CN116173295A - 一种仿生矿化丝素蛋白支架材料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及仿生矿化及组织工程支架材料领域，具体涉及一种仿生矿化丝素蛋白支架材料及其制备方法和应用。该制备方法包括以下步骤：1)将丝素蛋白进行诱导自组装，得到丝素蛋白纤维基质；2)将步骤1)得到的丝素蛋白纤维进行交联，得到交联丝素蛋白纤维矿化基质；3)将步骤2)得到的交联丝素蛋白纤维矿化基质在矿化液中进行矿化，得到仿生矿化丝素蛋白支架材料。该制备方法制备的仿生矿化丝素蛋白支架材料应用于骨组织修复。本发明中，丝素蛋白纤维内的矿化模式更高程度的模拟了自然骨组织的矿化形式，重现了与天然骨类似的表面化学性质及纳米尺度上的结构特征。

Description

一种仿生矿化丝素蛋白支架材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及仿生矿化及组织工程支架材料领域，具体涉及一种仿生矿化丝素蛋白支架材料及其制备方法和应用。

背景技术

当今社会由于外伤，肿瘤，手术等原因造成的骨组织缺损不断增加，植骨材料的需求也日益增多。临床常用的骨移植材料包括自体骨，异体骨，异种骨等，其中自体骨一直被认为是骨缺损质量的“金标准”。但是这些骨移植材料普遍存在来源有限，手术操作复杂，免疫排斥及并发症等问题，因此，制备结构功能高度仿生的人工骨材料以作为骨移植供体替代物是当前解决需求的关键。

丝素蛋白是一种性能优良且容易获取的天然高分子。由于一系列小的疏水性氨基酸以及亲水性大侧链氨基酸，丝素蛋白具有易于降解，结构可控和良好的生物活性。随着生物材料的发展，丝素蛋白在组织工程，肿瘤治疗和医疗检测等领域得到广泛研究和应用。丝素蛋白中加入羟基磷灰石矿物的方法很多，包括将各种粒径的羟基磷灰石与丝素蛋白基质物理混合；将羟基磷灰石混入丝素蛋白溶液再进行静电纺丝；或者通过电镀法将羟基磷灰石沉积到丝素蛋白基质表面上。然而这些方法制备的丝素蛋白羟基磷灰石复合材料无法对天然骨组织在微观结构和微环境上达到真正的仿生，导致这些复合材料机械性能差，生物活性低等。

天然骨组织是一种纳米复合材料，其微观结构主要由羟基磷灰石纳米晶体和胶原蛋白纳米纤维构成。通过生物矿化作用，羟基磷灰石矿化晶体在胶原蛋白纤维内部沉积，从而赋予了天然骨优异的机械性能，并维持了胶原蛋白良好的生物活性。仿生矿化是利用生物矿化原理在体外制备类似于天然有机-无机复合材料结构。目前仿生矿化主要是利用胶原蛋白纤维作为矿化基质来调控合成羟基磷灰石，从而实现胶原蛋白纤维内矿化。研究表明，胶原蛋白纤维内的特征性横纹结构(D＝67nm)主导了羟基磷灰石晶体在纤维内有规律地沉积。纤维内矿化支架具有更好的机械性能，并保持了矿化基质的表面化学结构，维持了良好的生物活性。但是目前纤维内矿化只在胶原蛋白等有限的几种矿化基质材料上实现。胶原蛋白供应有限且价格昂贵，因此寻找具有优越性能的非胶原蛋白类矿化基质，实现精确仿生矿化对于骨组织再生修复至关重要。

发明内容

针对现有技术所存在的问题，本发明第一方面提供了一种仿生矿化丝素蛋白支架材料，所述仿生矿化丝素蛋白支架材料包括交联丝素蛋白纤维矿化基质和矿化液。

本发明第二方面提供了上述仿生矿化丝素蛋白支架材料的制备方法，包括以下步骤：

1)将丝素蛋白在溶液中进行诱导自组装，得到丝素蛋白纤维基质；

2)将步骤1)得到的丝素蛋白纤维基质进行交联，得到交联丝素蛋白纤维矿化基质；

3)将步骤2)得到的交联丝素蛋白纤维矿化基质在矿化液中进行矿化，得到所述仿生矿化丝素蛋白支架材料。

优选地，包括以下技术特征中的至少一项：

11)步骤1)中，所述溶液为水；

12)步骤1)中，所述诱导自组装的温度0-10℃；

13)步骤1)中，所述诱导自组装的时间≥1h；

14)步骤1)中，所述丝素蛋白来自蚕丝；

15)步骤1)中，所述丝素蛋白的浓度≥0.1mg/mL；

21)步骤2)中，所述交联前，还包括将步骤1)得到的丝素蛋白纤维基质冷冻干燥；

22)步骤2)中，所述交联选自化学交联和物理交联中的至少一种；

31)步骤3)中，所述矿化液包括钙盐、稳定剂和磷酸盐；

32)步骤3)中，所述矿化液与所述交联丝素蛋白纤维矿化基质的体积比≥1；

33)步骤3)中，所述矿化的时间≥24小时；

34)步骤3)中，所述矿化后，还包括清洗、冷冻干燥。

优选地，包括以下技术特征中的至少一项：

121)特征12)中，所述诱导自组装的温度为4-8℃；

122)特征12)中，所述诱导自组装的时间为1-3天；

151)特征15)中，所述丝素蛋白溶液的浓度≥3mg/mL，优选地，所述丝素蛋白溶液的浓度≥5mg/mL。

221)特征22)中，所述交联为化学交联时，将所述丝素蛋白纤维基质与交联剂进行交联；

222)特征22)中，所述交联为物理交联时，将所述丝素蛋白纤维基质进行脱水，得到交联丝素蛋白纤维矿化基质；

223)特征22)中，所述交联为物理交联时，所述物理交联的温度≥80℃；

224)特征22)中，所述交联为物理交联时，所述物理交联的压力≥15psi；

225)特征22)中，所述交联为物理交联时，所述物理交联的时间≥15min；

311)特征31)中，所述钙盐为水溶性钙盐；

312)特征31)中，所述矿化液中，钙离子浓度为0.2-20mmol/L；

313)特征31)中，所述稳定剂选自聚天冬氨酸、聚天冬氨酸盐、聚丙烯酸，聚丙烯酸盐中的一种或者多种；

314)特征31)中，所述磷酸盐选自磷酸氢二钠和磷酸氢二钾中的一种或者多种；

315)特征31)中，所述矿化液中，磷酸根离子的浓度为0.3-30mmol/L；

321)特征32)中，所述矿化液与所述交联丝素蛋白纤维矿化基质的体积比≥100；

331)特征33)中，所述矿化的时间≥3天；

341)特征34)中，所述清洗使用的试剂为去离子水。

优选地，包括以下技术特征中的至少一项：

2211)特征221)中，所述交联剂选自戊二醛、碳二亚胺、genipin中的一种或者多种；

3111)特征311)中，所述钙盐选自氯化钙和硝酸钙中的一种或者多种；

3121)特征312)中，所述钙离子浓度为1-10mmol/L；

3131)特征313)中，当所述稳定剂为聚天冬氨酸盐时，所述聚天冬氨酸盐选自聚天冬氨酸钾和聚天冬氨酸钠中的一种或者多种；

3132)特征313)中，当所述稳定剂为聚天冬氨酸时，聚天冬氨酸的浓度为10-400μg/mL；优选地，所述聚天冬氨酸的浓度为50-200μg/mL；

3133)特征313)中，当所述稳定剂为聚天冬氨酸时，聚天冬氨酸的分子量为3000-50000g/mol；优选地，所述聚天冬氨酸的分子量为5000-50000g/mol；更优选地，所述聚天冬氨酸的分子量为20000-50000g/mol。

3141)特征314)中，所述磷酸根离子的浓度为1-5mmol/L；

优选地，步骤1)中，所述丝素蛋白的制备方法为：将蚕茧脱胶、冲洗、干燥，溶解、透析、离心和除杂，得到丝素蛋白。

优选地，包括以下技术特征中的至少一项：

A1)所述脱胶的溶液为Na₂CO₃溶液；

A2)所述脱胶为煮沸脱胶；

A3)所述脱胶时间为30-60min；

A4)所述冲洗溶液为蒸馏水；

A5)所述干燥时间为24-72h；

A6)所述溶解的溶液为溴化锂溶液；

A7)所述透析溶液为去离子水；

A8)所述透析溶液每次使用时间为8-12h；

A9)所述透析时间为2-3天；

A10)所述离心温度为4-8℃

A11)所述离心速度为6000-9000RPM；

A12)所述离心时间为5-30min。

优选地，包括以下技术特征中的至少一项：

A11-1)特征A1)中，所述Na₂CO₃溶液的浓度为0.02-0.1M；

A21)特征A2)中，所述煮沸脱胶的温度≥90℃；

A61)特征A6)中，所述干燥后的丝素蛋白与所述溴化锂溶液重量-体积比例为1:4-1：8；

A62)特征A6)中，所述溴化锂溶液的浓度为9.3-9.5M。

优选地，步骤3)中，所述矿化液的制备方法为：将包括钙盐、稳定剂和缓冲液的第一混合液和包括磷酸盐和缓冲液的第二混合液混合，得到所述矿化液。

优选地，包括以下技术特征中的至少一项：

B1)所述缓冲液的pH在37℃下为7.4-7.8；

B2)所述缓冲液为Tris缓冲盐溶液；

B3)所述缓冲液包括Trizma HCl、Trizma Base和NaCl中的一种或者多种。

本发明第三方面提供一种仿生矿化丝素蛋白支架材料在骨组织修复的应用，所述的仿生矿化丝素蛋白支架材料由上述的方法制备。

本发明具有以下有益效果中的至少一种：

1)与传统丝素蛋白羟基磷灰石复合材料制备方法不同，本发明提供了一种更接近生理条件实现丝素蛋白纤维内矿化。纤维内的矿化模式更高程度的模拟了自然骨组织的矿化形式，重现了与天然骨类似的表面化学性质及纳米尺度上的结构特征。

2)通过诱导丝素蛋白自组装以及仿生矿化过程，实现了非胶原纤维内矿化。这种方法制备出的纤维内矿化丝素蛋白支架显著增强了丝素蛋白纤维的机械强度，并能够为细胞生长提供类似于天然骨的内环境，从而可以促进骨髓间充质干细胞的黏附，增殖和成骨分化。

3)本发明提供了一个易于制备，原材料易于获得，价格低廉，机械和生物相容性优越的矿化支架材料，有望成为理想的骨缺损再生修复材料。

附图说明

图1为实施例1中采用ATR-FTIR检测不同处理后丝素蛋白样本的结构变化图，Fresh:新鲜制备丝素蛋白溶液冻干样品，4℃1D：丝素蛋白在4℃经过1天诱导自组装后的冻干样品，4℃1D+AC：丝素蛋白在4℃经过1天自组装，冻干后，再高温高压交联15分钟样品。

图2为实施例1中采用红外光谱分析了丝素蛋白二级结构含量的示意图，A:新鲜制备丝素蛋白溶液冻干样品,B:丝素蛋白在4℃经过1天自组装后的冻干样品，C:丝素蛋白在4℃经过1天自组装，冻干后，再高温高压交联15分钟样品。黑色实体线：实验红外光谱，红色实体线：拟合曲线，蓝色实体线：解卷积谱。RC：无规则卷曲，β-sh:β-折叠，T:β-turn。

图3为实施例1中用扫描电镜观察丝素蛋白诱导自组装前后的形态特征示意图，A:新鲜制备丝素蛋白溶液冻干样品,B:丝素蛋白在4℃经过1天自组装后的冻干样品，C:丝素蛋白在4℃经过1天自组装，冻干后，再高温高压交联15分钟样品。

图4A，C和D为实施例1中矿化后的仿生矿化丝素蛋白支架材料形态示意图，B:实施例1中矿化后的仿生矿化丝素蛋白支架材料形态EDX元素分析示意图。

图5为实施例1中矿化前后交联丝素蛋白纤维矿化基质的ATR-FTIR光谱分析示意图。SF：未矿化冻干样品，SF+PILP3D：矿化3天后的仿生矿化丝素蛋白支架材料。

图6为实施例1中为4℃自组装5天的丝素蛋白基质经过3天仿生矿化的扫描电镜示意图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。

一种仿生矿化丝素蛋白支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将丝素蛋白在溶液中进行诱导自组装，得到丝素蛋白纤维基质；

2)将步骤1)得到的丝素蛋白纤维基质进行交联，得到交联丝素蛋白纤维矿化基质；

3)将步骤2)得到的交联丝素蛋白纤维矿化基质在矿化液中进行矿化，得到所述仿生矿化丝素蛋白支架材料。

具体地，将蚕丝溶解制得丝素蛋白溶液，将丝素蛋白溶液低温静置诱导形成丝素蛋白纤维基质；将所述丝素蛋白纤维基质冷冻干燥后进行交联得到交联丝素蛋白纤维矿化基质；将所述交联丝素蛋白纤维矿化基质浸入矿化液进行矿化，得到所述仿生矿化丝素蛋白支架材料。本发明通过诱导丝素蛋白的自组装形成纤维，以聚天冬氨酸为稳定剂的水和无定形磷酸钙纳米簇进入丝素蛋白纤维内部，进而脱水，固化形成羟基磷灰石，最终形成矿化丝素蛋白纤维基质，实现了丝素蛋白纤维内矿化。本发明的矿化丝素蛋白支架材料高度仿生，矿化效率高，易于制备，机械性能好，有利于骨组织再生修复。

在一优选的实施例中，所述丝素蛋白的制备方法为：将剪成小块的干蚕茧放入到Na₂CO₃(0.02-0.1M)水溶液中煮沸30-60分钟脱胶，然后用蒸馏水彻底冲洗丝素。在通风柜中干燥24-72h，将干燥后的丝素按重量-体积比加入溴化锂溶液(9.3-9.5M)中于60-70℃下溶解4-6小时。将溶解的丝素蛋白用透析管(纤维素，MWCO 3kDa)对1-2L去离子水透析纯化2-3天。去离子水每8-12小时更换一次。透析纯化后，将丝素蛋白溶液转移到离心管中，4-8℃下以6000-9000RPM离心5-30min以除去杂质，即得到纯化丝素蛋白溶液。

在一优选的实施例中，所述丝素蛋白纤维基质为浓度≥0.1mg/mL丝素蛋白溶液在0-10℃诱导自组装≥1h形成，优选地，所述丝素蛋白溶液的浓度≥3mg/mL，更优选地，所述丝素蛋白溶液的浓度≥5mg/mL。优选地，自组装1-3天形成。所述诱导在低温环境进行，所述诱导温度为0-10℃，优选地，所述诱导温度4-8℃。

在一优选的实施例中，丝素蛋白纤维基质的交联方式包括化学交联和物理交联，在化学交联中，戊二醛的两个醛基分别与丝素蛋白纤维基质的氨基形成Schiff碱，将丝素蛋白纤维基质以五碳桥连接。在物理交联中，通过高温高压将丝素蛋白纤维基质重度脱水(hydrothermal treatment)形成物理交联。高温高压交联时，交联的温度≥80℃，交联的压力≥15psi，交联的时间≥15min。最优选地，所述交联的温度为122.7℃，交联的压力为22.6psi，所述交联后得到的交联丝素蛋白纤维矿化基质为稳定丝素蛋白结构。在矿化溶液中交联丝素蛋白纤维矿化基质不会溶解分离。

在一优选的实施例中，所述矿化液包括钙盐、稳定剂和磷酸盐。所述钙盐为水溶性钙盐，所述钙盐选自氯化钙和硝酸钙中的一种或者多种。所述矿化液中，钙离子浓度为0.2-20mmol/L；更为优选为1-10mmol/L。所述稳定剂选自聚天冬氨酸、聚天冬氨酸盐、聚丙烯酸，聚丙烯酸盐中的一种或者多种，当所述稳定剂为聚天冬氨酸盐时，所述聚天冬氨酸盐选自聚天冬氨酸钾和聚天冬氨酸钠中的一种或者多种；当所述稳定剂为聚天冬氨酸时，聚天冬氨酸的浓度为10-400μg/mL；优选地，所述聚天冬氨酸的浓度为50-200μg/mL；更优选为50μg/mL；当所述稳定剂为聚天冬氨酸时，聚天冬氨酸的分子量为3000-50000g/mol，优选地，所述聚天冬氨酸的分子量为5000-50000g/mol；更优选地，所述聚天冬氨酸的分子量为20000-50000g/mol。所述磷酸盐选自磷酸氢二钠和磷酸氢二钾中的一种或者多种；所述矿化液中，磷酸根离子的浓度为0.3-30mmol/L，优选地，所述磷酸根离子的浓度为1-5mmol/L。

在一优选的实施例中，本发明中将钙盐-聚天冬氨酸溶液与磷酸盐溶液混合即可制得矿化液，所述矿化溶液的配制方法为将钙盐和聚天冬氨酸溶于pH7.4-7.8(37℃)Tris缓冲盐溶液，再与用同种Tris缓冲盐溶液溶解的磷酸盐溶液混合。在本发明中，所述矿化液的配置方法采用上述方法能够使得聚天冬氨酸先结合钙离子，在与磷酸根离子溶液混合后能够让钙离子缓慢释放，缓慢形成不定型磷酸钙纳米簇并优先渗入丝素蛋白纤维内部，并有效抑制磷酸钙快速转化成羟基磷灰石并在纤维表面的沉积。本发明将所述交联丝素蛋白纤维矿化基质浸入矿化液中进行矿化，得到所述仿生矿化丝素蛋白支架材料。

在一优选的实施例中，所述矿化液与所述交联丝素蛋白纤维矿化基质的体积比≥10；进一步优选≥100。在本发明中，所述矿化液与所述交联丝素蛋白纤维矿化基质的体积比在上述范围内时能够保证矿化液的量足够，进而保证磷酸钙无机物能够优先沉积到丝素蛋白纤维基质内。所述矿化时间≥24小时；更优选为≥3天。优选矿化液每1-3天更换一次。所述矿化完成后，将所得产物用去离子水清洗，冷冻干燥，得到所述仿生矿化的丝素蛋白支架材料。

在一优选的实施例中，所述丝素蛋白的制备方法为：将蚕茧脱胶、冲洗、干燥，溶解、透析纯化、离心除杂，得到丝素蛋白。

实施例1

一、制备

(1)丝素蛋白的制备

将5g剪成小块的干蚕茧放入2升的Na₂CO₃(0.02M)水溶液中煮沸30分钟脱胶，然后用蒸馏水彻底冲洗。在通风柜中干燥24h，将干燥后的丝素按重量-体积比1:4加入至9.3M溴化锂溶液中溶解。60℃下4小时后，将完全溶解的丝素蛋白用透析管(纤维素，MWCO3kDa)对1L去离子水透析两天。去离子水每8小时更换一次。透析后，将丝素蛋白溶液转移到50ml离心管中，4℃下以9000RPM离心30min以除去杂质。

(2)丝素蛋白纤维的制备

将步骤(1)中得到的丝素蛋白溶液转移到新管并置于4℃的冰箱中24小时，以诱导丝素蛋白自组装形成纤维结构。将诱导后的丝素蛋白纤维基质溶液倒入特氟隆模具中，用液氮冷冻，然后冷冻干燥24小时，制成纯冻干的丝素蛋白纤维基质。冷冻干燥可以有效的锁住丝素蛋白纤维基质的形貌并防止其进一步自组装形成膜状结构。

(3)交联丝素蛋白纤维矿化基质的制备

将步骤(2)冷冻干燥的丝素蛋白纤维基质密封在高压灭菌处理袋中，然后放入蒸汽消毒器中。在122.7℃，22.6psi下物理交联15分钟。

(4)仿生矿化丝素蛋白纤维支架材料的制备

将5.72g Trizma HCl、1.66g of Trizma Base和9g NaCl置入1L去离子水中搅匀制备Tris缓冲盐溶液(pH7.4，37℃)。该缓冲盐溶液能够使得聚天冬氨酸结合钙离子，在与磷酸根离子溶液混合后能够让钙离子缓慢释放，缓慢形成不定型磷酸钙纳米簇并优先渗入丝素蛋白纤维内部，并有效抑制磷酸钙快速转化成羟基磷灰石以及在纤维表面的沉积。在Tris缓存盐溶液中分别加入9mM CaCl₂和4.2mM K₂HPO₄以制备仿生矿化所需的钙溶液和磷溶液。将聚天冬氨酸作为矿化稳定剂溶于CaCl₂溶液，使其浓度为100μg/mL。将钙离子溶液和磷酸根离子溶液等体积混合制备成矿化液。将步骤(3)所得的交联丝素蛋白纤维基质放入矿化液并于37℃进行矿化，每3天更换一次矿化液。矿化结束后用去离子水彻底清洗后冻干，得到仿生矿化丝素蛋白支架材料。

二、结果分析

(1)ATR-FTIR二级结构分析

本实施例采用ATR-FTIR检测不同处理后丝素蛋白样本的结构变化。如图1所示，新鲜的丝素蛋白(Fresh)在1646cm^-1处出现一个峰值，具有无规则卷曲构象的特征。在4℃下诱导自组装1天的丝素蛋白在1621cm^-1和1700cm^-1处达到峰值，具有反平行β-折叠结构的特征。在高温高压交联处理进一步降低了无规则卷曲构象。

为分析丝素蛋白二级结构的含量，对1600-1700cm^-1区域内的红外光谱进行了定量分析，结果如图2和表1所示。新鲜的丝素蛋白由无规卷曲(RC)结构、β-折叠(β-sheet)和β-turn(T)组成。当丝素蛋白溶液在4℃下诱导自组装一天后，无规卷曲(RC)结构的含量从70.0％减少到65.7％，而β-折叠(β-sheet)结构的含量从9.2％增加到34.3％。β-turn(T)的消失表明β-折叠结构的增加主要是由于β-turn的转变。丝素蛋白基质在高温高压处理进一步增加了β-折叠的含量。

表1丝素蛋白的反卷积酰胺I的峰值位置和积分强度

(2)丝素蛋白自组装前后分析

用扫描电镜观察丝素蛋白自组装前后的形态特征。新鲜丝素蛋白呈珠状形貌如图3A所示。如图3B所示，在4℃下诱导自组装1天后，丝素蛋白形成了直径为200-500nm相互粘连的纤维。这些丝素蛋白纤维均匀分布，形成无纺布纤维形态。通过比较图3A和图3B，可以得出本发明描述的丝素蛋白纤维基质中的纤维是由凝固的纤维蛋白珠状颗粒形成的。如图3C所示，高温高压交联后，丝素蛋白纤维基质未见明显的形貌变化，丝素蛋白纤维基质不溶于水，可作为稳定矿化基质使用。

(3)丝素蛋白纤维内仿生矿化后的形态研究

将交联丝素蛋白纤维矿化基质在矿化溶液中进行3天矿化。如图4A、C和D所示，矿化后的仿生矿化丝素蛋白支架材料保留了无纺布纤维形态。与未矿化的交联丝素蛋白纤维矿化基质相比，纤维表面和内侧变得粗糙。如图4B所示，EDS元素分析鉴定出高水平的钙和磷元素。

如图5所示，对矿化前后交联丝素蛋白纤维矿化基质的ATR-FTIR光谱分析显示，在1031cm^-1处出现强吸收带，这是由于磷酸盐的振动模式引起的。这些结果表明羟基磷灰石矿物嵌入到交联丝素蛋白纤维矿化基质内，形成交联丝素蛋白纤维矿化基质内矿化。这种交联丝素蛋白纤维矿化基质内矿化重现了天然骨中胶原纤维内羟基磷灰石的复合结构，达到了高度仿生，有利于骨组织再生修复。

(4)丝素蛋白非纤维矿化基质的仿生矿化后形态研究

当丝素蛋白在低温自组装超过3天后，丝素蛋白纤维形貌消失，形成膜状结构。如图6所示，为4℃自组装5天的丝素蛋白膜状基质经过3天仿生矿化的SEM图。可以看到经过5天的自组装，丝素蛋白的纤维形貌消失，钙磷矿只在丝素蛋白矿化基质的局部范围内沉积。不均匀的矿化沉积使得矿化后丝素蛋白材料不能重现天然骨的微观结构。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (11)

1.一种仿生矿化丝素蛋白支架材料，其特征在于，所述仿生矿化丝素蛋白支架材料包括交联丝素蛋白纤维矿化基质和矿化液。

2.根据权利要求1所述的仿生矿化丝素蛋白支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将丝素蛋白在溶液中进行诱导自组装，得到丝素蛋白纤维基质；

2)将步骤1)得到的丝素蛋白纤维基质进行交联，得到交联丝素蛋白纤维矿化基质；

3)将步骤2)得到的交联丝素蛋白纤维矿化基质在矿化液中进行矿化，得到所述仿生矿化丝素蛋白支架材料。

3.根据权利要求2所述的仿生矿化丝素蛋白支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下技术特征中的至少一项：

11)步骤1)中，所述溶液为水；

12)步骤1)中，所述诱导自组装的温度0-10℃；

13)步骤1)中，所述诱导自组装的时间≥1h；

14)步骤1)中，所述丝素蛋白来自蚕丝；

15)步骤1)中，所述丝素蛋白的浓度≥0.1mg/mL；

21)步骤2)中，所述交联前，还包括将步骤1)得到的丝素蛋白纤维基质冷冻干燥；

22)步骤2)中，所述交联选自化学交联和物理交联中的至少一种；

31)步骤3)中，所述矿化液包括钙盐、稳定剂和磷酸盐；

32)步骤3)中，所述矿化液与所述交联丝素蛋白纤维矿化基质的体积比≥1；

33)步骤3)中，所述矿化的时间≥24小时；

34)步骤3)中，所述矿化后，还包括清洗、冷冻干燥。

4.根据权利要求3所述的仿生矿化丝素蛋白支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下技术特征中的至少一项：

121)特征12)中，所述诱导自组装的温度为4-8℃；

122)特征12)中，所述诱导自组装的时间为1-3天；

151)特征15)中，所述丝素蛋白溶液的浓度≥3mg/mL，优选地，所述丝素蛋白溶液的浓度≥5mg/mL。

221)特征22)中，所述交联为化学交联时，将所述丝素蛋白纤维基质与交联剂进行交联；

222)特征22)中，所述交联为物理交联时，将所述丝素蛋白纤维基质进行脱水，得到交联丝素蛋白纤维矿化基质；

223)特征22)中，所述交联为物理交联时，所述物理交联的温度≥80℃；

224)特征22)中，所述交联为物理交联时，所述物理交联的压力≥15psi；

225)特征22)中，所述交联为物理交联时，所述物理交联的时间≥15min；

311)特征31)中，所述钙盐为水溶性钙盐；

312)特征31)中，所述矿化液中，钙离子浓度为0.2-20mmol/L；

313)特征31)中，所述稳定剂选自聚天冬氨酸、聚天冬氨酸盐、聚丙烯酸，聚丙烯酸盐中的一种或者多种；

314)特征31)中，所述磷酸盐选自磷酸氢二钠和磷酸氢二钾中的一种或者多种；

315)特征31)中，所述矿化液中，磷酸根离子的浓度为0.3-30mmol/L；

321)特征32)中，所述矿化液与所述交联丝素蛋白纤维矿化基质的体积比≥100；

331)特征33)中，所述矿化的时间≥3天；

341)特征34)中，所述清洗使用的试剂为去离子水。

5.根据权利要求4所述的仿生矿化丝素蛋白支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下技术特征中的至少一项：

2211)特征221)中，所述交联剂选自戊二醛、碳二亚胺、genipin中的一种或者多种；

3111)特征311)中，所述钙盐选自氯化钙和硝酸钙中的一种或者多种；

3121)特征312)中，所述钙离子浓度为1-10mmol/L；

3131)特征313)中，当所述稳定剂为聚天冬氨酸盐时，所述聚天冬氨酸盐选自聚天冬氨酸钾和聚天冬氨酸钠中的一种或者多种；

3132)特征313)中，当所述稳定剂为聚天冬氨酸时，聚天冬氨酸的浓度为10-400μg/mL；

优选地，所述聚天冬氨酸的浓度为50-200μg/mL；

3133)特征313)中，当所述稳定剂为聚天冬氨酸时，聚天冬氨酸的分子量为3000-

50000g/mol；优选地，所述聚天冬氨酸的分子量为5000-50000g/mol；更优选地，所述聚天冬氨酸的分子量为20000-50000g/mol。

3141)特征314)中，所述磷酸根离子的浓度为1-5mmol/L。

6.根据权利要求2-5任一项所述的仿生矿化丝素蛋白支架材料的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述丝素蛋白的制备方法为：将蚕茧脱胶、冲洗、干燥，溶解、透析纯化、离心除杂，得到丝素蛋白溶液。

7.根据权利要求6所述的仿生矿化丝素蛋白支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下技术特征中的至少一项：

A1)所述脱胶的溶液为Na₂CO₃溶液；

A2)所述脱胶为煮沸脱胶；

A3)所述脱胶时间为30-60min；

A4)所述冲洗溶液为蒸馏水；

A5)所述干燥时间为24-72h；

A6)所述溶解的溶液为溴化锂溶液；

A7)所述透析溶液为去离子水；

A8)所述透析溶液每次使用时间为8-12h；

A9)所述透析时间为2-3天；

A10)所述离心温度为4-8℃

A11)所述离心速度为6000-9000RPM；

A12)所述离心时间为5-30min。

8.根据权利要求7所述的仿生矿化丝素蛋白支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下技术特征中的至少一项：

A11-1)特征A1)中，所述Na₂CO₃溶液的浓度为0.02-0.1M；

A21)特征A2)中，所述煮沸脱胶的温度≥90℃；

A61)特征A6)中，所述干燥后的丝素蛋白与所述溴化锂溶液重量-体积比例为1:4-1：8；

A62)特征A6)中，所述溴化锂溶液的浓度为9.3-9.5M。

9.根据权利要求2-5任一项所述的仿生矿化丝素蛋白支架材料的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述矿化液的制备方法为：将包括钙盐、稳定剂和缓冲液的第一混合液和包括磷酸盐和缓冲液的第二混合液混合，得到所述矿化液。

10.根据权利要求9所述的仿生矿化丝素蛋白支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下技术特征中的至少一项：

B1)所述缓冲液的pH为7.4-7.8；

B2)所述缓冲液为Tris缓冲盐溶液；

B3)所述缓冲液包括Trizma HCl、Trizma Base和NaCl中的一种或者多种。

11.一种仿生矿化丝素蛋白支架材料在骨组织修复的应用，其特征在于，所述的仿生矿化丝素蛋白支架材料由权利要求2-10任一项所述的方法制备。

Images