CN116183778B - 高效液相色谱法检测甲氨蝶呤中间体及其对映异构体的方法 - Google Patents

高效液相色谱法检测甲氨蝶呤中间体及其对映异构体的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116183778B
CN116183778B CN202310413973.7A CN202310413973A CN116183778B CN 116183778 B CN116183778 B CN 116183778B CN 202310413973 A CN202310413973 A CN 202310413973A CN 116183778 B CN116183778 B CN 116183778B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mobile phase
peak
impurity
methotrexate
high performance
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202310413973.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116183778A (zh
Inventor
刘文武
付李
胡和平
苟文
徐秋平
丁兆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan Huiyu Pharmaceutical Co Ltd
Sichuan Huiyu Seacross Pharmaceutical Technology Co Ltd
Original Assignee
Sichuan Huiyu Pharmaceutical Co Ltd
Sichuan Huiyu Seacross Pharmaceutical Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan Huiyu Pharmaceutical Co Ltd, Sichuan Huiyu Seacross Pharmaceutical Technology Co Ltd filed Critical Sichuan Huiyu Pharmaceutical Co Ltd
Priority to CN202310413973.7A priority Critical patent/CN116183778B/zh
Publication of CN116183778A publication Critical patent/CN116183778A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116183778B publication Critical patent/CN116183778B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/74—Optical detectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
    • G01N30/8679—Target compound analysis, i.e. whereby a limited number of peaks is analysed
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Library & Information Science (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种高效液相色谱法测定(S)‑2‑(4‑(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸或其盐中所含R型异构体或R型异构体盐的检测方法，该色谱条件是以直链淀粉‑三(3,5‑二甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂的色谱柱，流动相是以流动相A正己烷与流动相B无水乙醇‑乙腈‑三氟乙酸体系的混合溶剂，其中流动相A与B按体积比为(78：22)～(85：15)进行等度洗脱。本发明提供的检测方法能够快速、准确地检测甲氨蝶呤中间体(S)‑2‑(4‑(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸对映异构体杂质的含量，从而能够在中间体工艺过程中有效地控制该R型异构体杂质进一步转化为甲氨蝶呤异构体杂质F，对甲氨蝶呤合成工艺起到指导作用，具有非常重要的意义。

Description

高效液相色谱法检测甲氨蝶呤中间体及其对映异构体的方法
技术领域
本发明涉及分析检测领域，涉及高效液相色谱法检测甲氨蝶呤中间体及其对映异构体的方法，具体涉及测定(S)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸或其盐中所含R型异构体或R型异构体盐的检测方法。
背景技术
甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)是一种叶酸还原酶抑制剂，为抗叶酸类抗肿瘤药，主要通过对二氢叶酸还原酶的抑制达到阻碍肿瘤细胞DNA的合成，从而抑制肿瘤细胞的生长与繁殖。其选择性地作用于S期，属于细胞周期特异性药物。临床上在急性白血病(尤其是急性淋巴细胞性白血病)、绒毛膜上皮癌及恶性葡萄胎等方面治疗效果较好。对头颈部肿瘤、乳腺癌、肺癌及盆腔肿瘤均有一定疗效，也可与其他药物联合治疗Burkitts淋巴瘤，晚期淋巴肉瘤(Ⅲ和Ⅳ期，Peter氏阶段系统)和晚期蕈样真菌病。甲氨蝶呤结构式为：
现有技术公开的甲氨蝶呤合成方法中，通常采用(S)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸二钠(简称M3)作为甲氨蝶呤合成过程中的关键手性中间体，其是由对甲氨基苯甲酰谷氨酸二乙酯合成而来，分子式C13H14N2Na2O5，分子量324.24，性状为白色至浅黄色粉末。其结构式为：
该中间体的对映异构体为(R)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸二钠(简称M3-A)，分子式C13H14N2Na2O5，分子量324.24，性状为白色结晶颗粒。其结构式为：
在甲氨蝶呤后续工艺步骤中，该R型异构体杂质会进一步转化为甲氨蝶呤异构体杂质(简称杂质F)，其结构式为：
由于终产物甲氨蝶呤的纯化工艺对甲氨蝶呤异构体杂质F无明显的清除效果，因此需要在中间体的制备过程阶段对该中间体的R异构体杂质进行检测控制，将其含量控制在非常低的水平，从而确保终产品中相应杂质含量符合质量要求。
经检索，目前没有涉及甲氨蝶呤中间体(S)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸对映异构体杂质色谱监控方法的文献报道，因此，需要开发一种可以在中间体工艺中准确地监控异构体杂质(R)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸含量的方法，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够快速、准确地检测甲氨蝶呤中间体(S)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸中对映异构体杂质(R)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸或其盐的含量的检测方法，从而能够在中间体工艺过程中有效地控制R型异构体杂质进一步转化为甲氨蝶呤异构体杂质F。
为实现上述目的，本发明提供了一种高效液相色谱法测定(S)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸或其盐中所含R型异构体或R型异构体盐的检测方法，所述的高效液相色谱法采用直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂的色谱柱，流动相是流动相A正己烷与流动相B无水乙醇-乙腈-三氟乙酸体系的混合溶剂，其中流动相A与B按体积比为(78：22)～(85：15)进行等度洗脱；
进一步，本发明所述的色谱柱为DALCELCHIRALPAKAD-H，规格为250mm×4.6mm，5μm或效能相当的色谱柱；
进一步，本发明所述的流动相B中无水乙醇与乙腈体积比为(85：15)～(95：5)，三氟乙酸体积分数为0.05％～1％；
优选地，所述的流动相B中无水乙醇与乙腈体积比为90：10；
优选地，所述的三氟乙酸体积分数为0.1％～0.5％，更优选为0.3％；
进一步，流动相A与流动相B体积比为(78：22)～(80：20)，优选为80：20；
进一步，本发明所述的流动相流速为0.3～1.2mL/min，优选为0.7～0.8mL/min，更优选为0.7mL/min；
进一步，本发明所述的柱温为20～35℃，优选为20～25℃，更优选为25℃；
进一步，本发明所述的进样量5～20μl，优选为5μl；
进一步，本发明所述的检测波长为295±5nm，优选为295nm；
进一步，本发明所述的(S)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸的盐和/或所述R型异构体的盐为二钠盐；
进一步，本发明所述的检测为定性和/或定量检测；
进一步，本发明所述的定量检测是以面积归一化法计算(S)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸或其盐供试品溶液中所含R型异构体的含量；
根据本发明的一些具体实施方式，所述检测方法包括如下步骤：
(1)配制供试品溶液：取甲氨蝶呤中间体M3供试品适量，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含1.0mgM3的溶液；
(2)配制系统适用性溶液：分别取供试品M3和对映异构体杂质M3-A对照品，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含M31.0mg和M3-A对映异构体30μg的混合溶液。
(3)设置色谱条件：用直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂(DALCELCHIRALPAKAD-H，规格：250mm×4.6mm，5μm或效能相当的色谱柱)；以体积比为80:20正己烷与无水乙醇-乙腈-三氟乙酸(90：10：0.3)体系混合溶液为流动相进行等度洗脱；检测波长为295nm；柱温为25℃；流速0.7ml/min；
(4)测定：取空白溶液甲醇、步骤(1)和(2)的溶液各5μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图；系统适用性溶液色谱图中，出峰顺序依次为中间体M3与其对映异构体M3-A峰，其中，M3-A峰与相邻的峰分离度应大于1.5，且按面积归一化法计算供试品溶液中间体M3对映异构体含量。
本发明具有下述有益效果：
本发明提供了一种甲氨蝶呤中间体(S)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸对映异构体杂质的检测方法，能够实现对该中间体异构体杂质定性和定量检测，具有准确度高、灵敏度高、精密度高、专属性良好的优点。本发明提供的检测方法能够快速、准确地检测甲氨蝶呤中间体(S)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸中R型对映异构体的含量，从而能够在中间体工艺过程中有效地控制R型异构体杂质进一步转化为甲氨蝶呤异构体杂质F，对甲氨蝶呤合成工艺起到指导作用，具有非常重要的意义。
附图说明
图1筛选案例一反相高效液相色谱图；
图2筛选案例二反相高效液相色谱图；
图3筛选案例三正相高效液相色谱图；
图4优化案例四正相高效液相色谱图；
图5优化案例五正相高效液相色谱图；
图6优化案例六正相高效液相色谱图；
图7优化案例七正相高效液相色谱图；
图8优化案例八正相高效液相色谱图；
图9优化案例九正相高效液相色谱图；
图10优化案例十正相高效液相色谱图；
图11优化案例十一正相高效液相色谱图；
图12优化案例十二正相高效液相色谱图；
图13优化案例十三正相高效液相色谱图；
图14优化案例十四正相高效液相色谱图；
图15优化案例十五正相高效液相色谱图；
图16优化案例十六正相高效液相色谱图；
图17优化案例十七正相高效液相色谱图；
图18优化案例十八正相高效液相色谱图；
图19优化案例十九正相高效液相色谱图；
图20优化案例二十正相高效液相色谱图；
图21优化案例二十一正相高效液相色谱图。
图22中间体M3供试品正相高效液相色谱图。
图23甲氨蝶呤反相高效液相色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种快速、准确地分离和检测出中间体(S)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸中其对映异构体杂质的方法，用以指导合成工艺开发控制，从而保证甲氨蝶呤原料药的质量符合标准规定，且满足临床上的用药安全。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：由于中间体M3中的对映异构体M3-A杂质在甲氨蝶呤后续工艺步骤中会进一步转化为甲氨蝶呤异构体杂质F；且目前已公开的甲氨蝶呤纯化工艺对甲氨蝶呤异构体杂质F无明显的清除效果，为了保证终产物甲氨蝶呤的质量符合标准要求，因此需要在中间体工艺过程中对异构体杂质M3-A的含量进行控制。发明人通过杂质限度研究发现，当将异构体杂质M3-A含量控制在3.0％以下时，能够保证合成的终产物甲氨蝶呤中甲氨蝶呤异构体杂质F的含量维持在2.39％以下(药典规定该杂质限度≤3％)，符合质量控制要求。
为了实现上述目的，需要开发一种能够准确检测异构体杂质M3-A含量的方法，用于指导工艺过程控制。
然而，分析检测过程中发现，不仅需要将异构体杂质M3-A和主成分中间体M3很好地分离，而且还需要异构体杂质M3-A与相邻已知或未知杂质峰有效分离，同时要保证异构体杂质M3-A的峰形好才能实现准确地定量。为此，发明人对检测条件进行充分地考察。首先，发明人尝试采用反相系统分离异构体杂质M3-A，但发现异构体M3-A与已知杂质根本无法分离(筛选案例一和案例二)；于是发明人决定采用AD-H的色谱柱，反相系统更换为正相，采用正己烷-无水乙醇-三氟乙酸体系作为流动相进行初步筛选，但结果是中间体M3峰与其对映异构体M3-A峰未能完全分离，发明人进一步通过改变流动相中洗脱剂种类、洗脱剂比例、酸的种类及其用量、流速以及柱温条件层层筛选才获得最佳的检测条件。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过市售购买获得。
本发明中，涉及的缩写及专业术语具有的含义如下：
M3：(S)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸二钠；
M3-A：(R)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸二钠；
M3-B&C：(S)-4-甲氨基苯甲酰谷氨酸单乙酯混合物，其中M3-B结构为
M3-C结构为
M3-D：(S)-4-二甲氨基苯甲酰谷氨酸；
M3-E：(S)-4-氨基苯甲酰谷氨酸；
M3-F：4-(甲氨基)苯甲酸；
SM3：(S)-4-甲氨基苯甲酰谷氨酸二乙酯。
面积归一化法：按各品种项下的规定，配制供试品溶液，取一定量进样，记录色谱图。测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。
自身对照法：测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液，作为对照溶液，进样，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积后与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。
外标法：按各品种项下的规定，精密称(量)取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，进样，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测物质的峰面积(或峰高)，计算杂质含量。
实施例1中间体M3对映异构体杂质含量的检测
供试品溶液：取甲氨蝶呤中间体M3供试品适量，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含1.0mg的溶液。
系统适用性溶液：分别取供试品M3和异构体杂质M3-A对照品，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含供试品1.0mg和对映异构体30μg的混合溶液。
色谱条件：用直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂(DALCELCHIRALPAKAD-H，规格：250mm×4.6mm，5μm或效能相当的色谱柱)；以体积比为80:20正己烷与无水乙醇-乙腈-三氟乙酸(90：10：0.3)的混合溶液为流动相进行等度洗脱；检测波长为295nm；柱温为25℃；流速0.7ml/min；进样体积5μl。
系统适用性要求：系统适用性溶液色谱图中，出峰顺序依次为中间体M3、异构体杂质M3-A，其中，M3-A峰与相邻的峰分离度应大于1.5。
测定法：精密量取供试品溶液和系统适应性溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，测得供试品溶液中异构体杂质M3-A的含量为0.45％。
限度：供试品溶液色谱图中，按面积归一化计算，中间体M3对映异构体含量不得过3.0％。
实施例2中间体M3对映异构体杂质检测方法的研究
在甲氨蝶呤的中间体M3中，除了其R型对映异构体杂质(M3-A)之外，还存在多个其它已知或未知杂质，在检测过程中，需要使M3-A峰与中间体M3以及相邻的其他杂质有效分离开，才能实现异构体杂质含量的测定。以下通过色谱条件的筛选，实现杂质峰的有效分离。
溶液配制：
稀释剂：甲醇。
M3-A杂质定位溶液：称取甲氨蝶呤中间体M3对映异构体杂质样品约1mg于10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。
M3-B&C杂质定位溶液：称取甲氨蝶呤中间体M3杂质B&C约5mg，置于10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。
M3-D杂质定位溶液：称取甲氨蝶呤中间体M3杂质D约5mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过。
M3-E杂质定位溶液：取甲氨蝶呤中间体M3杂质E约5mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过。
M3-F杂质定位溶液：取甲氨蝶呤中间体M3杂质F约5mg，置10ml量瓶中，加甲醇剂溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过。
SM3杂质定位溶液：取甲氨蝶呤中间体M3起始物料SM3约5mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过。
混合溶液-1：称取甲氨蝶呤中间体M3样品约10mg置10ml量瓶中，加甲醇适量溶解，分别移取M3-A、M3-B&C杂质定位溶液3ml，继续加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过。
混合溶液-2：称取甲氨蝶呤中间体M3样品约50mg置50ml量瓶中，加甲醇适量溶解，分别移取M3-A、M3-B&C、M3-D、M3-E、M3-F和SM3杂质定位溶液3ml，继续加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过。
2.1筛选案例一
以DAICELZWIX(+)0.30cm×25cm，3μm为色谱柱，以甲醇(含有25mmol/L甲酸和12.5mmol/L二乙胺)为流动相A，以水为流动相B，按流动相A与B体积比为98：2混合后进行等度洗脱；检测波长为295nm；柱温为30℃；流速0.3ml/min。取5μl混合溶液-1注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱图见图1，其结果显示：异构体M3-A峰与M3-B&C杂质峰出峰时间(7.120min)一致，两者无法分离。
2.2筛选案例二
在筛选案例一的基础上，除了改变流动相之外，其它检测条件不变；具体流动相是以体积比为1:4的甲醇和乙腈混合溶液(含有50mmol/L甲酸和50mmol/L二乙胺)为流动相A，以水为流动相B，按流动相A与B体积比为80：20混合后进行等度洗脱。取5μl混合溶液-1注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱图见图2，其结果显示：M3对映异构体M3-A峰与M3-B&C杂质峰出峰时间(4.930min)一致，两者无法分离。
2.3筛选案例三
采用AD-H色谱柱，正己烷-无水乙醇-三氟乙酸体系作为流动相进行初步筛选。
以直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂(DALCEL CHIRALPAKAD-H，规格：250mm×4.6mm，5μm)的色谱柱，以体积比为70：30正己烷与无水乙醇(含有体积分数为0.05％三氟乙酸)的混合溶液为流动相；检测波长为295nm；柱温为30℃；流速1.0ml/min。取5μl混合溶液-1注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱图见图3，其结果显示：结果显示中间体M3峰(出峰时间7.920min)与其对映异构体M3-A峰(出峰时间8.316min)未能完全分离。
2.4优化案例四
在筛选案例三的基础上，除了调整流动相中乙醇比例之外，其它检测条件不变；调整后流动相是体积比为80：20正己烷与无水乙醇(含有体积分数为0.05％三氟乙酸)的混合溶液。取5μl混合溶液-1注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱图见图4，其结果显示：M3峰(出峰时间15.211min)与M3-A峰(保留时间16.320min)未能达到基线分离。
2.5优化案例五
在优化案例四的基础上，除了调整三氟乙酸的用量(由原来体积分数0.05％调整为0.1％)之外，其它检测条件不变。取5μl混合溶液-1注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱图见图5，其结果显示：结果显示M3峰(出峰时间16.949min)与M3-A峰(出峰时间17.949min)未能达到基线分离。
2.6优化案例六
在优化案例五的基础上，除了将三氟乙酸更换为二乙胺之外，其它检测条件不变。取5μl混合溶液-1注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱图见图6，其结果显示：将三氟乙酸更换为二乙胺后，主峰M3与杂质M3-A峰的峰形出现前沿或者拖尾，故二乙胺不可取。因此发明人考虑在优化案例五的基础上继续降低无水乙醇的比例。
2.7优化案例七
在优化案例五的基础上，除了调整流动相中乙醇的比例之外，其它检测条件不变；调整后流动相是体积比为85：15正己烷与无水乙醇(含有体积分数为0.1％三氟乙酸)的混合溶液。取5μl混合溶液-1注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱图见图7，其结果显示：M3峰(出峰时间32.906min)与M3-A峰(出峰时间35.315min)的分离度为1.48且色谱峰的保留时间较长。考虑将三氟乙酸替换为甲酸进行尝试。
2.8优化案例八
在优化案例七的基础上，除了将三氟乙酸更换为甲酸之外，其它检测条件不变。取5μl混合溶液-1注入正相高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱图见图8，其结果显示：将三氟乙酸更换为甲酸后，主峰与杂质峰的峰形均不好且M3峰与M3-A峰无法分离。考虑将甲酸替换为乙酸进行尝试。
2.9优化案例九
在优化案例八的基础上，除了将甲酸更换为乙酸之外，其它检测条件不变。取5μl混合溶液-1注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱图见图9，其结果显示：将甲酸更换为乙酸后，主峰与杂质峰的峰形没有改善，且M3峰与M3-A峰的分离度也没有明显改善。结合优化案例八和优化案例九的试验结果，尝试采用三氟乙酸作为流动相中的改良剂，同时在优化案例七的基础上在流动相中添加乙腈。
2.10优化案例十
在优化案例七的基础上在流动相中加入乙腈，具体色谱条件为：以直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂(DALCELCHIRALPAK
AD-H，规格：250mm×4.6mm，5μm)的色谱柱；以正己烷为流动相A，以无水乙醇-乙腈-三氟乙酸(90：10：0.1)体系为流动相B，将流动相A和B按积比为85：15混合进行等度洗脱；检测波长为295nm；柱温为30℃；流速1.0ml/min。取5μl混合溶液-1注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱图见图10，其结果显示：在流动相中添加乙腈后，M3峰(出峰时间26.486min)与M3-A峰(保留时间28.491min)分离度达到1.52，且M3-A峰与M3-B&C峰(出峰时间30.770min)分离度达到1.67。考虑增加三氟乙酸的量使M3峰与M3-A峰的分离度增加。
2.11优化案例十一
在优化案例十的基础上，除了增加流动相B中三氟乙酸的用量(由原来体积分数0.1％调整为0.5％)之外，其它检测条件不变；调整后流动相B是无水乙醇-乙腈-三氟乙酸(90：10：0.5)体系。取5μl混合溶液-1注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱图见图11，其结果显示：当三氟乙酸的用量增加至0.5％(体积分数)，M3峰(出峰时间28.379min)与M3-A峰(出峰时间30.837min)的分离度增加至1.95，但M3-A峰与M3-B&C峰(出峰时间32.636min)的分离度降低至1.37。考虑继续增加三氟乙酸的量。
2.12优化案例十二
在优化案例十一的基础上，除了增加流动相B中三氟乙酸的用量(由原来体积分数0.5％调整为1％)之外，其它检测条件不变；调整后流动相B是无水乙醇-乙腈-三氟乙酸(90：10：1)体系。取5μl混合溶液-1注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱图见图12，其结果显示：当三氟乙酸的用量增加至1％(体积分数)，主峰与杂质峰的分离度没有明显改善，考虑在优化案例十一的基础上降低乙腈的比例。
2.13优化案例十三
在优化案例十一的基础上，除了降低流动相B中乙腈比例之外，其它检测条件不变；调整后流动相B是无水乙醇-乙腈-三氟乙酸(95：5：0.5)体系。取5μl混合溶液-1注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱图见图13，其结果显示：在优化案例十一的基础上降低乙腈的比例后，M3-A峰(出峰时间35.922min)与M3-B&C峰(出峰时间37.393min)的分离度降低至0.89。考虑在优化案例十一的基础上增加乙腈的比例。
2.14优化案例十四
在优化案例十一的基础上，除了增加流动相B中乙腈比例之外，其它检测条件不变；调整后流动相B是无水乙醇-乙腈(85：15：0.5)体系。取5μl混合溶液-1注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱图见图14，其结果显示：在优化案例十一的基础上增加流动相B中乙腈的比例后，M3峰(出峰时间21.909min)与M3-A峰(出峰时间24.362min)的分离度增加至2.43，M3-A峰与M3-B&C峰(出峰时间26.535min)的分离度增加至1.99且峰形较好，考虑调整洗脱剂的比例和增加柱温考察对出峰的影响。
2.15优化案例十五
在优化案例十一的基础上，调整流动相A与B的比例和升高柱温为35℃之外，其它检测条件不变；调整后流动相是以体积比为80：20正己烷(流动相A)与无水乙醇-乙腈-三氟乙酸(85：15：0.5)体系(流动相B)的混合溶液。取5μl混合溶液-1注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱图见图15，其结果显示：调整流动相A与B的比例和柱温后，杂质个数增加，且M3峰(出峰时间11.779min)与M3-A峰(出峰时间12.822min)的分离度降低至1.95。故发明人考虑使用优化案例十五的流动相比例，在优化案例十四的基础上降低柱温进行尝试。
2.16优化案例十六
在优化案例十五的基础上，除了改变柱温为25℃之外，其它检测条件不变。取5μl混合溶液-1注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱图见图16，其结果显示：结果显示降低柱温后，M3峰(出峰时间12.030min)与M3-A峰(出峰时间13.129min)的分离度为1.88，M3-A峰与M3-B&C峰(出峰时间15.986min)的分离度为4.28，均符合要求。由于发明人尝试用混合溶液-2在该色谱条件下进行分离，但发现M3-A峰与M3-D峰不能分离，因此在此条件的基础上降低流速进行考察。
2.17优化案例十七
在优化案例十六的基础上，除了改变流速为0.8ml/min之外，其它检测条件不变。取5μl混合溶液-2注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱图见图17，其结果显示：M3-A峰与M3-D峰(出峰时间16.388min)一致，同时会影响M3-A的检测。在此条件的基础上降低乙腈和三氟乙酸的量。
2.18优化案例十八
在优化案例十七的基础上，除了降低流动相B中乙腈和三氟乙酸的用量之外，其余检测条件不变；具体流动相B是无水乙醇-乙腈-三氟乙酸(90：10：0.1)体系。取5μl混合溶液-2注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱图见图18，其结果显示：降低流动相B中乙腈和三氟乙酸的用量后，M3-A峰(出峰时间18.922min)和M3-D峰(出峰时间19.599min)已有分离的趋势，但乙腈和三氟乙酸的比例已经相对较低，故下一步考虑降低柱温进行考察。
2.19优化案例十九
在优化案例十八的基础上，除了降低柱温为20℃之外，其余检测条件不变；取5μl混合溶液-2注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱图见图19，其结果显示：M3峰(出峰时间17.271min)与M3-A峰(出峰时间19.049min)的分离度为1.97。继续在此条件的基础上调整洗脱剂的比例。
2.20优化案例二十
在优化案例十九的基础上，除了调整流动相A与B比例之外，其余检测条件不变；具体流动相是以体积比为78：22正己烷(流动相A)与无水乙醇-乙腈-三氟乙酸(90：10：0.1)体系(流动相B)的混合溶液。取5μl混合溶液-2注入正相高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱图见图20，其结果显示：M3峰(出峰时间14.564min)与M3-A峰(出峰时间15.848min)的分离度为1.67。考虑在优化案例十九的基础上增加三氟乙酸的量、降低流速、增加柱温进行考察。
2.21优化案例二十一
在优化案例十九的基础上，除了增加流动相B中三氟乙酸的用量(由原来体积分数0.1％调整为0.3％)、升高柱温为25℃和降低流速为0.7ml/min之外，其余检测条件不变；具体流动相是以体积比为80:20正己烷(流动相A)与无水乙醇-乙腈-三氟乙酸(90：10：0.3)体系(流动相B)的混合溶液。取5μl混合溶液-2注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱图见图21，其结果显示：M3峰(出峰时间21.779min)与M3-A峰(出峰时间23.953min)的分离度为2.18；M3-A峰与M3-D峰(出峰时间25.175min)的分离度为1.21，其他杂质不干扰M3-A的检测。
由于甲氨蝶呤中间体M3供试品实际检测过程中杂质M3-D的含量较低，M3-D峰与M3-A峰能够达到有效分离，色谱图见图22，其结果显示：M3-A(出峰时间22.213min)与M3-D(出峰时间23.529min)的分离度为1.5；混合溶液-2中杂质M3-D的浓度较大，虽然在“优化案例二十一”的色谱条件下测得M3-A与M3-D的分离度为1.21，但该色谱条件已能够满足中间体M3供试品中杂质M3-A的检测要求。
实施例3方法学验证
按照优化案例二十一的色谱条件进一步进行方法专属性、准确度和灵敏度的考察。
3.1专属性
分别取实施例2配制的各个杂质定位溶液和混合溶液-2以及空白溶液甲醇注入高效液相色谱仪，记录色谱图，其结果见表1和图21。
表1各个杂质定位溶液和混合溶液-2各成分出峰时间
名称 M3-F M3-E M3 M3-A M3-D M3-B&C SM3
定位溶液 12.164min 18.806min 21.496min 23.777min 25.022min 28.997min 33.864min
混合溶液 12.073min 19.098min 21.475min 23.659min 24.914min 28.820min 33.724min
结果显示：杂质定位明确，空白溶剂不干扰各个杂质的检测，且单个杂质定位和混合溶液中杂质的保留时间一致；杂质B和杂质C出峰完全重叠但不干扰杂质M3-A的检测。另外，混合溶液-2中异构体M3-A与主峰M3分离度为2.21；M3-A与相邻峰(M3-D)的分离度为1.21，考虑到样品实际检测过程中M3-D的含量较低，因此M3-A峰与M3-D峰的分离度能够符合要求(见图22)。
3.2线性
M3贮备溶液-1：取M3供试品约30mg，精密称定，于100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。
M3-A贮备溶液：取M3-A对照品约30mg，精密称定，于100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。
分别精密量取M3和M3-A贮备溶液适量，用甲醇稀释成一系列浓度的溶液，作为各成分的线性溶液；精密量取M3和M3-A各线性溶液各2μl，按照上述色谱条件进行检测，记录色谱图，以浓度X(mg/ml)对峰面积Y做线性回归，计算回归方程及相关系数。
表2中间体M3和异构体M3-A线性结果
表2结果表明，M3在0.0902μg/ml～60.1600μg/ml和M3-A在0.0899μg/ml～59.9600μg/ml范围内，峰面积与测定的浓度呈良好的线性关系。
3.3准确度
M3贮备溶液-2：取M3供试品约1.0000g，精密称定，置100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。
精密量取M3贮备溶液-2各5ml，分别置不同的50ml量瓶中，再精密量取实施例“3.2线性”的M3-A贮备溶液各1ml、2.5ml、5ml、7.5ml，分别置上述50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。每个浓度的回收溶液平行配制3份，共12份。各精密量取5.0μl进样，记录色谱图。结果见下表：
表3异构体M3-A回收率结果
表3结果表明：异构体M3-A杂质回收率平均值均在95.4％～97.3％(药典规定范围90％～108％)范围内，12份回收率平均值的RSD为0.08％，表明本发明检测方法准确度均良好。
3.4定量限和检测限
精密量取实施例“3.2线性”的M3-A贮备溶液7.5ml于50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；逐级稀释，使M3-A峰高均为基线噪音的10～30倍时为定量限，其作为定量限溶液；使M3-A峰高均为基线噪音的3～10倍时为检测限，其作为检测限溶液。
将定量限和检测限溶液按照上述色谱条件进行检测，记录色谱图。结果见下表：
表4异构体M3-A定量限和检测限结果
名称 定量限(ug/ml) 定量限度(％) 检测限(ug/ml) 检测限度(％)
M3-A 0.0899 0.0090 0.0300 0.0030
表4结果表明，本发明检测方法灵敏度满足检测要求。
3.5精密度
精密称定甲氨蝶呤中间体M3供试品约20mg，置20ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。平行配制12份，其中6份作为重复性溶液，另外6份作为中间精密度溶液。
各精密量取5μl，按照上述色谱条件进行检测，记录色谱图。结果见下表：
表5异构体M3-A精密度结果
表5结果表明，本发明检测方法精密度良好。
在上述色谱条件下，为评价M3对映异构体杂质M3-A含量计算方式，分别采用面积归一化法、自身对照法、外标法进行计算比较，采用面积归一化法计算M3-A的含量为0.45％、采用自身对照法计算M3-A的含量为0.47％、采用外标法计算M3-A的含量为0.45％，三种计算结果基本一致，因此本发明采用面积归一化法计算异构体M3-A的含量。
实施例4中间体M3中异构体杂质M3-A的含量限定考察
以中间体M3作为反应物合成终产物甲氨蝶呤。其中，中间体M3中异构体杂质M3-A的含量为3.02％，其在合成过程中转化为杂质F，通过测定终产物甲氨蝶呤样品中杂质F的含量，确定中间体M3中异构体杂质M3-A的含量限度。
合成方法如下：将10g2,4-二氨基-6-溴甲基蝶啶、20g中间体M3加入120g盐酸溶液中(6mol/L)，氮气保护下，于60～65℃搅拌反应2h，过滤，乙醇洗涤得到粗品。将上述粗品加入50mL水中，滴加入10％氢氧化钠溶液至溶清，加入活性炭脱色过滤，取滤液滴加稀盐酸调节pH至4，过滤，乙醇洗涤，真空干燥，得到甲氨蝶呤。
用欧洲药典的方法检测上述制备方法得到的甲氨蝶呤中杂质F的含量为2.39％(图23)。
根据欧洲药典规定，杂质F的限度均不得过3％，可见，将中间体M3对映异构体杂质M3-A的含量控制在3.0％以下时，能够确保终产物甲氨蝶呤中杂质F的含量符合标准要求。

Claims (8)

1.一种高效液相色谱法测定(S)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸或其盐中所含R型异构体或R型异构体盐的检测方法，其特征在于，所述的高效液相色谱法采用直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂的色谱柱，流动相是流动相A正己烷与流动相B无水乙醇-乙腈-三氟乙酸体系的混合溶剂，其中流动相A与B按体积比为(78：22)～
(85：15)进行等度洗脱，所述直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂的色谱柱为DALCEL AD-H，规格为250mm×4.6mm，5μm，所述流动相B中无水乙醇与乙腈体积比为90：10，三氟乙酸体积分数为0.1％～0.5％，流动相流速为0.7～0.8mL/min，柱温为20～25℃，样量为5μl；检测波长为295nm。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述三氟乙酸体积分数为0.3％。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相A与流动相B体积比为(78：22)～(80：20)。
4.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相A与流动相B体积比为80：20。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，流动相流速为0.7mL/min。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，柱温为25℃。
7.根据权利要求1～6任意一项所述的检测方法，其特征在于：所述(S)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸的盐和/或所述R型异构体的盐为二钠盐。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述的检测为定性和/或定量检测；所述的定量检测是以面积归一化法计算(S)-2-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)戊二酸或其盐供试品溶液中所含R型异构体的含量。
CN202310413973.7A 2023-04-18 2023-04-18 高效液相色谱法检测甲氨蝶呤中间体及其对映异构体的方法 Active CN116183778B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310413973.7A CN116183778B (zh) 2023-04-18 2023-04-18 高效液相色谱法检测甲氨蝶呤中间体及其对映异构体的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310413973.7A CN116183778B (zh) 2023-04-18 2023-04-18 高效液相色谱法检测甲氨蝶呤中间体及其对映异构体的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116183778A CN116183778A (zh) 2023-05-30
CN116183778B true CN116183778B (zh) 2025-05-02

Family

ID=86449157

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310413973.7A Active CN116183778B (zh) 2023-04-18 2023-04-18 高效液相色谱法检测甲氨蝶呤中间体及其对映异构体的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116183778B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116768749B (zh) * 2023-06-21 2025-06-03 重庆药友制药有限责任公司 一种甲氨蝶呤中间体的精制方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3057991B8 (en) * 2013-10-15 2019-09-04 The Scripps Research Institute Chimeric antigen receptor t cell switches and uses thereof
CN114660183A (zh) * 2020-12-22 2022-06-24 重庆药友制药有限责任公司 一种分离测定l-丙氨酸异丙酯盐酸盐对映异构体的高效液相色谱分析方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Methotrexate determination in pharmaceuticals by enantioselective HPLC;D. Abd El-Hady等;《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》;20041118;919-925 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116183778A (zh) 2023-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111983113B (zh) 一种检测依折麦布辛伐他汀片中6-氧代辛伐他汀含量的方法
CN116183778B (zh) 高效液相色谱法检测甲氨蝶呤中间体及其对映异构体的方法
CN112903838A (zh) 法维拉韦中有关物质的测定方法
CN112649524A (zh) 分离检测叶酸中叶酸及叶酸光学异构体的方法
CN114624339A (zh) 一种测定吲哚布芬杂质的分析方法
CN113049687B (zh) 一种盐酸氨溴索原料和注射液有关物质的检测方法
CN111007158B (zh) 一种分离测定克唑替尼制备过程中有关物质的方法
CN114354810A (zh) 克林霉素磷酸酯中杂质n的检测方法、及杂质的分离方法
CN117647607B (zh) 一种同时测定5-(2-氟苯基)-1h-吡咯-3-甲醛中有关物质的hplc检测方法
CN110606846A (zh) 一种枸橼酸托法替布杂质及其分析方法和应用
CN110988163A (zh) 一种hplc法分离测定盐酸左西替利嗪及其基因毒性杂质e的方法
CN113358790B (zh) 一种尼麦角林及其制剂中有关物质的检测方法
CN111624276B (zh) 同时检测盐酸法舒地尔中基因毒性杂质5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯的方法
CN114594168A (zh) 一种吲哚布芬杂质的检测方法
CN114002352A (zh) 叶酸与其光学异构体的分离检测方法
CN114689767A (zh) 一种阿立哌唑原料及其制剂有关物质的检测方法
CN113504317A (zh) 阿哌沙班中基因毒性杂质的检测方法和应用
CN115856141B (zh) Hplc分离测定替尼类关键中间体及其相关杂质的方法
CN110940751A (zh) 一种泰地罗新原料药及其制剂中有关物质的检测方法
CN114062567B (zh) (1r,2s)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺盐酸盐及其有关物质的分离检测方法
CN110850012B (zh) 一种1-(2,3-二氯苯基)哌嗪盐酸盐及其有关物质的检测方法
CN116930363B (zh) 恩扎卢胺sm1及相关杂质的分离、鉴别及定量检测方法
CN116930370B (zh) 一种测定对乙酰氨基酚中对氯苯胺的方法
CN107091895B (zh) 采用hplc分离测定利奥西呱原料药中有关物质的方法
CN114544845A (zh) 一种盐酸达泊西汀中r异构体的测定方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant