/mL EDC和0.5～1mg/mL的NHS。
7.根据权利要求4～6任一项所述的试剂或试剂盒，其特征在于，
所述EB病毒早期抗原的活化条件包括15～25℃反应1小时；
所述固相载体的活化条件包括20～28℃反应1小时；
所述孵育的条件为20℃，震荡孵育1小时；
所述封闭的试剂为PEG 8000。
8.根据权利要求1～7任一项所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述固相载体的基质包括聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、衍生塑料、磁性微球、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜。
9.根据权利要求1所述的试剂或试剂盒，其特征在于，
所述固相载体混悬液中，包被有EB病毒早期抗原的固相载体的浓度为10uL/mL，缓冲液为含蔗糖的Tris封闭液，其中，蔗糖浓度为0.1vol％～5vol％，Tris浓度为0.5mol/L；
所述酶结合物溶液中，辣根过氧化物酶标记的抗人IgA抗体的浓度为1:(1000～5000)，缓冲液为PBS缓冲液。
10.根据权利要求1～9任一项所述的试剂或试剂盒，其特征在于，还包括校准品溶液，所述校准品包括校准品1和校准品2；
所述校准品1溶液中包括阴性人血清和PBS缓冲液，所述阴性人血清为未感染EB病毒的人血清，所述阴性人血清的S/CO值＜0.1；
所述校准品2溶液中包括阳性人血清和PBS缓冲液，所述阳性人血清为己灭活的抗人IgA抗体，所述阳性人血清的S/CO值为1.75～3.25。
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