CN116223155A - 胰岛素检测用样本前处理液、检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

胰岛素检测用样本前处理液、检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医学检测技术领域，提出了胰岛素检测用样本前处理液、检测试剂盒及检测方法。样本前处理液包括：液相、解离剂、螯合剂和添加剂。检测试剂盒包括样本前处理液，还包括磁珠包被抗体、吖啶酯标记抗体。胰岛素检测方法，包括以下步骤：将样本用样本前处理液进行前处理后，再加入磁珠包被抗体、吖啶酯标记抗体，反应后用清洗液清洗，加入发光底物，测定发光值。通过上述技术方案，解决了现有技术胰岛素抗体存在于样本中影响胰岛素检测结果的问题。

Description

胰岛素检测用样本前处理液、检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体的，涉及胰岛素检测用样本前处理液、检测试剂盒及检测方法。
背景技术
胰岛素是由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性胰岛素主要用来治疗糖尿病。目前可检测胰岛素的方法有免疫比浊法、时间分辨荧光免疫分析法、磁微粒化学发光法。相较于前两种检测方法，磁微粒化学发光法灵敏度高、线性范围宽特异性强且操作简便。
临床上使用胰岛素治疗的病人，血清中存在胰岛素抗体，影响免疫方法测定血胰岛素水平，在这种情况下需要一种样本前处理液，将胰岛素与针对胰岛素产生的抗体分离。目前市场上现有产品均没有这样一种样本前处理液，造成胰岛素测值不准确。因此，亟需研制一种可以使样本中胰岛素和胰岛素抗体分离的样本前处理液。
发明内容
本发明提出胰岛素检测用样本前处理液、检测试剂盒及检测方法，解决了现有技术胰岛素抗体存在于样本中影响胰岛素检测结果的问题。
本发明的技术方案如下：
一种胰岛素检测用样本前处理液，所述样本前处理液包括：液相、解离剂、螯合剂和添加剂。
作为进一步的技术方案，所述液相为水或水性溶剂，所述解离剂为水杨酸钠或ANS，所述螯合剂为EDTA。
本发明中，解离剂在使胰岛素与胰岛素抗体分离过程中发挥主要作用。
作为进一步的技术方案，所述样本前处理液的pH为5.5-8.5。
作为进一步的技术方案，以所述样本前处理液总重量计，所述解离剂的含量为1-2wt％。
作为进一步的技术方案，所述螯合剂EDTA在所述样本前处理液中的浓度为5-15mM。
作为进一步的技术方案，所述添加剂为pH调节剂、防腐剂、氯化钠中的一种或多种。
作为进一步的技术方案，所述pH调节剂在所述样本前处理液中的浓度为0.05-1M。
作为进一步的技术方案，以所述样本前处理液总重量计，所述氯化钠的含量为0.5-1.5％。
作为进一步的技术方案，以所述样本前处理液总重量计，所述防腐剂的含量为0.1％。
本发明中，pH调节剂使生物样本与样本前处理液的反应处在一个稳定的环境，氯化钠可以调节pH调节剂的离子强度，使整个反应的离子强度处于与人体血液离子强度相当的水平。
作为进一步的技术方案，防腐剂为Proclin300，Proclin300是用于体外诊断试剂或产品中控制微生物含量的高效防腐剂，以其广谱活性、优越的兼容性和稳定性及其在使用浓度下的低毒性，成为用于体外诊断试剂的理想高效防腐剂。Proclin300可在更长的时间内根除细菌、真菌及酵母，从而延长样本前处理液的储存时间，其水溶性确保其可轻易溶入所需试剂中，特别是，Proclin300对大多数的酶或抗体交联反应的功能无影响，所以不会干扰检验。
本发明还提出了一种胰岛素检测用样本前处理方法，包括以下步骤：将上述样本前处理液与样本混合反应，使胰岛素和胰岛素抗体分离。
作为进一步的技术方案，所述反应温度为4-37℃，反应时间为1-10min。
本发明还提出了一种检测试剂盒，包括上述的样本前处理液。
作为进一步的技术方案，所述检测试剂盒还包括磁珠包被抗体、吖啶酯标记抗体。
作为进一步的技术方案，所述磁珠包被抗体的制备方法如下：采用活化剂将羧基磁珠上的羧基活性成酰胺状态，此时磁珠处于不稳定状态；不稳定状态下的磁珠与胰岛素抗体采用共价键结合方式进行偶联；然后加入封闭剂将磁珠与抗体上多余的位点封闭；加入保存液保存即可得到磁珠包被抗体。
作为进一步的技术方案，所述吖啶酯标记抗体的制备方法如下：将吖啶酯与抗体在缓冲液中反应，然后用淬灭剂将吖啶酯和抗体上多余的位点封闭，将淬灭后的标记物用透析袋进行透析，使未反应的游离吖啶酯透析出去，待透析液发光值在10W以下时收集，加等体积甘油即可得到吖啶酯标记抗体。
作为进一步的技术方案，所述检测试剂盒还包括清洗液和发光底物。
本发明还提出了一种胰岛素检测方法，用上述检测试剂盒检测样本中胰岛素。
作为进一步的技术方案，包括以下步骤：将样本用上述样本前处理方法进行前处理后，再加入磁珠包被抗体、吖啶酯标记抗体，反应后用清洗液清洗，加入发光底物，测定发光值。
本发明的工作原理及有益效果为：
1、本发明中，在测定生物样本中的胰岛素时，通过对生物样本进行前处理，即将生物样本与样本前处理液进行混合反应，使胰岛素和胰岛素抗体分离，从而在后续的检测过程中，使得对胰岛素的测试不受胰岛素抗体的影响，进而提高生物样本中胰岛素检测结果的准确性，有效解决了现有技术中胰岛素抗体存在于样本中影响胰岛素检测结果的问题。
2、本发明中，样本前处理液包括解离剂，在生物样本与样本前处理混合反应的过程中，解离剂可以将胰岛素从胰岛素抗体中解离出来，从而消除后续检测中胰岛素抗体对检测结果的影响，提高检测结果的准确性。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明实验一中实施例5的检测试剂盒的相关性结果；
图2为本发明实验一中实施例6的检测试剂盒的相关性结果；
图3为本发明实验一中对比例1的检测试剂盒的相关性结果；
图4为本发明实验二中实施例5的检测试剂盒的相关性结果；
图5为本发明实验二中实施例7的检测试剂盒的相关性结果；
图6为本发明实验二中实施例8的检测试剂盒的相关性结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。
实施例1
在1LpH＝8.0的0.02M磷酸盐缓冲液中加入0.9％NaCl、10mM EDTA、1％水杨酸钠、0.1％Proclin300，得到样本前处理液，置于2℃～8℃保存。
实施例2
在1LpH＝8.0的0.02M磷酸盐缓冲液中加入0.9％NaCl、10mM EDTA、1％ANS、0.1％Proclin300，得到样本前处理液，置于2℃～8℃保存。
实施例3
在1LpH＝8.0的0.02M磷酸盐缓冲液中加入0.9％NaCl、10mM EDTA、1.5％水杨酸钠、0.1％Proclin300，得到样本前处理液，置于2℃～8℃保存。
实施例4
在1LpH＝8.0的0.02M磷酸盐缓冲液中加入0.9％NaCl、10mM EDTA、2％水杨酸钠、0.1％Proclin300，得到样本前处理液，置于2℃～8℃保存。
实施例5
检测试剂盒，包括实施例1的样本前处理液，还包括磁珠包被抗体、吖啶酯标记抗体、清洗液和发光底物；
其中，磁珠包被抗体的制备方法包括以下步骤：
(1)将100μL浓度为100mg/mL的磁珠用1mL磁珠偶联缓冲液将磁珠清洗三次，然后用670μL磁珠清洗液重悬磁珠；
(2)在(1)重悬后的磁珠中加入100μL浓度为10mg/mL的EDC和230μL浓度为20mg/mL的NHS，将磁珠活化30分钟；
(3)将(2)活化后的磁珠用磁珠清洗液清洗三次，然后加入1mL磁珠偶联缓冲液重悬磁珠，加入100μg胰岛素抗体，反应4小时；
(4)将(3)得到的液体磁吸后弃上清，用1mL 10％BSA清洗一次，然后加入1mL 10％BSA封闭1小时；
(5)将(4)得到的液体磁吸后弃上清，用1mL磁珠保存液清洗三次，保存，即得磁珠包被抗体浓缩液；
(6)将(5)中磁珠包被抗体浓缩液用磁珠稀释液稀释按照1/50比例稀释，即得磁珠包被抗体工作液。
上述步骤(1)～(6)中，磁珠清洗液为0.1M、pH＝5.0的MES；10％BSA为将BSA溶解于磁珠偶联缓冲液得到BSA质量浓度为10％的溶液；
磁珠保存液为0.05M Tris，0.5％BSA，0.3％Tween-20，0.1％Proclin300，pH＝8.0；其中，％指的是质量百分比；
磁珠稀释液为0.05M Tris，0.02M PB，0.9％NaCl，0.3％Tween-20，5％BSA，pH＝8.0，其中，％指的是质量百分比。
吖啶酯标记抗体的制备方法包括以下步骤：
(1)取400μL吖啶酯标记液于2mL离心管中，加入5μL吖啶酯和100μg胰岛素抗体，混匀，避光反应1小时，得到反应液；
(2)在(1)得到的反应液中加入50μL淬灭剂，淬灭30分钟；
(3)将(2)淬灭后的液体转移至提前煮沸过的透析袋中，用透析液进行透析，透析至透析液发光值在100000以下时收集，得到透析好的标记物；
(4)将(3)透析好的标记物收集至离心管中，加入等体积甘油进行保存，即得吖啶酯标记抗体浓缩液。
(5)将吖啶酯标记抗体浓缩液用吖啶酯稀释液稀释按照1/200比例稀释，即吖啶酯标记抗体工作液。
上述步骤(1)～(5)中，吖啶酯标记液为0.1M、pH＝8.0的PBS；
淬灭剂为2％甘氨酸，具体为将甘氨酸用吖啶酯标记液溶解后得到甘氨酸质量浓度为2％的溶液；
透析液为0.01M、pH＝6.3的PBS；
吖啶酯稀释液为0.05M Tris，3.6％NaCl，0.5％BSA，0.05％Triton-X100，0.2％酪蛋白，0.5％蔗糖，0.1％Proclin300，pH＝7.4；其中，％指的是质量百分比。
清洗液，以配制10L为例，配方为：磷酸氢二钠40g，磷酸二氢钠229.9g，氯化钠1800g，吐温20 100mL，Proclin-300 10mL，余量为纯化水；配制方法为：配制桶中加入体外诊断试剂用纯化水8L，准确称取磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠，吐温20，Proclin300，匀速搅拌，充分溶解后定容至10L，得到清洗液，置于2℃～8℃避光保存备用。
发光底物包括发光底物液A和发光底物液B：
发光底物液A，以配制1000mL为例，配方为浓硝酸3.45mL，双氧水16.45g，余量为纯化水；配制方法为：配制桶中加入体外诊断试剂用纯化水800mL，准确称取浓硝酸、双氧水搅拌充分溶解后定容至1000mL，得到发光底物液A，置于2℃～8℃避光保存备用。
发光底物液B，以配制1000mL为例，配方为曲拉通X-100 3.2g，氢氧化钠12g，余量为纯化水；配制方法为：配制桶中加入体外诊断试剂用纯化水800mL，准确称取曲拉通X-100、氢氧化钠，匀速搅拌，充分溶解后定容至1000mL，得到发光底物液B，置于2℃～8℃避光保存备用。
实施例6
本实施例的检测试剂盒与实施例5的区别仅在于样本前处理液为实施例2的样本前处理液。
实施例7
本实施例的检测试剂盒与实施例5的区别仅在于样本前处理液为实施例3的样本前处理液。
实施例8
本实施例的检测试剂盒与实施例5的区别仅在于样本前处理液为实施例4的样本前处理液。
对比例1
本对比例的检测试剂盒与实施例5的区别仅在于样本前处理液为：在1LpH＝8.0的0.02M磷酸盐缓冲液中加入0.9％NaCl、10mM EDTA、0.1％Proclin300，得到样本前处理液，置于2℃～8℃保存；其中，％指的是质量百分比。
实验一
实验试剂盒：实施例5、实施例6和对比例1的检测试剂盒。
实验样本：1-15号样本，样本来源：收集有对比试剂盒测值的用于胰岛素项目的样本15例(包含有低中高值)，编号为1-15号。
实验方法：1-15号样本分别用实施例5、实施例7、实施例8的检测试剂盒检测，检测方法如下：
(1)将1-15号样本依次放入全自动化学发光免疫分析仪的配套样本架中；
(2)全自动化学发光免疫分析仪按照提前设定好的反应模式进行自动加样，反应模式如下：
A.加样针首先取50μL样本前处理液加入到反应杯中，然后取15μL样本加入到样本前处理液中，在孵育盘37℃下孵育3分钟；
B.加样针依次取50μL磁珠包被抗体工作液、50μL吖啶酯标记抗体工作液于孵育后的液体中，反应15分钟；
C.将反应液用清洗液清洗后，依次加入发光底物液A、发光底物液B，测定发光值。
实验结果：测得的结果与对比试剂盒测值做相关性对比，对比结果如下表1和图1-3。
表1实验一发光值
Figure BDA0004110013890000061
Figure BDA0004110013890000071
从表1和图1-3的对比结果可以看出，与实施例5相比，实施例6的检测试剂盒和对比例1的检测试剂盒测得发光值较低，而实施例5与实施例6、对比例1的检测试剂盒的区别仅在于样本前处理液不同，说明实施例6和对比例1的检测试剂盒所采用的样本前处理液并没有将样本中的胰岛素从胰岛素抗体中解离出来，导致胰岛素的测试结果偏低，而实施例5的检测试剂盒所采用的样本前处理液即实施例1的样本前处理液，则可以充分的将胰岛素从胰岛素抗体中解离，从而提高对样本中胰岛素检测的准确度。
实验二
实验试剂盒：实施例5、实施例7、实施例8的检测试剂盒。
实验样本：1-15号样本，样本来源：收集有对比试剂盒测值的用于胰岛素项目的样本15例(包含有低中高值)，编号为1-15号。
实验方法：1-15号样本分别用实施例5、实施例7、实施例8的检测试剂盒检测，检测方法同实验一。
实验结果：测得的结果与对比试剂盒测值做相关性对比，对比结果如下表2和图4-6：
表2实验二发光值
Figure BDA0004110013890000072
Figure BDA0004110013890000081
从表2和图4-6的对比结果可以看出，与实施例5和实施例8相比，实施例7的检测试剂盒测得的发光值最高，且跟对比试剂盒所测结果相关性最好，高达0.99以上，而实施例5和实施例7、实施例8的检测试剂盒的区别仅在于所采用的样本前处理液(即实施例1、实施例3和实施例4的样本前处理液)不同，具体区别仅在于样本前处理液中水杨酸钠的质量浓度不同，说明当样本前处理液中水杨酸钠的质量浓度为1.5％时，可以起到最佳的解离效果。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种胰岛素检测用样本前处理液，其特征在于，所述样本前处理液包括：液相、解离剂、螯合剂和添加剂。
2.根据权利要求1所述的胰岛素检测用样本前处理液，其特征在于，所述液相为水或水性溶剂，所述解离剂为水杨酸钠或ANS，所述螯合剂为EDTA。
3.根据权利要求1所述的胰岛素检测用样本前处理液，其特征在于，所述样本前处理液的pH为5.5-8.5。
4.根据权利要求1所述的胰岛素检测用样本前处理液，其特征在于，所述添加剂为pH调节剂、防腐剂、氯化钠中的一种或多种。
5.一种胰岛素检测用样本前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1-4任意一项所述的样本前处理液与样本混合反应，使胰岛素和胰岛素抗体分离。
6.一种检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-5任意一项所述的样本前处理液。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括磁珠包被抗体、吖啶酯标记抗体。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括清洗液和发光底物。
9.一种胰岛素检测方法，其特征在于，用权利要求6-8任意一项所述的检测试剂盒检测样本中胰岛素。
10.根据权利要求9所述的胰岛素检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将样本用如权利要求6所述的样本前处理方法进行前处理后，再加入磁珠包被抗体、吖啶酯标记抗体，反应后用清洗液清洗，加入发光底物，测定发光值。
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