CN116179494A - 低成瘤性的mdck细胞株及其构建方法和应用 - Google Patents

低成瘤性的mdck细胞株及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供低成瘤性MDCK细胞株及其构建方法和应用。本发明自噬相关基因敲除的MDCK细胞株通过CRISPR Cas9基因编辑系统敲除lc3基因或者sqstm1基因，整体上获得了低成瘤性的细胞株，应用安全性更高。

Description

低成瘤性的MDCK细胞株及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及细胞应用技术领域，具体涉及低成瘤性MDCK细胞株及其构建方法和应用。
背景技术
成瘤性是指基质细胞在动物体内形成肿瘤的特性。《中国药典》规定新建细胞系/株及新型细胞基质应进行成瘤性检查。因此用于疫苗生产的细胞系都应进行成瘤性检查，而对已经进行过成瘤性检查的细胞，若其进行过基因方面的改造，则也同样应该检查成瘤性。目前，已证明具有成瘤性的常用细胞有CHO、BHK21、MDCK等细胞。
其中，MDCK细胞是正常犬肾来源的传代细胞，其是由Madin和Darby从考克斯班尼犬的肾脏组织中分离培养获得，此类肾脏细胞在原代培养时形态类似成纤维细胞。目前，MDCK细胞常用于病毒的扩增、纯化和检测，被认为是最适用于病毒疫苗生产的细胞系之一，因此有必要探究构建具有低成瘤性的MDCK细胞株。
发明内容
基于此，有必要提供低成瘤性MDCK细胞株及其构建方法和应用，通过基因编辑敲除MDCK细胞株中的自噬相关基因获得低成瘤性的细胞株，应用安全性更好。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种低成瘤性MDCK细胞株，所述MDCK细胞株的自噬相关基因被敲除。
所述低成瘤性MDCK细胞株为MDCK-lc3KO细胞株，于2022年9月9日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：武汉大学，请求保藏的培养物培养物分类命名为：基因缺失的犬肾细胞MDCK-lc3KO，保藏编号为CCTCC NO:C2022288。
所述低成瘤性MDCK细胞株为MDCK-sqstm1KO细胞株，于2022年9月9日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：武汉大学，请求保藏的培养物分类命名为：基因缺失的犬肾细胞MDCK-sqstm1KO，保藏编号为CCTCC NO:C2022289。
本发明还提供低成瘤性MDCK细胞株的构建方法，包括如下步骤：采用CRISPR Cas9基因编辑系统来敲除MDCK细胞中的自噬相关基因；验证自噬相关基因敲除的MDCK细胞株的成瘤性。
在其中一些实施例中，所述自噬相关基因为lc3基因，针对lc3基因靶点序列为：GCCGGTCCGAGGGCATCGCG。基于CRISPR Cas9基因编辑系统来敲除lc3基因的gRNA序列如SEQID NO:1、SEQ ID NO:2所示。针对lc3基因敲除所构建的载体采用的5’同源臂和3’同源臂的序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
在其中一些实施例中，所述自噬相关基因为sqstm1基因，针对sqstm1基因靶点序列为：CCATGCGCTCAGGAGGCACC。基于CRISPR Cas9基因编辑系统来敲除sqstm1基因的gRNA序列如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示。针对sqstm1基因敲除所构建的载体采用的5’同源臂和3’同源臂的序列如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示。
上述低成瘤性MDCK细胞株可以在培养病毒、制备病毒疫苗中进行应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用CRISPR-Cas9基因编辑方法，成功得到了自噬相关基因敲除的MDCK-lc3-KO和MDCK-sqstm1-KO细胞株，并且经验证MDCK-lc3-KO和MDCK-sqstm1-KO细胞株的成瘤性较原始MDCK细胞显著降低，应用更安全。
附图说明
图1为pX330以及pY75质粒图谱(a：pX330，b：pY75)。
图2为lc3-KO5'同源臂连接及菌液PCR核酸电泳。
图3为lc3-KO 3'同源臂连接及菌液PCR核酸电泳。
图4为MDCK细胞和MDCK-lc3 KO细胞Q-PCR结果。
图5为sqstm1-KO5'同源臂连接及菌液PCR核酸电泳。
图6为sqstm1-KO3'同源臂连接及菌液PCR核酸电泳。
图7为MDCK细胞和MDCK-sqstm1 KO细胞Q-PCR实验结果。
图8为MDCK-lc3 KO和MDCK-sqstm1KO基因组定位PCR验证。
图9为三种细胞的生长曲线对比图。
图10为MDCK细胞和MDCK-lc3 KO细胞在lc3上表达差异对比。
图11为MDCK细胞和MDCK-sqstm1KO细胞在sqstm1上表达差异对比。
图12为三种细胞平板克隆形成实验镜下及结晶紫染色对比。
图13为三种细胞平板克隆平均克隆数统计对比。
图14为三种细胞的软琼脂克隆形成实验第10天克隆形成镜下图。
图15为三种细胞软琼脂克隆平均克隆数对比。
图16为三种细胞107/只接种裸鼠4月后平均瘤体面积体重比。
图17为裸鼠接种细胞后4个月重要器官组织病理切片结果(20X)。
图18为裸鼠接种细胞后4个月主要免疫相关器官组织以及瘤体的病理切片结果(20X)。
上述部分图中统计差异的显示：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns无显著差异。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明的技术构思在于采用CRISPR-Cas9基因编辑方法敲除MDCK细胞中的自噬相关基因，获得成瘤性更低的细胞株，提升应用安全性。具体举例如下：
部分试验材料来源说明：
MDCK细胞：ATCC引进，MDCK CCL-34，P57。本申请实验初始使用MDCK细胞为：原始MDCK细胞经传代培养至P72代次的MDCK细胞。
动物：Balb/C裸鼠：4-5周龄雌性，采购自维通利华公司。
主要试剂：VP-SFM培养基购于Gibco公司，货号：12559019；胎牛血清购于Gibco公司，货号：16140071；酶切酶连实验的工具酶均购自NEB公司，质粒、DNA、RNA提取试剂盒均购自Takara公司。
实施例1
本实施例构建lc3基因缺失的MDCK-lc3KO细胞株，其构建过程包括如下步骤：
S1，设计并评估gRNA序列：
从NCBI下载lc3的基因序列(基因ID：477201)，针对lc3基因中的Exon1和Exon4序列设计gRNA。依据据网页评估进行gRNA初步筛选，得到针对Exon1、Exon4的各三对gRNA，进行脱靶位点off-target评估，具体评估结果如下表：
lc3-KO的gRNA脱靶性评估
Figure SMS_1
根据上表设计2对gRNA序列(均在Exon1上)：
Exon1-gRNA1：
5'-CACCGCCGGTCCGAGGGCATCGCG-3'(SEQ ID NO.1)
3'-CGGCCAGGCTCCCGTAGCGCAAA-5'(SEQ ID NO.2)。
Exon1-gRNA2：
5'-CACCGCGCGATGCCCTCGGACCGGC-3'(SEQ ID NO.3)。
3'-CGCGTACGGGAGCCTGGCCGCAAA-5'(SEQ ID NO.4)。
将两对gRNA进行NCBI-blast定位验证：
Exon1-gRNA1定位chromosome24，24363399 to 24363318，Blast匹配率100％。
Exon1-gRNA2定位chromosome24，24363182 to 24363201，Blast匹配率100％。
表明两对gRNA序列均有望100％定位于靶基因的目标位置。
选取Exon1-gRNA1作为实验gRNA序列进行实验，lc3靶序列为GCCGGTCCGAGGGCATCGCG。
S2，构建gRNA载体质粒及测序验证：
将Exon1-gRNA1双链通过BbsI双酶切连接到pX330质粒(gRNA载体质粒：pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9，购自淼灵生物公司，图谱见图1中的a)的gRNA骨架的5’端。
gRNA载体质粒构建后设计Exon1-gRNA1相关测序引物为：
gRNA forward primer：GGCCTATTTCCCATGATTCC(SEQ ID NO.5)。
gRNA reverse primer：CTTGATGTACTGCCAAGTGG(SEQ ID NO.6)。
进行质粒PCR产物测序，8个PCR纯化产物中，经测序7个可完全匹配。
S3，构建同源臂载体质粒及测序验证：
选择在gRNA对应的基因序列上距离gRNA结合位置5’和3’两端距离100bp～120bp左右分别设计一段长约1200bp～1500bp的序列作为5’端的同源臂序列和3’端的同源臂序列。
具体同源臂序列如下：
5’端的同源臂序列：
Ttgaactgattgccctctccagtcttaccagttgtgtcctttcttgttttgtactccacagattaaccgtcactgttcatgttccactgtgttttagatctactcacatgtttgccagttgagttgctcaccatttttctatcttctctttggagttctgcaaattcattacaaagtgccaaaatgctacttttatttatcccgctttggattttatgtgagaatcctggtctttaatgaagtttgtaagctcttcttcaggtactgcctctcccattttttttctctccttctggaattctgattgggcctgtgataggactgaagtgagaagactcacttcctcttttacattgcccatcacctagtttctctggtgagttgcttctgatctattttccagttcagtggcttatcttctatatctaatctacttttttgtctcatcctttgagacctgaatttcaatagtttttctaattctagaaattccttctaaaacctgtgttcctttttagtgtcttgctctttcatgttttaatcccctcaccctagcttttttttctctaatcatgagctccacgaaggcgagaaggtctttgggttcactgttgtcacccccggtgcctcgcaccgttgctggaacagaacagactccgagtgtcctatgggatgacttggcaccagtgggaacggaaagatgccgatctggggactggctctggctcccgctcgctctcgggctctcgggctctcgggctgcgggagccgagaggtggctcaaccccggcttcggggagagggggcggcagcccatgacatcaccggactgtgacgtgcccaggaagccccgccccttcgcggcccagaccgggaatccagctctgtcccgtgacgtcacgggtccgggcgggagggttttgcgtcggcccaatgggagtggcgcgccggcctcccctttaaggaatgttgtgacctgacgt(5’-3’序列)(SEQ ID NO.7)。
3’端的同源臂序列：
taaggaggtgcagcagatccgcgaccagcaccccagcaagatcccggtgagtcccgccaccccccatccccgcggccccaggccccgccgggctcacgcatcccccgccccacccctaggtgatcatcgagcgctacaagggtgagaaacagctgcctgtcctggacaagaccaagttcctggtcccagaccatgtcaacatgagcgagttggtcaagattatccggtgtgtgggcagcagcagtcagaaggggcttgggtccttctgggggagggcgaggccccagcaggccgggcctggccttaaatctctgttctggagaggttgggatagtcaaggtcagggctgggatcagtgtcaggtcagaggtgagggctcctagaaggggctgggatgggtgtgaagccacctcaatcctttggggggaagaggggtgtagggctccacccacccaggagccaggtcccctcatactggcttgctcttctgcccaccccaggcgccgcctgcagctgaaccccacgcaggccttcttcctgctggtgaaccagcacagcatggtgagcgtgtccacacccatcgcggacatctatgagcaggagaaggatgatgatggcttcctctacatggtctacgcctcccaggaaaccttcggcttctgagccagcagtagggggggtggttggcctgggagtgggggggtgccctgtcaggctctgcccagggaactcctggctcctgaactgaactgctctgcccgggctgggctgggcagggatgctggccccctagccagggggcaccaactgcacctactctgcccctgggtggatcctgggccagtcattgttagggatgccctcctgggtgctggctgggatgggggagggtggggaacagcccccagcactcttgctcgtgtga(5’-3’序列)(SEQ ID NO.8)。
设计同源臂引物，包括同源臂引物以及保护碱基，具体如下表所示：
lc3-KO的同源臂引物设计
Figure SMS_2
按照图2中的a所示进行酶切酶连反应，利用同源臂载体质粒pY75(同源臂载体质粒：pUC57-puro，即由淼灵生物公司购入的pUC57质粒通过EcoRI和BamHI双酶切酶连导入loxP-PGK-Puro-SV40pA-loxP片段构建而来，图谱如图1中的b)构建含有5'同源臂的同源臂载体质粒pY75+5’同源臂。
通过转化摇菌、质粒小提得到pY75+5'同源臂的质粒，菌液PCR和酶切验证如图2中的b所示：释放1500bp条带为阳性，而释放500bp左右条带则为阴性，得到所有的16个菌样PCR结果显示均为阳性，经测序完全匹配。
在上述质粒基础上按照以下继续进行酶切酶连反应，酶切连接如图3中的a所示，构建含有3'同源臂的pY75+5’同源臂+3’同源臂质粒。菌液PCR结果如图3中的b所示:释放1230bp条带为阳性，而240bp左右条带则为阴性，得到所有的16个菌样PCR中14个显示阳性结果，经测序完全匹配。
S4，MDCK细胞转染及单克隆细胞筛选与DNA水平鉴定：
细胞转染：首先将清洗后的电转杯置于无水乙醇中浸泡6-8h。电转前，将电转杯置于紫外下1h，无菌条件下风干1h，使电转杯中残留的乙醇充分挥发，4℃无菌保存备用。在6孔细胞培养板中加入VP-SFM完全培养基(购于Gibco公司，货号：12559019)2mL/孔，为了避免质粒带来的污染，在每孔中加入1:1000双抗，放入37℃孵箱中预热备用。用VP-SFM无血清培养基按照每个电转体系中细胞总量为1×106/mL，体系体积为0.2mL重悬细胞后，向其中加入gRNA载体质粒以及同源臂载体质粒各8μg/体系，细胞悬液吹打混匀备用。设置电转电压强度，脉冲宽度以及脉冲次数为110v、25ms、单脉冲，取0.2mL细胞悬液轻轻加入电转杯两个电极片中间的凹槽中，盖上电转杯，打开电源，开始电转。电转脉冲程序完成后，每次在凹槽中吸取180μL电转后的细胞悬液平均加入六孔板中的三个孔，每孔60μL，轻轻吹打将培养板中的细胞混匀，置于37℃孵箱培养。
单克隆细胞筛选步骤：首先确认杀灭MDCK细胞的最低嘌呤霉浓度为6μg/mL，以此浓度进行嘌呤霉素初筛，并采用极限释法单克隆细胞再筛，之后进行单克隆细胞的鉴定。其中，嘌呤霉素细胞初筛的步骤为：电转完成后密切观察细胞生长状况，由于电转时细胞表面电穿孔导致部分细胞逐渐死亡，第二天六孔板镜下观察可发现部分细胞凋亡漂浮，贴壁细胞长至60％汇合度时需要换液。六孔板中每2-3天换一次液，镜下观察可发现绝大部分细胞会逐渐停止生长脱落。有嘌呤霉素抗性的细胞大约可在第5-7天镜下观察到单个细胞或2-3个细胞形成小细胞团，继续筛选培养镜下可见细胞克隆数量逐渐增加。
极限释法单克隆细胞再筛的步骤为：当细胞培养7-10天后，观察六孔板中出现单克隆细胞长成细胞团，计数单个细胞孔中等单克隆细胞团的数目，弃去培养基，将其充分消化。将消化后的细胞悬液进行细胞计数，计算细胞总量后进行极限稀释至96孔板。极限稀释后每天密切观察单克隆细胞生长状况，4-5天后镜下观察，标记仅含有单个单克隆细胞团的孔。一般单克隆细胞在培养10-14天可长满96孔板的细胞孔，当细胞长满后，依次扩增至24孔板、6孔板、T25，适时提取细胞基因组进行PCR鉴定。
单克隆细胞鉴定的步骤为：细胞消化后提取MDCK细胞基因组，分别设计两对引物来对单克隆细胞进行鉴定：首先分别在靶基因的5’同源臂和3’同源臂位置设计上下游引物(或是在5’同源臂的上游以及3’同源臂的下游设计引物)，且其引物的结合位置应和gRNA结合位点的距离大于100bp以上，此法设计的全长PCR可同时鉴别阴性、单等位基因敲除和双等位基因敲除的不同种类单克隆；其次，分别在5’同源臂序列和嘌呤霉素抗性基因序列或是抗性基因序列和3’同源臂序列上分别设计两组上下游引物，这样设计的定位PCR用来进一步确认克隆的位置，以排除细胞中残留质粒以及脱靶位点的干扰，由于全长PCR片段太长，PCR难以得到结果，因此以定位PCR为主。PCR反应体系应采用高保真酶PCR体系，可用于后续的PCR产物测序以及PCR产物电泳分析。
经试验研究发现：有嘌呤霉素抗性的细胞大约可在第5～7天镜下观察到单个细胞或2-3个细胞形成小细胞团，继续筛选培养镜下可见细胞克隆数量逐渐增加。当细胞培养7-10天后，观察六孔板中出现单克隆细胞长成的细胞团，将其消化后计数，极限稀释至96孔板，5天后镜下观察，保留仅含单个单克隆细胞团的孔。2周可长满96孔板的细胞孔，传代至24孔板进行扩大培养，依次扩增至两个6孔板，一份继续培养保种，另一份提细胞基因组进行PCR鉴定：将6孔板中生长的单克隆细胞极限稀释后，选择96孔板中生长状态比较好的两个细胞孔(lc3-1、lc3-4)进行提取基因组定位PCR验证，可通过核酸电泳条带显示鉴定其基因编辑的确切位置，若仅仅出现脱靶的情况则不会出现条带。
S5，Q-PCR验证基因敲除：
Q-PCR结果测试如图4所示，结果显示：相较于MDCK细胞，MDCK-lc3KO细胞lc3的转录水平有显著降低(p<0.05)。
实施例2
参考实施例1的构建方法，本实施例构建sqstm1基因缺失的MDCK-sqstm1KO细胞株，其构建过程包括如下步骤：
S1，设计并评估gRNA序列：
从NCBI下载sqstm1的基因序列(基因ID：481459)，针对sqstm1基因中的Exon2序列设计gRNA。依据据网页评估进行gRNA初步筛选，得到Exon2的5对gRNA进行脱靶位点off-target评估，具体评估结果如下表：
sqstm1-KO的gRNA脱靶性评估
Figure SMS_3
Figure SMS_4
根据上表设计2对gRNA序列(均在Exon2上)：
gRNA2-1：
5'-CACCGCCATGCGCTCAGGAGGCACC-3'(SEQ ID NO.13)。
3'-CGGTACGCGAGTCCTCCGTGGCAAA-5'(SEQ ID NO.14)。
gRNA2-2：
5'-CACCGCAAGATGCGCTCGGTTCAGC-3'(SEQ ID NO.15)。
3'-CGTTCTACGCGAGCCAAGTCGCAAA-5'(SEQ ID NO.16)。
将两对gRNA进行NCBI-blast定位验证：
gRNA2-1定位chromosome11，1834675to 1834694，Blast匹配率100％。
gRNA2-2定位chromosome11，1835112to 1835131，Blast匹配率100％。
表明两对gRNA序列均100％定位于靶基因的目标位置。
选取gRNA2-1作为实验gRNA序列进行下列实验，sqstm1靶序列为CAAGATGCGCTCGGTTCAGC。
S2，构建gRNA载体质粒及测序验证：
将gRNA2-1双链通过BbsI双酶切连接到pX330质粒的gRNA骨架的5’端。
gRNA载体质粒构建后设计gRNA2-1相关测序引物为：
gRNA forward primer：GGCCTATTTCCCATGATTCC(SEQ ID NO.17)。
gRNA reverse primer：CTTGATGTACTGCCAAGTGG(SEQ ID NO.18)。
进行质粒PCR产物测序，8个PCR纯化产物均可以完全匹配。
S3，构建同源臂载体质粒及测序验证：
选择在gRNA对应的基因序列上距离gRNA结合位置5’和3’两端距离100bp左右分别设计一段长约1.2kbp的序列作为5’端的同源臂序列和3’端的同源臂序列。具体同源臂序列如下：
5’端的同源臂序列：
cggaattctatcacgttctgacactgccattgttcttatggtggctgtttttatggtggctattgcatccagtggcccacagagctggttcagcctgcatggtggtactttaacatcctttgctaaatctacaattaaaaatcaaagagtatatatgaatactttagcttcgttgggggcagatgtactcatctgcttgattctcctaaaccacaggaggcccaaggcctttggaggggtcataggtgaggatctcctacagttgaagatgggtctgggcccaggcctgatcagatgtgcatggaggtggcagctggctcagaggcagagtggcaggaagccagttgcccctgcacaaacatgctctgtgtcctctgggtgcccagggcccaacttggaggacttaacttgtaggcagtggcacaatgaacaggcaatctggcctcagccctgctgcccactggctcacgcaggtgtgcttcggttcctaggcccgtggatacccttctagcacttttcagtagcttgtgtcccacagagaaaccttgggtgctcacgtgctgtcttttaaataatctagatgaggatggagacttggttgccttttccagtgatgaagaactgacaatggcaatgtcctatgtgaaggatgacatcttccgcatttacattaaaggtaaaggtctgatttgggtgctgcctgaagctggatgcttcttgctgagtaagacctgttttgaggttttggagaaatcccttcaaagtagtggagaagaacctgggagtggtttaagacagaatcacctctgtgcttggcctgagaaaggaatcccaacgaccacaaggggtggggcctgaggatctctgggttctctcttgattgtgcccagactaagggggtaggagggggcagctttggggataccatgggggtttattttaacacggggcagggccaaagctgtacagacacagctccctgctgcttgtcacttggcctgggccacatgtacctggataacaggcacgggactgggaccctcccagcaggttcttgggtccctttgttgctgtccctccaatggctgagttctgcatgatatccg(5’-3’序列)(SEQ ID NO.19)。
3’端的同源臂序列：
Gcgtcgactgttctggtgtcactctacccctctgctacctcctctctagggcttttctcatagccgctggctccgaaagctgaaacacgggcactttgggtggcctggctgggagatgggtccaccagggaactggagcccgcgtcctccccgggctggggatgcccgccctggccctgcggcagaatcaggtgaggcttgcatttgtgggctactgtggcgggagctgtcagggctgggagagctggagggcctttcccatgttctgcgtggctgctgagcctgtggctggggggggggcggggcgcttaatcctcagccttgcaaagtggggagtgtcctcttcattttgcacacaggacatggaggctcctgatggcccatggccactgattcacctacactagatttagactcggcccagtcctaaaccacaccccatcttgtcaagcctttttatttatttattttttttaagtaagctttatatctagctgggagcttgaacccacgaccctgagatcaagcattgtatgttctactgattgagccagcagggcatcctgctgaaatatttttaagcgtattcacagagttaaacacttaacatataacttgtgtttcagaattttagattctggttttattctaaatttattatttttctgttcctctggtttaccttgttctttggaaccaaggtgaggaggtttgtttgtttgatatttgacatctgagctagaatggggtccatatttcataccccatgcagtgaatcccccccggcttctgaacagcagtgtcacagagcagcccagaatggtggcgatggaggggcagggtcccagggatggatggcccctgtgatgaaggtgatgtggatcccg(5’-3’序列)(SEQ IDNO.20)。
同源臂引物设计包括同源臂引物以及保护碱基，具体如下表所示：
sqstm1-KO的同源臂引物设计
Figure SMS_5
Figure SMS_6
按照图5中的a所示进行酶切酶连反应，构建含有5'同源臂的同源臂载体质粒pY75+5’同源臂。
通过转化摇菌、质粒小提得到pY75+5'同源臂的质粒，菌液PCR和酶切验证如图5中的b所示：释放1400bp条带为阳性，而释放400bp左右条带则为阴性，得到所有的15个菌样PCR结果显示出14个阳性条带，阳性样本经测序完全匹配。
在上述质粒基础上按照以下继续进行酶切酶连反应，酶切连接如图6中的a所示，构建含有3'同源臂的pY75+5’同源臂+3’同源臂质粒，菌液PCR结果如图6中的b所示:释放1250bp条带为阳性，而255bp左右条带则为阴性，所有的15个菌样均为阳性，经测序完全匹配。
S4，MDCK细胞转染及单克隆细胞筛选与DNA水平鉴定：
按照lc3基因敲除的相关实验方案进行MDCK细胞转染及单克隆细胞筛选，在sqstm1敲除的细胞筛选中，极限稀释后在96孔板中一周之内筛选出了3个样孔，编号sq-1、sq-2、sq-3，选取生长状态较好的sq-1细胞提取基因组进行验证。
采用定位PCR将两个引物分别设计在嘌呤霉素抗性序列以及5'同源臂上游或者嘌呤霉素抗性序列以及3'同源臂下游。针对性敲除MDCK细胞中的sqstm1和LC3基因获得的MDCK细胞单克隆细胞样(lc3-1和sq-1)的5’和3’定位PCR验证，结果见图8(a：5’定位PCR验证其中第1、9泳道为lc3-1和sq-1。b：3’定位PCR验证其中6、7泳道为lc3-1和sq-1)。核酸电泳显示均为阳性条带，进一步，将上述获得的MDCK单克隆细胞样(lc3-1和sq-1)PCR产物纯化后测序，结果显示：
lc3-1样品和sq-1样品的5’和3’定位PCR产物测序均可正确匹配(单个碱基的突变或缺失可认为是细胞基因自身的突变所致，对实验结果无影响)
且lc3-1细胞为纯合突变株(MDCK-lc3-/-P80)，sq-1细胞也为纯合突变株(MDCK-sqstm1-/-P79)。
S5，Q-PCR验证基因敲除结果
Q-PCR结果测试如图7所示，结果显示：相较于MDCK细胞，MDCK-sqstm1KO细胞中sqstm1的转录水平有显著降低(p<0.05)。
进一步针对MDCK-lc3-/-、MDCK-sqstm1-/-细胞基因组进行二代测序分析，结果见下表：
MDCK-lc3-/-、MDCK-sqstm1-/-细胞基因组二代测序分析结果
Figure SMS_7
Figure SMS_8
经比对两组细胞中的插入的大片段均与实验中插入的puro序列匹配，证明基因组水平在目的位点成功插入puro序列。
为了验证基因敲除MDCK-lc3-/-(KO)细胞和MDCK-sqstm1-/-(KO)细胞相较于MDCK细胞中lc3、sqstm1的转录水平，将MDCK-lc3-/-细胞、MDCK-sqstm1-/-细胞与原始细胞MDCK进行了转录组送样测序，三种细胞各送检了3个样本(分别命名为MDCK-normal1、2、3和MDCK-lc1、2、3以及MDCK-sq1、2、3)。
如图10和11的转录组测序结果显示：相较于MDCK细胞，MDCK-lc3-/-细胞中lc3的表达水平显著降低(p<0.05)，MDCK-sqstm1-/-细胞中sqstm1的表达水平也显著降低(p<0.05)。
实施例3绘制细胞MDCK(P72)、MDCK-lc3-/-(P81)、MDCK-sqstm1-/-(P80)的生长曲线
获得以上的单克隆细胞后，将其扩大传代后进行生长曲线的测定以及对比(注：此时细胞代次较原始单克隆细胞高一代，此后的一系列验证实验均在此代次开始进行)：
从T细胞培养瓶中将细胞消化后稀释，取细胞悬液进行计数后，根据计数结果，将细胞悬液稀释至浓度为1×106/mL，将稀释好的细胞悬液接种于T细胞瓶中，然后将T细胞瓶放置于37℃孵箱中，每隔24h进行计数，连续计数7天；根据每天的细胞计数记录，以小时(h)为横坐标，以细胞密度(×106/mL)为纵坐标，进行细胞生长曲线的绘制，如图9所示。
图9展示了三种细胞在7d内细胞生长状况：MDCK细胞的倍增时间为24h，达到平台期时间为62h，平台期活细胞平均密度为6.3×105/mL。MDCK-lc3-/-细胞倍增时间为32h，达到平台期的时间为54h，平台期活细胞平均密度为4.7×105/mL。MDCK-sqstm1-/-细胞倍增时间为40h，达到平台期的时间为55h，平台期活细胞平均密度为4.2×105/mL。
实施例4细胞平板克隆形成实验
细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞并不都可增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞则可判定为在贴壁状态下具有一定增殖活力的细胞。克隆形成率反映了细胞群体的依赖性和细胞增殖能力两个重要功能。试验方法步骤如下：
S1，取对数生长期的各组细胞(MDCK、MDCK-lc3-/-、MDCK-sqstm1-/-)，分别用胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞重悬在5％胎牛血清的VP-SFM培养液中备用。
S2，将细胞悬液稀释成1×103/mL的浓度，在六孔板中每孔分别加入2mL。置于37℃、5％CO2的孵箱中培养1-2周。
S3，每隔12h观察细胞生长状况，当六孔板中出现肉眼可见的细胞克隆后，在继续培养2-3天，观察细胞克隆长成小型细胞团(＜50个)时，避免细胞克隆连成一片，此时弃去上清液，用PBS缓冲液小心清洗2次。弃去固定液，加适量1％结晶紫染色液染10～20分钟，然后用流水缓慢洗去结晶紫染色液，放在室温晾干，拍照记录。
S4、将细胞六孔板置于显微镜下计大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率：
克隆形成率＝(平均克隆数/接种总细胞数)×100％
本实施例将MDCK(P72)、MDCK-lc3-/-(P81)、MDCK-sqstm1-/-(P80)三者按照上述实验方法中的细胞平板克隆形成实验进行操作，一周后观察到三组细胞的六孔板中均出现了明显的细胞团，镜下及结晶紫染色如图12。
通过图12可观察到MDCK(P72)、MDCK-lc3-/-(P81)、MDCK-sqstm1-/-(P80)三种细胞在一周内均形成了明显的细胞团。但是由于MDCK细胞株生长过快，细胞团间部分已经汇合，计算三者的克隆形成率时，将六孔板中每个样孔分为22个视野，通过计数计算6个样孔共132个视野的平均克隆数，统计结果见图13。
根据平均克隆数计算出其平均克隆形成率，计算三者的克隆形成率：
MDCK细胞株：克隆形成率＝(22×71.13)/2000×100％＝78.29％
MDCK-lc3-/-细胞株：克隆形成率＝(22×42.81)/2000×100％＝47.09％
MDCK-sqstm1-/-细胞株：克隆形成率＝(22×27.06)/2000×100％＝29.77％
通过以上的平板实验克隆形成率的对比，发现：上述三种细胞在平均克隆数以及克隆形成率均有显著性差异(P<0.01)。
实施例5细胞软琼脂克隆形成实验
将MDCK(P72)、MDCK-lc3-/-(P81)、MDCK-sqstm1-/-(P80)三种细胞进行细胞软琼脂克隆形成实验测试，步骤如下：
1)将对数生长期的细胞用0.1％胰酶进行消化，离心后收集细胞沉淀用VP-SFM完全培养基进行重悬。
2)将得到的细胞悬液进行适当稀释后计算活细胞数目，然后调整细胞密度至1×103/mL，放入37℃中孵育保温待用。
3)底层琼脂的制备：首先配制1.3％的琼脂高温高压灭菌后取出，将其取出6mL置于无菌水浴中温度设置为42℃时孵育待用，将VP-SFM完全培养基取出6mL置于10mL离心管中，放置于37℃孵箱中孵育半小时，将二者取出立即混合，稍稍吹匀后迅速加入六孔板中，每孔2mL，室温下凝固。
4)上层琼脂的制备：首先配制0.8％的琼脂高温高压灭菌后取出，将其取出6mL置于无菌水浴中温度设置为42℃时孵育待用，将第二步中的细胞悬液吹打混匀后(防止细胞形成沉淀)取出6mL，将二者取出立即混合，稍稍吹匀后迅速加入六孔板中，每孔2mL，室温下凝固。
5)在上层胶上再加入1mLVP-SFM完全培养基，将六孔板置于37℃孵箱中静置培养1-2周，每隔12h观察细胞克隆的形成，每隔48小时各个孔补充1mL VP-SFM完全培养基，防止胶干燥。
6)当观察细胞克隆形成明显细胞团后将培养板置于显微镜下计数克隆数量，每个细胞集落含50个或大于50个细胞为1个克隆，以克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数)×100％进行计算，最后拍照记录。
十天后观察结果如图14所示。软琼脂克隆形成实验结果显示：在10天后MDCK细胞株以及MDCK-lc3-/-细胞均出现了明显的细胞团，而MDCK-sqstm1-/-细胞培养至三周后仍未出现明显的细胞团，将六孔板一个样孔分割为22个视野，通过计数统计6个样孔共132个视野的平均克隆数，统计见图15。
计算平均克隆形成率：
MDCK细胞的克隆形成率＝(10.72×22)/1000×100％＝23.58％
MDCK-lc3-/-的克隆形成率＝(4.14×22)/1000×100％＝9.11％
MDCK-sqstm1-/-的克隆形成率＝0％
通过以上的软琼脂克隆形成实验克隆形成率的对比发现：三者在软琼脂培养环境中生长出现显著性差异(P<0.01)。其中，MDCK-sqstm1-/-细胞在三周内未出现明显的细胞克隆团，证明MDCK-sqstm1-/-细胞在软琼脂的环境下无法正常生长。
实施例6细胞成瘤性实验测试
针对MDCK(P73)、MDCK-lc3-/-(P82)、MDCK-sqstm1-/-(P81)(注：由于裸鼠成瘤性实验需要细胞量较大，因此将各组细胞在上述代次的基础上又进行了一次的扩增传代，因此此处的细胞代次较上述其他验证实验代次高一代)三种细胞进行细胞成瘤性实验测试，步骤如下：
1)将复苏的细胞传至3代之后，使用胰酶消化并将得到的细胞重悬于PBS中，制备成浓度分别为5×107/mL、5×106/mL、5×105/mL、5×104/mL的待检细胞悬液，备用于后续的成瘤性检测。
2)取MDCK细胞(ATCC-CCL34)作为阴性对照。将MDCK细胞消化后同样按上述密度重悬于PBS缓冲液中备用。
3)将4～7周龄的雌性裸鼠随机分成3组，将MDCK、MDCK-lc3-/-以及MDCK-sqstm1-/-三株细胞分别于裸鼠背部区域皮下接种0.2mL。
裸鼠分组情况统计表
Figure SMS_9
4)每周观察和触摸裸鼠在注射部位的结节或瘤体状态，至少观察4个月，并记录注射部位的结节状态以及裸鼠体重变化。
5)观察期末，肉眼及镜下观察注射局部及其他主要脏器组织(如心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑、淋巴结)是否出现异常组织增生情况，制作病理切片判断是否形成肿瘤。
病理切片结果如图17和18所示。由图可以看出：病理结果未发现肿瘤向肝脏、心脏、肾脏、肺脏、脾脏、脑等器官组织的转移现象。其中脾脏组织中存在红髓淤血、中性粒细胞增多以及出现大面积髓外造血灶，可能因为瘤体生长在裸鼠的皮下，但裸鼠没有胸腺缺乏T细胞免疫，而脾脏作为最大的免疫器官、也是体液免疫的中心，因此脾脏主要有关代偿性形成的增生来发挥集体的免疫作用。
针对MDCK细胞、MDCK-lc3-/-细胞以及MDCK-sqstm1-/-细胞的成瘤性测试结果统计如下：
(1)MDCK细胞、MDCK-lc3-/-细胞以及MDCK-sqstm1-/-细胞4月内在107/只接种裸鼠时肿瘤形成率分别为100％、50％、40％，且MDCK-lc3-/-细胞及MDCK-sqstm1-/-细胞形成肿瘤的瘤体面积体重比较MDCK细胞显著降低。
(2)MDCK细胞、MDCK-lc3-/-细胞以及MDCK-sqstm1-/-细胞在106/只接种后肿瘤形成率分别为90％、20％、0％。
(3)仅有MDCK细胞在105/只接种裸鼠时有20％的肿瘤形成率，MDCK-lc3-/-细胞以及MDCK-sqstm1-/-细胞在105/只组中未形成明显的实质瘤。
(4)上述三种细胞在104/只接种裸鼠后均未形成明显的实质瘤。
(5)图16中的瘤体面积体重比结果显示，相较于MDCK细胞，两株基因敲除细胞的肿瘤瘤体面积体重比显著降低，两者之间无显著差异。
(6)各实验组肉眼可见的接种部位肿块为瘤性组织，病理结果显示肿瘤不存在向肝脏、心脏、肾脏、肺脏、脾脏、脑等组织转移现象。
裸鼠成瘤性实验是根据《中国药典》对于基质细胞成瘤性的动物体内验证的实验，通过不同接种细胞浓度建立组间对比，从而通过4个月的观察记录以及观察终点时的病理结果对不同细胞株的成瘤性进行评估，本实验通过基因敲除细胞与原始细胞的对比，证实基因敲除后细胞的成瘤性显著降低，从而证明此基因敲除细胞有作为应用于疫苗生产细胞系的潜力，提高疫苗生产用基质细胞的安全性。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种低成瘤性MDCK细胞株，其特征在于，所述MDCK细胞株的自噬相关基因被敲除。
2.根据权利要求1所述的低成瘤性MDCK细胞株，其特征在于，所述低成瘤性MDCK细胞株为MDCK-lc3KO细胞株，保藏编号为C2022288；或者
所述低成瘤性MDCK细胞株为MDCK-sqstm1KO细胞株，保藏编号为C2022289。
3.一种权利要求1所述的低成瘤性MDCK细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用CRISPR Cas9基因编辑系统来敲除MDCK细胞中的自噬相关基因；
验证自噬相关基因敲除的MDCK细胞株的成瘤性。
4.根据权利要求3所述的低成瘤性MDCK细胞株的构建方法，其特征在于，所述自噬相关基因为lc3基因，针对lc3基因靶点序列为：GCCGGTCCGAGGGCATCGCG。
5.根据权利要求4所述的低成瘤性MDCK细胞株的构建方法，其特征在于，基于CRISPRCas9基因编辑系统来敲除lc3基因的gRNA序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示。
6.根据权利要求5所述的低成瘤性MDCK细胞株的构建方法，其特征在于，针对lc3基因敲除所构建的载体采用的5’同源臂和3’同源臂的序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
7.根据权利要求3所述的低成瘤性MDCK细胞株的构建方法，其特征在于，所述自噬相关基因为sqstm1基因，针对sqstm1基因靶点序列为：CCATGCGCTCAGGAGGCACC。
8.根据权利要求7所述的低成瘤性MDCK细胞株的构建方法，其特征在于，基于CRISPRCas9基因编辑系统来敲除sqstm1基因的gRNA序列如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示。
9.根据权利要求8所述的低成瘤性MDCK细胞株的构建方法，其特征在于，针对sqstm1基因敲除所构建的载体采用的5’同源臂和3’同源臂的序列如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示。
10.权利要求1或2所述的低成瘤性MDCK细胞株在培养病毒中的应用。
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