CN116200302B - 屎肠球菌lv-434、微生物菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

屎肠球菌lv-434、微生物菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物领域，尤其涉及屎肠球菌LV‑434、微生物菌剂及其制备方法和应用。本发明提供了屎肠球菌LV‑434(EnterococcusfaeciumLV‑434)，其保藏编号为：CGMCCNo.26338。本发明提供了一种高效降解玉米赤霉烯酮毒素的屎肠球菌，并研发针对筛选出的菌株的发高密度发酵工艺，来降低使用成本。

Description

屎肠球菌LV-434、微生物菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及屎肠球菌LV-434、微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
霉菌毒素是一种存在于饲料和饲料原料中的危害因素，是由霉菌所产生的毒性很强的次生代谢产物。正常情况下，饲料原料的采收以及饲料的加工、运输和贮存过程中均有霉菌毒素产生。霉菌毒素分布广泛，国内外的饲料及饲料原料均饱受霉菌毒素的侵扰。霉菌毒素严重危害动物健康，含有霉菌毒素的饲料被动物摄入后可导致其肝脏、肾脏等器官功能受损，降低动物自身免疫力，影响饲料转化率等。
玉米赤霉烯酮，又称F-2毒素，是由镰刀菌属菌侏，如禾谷镰刀菌和三线镰刀菌、黄色镰孢、木贼镰孢、半裸镰孢、茄病镰孢等菌种产生的致病真菌毒素，是世界上污染粮油或饲料最广泛的真菌毒素之一，玉米赤霉烯酮通过污染谷类等农作物，进而进入人或动物体内，危害人和动物的健康，造成巨大的经济损失。种猪对玉米赤霉烯酮非常敏感，且不同生理阶段公、母猪的中毒症状有别。玉米赤霉烯酮可导致家畜排卵减少，发情周期延长或长期不发情，受胎率下降，流产。还可引发牛阴道炎、阴道分泌物减少、繁殖性能下降和母牛乳腺增大等症状。
对受玉米赤霉烯酮污染的饲料或原料进行有效的处理，主要还是依靠防霉来控制其危害。玉米赤霉烯酮的脱毒主要有物理方法和生物转化法两类。物理方法脱毒主要包括传统的日晒、清洗、浸泡、去皮、分拣等，还有较常见的高温灭活、辐射处理、有机吸附剂法与无机吸附剂法。生物法脱毒主要是微生物降解与酶制剂降解两种，前者主要是通过将霉菌毒素作为微生物自身生化反应的底物而降解霉菌毒素；后者主要是通过微生物产出的胞外酶与霉菌毒素结合并将其转化为其他无毒、弱毒产物，从而达到降解目的。生物法具有低毒性、低污染、低残留，高效、特异性强、安全等优点，是目前霉菌毒素脱毒的热点研究方向。
目前国内外已发现的玉米赤霉烯酮降解菌株主要有酵母菌属、芽孢杆菌属以及假单胞菌属，仍需要分离、筛选出更多适应于养殖行业特点的具有降解玉米赤霉烯酮能力的菌株。
屎肠球菌是一种圆形或椭圆形的球菌，革兰氏阳性，为需氧或兼性厌氧菌，屎肠球菌为肠道共生菌，具有多种优良生物学特性，可在肠道中形成优势菌群，由于其生长速度快，具较好粘附力，产生乳酸以及一些抗菌物质，快速占有优势地位，从而增加有益菌数量，抑制有害菌，促进肠道健康，调节肠道微生态平衡且防治腹泻，在提高生长性能方面功效显著，另外多数乳酸菌对高温耐受性不强，导致乳酸菌产品的应用与开发比较困难，而屎肠球菌是一种抗逆性较强(氧气、酸碱、高温、高盐)的乳酸菌，在畜禽养殖业中有着广泛应用。
因为屎肠球菌在养殖行业中的独特优势，所以筛选能够降解玉米赤霉烯酮的屎肠球菌能够减少被霉菌污染的饲料及饲料原料对养殖动物健康的影响，同时屎肠球菌在通过进食进入养殖动物肠道后也能够显著提高养殖动物的健康水平，这对于畜禽养殖业健康发展是非常重要的。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了屎肠球菌LV-434、微生物菌剂及其制备方法和应用。本发明提供了一种高效降解玉米赤霉烯酮毒素的屎肠球菌，并研发针对筛选出的菌株的发高密度发酵工艺，来降低使用成本。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了屎肠球菌LV-434(Enterococcusfaecium LV-434)，其保藏编号为：CGMCC No.26338。
本发明提供了微生物菌剂，包括以下任一项以及可接受的助剂；
(Ⅰ)、上述屎肠球菌LV-434(Enterococcusfaecium LV-434)；和/或
(Ⅱ)、上述屎肠球菌LV-434(Enterococcusfaecium LV-434)的灭活菌；和/或
(III)、上述屎肠球菌LV-434(Enterococcusfaecium LV-434)的发酵液、培养物、外泌体、裂解物或提取物。
本发明还提供了屎肠球菌LV-434高密度发酵培养工艺以及培养基。传统的乳酸菌发酵过程中常常使用MRS培养基，MRS培养基的主要成分及含量为：蛋白胨10g/L，牛肉粉5g/L，酵母浸粉4g/L，葡萄糖20g/L，三水合乙酸钠5g/L，七水合磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸铵2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，四水合硫酸锰0.05g/L，吐温80 1ml/L，从它的配方组成来看，蛋白胨、牛肉粉、酵母浸粉这些氮源价格昂贵，而且发酵后的活菌数大约为1×109CFU/mL，在饲用微生态制剂领域内使用的时候，发酵后不高的活菌数以及价格高昂的培养基配方组合在一起，就会大大增加使用成本，无法在激烈的市场竞争中获得竞争优势。因此，本发明通过筛选获得对玉米赤霉烯酮具有高降解率的屎肠球菌LV-434之后，要想在饲用微生态制剂领域内得到广泛使用，就必须降低培养基成本并且提高发酵罐的单位活菌数量，因此研发适合屎肠球菌LV-434特性的高密度发酵工艺及培养基是非常有必要的。经过大量的研究，本发明确定了以下针对屎肠球菌LV-434的高密度发酵培养工艺及培养基配方。
本发明还提供了培养基，包括斜面培养基、种子培养基或发酵培养基中的一种或多种；
所述斜面培养基的pH值为7.0～7.2，包括：蛋白胨5～15g/L、酵母粉2～6g/L、葡萄糖10～30g/L、磷酸二氢钾1～4g/L、硫酸镁0.1～0.5g/L和琼脂15g/L；
所述种子培养基的pH值为7.0～7.2，包括：玉米浆粉2～8g/L、蛋白胨5～15g/L、氯化钠3～7g/L和葡萄糖5～15g/L；
所述发酵培养基的pH值为7.0～7.2，包括：玉米浆粉10～20g/L、蛋白胨5～15g/L、葡萄糖10～30g/L、氯化钠3～6g/L、乙酸钠2～5g/L、磷酸二氢钾0.5～2g/L、柠檬酸氢二铵0.5～2g/L和硫酸镁0.1～0.5g/L。
在本发明的一些实施方案中，上述培养基中，所述斜面培养基包括：蛋白胨10g/L、酵母粉4g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁0.2g/L和琼脂15g/L；
所述种子培养基包括：玉米浆粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L和葡萄糖10g/L；
所述发酵培养基包括：玉米浆粉15g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖20g/L、氯化钠5g/L、乙酸钠3g/L、磷酸二氢钾1g/L、柠檬酸氢二铵1g/L和硫酸镁0.3g/L。
本发明还提供了上述培养基在制备微生物菌剂中的应用。
本发明还提供了上述微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
S1：取预培养的所述屎肠球菌LV-434接种，培养后，获得一级种子液；
S2：取所述一级种子液接种，培养后，获得二级种子液；
S3：取所述二级种子液发酵培养后，获得所述微生物菌剂。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S1中所述预培养采用上述培养基中的所述斜面培养基；S1中所述培养和S2中所述培养采用上述培养基中的所述种子培养基；S3中所述发酵培养采用上述培养基中的所述发酵培养基。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S1中所述预培养的时间为24h，温度为37℃。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S1中所述培养的时间为18h，温度为37℃，转速为150r/min。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S1中所述接种的接种量为1％，活菌数为1.0×109CFU/mL。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述接种的接种量为2％。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述培养的温度为37℃，转速为50r/min，空气流量为15L/min，罐压为0.05Mpa，pH值为6.8～7.2，时间为14～20h。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述培养的时间为16h。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S3中所述发酵培养时分段流加补料培养基；所述补料培养基包括：糖类化合物。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S3中所述补料培养基包括：果葡糖浆。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S3中所述补料培养基包括：F55型果葡糖浆。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S3中所述分段流加包括以下步骤：发酵0～5h，以1～3kg/h的速率流加所述补料培养基；发酵6～10h，以3～5kg/h的速率流加所述补料培养基；发酵11～15h，以4～6kg/h的速率流加所述补料培养基。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S3中所述分段流加包括以下步骤：发酵0～5h，以2kg/h的速率流加所述补料培养基；发酵6～10h，以4kg/h的速率流加所述补料培养基；发酵11～15h，以5kg/h的速率流加所述补料培养基。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S3中所述分段流加包括以下步骤：发酵0～5h，以1kg/h的速率流加所述补料培养基；发酵6～10h，以3kg/h的速率流加所述补料培养基；发酵11～15h，以4kg/h的速率流加所述补料培养基。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S3中所述分段流加包括以下步骤：发酵0～5h，以3kg/h的速率流加所述补料培养基；发酵6～10h，以5kg/h的速率流加所述补料培养基；发酵11～15h，以6kg/h的速率流加所述补料培养基。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S3中所述发酵培养的温度为37℃，转速为80r/min，空气流量为600L/min，罐压为0.05～0.07Mpa，pH值为6.5～6.8，时间为18h。
在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S3中所述pH值通过蠕动泵补充25％氢氧化钠调节。
本发明还提供了上述屎肠球菌LV-434、上述微生物菌剂或上述制备方法获得的微生物菌剂在制备饲料和/或饲料原料中的应用。
本发明还提供了上述屎肠球菌LV-434、上述微生物菌剂或上述制备方法获得的微生物菌剂在降解和/或去除污染物中玉米赤霉烯酮毒素中的应用。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述污染物包括：污染的谷物、污染的饲料原料或污染的饲料中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述谷物包括：玉米、小麦、大麦、稻谷或高梁中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述饲料原料包括：粮食副产物、麸皮或玉米皮中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述粮食副产物包括：小麦、大麦、稻谷、玉米或高梁中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述饲料包括：粮食副产物或上述饲料原料。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述粮食副产物包括：麦、大麦、稻谷、玉米或高梁中的一种或多种。
本发明提供了上述微生物菌剂或上述制备方法获得的微生物菌剂的使用方法，取所述微生物菌剂与吸附剂和螯合镁混合、干燥后，获得固态微生物菌剂后，与样品混合。
在本发明的一些实施方案中，上述使用方法中，所述螯合镁包括：EDTA-Mg、HEDP-Mg、EDTMP-Mg或DTPMPA-Mg中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，上述使用方法中，所述螯合镁为EDTA-Mg。
在本发明的一些实施方案中，上述使用方法中，所述微生物菌剂的pH值为7.0。
在本发明的一些实施方案中，上述使用方法中，所述微生物菌剂的活菌数为1.0×1010～1.1×1010CFU/mL。
在本发明的一些实施方案中，上述使用方法所述微生物菌剂与所述吸附剂的重量比为1:(3～10)。
在本发明的一些实施方案中，上述使用方法中，所述微生物菌剂与所述吸附剂的重量比为1:5。
在本发明的一些实施方案中，上述使用方法所述吸附剂包括玉米粉、麸皮、淀粉、硅藻土、糊精或活性炭中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，上述使用方法中，所述吸附剂为麸皮。
在本发明的一些实施方案中，上述的使用方法所述螯合镁添加的质量百分比为0.05％～0.5％。
在本发明的一些实施方案中，上述使用方法中，所述螯合镁添加的质量百分比为0.2％。
在本发明的一些实施方案中，上述使用方法所述与样品混合时，所述固态微生物菌剂添加的质量百分含量为0.01％～5％。
在本发明的一些实施方案中，上述使用方法中，所述固体微生物菌剂添加的质量百分含量为3％。
本发明提供了屎肠球菌LV-434(Enterococcusfaecium LV-434)，其保藏编号为：CGMCC No.26338。本发明还提供了微生物菌剂及微生物菌剂的制备方法和应用。
本发明提供的屎肠球菌LV-434微生物菌剂对玉米赤霉烯酮毒素的降解率最高可达99.2％，能够有效消除玉米赤霉烯酮毒素的危害，可以用于谷物、饲料、饲料原料中，对于解决饲料及其原料中毒素污染问题，提高利用率，提高畜牧业经济效益具有重要的意义。
生物保藏说明
生物材料：LV-434；分类命名：屎肠球菌(Enterococcusfaecium)；于2022年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No.26338。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示筛选时菌株LV-434不同时间的玉米赤霉烯酮。
具体实施方式
本发明公开了屎肠球菌LV-434、微生物菌剂及其制备方法和应用。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”“左右”的修饰。在此处，“约”“左右”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本发明提供了一株高效降解玉米赤霉烯酮毒素的屎肠球菌Enterococcusfaecium LV-434，该菌株分离自太原某奶牛养殖场的奶牛粪便样品。屎肠球菌菌株LV-434保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.26338，保藏日期为2022年12月27日。
本发明还提供了屎肠球菌LV-434的高密度发酵培养工艺，包括以下步骤：
(1)屎肠球菌LV-434斜面培养：取屎肠球菌LV-434菌种在无菌条件下接种到斜面培养基上，37℃培养24h。
(2)屎肠球菌LV-434一级种子液制备：取屎肠球菌LV-434斜面培养物，向菌株斜面中加入无菌生理盐水洗下斜面菌株，震荡，用无菌生理盐水将屎肠球菌LV-434菌数量调整到约1.0×109，按1％的接种量接种到一级种子培养基中，每瓶装液量为500mL，摇床转速150r/min，37℃培养18h，作为一级种子液。
(3)屎肠球菌LV-434种子罐扩大培养：取一级种子液，按照2％接种量接种到已消毒的装有70L二级种子培养基的100L种子罐中，培养温度为37℃，搅拌转速为50r/min，空气流量为15L/min，罐压0.05Mpa，pH控制在7.0左右，培养14～20h，作为二级种子液。
(4)屎肠球菌LV-434发酵培养：将种子罐中长好的二级种子液通过管道压入已经消毒的装有3000L发酵培养基的5000L发酵罐中，培养温度为37℃，搅拌转速为80r/min，空气流量为600L/min，罐压控制在0.05～0.07Mpa范围内，此时，发酵开始计时，在发酵的过程中，通过蠕动泵补25％氢氧化钠将pH控制在6.5～6.8范围内，在发酵过程中根据发酵时间进行分段流加补料培养基，发酵时间18h，终止发酵，进行活菌计数。
其中，步骤(1)的斜面培养基基组分及其用量为：蛋白胨5～15g/L、酵母粉2～6g/L、葡萄糖10～30g/L、磷酸二氢钾1～4g/L、硫酸镁0.1～0.5g/L、琼脂15g/L，pH7.0～7.2。
优选的，所述的斜面培养基基组分及其用量为：蛋白胨10g/L、酵母粉4g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁0.2g/L、琼脂15g/L，pH7.0～7.2。
其中，步骤(2)、(3)的一级种子培养基和二级种子培养基组分及其用量为：玉米浆粉2～8g/L，蛋白胨5～15g/L，氯化钠3～7g/L，葡萄糖5～15g/L，pH7.0～7.2。
优选的，所述的一级种子培养基和二级种子培养基组分及其用量为：玉米浆粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖10g/L，pH7.0～7.2。
优选的，步骤(3)的二级种子液培养时间为16h。
其中，步骤(4)的发酵培养基组分及其用量为：玉米浆粉10～20g/L，蛋白胨5～15g/L，葡萄糖10～30g/L，氯化钠3～6g/L，乙酸钠2～5g/L，磷酸二氢钾0.5～2g/L，柠檬酸氢二铵0.5～2g/L，硫酸镁0.1～0.5g/L，pH7.0～7.2。
优选的，所述的发酵培养基组分及其用量为：玉米浆粉15g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，氯化钠5g/L，乙酸钠3g/L，磷酸二氢钾1g/L，柠檬酸氢二铵1g/L，硫酸镁0.3g/L，pH7.0～7.2。
其中，步骤(4)所述的补料培养基是糖类化合物，优选的，是果葡糖浆，更优选的，是F55型果葡糖浆。
优选的，补料培养基流加的方法为根据发酵时间进行分段流加，发酵0～5h期间，按照1～3kg/h速率流加F55型果葡糖浆，发酵6～10h期间按照3～5kg/h速率流加F55型果葡糖浆，发酵11～15h期间按照4～6kg/h速率流加F55型果葡糖浆，之后不再流加补料培养基。
优选的，分段流加方式为：发酵0～5h期间，按照2kg/h速率流加F55型果葡糖浆，发酵6～10h期间，按照4kg/h速率流加F55型果葡糖浆，发酵11～15h期间，按照5kg/h速率流加F55型果葡糖浆，之后不再流加补料培养基。
本发明还提供了降解玉米赤霉烯酮毒素的微生物菌剂的使用方法。为了降低使用成本，发明人将获得的屎肠球菌LV-434发酵液pH值调节为7.0，再与玉米粉、麸皮、淀粉、硅藻土、糊精、活性炭等中的一种或几种吸附剂混合，干燥，制得固态微生物菌剂，添加到被玉米赤霉烯酮污染的谷物、饲料原料或者饲料进行降解脱毒。
所述菌剂中含有的菌株是屎肠球菌LV-434。
所述的屎肠球菌LV-434发酵液活菌数在1.0×1010CFU/mL左右。
所述的屎肠球菌LV-434发酵液与吸附剂混合时的重量比为1:3～10，优选为1:5。
吸附剂优选为麸皮。
其中，固态微生物菌剂添加比例为：按照质量百分含量为0.01～5％添加，优选的添加比例为3％。
上述应用中，所述谷物为玉米、小麦、大麦、稻谷或高梁。所述饲料原料及饲料为小麦、大麦、稻谷、玉米、高梁等粮食副产物如麸皮、玉米皮等饲料原料及它们加工而成的饲料。
发明人在固态微生物菌剂降解玉米赤霉烯酮性能考察过程中发现，当往pH7.0的发酵液中添加螯合镁(EDTA-Mg)，所制得的固态微生物菌剂降解玉米赤霉烯酮性能有明显的提高，降解率最高能够达到99.2％，所述螯合镁(EDTA-Mg)的添加质量百分比为0.05～0.5％，优选的为0.2％。
本发明实施例1～实施例10中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1屎肠球菌LV-434的分离筛选及鉴定
菌株LV-434的分离筛选：
该菌株分离自太原某奶牛养殖场的奶牛粪便样品。先配置含碳酸钙的分离培养基(培养基配方：20g葡萄糖、15g蛋白胨、5g牛肉膏、10g碳酸钙、15g琼脂，蒸馏水定容至1000mL)，121℃，20min消毒后倒平板，冷却备用。在净化台中取少量奶牛粪便样品，悬浮于100mL无菌生理盐水中，震荡，用无菌生理水进行梯度稀释至，然后分别吸取不同梯度的稀释液100μL在分离平板上，进行涂布分离，平板倒置放培养箱中，培养温度为37℃，培养24h。从有碳酸钙溶解圈的单菌落中选择形状较小、圆形凸起、表面光滑且略白色的单菌落，挑取至斜面培养基上培养，保存备用。
挑取不同的单菌落斜面，接种于含玉米赤霉烯酮浓度为5mg/L的培养基中(培养基配方：20g葡萄糖、15g蛋白胨、5g牛肉膏，蒸馏水定容至1000mL)，在37℃摇床150r/min培养48h，10000r/min离心5min，取适量培养液上清，加入4倍体积的甲醇，超声混匀，有机相针头过滤后，用高效液相色谱检测培养液中的玉米赤霉烯酮含量，通过和对照进行玉米赤霉烯酮含量比较，获得具有降解玉米赤霉烯酮功能的菌株。高效液相色谱检测玉米赤霉烯酮条件为:色谱柱：安捷伦，ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇/水(3:1)；流速：1mL/min；进样量：20μL；柱温：40℃；荧光检测器参数：Ex＝274nm，Em＝440nm。玉米赤霉烯酮降解率＝(空白对照组含量－样品组含量)÷空白对照组含量×100％。
从535株菌株中筛选出4株玉米赤霉烯酮降解菌，分别编号为LV-77、LV-244、LV-434及LV-489，降解率分别为42.5％、57.2％、94.5％和77.9％。
筛选出的菌株LV-434具有良好的降解玉米赤霉烯酮活性，其在培养0h和48h时的高效液相图如图1所示。为了筛选出具有良好降解玉米赤霉烯酮的菌株，筛选设计中需要使用高浓度的玉米赤霉烯酮，本实施例中玉米赤霉烯酮的浓度设定为5mg/L，从图1中可以看出，筛选出来的菌株LV-434对5mg/L这种高浓度的玉米赤霉烯酮也是有很好的降解作用的，但是由于微生物在含有不同物质的培养基中生长时，通常都有时间长短不一的适应期，在本实施例中，我们也观察到菌株LV-434的生长对高浓度的玉米赤霉烯酮有一定的适应期，所以菌株LV-434培养了48h表现出很好的降解作用。需要指出的是，实施例10中采用的是已经发酵培养好的LV-434菌株，同时玉米赤霉烯酮的浓度比实施例1中的低得多，所以静置处理24h就能发挥出良好的降解效果。
因此，选择玉米赤霉烯酮降解率为94.5％的菌株LV-434进行鉴定。
实施例2菌株LV-434鉴定
(1)菌体特征：革兰氏阳性，细胞球状，直径0.8～1.0μm，无鞭毛，无芽孢；
(2)菌落特征：菌落乳白色，边缘整齐，圆形，凸起，不透明，表面湿润光滑；
(3)生理生化特征：过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、明胶液化试验和硫化氢试验均为阴性，精氨酸水解试验阳性，10℃和45℃生长试验阳性，6.5％NaCl生长试验阳性，pH4.5和pH9.5生长试验阳性，葡萄糖产气实验阴性，能利用麦芽糖、蔗糖、乳糖、山梨醇、甘露醇、海藻糖。
与《简明第八版伯杰细菌鉴定手册》、《常见细菌系统鉴定手册》和《乳酸细菌的分类鉴定》对照，鉴定菌株LV-434为屎肠球菌。
另外，对该菌株进行分子鉴定，通过通用引物27F与1492R扩增菌株LV-434的16srRNA，获得16s rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示，将所测得的序列与Genbank中的16srRNA序列进行BLAST相似性分析比较，结果表明该菌株与Enterococcusfaecium strainATCC 19434的16s rRNA序列的同源性均达到了99.6％，进一步确定菌株LV-434为屎肠球菌。菌株LV-434保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.26338，保藏日期为2022年12月27日。
菌株LV-434的16SrDNA序列具体如下：
(如SEQ ID NO:1所示)
实施例3屎肠球菌LV-434的高密度发酵培养工艺以及培养基
1、培养基配置
斜面培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁0.2g/L，琼脂15g/L，pH7.0～7.2。
种子培养基：玉米浆粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖10g/L，pH7.0～7.2。
发酵培养基：玉米浆粉15g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，氯化钠5g/L，乙酸钠3g/L，磷酸二氢钾1g/L，柠檬酸氢二铵1g/L，硫酸镁0.3g/L，pH7.0～7.2。
2、屎肠球菌LV-434高密度发酵方法
(1)屎肠球菌LV-434斜面培养：取实施例2的屎肠球菌LV-434菌种在无菌条件下接种到斜面培养基上，37℃培养24h。
(2)屎肠球菌LV-434一级种子液制备：取步骤(1)获得的屎肠球菌LV-434斜面培养物，向菌株斜面中加入无菌生理盐水洗下斜面菌株，震荡，用无菌生理盐水将屎肠球菌LV-434菌数量调整到约1.0×109，按1％的接种量接种到种子培养基中，每瓶装液量为500mL，摇床转速150r/min，37℃培养18h，作为一级种子液。
(3)屎肠球菌LV-434种子罐扩大培养：取步骤(2)获得的一级种子液，按照2％接种量接种到已消毒的装有70L二级种子培养基的100L种子罐中，培养温度为37℃，搅拌转速为50r/min，空气流量为15L/min，罐压0.05Mpa，pH控制在7.0左右，培养16h左右，作为二级种子液。
(4)屎肠球菌LV-434发酵培养：将步骤(3)种子罐中长好的二级种子液通过管道压入已经消毒的装有3000L发酵培养基的5000L发酵罐中，培养温度为37℃，搅拌转速为80r/min，空气流量为600L/min，罐压控制在0.05～0.07Mpa范围内，在发酵的过程中，通过蠕动泵补25％氢氧化钠将pH控制在6.5～6.8范围内。
(5)在发酵过程中根据发酵时间进行分段流加F55型果葡糖浆：发酵0～5h期间，按照2kg/h速率流加F55型果葡糖浆，发酵6～10h期间，按照4kg/h速率流加F55型果葡糖浆，发酵11～15h期间，按照5kg/h速率流加F55型果葡糖浆，之后不再流加F55型果葡糖浆。
发酵时间18h，终止发酵后发酵罐中的屎肠球菌LV-434活菌数为1.22×1010CFU/mL。
实施例4
本实施例和实施例3的区别在于(培养基配方不同)：
斜面培养基：蛋白胨5g/L，酵母粉6g/L，葡萄糖30g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.1g/L，琼脂15g/L，pH7.0～7.2。
种子培养基：玉米浆粉2g/L，蛋白胨15g/L，氯化钠3g/L，葡萄糖15g/L，pH7.0～7.2。
发酵培养基：玉米浆粉10g/L，蛋白胨15g/L，葡萄糖10g/L，氯化钠3g/L，乙酸钠2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，硫酸镁0.5g/L，pH7.0～7.2。
其余所有条件均与实施例3完全一致，终止发酵后发酵罐中的屎肠球菌LV-434活菌数为1.01×1010CFU/mL。
实施例5
本实施例和实施例3的区别在于(培养基配方不同)：
斜面培养基：蛋白胨15g/L，酵母粉2g/L，葡萄糖10g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸镁0.5g/L，琼脂15g/L，pH7.0～7.2。
种子培养基：玉米浆粉8g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠7g/L，葡萄糖5g/L，pH7.0～7.2。
发酵培养基：玉米浆粉20g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖30g/L，氯化钠6g/L，乙酸钠5g/L，磷酸二氢钾2g/L，柠檬酸氢二铵0.5g/L，硫酸镁0.1g/L，pH7.0～7.2。
其余所有条件均与实施例3完全一致，终止发酵后发酵罐中的屎肠球菌LV-434活菌数为0.99×1010CFU/mL。
实施例6
本实施例和实施例3的区别在于(屎肠球菌LV-434高密度发酵方法中步骤(5)不同)：
(5)在发酵过程中根据发酵时间进行分段流加F55型果葡糖浆：发酵0～5h期间，按照1kg/h速率流加F55型果葡糖浆，发酵6～10h期间，按照3kg/h速率流加F55型果葡糖浆，发酵11～15h期间，按照4kg/h速率流加F55型果葡糖浆，之后不再流加补料培养基。
其余所有条件均与实施例3完全一致，终止发酵后发酵罐中的屎肠球菌LV-434活菌数为0.97×1010CFU/mL。
实施例7
本实施例和实施例3的区别在于(屎肠球菌LV-434高密度发酵方法中步骤(5)不同)：
(5)在发酵过程中根据发酵时间进行分段流加F55型果葡糖浆：发酵0～5h期间，按照3kg/h速率流加F55型果葡糖浆，发酵6～10h期间，按照5kg/h速率流加F55型果葡糖浆，发酵11～15h期间，按照6kg/h速率流加F55型果葡糖浆，之后不再流加补料培养基。
其余所有条件均与实施例3完全一致，终止发酵后发酵罐中的屎肠球菌LV-434活菌数为1.06×1010CFU/mL。
实施例8二级种子液培养时间对发酵的影响
本实施例和实施例3的区别在于：二级种子液种龄分别为14h、18h、20h，其余所有条件均与实施例3完全一致，分别发酵，每组做三个重复，结果取平均值，得到的屎肠球菌LV-434活菌数结果如表1所示，该结果表明在二级种子液种龄为14h、18h和20h时，发酵得到的活菌数均低于实施例3，这说明二级种子液的种龄对发酵有明显的影响。
表1二级种子液种龄对发酵的影响
二级种子液种龄(h) 活菌数(CFU/mL)
14 0.92×1010
18 0.83×1010
20 0.77×1010
实施例9流加不同补料培养基对发酵的影响
本实施例和实施例3的区别在于：补料培养基分别为葡萄糖、果糖、蔗糖、F42型果葡糖浆，F90型果葡糖浆，其余所有条件均与实施例3完全一致，分别发酵，每组做三个重复，结果取平均值，得到的屎肠球菌LV-434活菌数结果如表2所示，说明流加糖类的选择对发酵后活菌数的影响也较为明显，其中价格低廉的果葡糖浆效果较好，而且不同类型的果葡糖浆中F55型效果最佳，这也说明果葡糖浆中葡萄糖和果糖的合适配比对于屎肠球菌LV-434发酵后的活菌数影响较大。
表2不同补料培养基对发酵的影响
补料培养基 活菌数(CFU/mL)
葡萄糖 0.94×1010
果糖 0.91×1010
蔗糖 0.90×1010
F42型果葡糖浆 1.02×1010
F90型果葡糖浆 0.98×1010
实施例10固态微生物菌剂对被玉米赤霉烯酮污染的饲料的应用效果
(1)按照下面方法制备两种固态微生物菌剂
不含螯合镁(EDTA-Mg)固态微生物菌剂制备：将实施例1获得的屎肠球菌LV-434发酵液活菌数调节为1.0×1010CFU/mL左右，pH值调节为7.0，再与麸皮混合，发酵液与吸附剂混合时的重量比为1:5，干燥，制得固态微生物菌剂。
含螯合镁(EDTA-Mg)固态微生物菌剂制备：将实施例1获得的屎肠球菌LV-434发酵液活菌数调节为1.0×1010CFU/mL左右，pH值调节为7.0，然后往其中加入0.2％的螯合镁(EDTA-Mg)，混合均匀后再与麸皮混合，发酵液与吸附剂混合时的重量比为1:5，干燥，制得固态微生物菌剂。
(2)另取发霉饲料若干，粉碎混匀并用新鲜无霉饲料与其混合，混合的标准是将其中玉米赤霉烯酮的浓度调节为1000μg/kg。取制备好的的两种固态微生物菌剂，分别按照3％的重量比添加到该霉变饲料中，混合均匀，不含螯合镁(EDTA-Mg)的固态微生物菌剂作为实验组一，含螯合镁(EDTA-Mg)的固态微生物菌剂作为实验组二。
另外取新鲜没有霉变的饲料代替固态微生物菌剂，也按照3％的重量比添加到该霉变饲料中，混合均匀，作为对照组；
需要指出的是，新版饲料卫生标准GB13078—2017《饲料卫生标准》对玉米赤霉烯酮的限量标准更加严格，分类更加细致，例如猪配合饲料由原来的500μg/kg限量降低到250μg/kg，青年母猪和仔猪配合饲料更是降低到100μg/kg和150μg/kg；其他的配合饲料和玉米中的限量为500μg/kg。本实施例中将玉米赤霉烯酮的浓度调节为1000μg/kg，显著高于国家标准，从而更好地验证固态微生物菌剂对玉米赤霉烯酮降解效果。
以上每组做三个重复，结果取平均值。
(3)选择25℃、28℃、31℃、34℃和37℃分别进行静置处理24h，从对照组和试验组准确称量10g样品，用50mL甲醇剧烈振荡抽提玉米赤霉烯酮，0.45μm有机相微孔滤膜过滤，取甲醇滤液用HPLC方法检测并计算玉米赤霉烯酮的降解率，结果如表3所示，玉米赤霉烯酮的HPLC检测方法及降解率计算方法见实施例1。
结果表明该固态微生物菌剂对污染玉米粉经过24小时的脱毒处理，对照组在各个温度下都无任何降解现象，实验组均有良好的降解率，同时温度对降解率的影响不大，这说明屎肠球菌LV-434固态微生物菌剂能够在不同的环境温度下使用，对于其广泛使用是非常有利的。另外，实验组一和实验组二的结果表明螯合镁(EDTA-Mg)的添加能够明显提高固态微生物菌剂降解玉米赤霉烯酮的效果，降解率最高能够达到99.2％。
表3固态微生物菌剂降解玉米赤霉烯酮的效果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.屎肠球菌（Enterococcus faecium）LV-434，其特征在于，其保藏编号为：CGMCCNo.26338。
2.微生物菌剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的屎肠球菌（Enterococcus faecium）LV-434以及可接受的助剂。
3.如权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：取预培养的所述屎肠球菌LV-434接种，培养后，获得一级种子液；
S2：取所述一级种子液接种，培养后，获得二级种子液；
S3：取所述二级种子液发酵培养后，获得所述微生物菌剂。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，S1中所述预培养采用斜面培养基；S1中所述培养和S2中所述培养采用种子培养基；S3中所述发酵培养采用发酵培养基；
所述斜面培养基的pH值为7.0~7.2，包括：蛋白胨5~15 g/L、酵母粉2~6 g/L、葡萄糖10~30 g/L、磷酸二氢钾1~4 g/L、硫酸镁0.1~0.5 g/L和琼脂15 g/L；
所述种子培养基的pH值为7.0~7.2，包括：玉米浆粉2~8 g/L、蛋白胨5~15 g/L、氯化钠3~7 g/L和葡萄糖5~15 g/L；
所述发酵培养基的pH值为7.0~7.2，包括：玉米浆粉10~20 g/L、蛋白胨5~15 g/L、葡萄糖10~30 g/L、氯化钠3~6 g/L、乙酸钠2~5 g/L、磷酸二氢钾0.5~2 g/L、柠檬酸氢二铵0.5~2g/L和硫酸镁0.1~0.5 g/L。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S3中所述发酵培养时分段流加补料培养基；所述补料培养基包括：糖类化合物。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，S3中所述分段流加包括以下步骤：发酵0~5h，以1~3 kg/h的速率流加所述补料培养基；发酵6~10h，以3~5 kg/h的速率流加所述补料培养基；发酵11~15h，以4~6 kg/h的速率流加所述补料培养基。
7.如权利要求1所述的屎肠球菌LV-434、如权利要求2所述的微生物菌剂或如权利要求3至6任一项所述制备方法获得的微生物菌剂的应用，包括但不限于以下任意一项：
（I）、在制备饲料和/或饲料原料中的应用；和/或
（II）、在降解和/或去除污染物中玉米赤霉烯酮毒素中的应用。
8.如权利要求2所述的微生物菌剂或如权利要求3至6任一项所述的制备方法获得的微生物菌剂的使用方法，其特征在于，取所述微生物菌剂与吸附剂和螯合镁混合、干燥后，获得固态微生物菌剂后，与样品混合。
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