CN116173125B - 一种组合物在制备治疗自身免疫性甲状腺炎诱导的卵巢储备功能低下的药物中的用途 - Google Patents
一种组合物在制备治疗自身免疫性甲状腺炎诱导的卵巢储备功能低下的药物中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种组合物在制备治疗自身免疫性甲状腺炎诱导的卵巢储备功能低下的药物中的用途;所述组合物是由包括如下原料药制备而成的制剂:鹿角胶或鹿角霜3~13份、熟地黄5~20份、山药5~20份、山茱萸5~20份、枸杞子5~20份。本发明运用国际常用制备EAT模型小鼠的NOD‑SCID小鼠建立了的EAT诱导的DOR模型,证实资冲颗粒通过激发Keap/Nrf2/HO‑1通路和抑制NFKΒ/IKKβ通路共同发挥降低氧化应激、调节免疫、抗炎等,减少颗粒细胞及卵母细胞凋亡,保护EAT小鼠(NOD‑SCID)的卵巢储备功能以及甲状腺。
Description
技术领域
本发明涉及一种组合物在制备治疗自身免疫性甲状腺炎诱导的卵巢储备功能低下的药物中的用途。
背景技术
肾精是肾中所藏的先天之精和后天之精的总称,是构成胚胎的原始物质和生命产生的本原。肾气是肾中所藏的先、后天之气和自然界之清气及其生理功能的概称,是肾之生理功能活动的物质基础和维持生命活动的本原与动力。肾精与肾气互生互化、相互为用,类似阴阳的互根互藏互用关系。如果机体处于肾阳虚的状态,产生“阳虚则寒”的虚寒证,则可通过直接温补肾阳的方法达到扶阳益火的目的;亦可以通过补肾填精,肾精与肾气相互资生、相互为用,肾精为体,肾气为用,阳得阴助而源泉不竭,达到恢复机体阴阳平衡的状态,即景岳所言“善补阳者,必于阴中求阳,则阳得阴助而生化无穷”;也可以通过温肾填精以扶阳益火、填补肾精协同发挥治疗作用。
资冲颗粒组方为鹿角胶、熟地黄、山药、山茱萸、枸杞子、菟丝子,具有抑制氧化应激和调节免疫的功能,一直是临床上治疗不孕症的方剂。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供了一种组合物在制备治疗自身免疫性甲状腺炎诱导的卵巢储备功能低下的药物中的用途;
所述组合物是由包括如下原料药制备而成的制剂:
鹿角胶或鹿角霜3~13份、熟地黄5~20份、山药5~20份、山茱萸5~20份、枸杞子5~20份。
进一步地,所述组合物由包括如下原料药制备而成的制剂:
鹿角胶或鹿角霜6~10份、熟地黄15份、山药15份、山茱萸15份、枸杞子15份。
进一步地,所述药物是增多原始卵泡、初级卵泡和/或次级卵泡的药物。
进一步地,所述药物是减少闭锁卵泡和/或改善黄体数目的药物。
进一步地,所述药物是抑制卵巢细胞凋亡的药物。
更进一步地,所述药物是降低促凋亡蛋白BAX、Caspase-3水平,和/或增加抗凋亡蛋白BCL-2水平的药物。
进一步地,所述药物是降低卵泡刺激素FSH水平,升高E2、ATP、Irisin水平的药物。
进一步地,所述药物是降低甲状腺抗体和/或升高抗缪勒管激素AMH的药物;所述甲状腺抗体为TPOAb和/或TGAb。
进一步地,所述药物是降低IL-17水平、IL-17/TG-Fβ比值,调节Th17/Treg细胞亚群失衡、和/或升高TG-Fβ水平的药物。
进一步地,所述药物是降低氧化应激指标eNOS含量,和/或增加HO-1蛋白、LONP1蛋白含量的药物。
进一步地,所述药物是下调Keap1蛋白相对含量、上调Nrf2、LONP1、HO-1蛋白相对含量的药物。
进一步地,所述药物是治疗自身免疫性甲状腺炎的药物。
进一步地,所述药物是治疗自身免疫性甲状腺炎和卵巢储备功能低下的药物。
进一步地,所述制剂为口服制剂;所述口服制剂为颗粒剂、溶液剂、膏剂、丸剂、粉剂。
本发明运用国际常用制备EAT模型小鼠的NOD-SCID小鼠建立了的EAT诱导的DOR模型,证实资冲颗粒通过激发Keap/Nrf2/HO-1通路和抑制NFKΒ/IKKβ通路共同发挥降低氧化应激、调节免疫、抗炎等,减少颗粒细胞及卵母细胞凋亡,保护EAT小鼠(NOD-SCID)的卵巢储备功能以及甲状腺。将资冲颗粒应用于自身免疫性甲状腺炎诱导的卵巢储备功能低下具有良好前景。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1Tunel检测资冲颗粒对卵巢组织凋亡的影响
图2资冲颗粒对EATNOD小鼠模型卵巢BAX、Caspase-3、BCL-2光密度值的影响
图3各组小鼠卵巢组织HO-1、LONP1、eNOS光密度值的影响
图4资冲颗粒对小鼠卵巢组织Nrf2、Keap1、HO-1、LONP1蛋白表达的影响
图5资冲颗粒对小鼠卵巢组织IKKβ、p65、IKBα蛋白表达的影响
具体实施方式
实施例1资冲颗粒(ZCKLJ)改善EAT导致的DOR小鼠(NOD-SCID)卵巢储备功能的机制研究
1实验材料
1.1实验动物
参照国际标准建立EAT模型,选用自身免疫性甲状腺炎(AIT)理想动物模型NOD小鼠作为研究对象。NOD-SCID雌性小鼠,4-5周龄,18只,体重12-15g,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供(许可证号SCXK(京)2019-0008),无菌饲料喂养(成都达硕实验动物有限公司)。饲养地点和实验单位为成都中医药大学妇科实验室。饲养环境通风良好,温度保持在20-24℃,定期对环境消毒灭菌。
1.2实验试剂
表1主要实验试剂
1.3实验仪器
表2主要实验仪器
2实验方法
2.1试剂配制
2.1.1高碘水
将0.64g碘化钠晶体与1L纯净水混合,配成浓度为0.64g·L-1的高碘水;
2.1.2抗原溶液
将猪甲状腺球蛋白(pTg)抗原(1mg/ml)溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中。
2.1.3初次免疫乳化剂
将弗氏完全佐剂(CFA)和抗原溶液以1:1体积比分别吸入1个50ml离心管中,将离心管放置在漩涡振荡器上高速震荡(约2000转/分)40分钟,直至形成黏稠的乳化剂为止,使其最终浓度达500mg·L-1,现配现用。
2.1.4加强免疫乳化剂
将弗氏不完全佐剂(IFA)和抗原溶液以1:1体积比,如同初次免疫乳化剂制备方法,制备成500mg·L-1油包水乳状液。
2.2药物配制
资冲颗粒胶处方:山茱萸、熟地黄、山药、枸杞子、鹿角胶等,1剂合计81g生药,人临床用量为1日1剂,按平均体重50kg计算,相当于1.62g生药/kg,即0.35g颗粒/kg。实验过程中采用颗粒剂型,由华润三九医药股份有限公司制备,每剂17.61g,1g颗粒相当于4.6g原生药(原生药组成:鹿角胶6份、熟地黄15份、山药15份、山茱萸15份、枸杞子15份)。小鼠与人体之间的用药剂量换算系数为9.1,小鼠灌胃剂量为3.185g颗粒/kg体重。小鼠平均体重按15g计算,0.05g/只/日。每日灌胃0.1ml/只。
2.3实验分组
将18只NOD-SCID雌性小鼠适应喂养1周后,按小鼠体重大小编号,采用随机数字表法进行分组,分为NOD对照组、NOD模型组、NOD资冲颗粒组,每组6例。
2.4造模及干预方法
NOD对照组:每周五上午9点于小鼠的颈部、背部、大腿内侧、腹部等皮下多点注射0.1ml的PBS缓冲液,并予以0.1ml/只/日的生理盐水灌胃;
NOD模型组:每周五上午9点于小鼠的颈部、背部、大腿内侧、腹部等皮下进行多点注射完全弗氏佐剂抗原0.1ml,连续2周;第3周起每只小鼠皮下多点注射不完全弗氏佐剂抗原0.1ml,持续6周。造模期间予以0.1ml/只/日的生理盐水灌胃,进行高碘水(0.05%NaI水)喂养。
NOD资冲颗粒组:每周五上午9点于小鼠的颈部、背部、大腿内侧、腹部等皮下多点注射完全弗氏佐剂抗原0.1ml,连续2周;第3周起每只小鼠皮下多点注射不完全弗氏佐剂抗原0.1ml,持续6周,造模期间高碘水(0.05%NaI水)喂养。于第2周开始周一至周五每天资冲颗粒混悬液灌胃0.1ml/只,周六、周日停药2天。
2.5标本采集
随机选取6例/组保存于液氮中的甲状腺、卵巢、下丘脑、垂体组织标本用于检测组织匀浆中的氧化应激标记物,余下的3例/组的卵巢组织用于Western blot检测。每组随机选取3个用于HE染色的卵巢组织进行免疫组化和TUNEL检测。
2.6观测指标
2.6.1一般状况、体重、肛温、动情周期、性腺指数
每日观察各组小鼠的存活情况、精神状态、行为活动、进食情况、毛被(有无立毛、体毛篷松、脱毛)、二便排泄等情况。每周五记录体重和肛温。实验中观察小鼠一般状态,记录其变化。若有动物死亡,记录死亡数量及原因。
隔日早晨8:00至9:00对小鼠进行阴道脱落细胞涂片,方法如下:将纹绣专用尖头小棉签用0.9%NaCl溶液湿润后插入小鼠阴道约0.5cm,顺时针旋转3-4周,抽出棉签,将其上的阴道脱落物旋转涂抹于玻片上(切勿重叠),将玻片放置于COIC显微镜下(10*10倍)光镜下观察细胞形态,依据表3判断小鼠动情周期变化观察。性成熟的雌性小鼠的动情周期为4-5天,按细胞学涂片的形态学变化划分为动情前期、动情期、动情后期和动情间期。周期过长(≥6d)、不完整、过短或者长时间处于同一周期(≥3d)被认为是周期紊乱。
表3阴道脱落细胞特征
2.6.2甲状腺HE染色进行病理评分
(1)包埋:固定组织经全自动脱水机脱水(脱水时长:75%酒精4h,85%酒精2h,95%酒精1h,100%酒精0.5h,100%酒精0.5h,100%酒精0.5h,100%酒精0.5h,二甲苯10min,二甲苯10min,石蜡1h,石蜡2h,石蜡3h),包埋;
(2)切片:采用Leica RM2235切片机将组织切成5μm厚的薄片,在温水中将组织展平后捞在载玻片上,60℃烘烤切片至少2h;
(3)染色:苏木精染色10-20min;自来水冲洗1-3min;盐酸酒精分化5-10s;自来水冲洗1-3min;放入50℃的温水中或弱碱性水溶液返蓝,直到出现蓝色为止;自来水冲洗1-3min;放入85%的酒精3-5min;伊红染色3-5min;水洗3-5s;梯度酒精脱水;二甲苯透明;中性树胶封固;
(4)镜检:小鼠卵巢组织采用3DHISTECH(Hungary)生产的Pannoramic250数字切片扫描仪对切片进行图像采集。小鼠甲状腺组织采用麦克奥迪实业集团有限公司生产的BA210Digital数码三目摄像显微摄像系统对切片进行图像采集。每张切片先于40倍下观察全部组织,观察大体病变,要观察的区域选择采集100倍和400倍图片以观察具体病变。
甲状腺组织病理评分参考Charveire分类法:
表4 Charveire分类法
2.6.3卵巢HE染色进行各级卵泡及黄体计数
卵巢HE染色方法同“2.6.2”,染色后进行各级卵泡计数,原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡、闭锁卵泡、黄体等数目。
2.6.4ELISA测定小鼠血清甲状腺抗体、甲功、性激素、免疫指标及ATP、Irisin
2.6.4.1复温
将所有试剂平衡至室温。
2.6.4.2标准品的加样
设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。
2.6.4.3加样
分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL,然后再加待测样品10μL(样品最终稀释度为5倍)。
2.6.4.4加酶温育
每孔加入酶标试剂100μL,空白孔除外,用封板膜封板后置37℃温育60分钟。
2.6.4.5配液
将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。
2.6.4.6洗涤
小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置1min后弃去,如此重复5次,拍干。
2.6.4.7显色
每孔先加入底物液A50μL,再加入底物液B 50μL,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15min。
2.6.4.8终止
每孔加终止液50μ1,终止反应此时蓝色立转黄色。
2.6.4.9测定
在15min内,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。
2.6.5TUNEL荧光染色观察卵巢组织细胞凋亡情况
(1)常规脱蜡水化:将卵巢组织石蜡切片浸于二甲苯中5min,三次,取出切片置于100%无水乙醇中3min两次,再依次置入90%-70%各级酒精各3min;流水冲洗3min,置入双蒸水中3min,再用PBS冲洗3次,每次3min;
(2)通透:将PBS与蛋白酶配制成20ug/ml的蛋白酶K工作液,每张片上滴加100uL蛋白酶K工作液,随后将切片置于避光的湿盒中,37℃恒温箱中孵育20分钟;
(3)PBS漂洗:用0.01%PBS缓冲液漂洗3次3分钟/次,洗3次;
(4)Tunel染色标记:配制Tunel反应混合液(1份1液-试剂盒中的Enzyme Solution+9份2液-试剂盒中的Label Solution);每个样迅速滴加50uL染液(注:阴性对照样本不加),加盖盖玻片后放入湿盒,37℃恒温箱中避光孵育1h,再用0.01%PBS缓冲液漂洗每次5min,共计3次,此步骤要全程注意避光;PBS洗,3分钟/次,洗3次;滴加DAPI复染,避光孵育5分钟;PBS洗,3分钟/次,洗3次;
(5)缓冲甘油封片即可在荧光显微镜下观察
(6)荧光显微镜观察凋亡细胞胞核发出的绿色荧光并拍照。
2.6.6免疫组化(IHC)观察卵巢组织BAX、Caspase-3、BCL-2、HO-1、LONP1、eNOS蛋白
(1)卵巢组织切片经二甲苯脱蜡、乙醇分梯度脱水:将石蜡切片浸于二甲苯中5min,三次;乙醇分梯度脱水:取出切片置于100%无水乙醇中3min X3次,再分别依次置入95%、80%、70%各级酒精各3min;流水冲洗3min,置入双蒸水中3min,再用PBS冲洗3min X3次)。
(2)脱蜡后内源性酶的抑制(封闭内源性抗原):3%的过氧化氢H2O2处理10min,PBS 3min X3次;
(3)抗原修复:将盛有抗原修复液的烧杯置入水浴设备中加热至95℃,切片置入抗原修复液中加热处理25min,置于抗原修复液的相应容器放置自然状态至恢复至室温,再用PBS洗3min X3次。
(4)加入第一抗体:加入Anti-Ki67(稀释比例1:200),盖玻片置于组织上,37℃放置3小时。PBS冲洗盖玻片,每次3min,取出切片,甩掉并擦干组织周围的液体(组织切勿干燥),平放于湿盒中。
(5)加入二抗:滴加40ul二步法抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒中的A(ChemMateTMEnvision+HRP)于卵巢组织上,37℃孵育45min;孵育完毕,用PBS冲洗切片3次,每次3min,取出切片,甩掉并擦干组织周围的液体(组织切勿干燥),平放于湿盒中;
(6)苏木素染色:滴加预备好的显色剂DAB工作液40ul,光镜下控制显色;显色完毕后,用蒸馏水冲洗终止显色;
(7)苏木素复染,各级酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
2.6.7Western blot检测卵巢组织Nrf2、Keap1、HO-1、LONP1、NF-kB p65、IKBα、IKKβ蛋白的表达
2.6.7.1卵巢组织总蛋白提取
(1)组织块用预冷的PBS洗涤2-3次,去除血污,剪成小块置于匀浆管中,加入1-2个3mm的匀浆珠,加入10倍组织体积的裂解液(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂),设置匀浆程序进行匀浆;如果需要提高蛋白浓度,可以适量减少裂解液体积;
(2)将匀浆完成的卵巢组织匀浆管取出,放置冰上裂解液30min,每隔5min震荡一次确保组织完全裂解;12000rpm,4℃,离心10min,用移液器小心吸取上清液,即为总蛋白溶液,分装后放-80℃冰箱冻存;
2.6.7.2BAC法蛋白定量
参考BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度的具体方法:
(1)制备BCA工作液,根据样品数量计算所需工作液的总量后,试剂A与试剂B的比率为50:1充分混匀,置于室温下稳定24h;
(2)将蛋白标准品充分并完全溶解,按1:9比例进行稀释,使蛋白标准品终浓度为0.5mg/mL;
(3)在96孔板的标准品孔中分别加入0、1、2、4、8、12、16、20uL配置好的蛋白标准品溶液,并用标准品稀释液补足20uL;在待测样品孔中加入各组待测蛋白,并用标准品稀释液补足20pL;
(5)向各孔分别添加200uLBCA工作液,并在振荡器上振荡30s,使其充分混合,将微孔板密封,置于37℃恒温箱中孵育30min;
(6)采用全自动多功能酶标仪检测570nm波长的OD值,绘制标准曲线图。
2.6.7.3蛋白变性
将蛋白溶液按照4:1的比例加入还原型蛋白上样缓冲液,沸水浴变性15min,收入-20℃冰箱保存备用;
2.6.7.4SDS-PAGE电泳
(1)清洗玻璃板;
(2)制胶与上样;①待玻璃板自然晾干后,将一块凹玻璃板和一块平玻璃组成一对,放入制胶器,插入斜插板将玻璃板固定,检查底部是否对齐,避免漏胶;②根据实验需求配制不同浓度的分离胶,加入TEMED后立即混合均匀,将分离胶灌到适当的的高度,灌胶之前可以用梳子试一下,梳子齿距离分离胶上液面大约5-8mm为宜。然后将纯水缓慢均匀加入到分离胶上层,直至加满。大约30min后待分离胶凝固即可倒去分离胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干;
表5 SDS-PAGE分离胶配方表
表6 SDS-PAGE浓缩胶配比表
(3)按照上述配方配制5%的浓缩胶,加入TEMED后立即混合均匀,即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中,注意梳子下面不能有气泡。
(4)等浓缩胶凝固好,取下制胶器,小心拔掉梳子,即可准备开始电泳;
(5)将制胶器放入电泳槽后加足够的电泳液后上样电泳。浓缩胶电压75V,分离胶用120V。电泳至溴酚蓝里最底部大约1cm即可终止电泳,进行转膜。
2.6.7.5转膜
(1)准备6张7×9cm的滤纸和一张大小适中的PVDF(0.45um)膜,PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化2min;
(2)在加有转移液的盆里放入转膜用的夹子,两块海绵垫,一支玻璃棒,滤纸和经过活化的PVDF膜;
(3)将夹子打开,左边白色,右边为黑色,在两边各加一块海绵、三层滤纸;
(4)小心剥下分离胶放在滤纸上,将PVDF膜置于胶上,不要有气泡,在膜上盖三张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫;
(5)转膜条件(湿转):300mA恒流转膜半小时,转膜过程中将转膜设备放在冰水中降温。
2.6.7.6免疫反应
(1)将转印完的膜放入装有TBST的孵育槽中,快速涮洗一次,然后加上的脱脂牛奶,放置脱色摇床上,室温下封闭30min;
(2)按照抗体说明书,进行一抗稀释,配置好后,倒掉孵育槽中的封闭液,加入配置好的一抗,4℃孵育摇床过夜(摇床慢摇);
(3)回收一抗,用TBST快速涮洗膜三次,然后加入TBST,放置脱色摇床上快速洗脱,每次5min,洗三次;
(4)将二抗用TBST按照1:5000的比例进行稀释,然后加入孵育槽中,放置摇床上慢摇,室温下孵育30min;
(5)用TBST快速涮洗膜三次,然后再加入TBST,放置脱色摇床上快速洗脱,每次5min,洗三次。
2.6.7.7化学发光
在暗室中将ECLA液和ECLB液两种试剂在离心管中等体积混合,在曝光匣上贴双层PE手套或者其他透明薄膜,将PVDF膜的蛋白面朝上放在曝光匣两层薄膜之间,加入混合好的ECL溶液充分反应,1-2min后,去尽残液,盖上层薄膜开始压胶片。压完的胶片用显影、定影试剂进行显影和定影。根据不同的发光强度调整曝光条件。
2.6.7.8凝胶图像分析
将胶片进行扫描存档,PhotoShop整理去色,Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。
2.7统计方法
计量资料:均用均数和标准差表示,若方差齐,则使用ANOVA单因素方差分析中的LSD检验进行组间多重比较;若方差不齐,方差不齐用G-H检验或Tamhane’s T2比较。计数资料采用卡方检验。所有统计检验均采用双侧检验,当P<0.01具有显著统计学意义,P<0.05为差异有统计学意义,P>0.05为无统计学意义。
3结果
3.1资冲颗粒对EAT小鼠(NOD-SCID)的一般情况、体重、肛温、动情周期、性腺指数的影响
3.1.1小鼠一般状况
NOD对照组小鼠活动正常、毛发光泽、二便正常、动情周期规律。NOD模型组小鼠和NOD资冲颗粒组小鼠于造模第4周开始注射部位皮下硬结明显,造模结束时皮下硬结仍未消退完全。NOD模型组小鼠于造模第4周开始出现大便颜色偏浅、质地偏稀,活动度减弱,第6-8周时出现立毛。
3.1.2各组小鼠体重及肛温变化
表7各组小鼠体重变化(n=6)
与对照组比较,*p<0.05,**p<0.01,与模型组比较#p<0.05,##p<0.01;与造模前比较,△P<0.05,△△P<0.01。
各组小鼠体重均符合正态分布且方差齐,故采用单因素方差中的LSD检验。
(1)造模前各组小鼠体重:造模前各组间体重差异无统计学意义(P>0.05);
(2)造模后各组小鼠体重:造模后各组小鼠组间体重差异无统计学意义(P>0.05);
(3)NOD对照组、NOD资冲颗粒组小鼠体重较造模前显著增加(p<0.01),造模组较造模前体重无明显差异(P>0.05)。
3.1.3各组小鼠肛温变化
表8各组小鼠肛温变化(n=6)
与对照组比较,*p<0.05,**p<0.01,与模型组比较#p<0.05,##p<0.01;与造模前比较,△P<0.05,△△P<0.01。
各组小鼠肛温均符合正态分布且方差齐,故采用单因素方差中的LSD检验。
(1)造模前肛温:各组小鼠造模前肛温差异无统计学意义(P>0.05);
(2)造模后肛温:NOD模型组温度较对照组显著降低(P<0.01);NOD资冲颗粒组的肛温较模型组显著升高(P<0.01);造模后NOD对照组与NOD资冲颗粒组肛温无显著差异(P>0.05)。
3.1.4各组小鼠动情周期变化
表9各组小鼠动情周期变化(n=6)
注:NOD小鼠动情周期为4-6d,周期过长(≥6d)、不完整、过短或者长时间处于同一周期(≥3d)被认为是周期紊乱。△动情前期;◇代表动情期;¤动情后期;○动情间期。
(1)对照组动情周期未见明显紊乱;
(2)造模后模型组NOD小鼠2例出现动情间期延长,3例出现动情期延长,动情周期紊乱率83.3%;
(3)NOD资冲颗粒组小鼠1例出现动情期延长,2只例出现动情间期停滞,动情周期紊乱率33.3%;
(4)小结:模型组小鼠动情周期紊乱率较高,NOD资冲颗粒组动情周期紊乱率下降。
3.1.5各组小鼠性腺指数
表10各组小鼠的卵巢脏器指数情况(n=6)
与对照组比较,*p<0.05,**p<0.01,与模型组比较#p<0.05,##p<0.01。各组小鼠卵巢脏器指数均符合正态分布且方差齐,故采用单因素方差中的LSD检验。与NOD对照组相比,NOD模型组的卵巢脏器指数(0.052±0.008)显著下降(P<0.01);与模型组相比,NOD资冲颗粒组的卵巢脏器指数(0.073±0.007)显著升高(P<0.01)。
3.2资冲颗粒对EAT小鼠(NOD-SCID)甲状腺病理评分的影响
表11各组小鼠甲状腺病理评分
与对照组比较,*p<0.05,**p<0.01,与模型组比较#p<0.05,##p<0.01。
各组小鼠甲状腺淋巴细胞浸润强度、甲状腺滤泡结构改变、病理总分方差不齐,采用G-H检验。
(1)与NOD对照组相比,NOD模型组甲状腺淋巴细胞浸润强度、甲状腺滤泡结构改变、病理评分总分均显著升高(P<0.01);
与NOD模型组相比,NOD资冲颗粒组甲状腺淋巴细胞浸润强度明显减轻(P<0.05),甲状腺滤泡结构改变、病理评分总分显著减少(P<0.01)。
3.3资冲颗粒对EAT小鼠(NOD-SCID)各级卵泡及黄体的影响
表12资冲颗粒对各级卵泡及黄体的影响(n=6)
与对照组比较,*p<0.05,**p<0.01,与模型组比较#p<0.05,##p<0.01。(1)原始卵泡:与NOD对照组相比,NOD模型组原始卵泡显著减少(P<0.01);与NOD模型组相比,NOD资冲颗粒组原始卵泡明显增多(P<0.05)。(2)初级卵泡:与NOD对照组相比,NOD模型组初级卵泡显著减少(P<0.01);与NOD模型组相比,NOD资冲颗粒组初级卵泡明显增多(P<0.05)。(3)次级卵泡:与NOD对照组相比,NOD模型组次级卵泡显著减少(P<0.01);与NOD模型组相比,NOD资冲颗粒组次级卵泡显著增多(P<0.01)。(4)成熟卵泡:各组间成熟卵泡差异不具有统计学差异(P>0.05)。
(5)闭锁卵泡:与NOD对照组相比,NOD模型组闭锁卵泡显著增加(P<0.01);与NOD模型组相比,NOD资冲颗粒组次级卵泡显著减少(P<0.01)。(6)黄体数:与NOD对照组相比,NOD模型组黄体数显著减少(P<0.01);与NOD模型组相比,NOD资冲颗粒组黄体数显著增多(P<0.01)。
3.4资冲颗粒对EAT小鼠(NOD-SCID)血清TPOAb、TGAb、FT3、FT4、TSH的影响
表13资冲颗粒对TPOAb、TGAb、FT3、FT4、TSH的影响(n=6)/>
与对照组比较,*p<0.05,**p<0.01,与模型组比较#p<0.05,##p<0.01。
除TSH外,各组小鼠血清TPOAb、TGAb、FT3、FT4均符合正态分布且方差齐,故采用单因素方差中的LSD检验,TSH采用G-H检验。与对照组相比,NOD模型组的TPOAb、TGAb浓度显著高于对照组(P<0.01),FT3、FT4虽有下降趋势但差异不具有统计学差异(P>0.05),TSH虽有升高趋势差异不具有统计学差异(P>0.05);与模型组相比,NOD资冲颗粒组TPOAb显著下降(P<0.01)、TGAb明显下降(P<0.05);其余组间差异无统计学差异(P>0.05)。
3.5资冲颗粒对EAT小鼠(NOD-SCID)血清AMH、FSH、E2的影响
表14资冲颗粒对AMH、FSH、E2的影响(n=6)
与对照组比较,*p<0.05,**p<0.01,与模型组比较#p<0.05,##p<0.01。各组小鼠血清AMH、FSH、E2均符合正态分布且方差齐,故采用单因素方差中的LSD检验。
(1)AMH:与NOD对照组相比,NOD模型组小鼠血清AMH显著降低(P<0.01);与NOD模型组相比,NOD资冲颗粒组显著升高(P<0.01)。
(2)FSH:与NOD对照组相比,NOD模型组小鼠血清FSH显著升高(P<0.01);与NOD模型组相比,NOD资冲颗粒组显著下降(P<0.01)。
(3)E2:与NOD对照组相比,NOD模型组小鼠血清E2显著降低(P<0.01);与NOD模型组相比,NOD资冲颗粒组明显升高(P<0.05)。
3.6资冲颗粒对EAT小鼠(NOD-SCID)血清ATP、Irisin的影响
表15资冲颗粒对ATP、Irisin的影响(n=6)
与对照组比较,*p<0.05,**p<0.01,与模型组比较#p<0.05,##p<0.01。各组小鼠血清ATP、Irisin均符合正态分布且方差齐,故采用单因素方差中的LSD检验。
(1)ATP:与对照组相比,NOD模型组小鼠ATP显著降低(P<0.01);于模型组相比,NOD资冲颗粒组ATP明显升高(P<0.05);
(2)Irisin:与对照组相比,NOD模型组小鼠Irisin显著降低(P<0.01);于模型组相比,NOD资冲颗粒组Irisin明显升高(P<0.05);
3.6资冲颗粒对EAT小鼠(NOD-SCID)血清IL-17、TG-Fβ、IL-17/TG-Fβ的影响
表16资冲颗粒对IL-17、TG-Fβ、IL-17/TG-Fβ的影响
与对照组比较,*p<0.05,**p<0.01,与模型组比较#p<0.05,##p<0.01。
各组小鼠血清IL-17、TG-Fβ、IL-17/TG-Fβ呈正态分布,方差齐,采用单因素方差中的LSD检验。
(1)IL-17:与对照组相比,NOD模型组小鼠IL-17显著升高(P<0.01);与模型组相比,NOD资冲颗粒组IL-17显著降低(P<0.01);
(2)TG-Fβ:与对照组相比,NOD模型组小鼠TG-Fβ显著降低(P<0.01);与模型组相比,NOD资冲颗粒组TG-Fβ显著升高(P<0.01);
(3)IL-17/TG-Fβ:与对照组相比,NOD模型组小鼠IL-17/TG-Fβ显著升高(P<0.01);与模型组相比,NOD资冲颗粒组IL-17/TG-Fβ显著降低(P<0.01)。
3.7资冲颗粒对EAT小鼠(NOD-SCID)卵巢组织凋亡的影响
TUNEL定位于细胞核,呈绿色荧光;DAPI为蓝色荧光;Merge中绿色+蓝色荧光重合的明黄色荧光为阳性信号。荧光显现的部位以及数量可以反映细胞凋亡的情况。TUNEL染色结果显示NOD模型组小鼠卵巢绿色荧光以卵母细胞及卵巢间质为主。与NOD对照组比较,模型组卵巢荧光面积和数量明显增多;与模型组比较,NOD资冲颗粒组卵巢荧光面积和数量明显减少。对各组小鼠卵巢细胞凋亡指数(AI)进行比较,NOD对照组(2.83±1.87)%、NOD模型组(18.03±2.40)%、NOD资冲颗粒组(5.20±2.20)%。与对照组相比,NOD模型组卵巢细胞凋亡指数显著升高(P<0.01),与模型组相比,NOD资冲颗粒组卵巢细胞凋亡指数显著降低(P<0.01)。见图1。
3.8资冲颗粒对EAT小鼠(NOD-SCID)的卵巢组织BAX、Caspase-3、BCL-2光密度值的影响
表17资冲颗粒对BAX、Caspase-3、BCL-2光密度值的影响(n=6)
与对照组比较,*p<0.05,**p<0.01,与模型组比较#p<0.05,##p<0.01。
各组小鼠卵巢组织BAX、Caspase-3、BCL-2光密度值均符合正态分布且方差齐,故采用单因素方差中的LSD检验。
(1)BAX:卵巢组织中的BAX蛋白在卵巢弥漫表达,卵母细胞、颗粒细胞及间质细胞胞浆均表达。与NOD对照组相比,NOD模型组的BAX蛋白表达量显著升高(P<0.01);与NOD模型组相比,NOD资冲颗粒组的BAX蛋白平均光密度值明显降低(P<0.05)。
(2)Caspase-3:小鼠卵巢组织中的Caspase-3蛋白在卵巢弥漫表达,卵母细胞、颗粒细胞及间质细胞胞浆均表达。与NOD对照组相比,NOD模型组的Caspase-3蛋白平均光密度值显著升高(P<0.01);与NOD模型组相比,NOD资冲颗粒组的Caspase-3蛋白平均光密度值显著降低(P<0.01)。
(3)BCL-2:小鼠卵巢组织中的BCL-2蛋白在卵巢弥漫表达,其中以卵母细胞、颗粒细胞胞浆为主,部分间质细胞(尤其是间质腺细胞)胞浆灶性表达。与NOD对照组相比,NOD模型组的BCL-2蛋白平均光密度值明显降低(P<0.05);与NOD模型组相比,NOD资冲颗粒组的BCL-2蛋白平均光密度值明显升高(P<0.05)。见图2。
3.9资冲颗粒对EAT小鼠(NOD-SCID)的卵巢组织HO-1、LONP1、eNOS光密度值的影响
表18资冲颗粒对HO-1、LONP1、eNOS光密度值的影响(n=6)
与对照组比较,*p<0.05,**p<0.01,与模型组比较#p<0.05,##p<0.01。
各组小鼠卵巢组织HO-1、LONP1、eNOS光密度值均符合正态分布且方差齐,故采用单因素方差中的LSD检验。
(1)HO-1:卵巢组织中的HO-1蛋白在卵巢弥漫表达,卵母细胞、颗粒细胞胞浆均为主,部分间质细胞(尤其是间质腺细胞)胞浆灶性表达。与NOD对照组相比,NOD模型组的HO-1蛋白表达量明显降低(P<0.05);与NOD模型组相比,NOD资冲颗粒组的HO-1蛋白平均光密度值较模型组明显升高(P<0.05)。
(2)LONP1:卵巢组织中的LONP1蛋白在卵巢弥漫表达,在卵母细胞、颗粒细胞胞浆和间质细胞均表达。与NOD对照组相比,NOD模型组的LONP1蛋白表达量显著降低(P<0.01);与NOD模型组相比,NOD资冲颗粒组的LONP1蛋白平均光密度值较模型组显著升高(P<0.01)。
(3)eNOS:卵巢组织中的eNOS在卵巢弥漫表达,包括卵母细胞、颗粒细胞胞浆和部分间质细胞(尤其是间质腺细胞)胞浆、血管内皮等表达。与NOD对照组相比,NOD模型组的eNOS蛋白表达量明显升高(P<0.05);与NOD模型组相比,NOD资冲颗粒组的eNOS蛋白平均光密度值明显降低(P<0.05)。见图3。
3.10资冲颗粒对EAT小鼠(NOD-SCID)的卵巢组织Nrf2、Keap1、HO-1、LONP1蛋白表达的影响
表19资冲颗粒对小鼠卵巢组织Nrf2、Keap1、HO-1、LONP1蛋白表达的影响(n=6)
与对照组比较,*p<0.05,**p<0.01,与模型组比较#p<0.05,##p<0.01。各组小鼠卵巢组织的Keap1、Nrf2、HO-1、LONP1蛋白相对表达量均符合正态分布且方差齐,采用LSD检验。与NOD照组相比,NOD模型组Keap1蛋白表达量呈显著上调趋势(P<0.01),Nrf2、HO-1、LONP1蛋白达量显著下降(P<0.01)。与NOD模型组相比,NOD资冲颗粒组Keap1蛋白表达量呈显著下调趋势(P<0.01),Nrf2、LONP1蛋白表达量呈显著上调趋势(P<0.01),HO-1蛋白表达明显上调(P<0.05)。见图4。
3.11资冲颗粒对EAT小鼠(NOD-SCID)卵巢组织IKKB、p65、IKBα蛋白表达的影响
表20资冲颗粒对小鼠卵巢组织IKKβ、p65、IKBα蛋白表达的影响
与对照组比较,*p<0.05,**p<0.01,与模型组比较#p<0.05,##p<0.01。
各组小鼠卵巢组织的IKKβ、IKBα、p65蛋白相对表达量均符合正态分布且方差齐,采用LSD检验。与NOD照组相比,NOD模型组IKKβ、p65蛋白表达量呈显著上调(P<0.01),IKBα蛋白达量显著下调(P<0.01)。与NOD模型组相比,NOD资冲颗粒组IKKβ、p65蛋白表达量呈显著下调趋势(P<0.01),IKBα蛋白表达量呈明显上调趋势(P<0.05)。见图5。
4结论
本发明运用的国际常用制备EAT模型小鼠的NOD-SCID小鼠成功建立了EAT诱导的DOR模型。造模8周后,EAT小鼠原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡等均有减少,血清性激素AMH、E2显著下降,FSH显著升高。研究结果发现:(1)资冲颗粒可显著升高EAT小鼠(NOD-SCID)的肛温、改善动情周期、升高卵巢脏器指数;(2)资冲颗粒可以增加EAT小鼠(NOD-SCID)的血清AMH、E2、ATP、Irisin水平,降低FSH、TGAb、TPOAb水平;(3)资冲颗粒可以显著增加原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡,减少闭锁卵泡,改善黄体数目;(4)资冲颗粒可以降低IL-17水平,升高TG-Fβ水平,显著降低IL-17/TG-Fβ比值,调节Th17/Treg细胞亚群失衡;(5)资冲颗粒可以降低促凋亡蛋白BAX、Caspase-3水平,增加抗凋亡蛋白BCL-2水平,抑制卵巢细胞凋亡;(6)资冲颗粒可以显著降低卵巢颗粒细胞及卵母细胞中氧化指标eNOS含量,显著增加抗氧化相关蛋白HO-1、LONP1蛋白的含量;(7)资冲颗粒通过激发Keap/Nrf2/HO-1通路抗氧化应激以抗凋亡来调节小鼠的卵巢功能,即下调负性调节抗氧化蛋白Keap1相对含量、上调Nrf2、LONP1、HO-1蛋白相对含量发挥抗氧化应激的作用;(8)资冲颗粒可以抑制NFKΒ/IKKβ通路进行免疫调节抗氧化、抗凋亡改善小鼠卵巢功能。综上,资冲颗粒通过激发Keap/Nrf2/HO-1通路和抑制NFKΒ/IKKβ通路共同发挥降低氧化应激、调节免疫、抗炎等,减少颗粒细胞及卵母细胞凋亡,保护EAT小鼠(NOD-SCID)的卵巢储备功能。
Claims (9)
1.一种组合物在制备治疗自身免疫性甲状腺炎合并卵巢储备功能低下的药物中的用途;
所述组合物是由如下原料药制备而成的制剂:
鹿角胶或鹿角霜6~10份、熟地黄15份、山药15份、山茱萸15份、枸杞子15份。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述药物是增多原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡,减少闭锁卵泡和/或改善黄体数目的药物。
3.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述药物是抑制卵巢细胞凋亡的药物。
4.根据权利要求3所述的用途,其特征在于,所述药物是降低促凋亡蛋白BAX、Caspase-3水平,和/或增加抗凋亡蛋白BCL-2水平的药物。
5.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述药物是降低卵泡刺激素FSH水平,升高E2、ATP 、Irisin水平的药物。
6.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述药物是降低甲状腺抗体和/或升高抗缪勒管激素AMH的药物;所述甲状腺抗体为TPOAb和/或TGAb。
7.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述药物是降低IL-17水平、IL-17/TG-Fβ比值,调节Th17/Treg细胞亚群失衡、和/或升高TG-Fβ水平的药物。
8.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述药物是降低氧化应激指标eNOS含量,增加HO-1蛋白、LONP1蛋白含量,和/或下调Keap1蛋白相对含量、上调Nrf2、LONP1、HO-1蛋白相对含量的药物。
9.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述制剂为口服制剂;所述口服制剂为颗粒剂、溶液剂、膏剂、丸剂、粉剂。
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