CN115227805A - 线粒体多肽Humanin及类似物在制备保护卵巢功能药物中的应用 - Google Patents

线粒体多肽Humanin及类似物在制备保护卵巢功能药物中的应用 Download PDF

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CN115227805A CN202211028911.6A CN202211028911A CN115227805A CN 115227805 A CN115227805 A CN 115227805A CN 202211028911 A CN202211028911 A CN 202211028911A CN 115227805 A CN115227805 A CN 115227805A
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Abstract

本发明涉及涉及线粒体多肽Humanin及类似物在制备保护卵巢功能药物中的应用，属于线粒体多肽Humanin的新用途。将线粒体多肽Humanin应用在制备化疗时保护女性卵巢功能及生育功能药物中；实验结果显示外源性补充Humanin能够明显改善环磷酰胺处理大鼠的卵巢卵泡丢失，增加大鼠的抗缪勒氏管激素水平并抑制卵巢局部细胞凋亡；外源性补充Humanin能够明显逆转卵巢颗粒细胞凋亡以及PI3K/AKT及STAT3信号通路表达异常；本发明为将来基于多肽Humanin的环磷酰胺化疗时卵巢功能及生育力保存的药物开发提供了可能，具有较大的应用价值与前景。

Description

线粒体多肽Humanin及类似物在制备保护卵巢功能药物中的 应用
技术领域
本发明涉及线粒体多肽Humanin的新用途，更具体地，涉及线粒体多肽Humanin及类似物在制备保护卵巢功能药物中的应用，尤其涉及在环磷酰胺化疗时保护卵巢功能及生育功能药物中的用途。
背景技术
据统计，7-10％的乳腺癌病例在育龄妇女中被诊断出来。诊断时年龄小是不良预后因素，大多数年轻女性接受辅助化疗和/或激素治疗，这显著降低了复发和死亡的风险。然而，辅助治疗可能对生育能力产生负面影响。作为一种广泛使用的抗肿瘤和免疫抑制剂，环磷酰胺(CTX)的主要并发症是性腺损伤，特别是在女性患者中。
CTX破坏卵泡的颗粒细胞并降低黄体酮和雌激素的水平，导致卵巢功能下降和卵巢组织纤维化。乳腺癌是女性第一大恶性肿瘤，其发病呈年轻化趋势，很多患者在诊断为乳腺癌之前并未完成生育。而放化疗对卵巢功能的不可逆损伤是患者生育功能下降甚至丧失的重要原因。因此，在开始放化疗之前，应认真思考、讨论和解决生育问题。一项研究发现，38％的女性在被诊断患有癌症并接受化疗后怀孕的可能性较小，癌症幸存者在化疗后面临一系列妊娠并发症的风险，例如流产、糖尿病和贫血。CTX诱发的卵巢损伤的机制很复杂，尚未完全阐明。在机制上，已知CTX通过促进原始卵泡凋亡，加速原始卵泡活化和增加卵泡闭锁进而导致卵巢损伤。CTX还可以损害卵巢血管和基质。因此，避免CTX诱导的年轻女性卵巢损伤以维持女性癌症患者的生育能力正成为越来越紧迫的问题。
Humanin是一种线粒体衍生的肽，由Hashimoto等人于2001年首次鉴定。分子式为C119H203N34O32S2。从阿尔茨海默病患者大脑正常部位的cDNA库中筛选Humanin。研究表明，人蛋白在多种组织和细胞中表达，例如视网膜色素上皮，血管，腺样体β细胞，睾丸和卵巢。用甘氨酸(Gly)取代Humanin的第14位丝氨酸(Ser)的产物比Humanin的生物活性高1000倍。由于HNG比天然多肽更具活性，HNG的应用引起了广泛的关注，包括在临床前研究中。Humanin具有细胞内和细胞外功能，例如(1)有助于线粒体中的逆行信号通路调节；(2)作为抗应激反应的保护因素；(3)抑制活性氧(ROS)生物合成；(4)抵抗内质网应激；(5)通过与Bax的特异性结合抑制异位线粒体外膜(MOM)。
目前未见任何关于线粒体多肽Humanin在环磷酰胺化疗时卵巢保护作用的任何报道。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了线粒体多肽Humanin及其类似物的一种新用途，即将线粒体多肽Humanin在制备化疗时保护卵巢功能及生育能力药物中的应用。本发明通过补充Humanin能够明显改善环磷酰胺处理大鼠的卵巢卵泡丢失，增加大鼠的抗缪勒氏管激素水平并抑制卵巢局部细胞凋亡；外源性补充Humanin能够明显逆转卵巢颗粒细胞凋亡以及PI3K/AKT及STAT3信号通路表达异常；以此解决现有技术中卵巢功能保护的技术问题。
根据本发明第一方面，提供了线粒体多肽Humanin或线粒体多肽Humanin类似物在制备保护卵巢功能药物中的应用。
优选地，所述线粒体多肽Humanin及其类似物通过提高p-PI3K和p-AKT蛋白的表达并抑制Caspase3蛋白的表达，以激活卵巢PI3K/AKT通路并减少卵巢细胞凋亡。
优选地，所述线粒体多肽Humanin及其类似物用于改善卵巢卵泡丢失。
优选地，所述线粒体多肽Humanin及其类似物用于增加卵巢湿重并提高卵巢指数。
优选地，所述线粒体多肽Humanin及其类似物用于提高原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡数量并降低闭锁卵泡数量。
优选地，所述线粒体多肽Humanin及其类似物用于提高Tyr705p-STAT3和Ser727p-STAT3蛋白的表达，以激活卵巢STAT3通路。
优选地，所述线粒体多肽Humanin及其类似物用于增加抗缪勒氏管激素水平。
优选地，所述类似物为线粒体多肽Humanin的第14位丝氨酸被甘氨酸替代。
根据本发明另一方面，提供了线粒体多肽Humanin或线粒体多肽Humanin类似物在制备化疗时保护卵巢功能药物中的应用。
优选地，所述化疗使用的药物为环磷酰胺。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
本发明基于环磷酰胺诱导卵巢损伤大鼠模型，对其进行外源性补充Humanin，发现Humanin能够明显增加大鼠卵巢湿重及卵巢指数，增加环磷酰胺模型大鼠的AMH水平，增加卵泡数量，降低环磷酰胺模型大鼠卵巢局部的凋亡水平以及激活卵巢PI3K/AKT和STAT3信号通路；通过4-HC(4-氢过氧化环磷酰胺)诱导细胞凋亡模型，实验结果表明线粒体多肽Humanin能够激活PI3K/AKT信号通路缓解4-HC引起的细胞凋亡，即线粒体来源肽Humanin在环磷酰胺诱导的卵巢细胞凋亡中发挥重要作用。因此，线粒体来源肽Humanin可作为环磷酰胺化疗时卵巢功能及生育力保存的药物的活性成分，本发明为将来基于线粒体来源肽Humanin的环磷酰胺化疗时卵巢功能及生育力保存药物的开发提供了可能，本发明具有较大的应用价值和发展前景。
附图说明
图1为实施例1各组中大鼠体重(A)、卵巢重量(B)及卵巢指数(C)结果示意图，其中CONTROL为空白对照组，CTX为环磷酰胺大鼠模型组，CTX+HNG为环磷酰胺+Humanin类似物HNG处理组，HNG为单独HNG处理组；
图2为实施例1各组中大鼠卵巢组织HE染色形态示意图；
图3为实施例1各组中大鼠原始卵泡(A)、初级卵泡(B)、次级卵泡(C)数量统计结果；
图4为实施例1各组中大鼠窦卵泡(A)以及闭锁卵泡(B)数量统计结果；
图5为实施例1各组中大鼠AMH水平(A)以及十天内动情期天数(B)统计结果；
图6为实施例1各组中大鼠卵巢TUNEL染色结果(A)以及统计结果(B)；
图7为实施例1各组中大鼠卵巢Bcl2和Bax蛋白的Western Blot蛋白条带图；
图8为实施例1各组中大鼠卵巢Bcl2(A)和Bax蛋白(B)的Western Blot表达定量结果图；
图9为实施例1各组中大鼠卵巢p-Bcl2蛋白的Western Blot蛋白条带图(A)和p-Bcl2蛋白的Western Blot的表达统计图(B)；
图10为实施例1各组中大鼠卵巢Tyr705p-STAT3、Ser727p-STAT3和STAT3蛋白的Western Blot蛋白条带图；
图11为实施例1各组中大鼠卵巢Tyr705p-STAT3(A)、Ser727p-STAT3蛋白(B)的Western Blot表达定量结果图；
图12为实施例1各组中大鼠卵巢p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT and Caspase3蛋白的Western Blot蛋白条带图；
图13为实施例1各组中大鼠卵巢p-PI3K(A)、P-AKT(B)和Caspase3蛋白(C)的Western Blot表达定量结果图；
图14为实施例2中不同浓度梯度的4-HC引起的卵巢颗粒细胞COV434细胞凋亡流式分析图；
图15为实施例2中不同浓度梯度的4-HC引起的卵巢颗粒细胞COV434细胞凋亡率统计图；
图16为实施例2为空白对照组、4-HC组、4-HC+(2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)浓度HNG组的卵巢颗粒细胞COV434细胞凋亡流式分析图；
图17为实施例2为空白对照组、4-HC组、4-HC+(2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL)浓度HNG组的卵巢颗粒细胞COV434细胞凋亡率统计图；
图18为实施例2为空白对照组、4-HC组、4-HC+HNG组、4-HC+HNG+LY294002组的卵巢颗粒细胞COV434细胞凋亡流式分析图；
图19为实施例2为空白对照组、4-HC组、4-HC+HNG组、4-HC+HNG+LY294002组的卵巢颗粒细胞COV434细胞凋亡率统计图；
图20为实施例2为空白对照组、4-HC组、4-HC+HNG组、4-HC+HNG+LY294002组中p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、Caspase 3、and Bcl-2蛋白的Western Blot蛋白条带图；
图21为实施例2为空白对照组、4-HC组、4-HC+HNG组、4-HC+HNG+LY294002组中p-PI3K(A)、p-AKT(B)蛋白的Western Blot表达定量结果图；
图22为实施例2为空白对照组、4-HC组、4-HC+HNG组、4-HC+HNG+LY294002组中Caspase 3(A)、Bcl-2(B)蛋白的Western Blot表达定量结果图；
以上图中*代表p＜0.05；**代表p＜0.01；***代表p＜0.001；****代表p＜0.0001。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
线粒体多肽Humanin由线粒体基因组的16S核糖体RNA基因MT-RNR2上的一个小开放阅读框所编码，由24个氨基酸组成(Met-Ala-Pro-Arg-Gly-Phe-Ser-Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Ala)，在生物体中高度保守；本发明以环磷酰胺诱导卵巢损伤大鼠模型为研究对象，通过外源性补充Humanin类似物HNG(Humanin的第14位丝氨酸被甘氨酸所替代)，比Humanin的生物活性高1000倍。观察大鼠体重及卵巢湿重、卵巢形态学、抗缪勒氏管激素(AMH)水平、卵巢凋亡指标以及PI3K/AKT及STAT3信号通路蛋白水平的变化；同时，本发明通过实验观察并验证了Humanin对卵巢颗粒细胞的保护作用是通过激活PI3K/AKT信号通路实现的，外源性补充Humanin改善了颗粒细胞凋亡率并激活PI3K/AKT信号通路，这种效应能被PI3K抑制剂所抑制。
实施例1：大鼠环磷酰胺卵巢损伤模型的建立以及外源性补充线粒体来源肽Humanin类似物HNG对环磷酰胺大鼠模型细胞凋亡、内分泌、动情周期以及排卵状态影响实验
1、大鼠环磷酰胺卵巢损伤模型的构建
采用环磷酰胺建立大鼠环磷酰胺卵巢损伤模型；选取8周龄SD大鼠(250g左右)，首剂腹腔注射环磷酰胺50mg/kg体重，随后每日腹腔注射环磷酰胺8mg/kg体重，连续注射14天；
2、40只8周龄SD大鼠购买自湖北省疾控中心，动物随机分为4组，每组10只，具体分组如下：
A、空白对照组(CONTROL)
B、环磷酰胺大鼠模型组(CTX)
C、环磷酰胺模型+HNG组(CTX+HNG)
D、HNG组
A组为空白对照组；B、C组大鼠均为环磷酰胺大鼠卵巢损伤模型，其中C组大鼠在模型构建结束前一周开始，每日腹腔注射10mg/kg体重的HNG，连续注射两周(即模型结束后一周)；D组大鼠与C组大鼠同时腹腔注射相同剂量HNG。
3、大鼠体重即卵巢湿重的测定
HNG干预结束后，对各组大鼠进行称重，记录各组大鼠的体重，处死大鼠收集静脉血并取出卵巢组织，对卵巢组织进行称重记录；卵巢指数＝卵巢湿重(mg)/体重(g)；
结果见图1，与大鼠环磷酰胺模型组相比，外源性补充HNG可以明显增加大鼠卵巢湿重并提高卵巢指数。
4、卵巢形态学观察以及原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、窦卵泡以及闭锁卵泡的计数
(1)固定：取新鲜大鼠卵巢组织，将其固定于4％多聚甲醛48h；流水冲洗3次，每次5min；
(2)脱水：按照以下顺序脱水：50％乙醇→70％乙醇→90％乙醇→无水乙醇，各2h；再用二甲苯浸泡两次，每次15min；
(3)浸蜡：将石蜡融化，温度保持在55℃左右；一共需要过三遍蜡，每次2h；
(4)包埋：在包埋模具中加入约模具槽三分之二的蜡液，用镊子夹取组织放入包埋模具，将其放在冰上冷却；用镊子将组织按压平整，固定组织位置；再将包埋盒放在模具上，滴加蜡液；
(5)切片：选择刀口平整无缺刻的部分来进行切削。将包埋好的蜡块放在石蜡切片机上切片，切好的片段用毛笔小心转移到38-40℃的展片台内的清水上，待几分钟后切片完全没有褶皱，选择组织形状完整并且没有刀痕的片子进行捞片；放入60℃烘箱内烤片，烤片过夜，取出后常温保存备用；
(6)将切片进行HE染色后进行卵泡计数，每5张连续卵巢组织切片选取一张，每组一共选8张作HE染色，然后显微镜下观察卵巢组织形态和各级卵泡并进行计数；
各组大鼠HE染色结果见图2，计数结果见图3、图4，从图中可以看出外源性补充HNG可以提高原始卵泡，初级卵泡，次级卵泡和窦卵泡数量并降低闭锁卵泡数量；说明外源性补充HNG能够改善环磷酰胺对大鼠卵巢卵泡的影响。
5、各组大鼠激素水平测定
(1)采集大鼠静脉血，将静脉血置于室温下静置30分钟，待血液凝固后置于低温高速离心机离心，离心条件为4℃、3000g，8分钟；
(2)将收集的血清置于-80℃冰箱，待用；
(3)采用武汉基因美公司的AMH ELISA试剂盒测定大鼠血清中的AMH含量；
结果见图5中的(A)，从图中可以看出外源性补充HNG可以明显增加环磷酰胺模型大鼠的血清AMH水平，说明外源性补充HNG可以改善环磷酰胺模型大鼠的生殖内分泌状态，改善血清中AMH水平。
6、各组大鼠动情周期检测
(1)每天上午九点准备好所需材料和试剂：100μL灭菌枪头、生理盐水、载玻片、铅笔、玻片架；
(2)先将载玻片进行编号，戴上厚手套以防被大鼠咬伤，固定好大鼠使阴道口充分暴露，用100μL移液器吸取30μL生理盐水，快速且轻柔注入大鼠阴道内、回吸，反复几次，肉眼可见移液器枪内生理盐水变浑浊再吸出生理盐水；
(3)将抽吸到的生理盐水涂于载玻片中间位置，均匀抹开；
(4)将载玻片置于玻片架上，自然风干后，用多聚甲醛固定5min；
(5)自然晾干，将瑞氏-姬姆萨染液滴在玻片中间使染液覆盖有细胞区域，持续5min，自然晾干；
(6)显微镜下观察细胞类型，判断大鼠处于动情周期哪个期；
结果见图5中的(B)，从图中可以看出，外源性补充HNG能增加环磷酰胺模型大鼠的动情期天数，说明外源性补充HNG可以改善环磷酰胺模型大鼠的动情周期紊乱。
7、各组大鼠卵巢TUNEL染色
(1)将石蜡切片在37℃恒温箱中烘烤30min；
(2)二甲苯浸泡两次，每次10min；
(3)将切片依次放在无水乙醇→90％乙醇→70％乙醇各5min，然后置于蒸馏水漂洗三次，每次5min；
(4)擦干切片，将蛋白酶k滴在切片上，37℃湿润反应30min；
(5)PBS漂洗两次，每次10min，擦干切片；
(6)每个样本滴加50μL新配制的TdT酶工作液，37℃避光反应1h，阴性对照组不加TdT酶；
(7)PBS漂洗两遍，每次5min，甩去PBS，组织周围擦干；
(8)每个切片滴加50μL Streptavidin-HRP工作液，37℃避光反应30min，甘油封片；
(9)荧光显微镜观察：凋亡细胞发出绿色荧光，观察并拍照；
结果见图6，从图中可以看出外源性补充HNG可以明显减弱环磷酰胺模型大鼠卵巢TUNEL荧光强度，说明外源性补充HNG可以降低环磷酰胺模型大鼠卵巢局部细胞凋亡水平。
8、Westren Blot检测各组凋亡相关蛋白Bcl2、Bax、p-Bcl2蛋白的表达情况
8.1卵巢组织蛋白样品的制备
(1)取50mg卵巢组织放入1.5mL EP管，用PBS漂洗两遍；
(2)用移液器滴加500μL RIPA裂解液(含PMSF)、5μL蛋白酶抑制剂和5μL磷酸酶抑制剂于EP管中，充分碾磨直到看不见组织块；
(3)冰上裂解30min，12000rpm、4℃离心10min；
(4)收集上清。
8.2蛋白浓度的测定
(1)取0.8mL蛋白标准配置液加入到20mg BSA中配成25mg/mL的蛋白标准液，然后取适量蛋白标准液，配成浓度为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL的稀释液；
(2)按A液:B液＝50:1配制BCA工作液，充分混匀；
(3)将20μL上述稀释标准品和2μL待测样品+20μL PBS分别加到96孔板，再在每个孔中加入200μL的BCA混合液；
(4)37℃恒温摇床放置30min，然后用酶标仪测定各孔的OD值，计算待测样品蛋白浓度；
(5)蛋白变性：将待测蛋白上清与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)充分混匀，立即放进95℃恒温水浴锅加热5min，取出放在-20℃备用。
8.3电泳
(1)根据试剂盒说明书配制10％的分离胶和5％的浓缩胶；
(2)配制电泳液；
(3)取出凝胶上的齿梳，在最左边的孔中加入5μL蛋白marker，依次往每个孔加入待测蛋白样品；
(4)电泳：先80V处理30min，然后120V处理60-80min。
8.4转膜
(1)配制转膜液：1包转膜粉剂+800mL超纯水+200mL甲醇；
(2)用适量转膜液湿润转膜夹板，将黑色面朝下，白色面朝上；
(3)切胶：将装胶的电泳架取出，自来水冲洗掉表面泡沫，根据溴酚蓝和蛋白marker位置切掉没有待测样品的胶，全程保证胶处于湿润状态；
(4)切一张大小合适的PVDF膜，用甲醇浸湿活化；
(5)按黑色转膜夹板-海绵垫-切好的凝胶-PVDF膜-海绵垫-白色转膜夹板放置，固定好转膜夹；
(6)往转膜夹加入预冷的转膜液，将转膜槽放在加满冰块的盆中，在280mA、160V下转膜1h。
8.5免疫印迹显色
(1)封闭：按100mL TBST+5g脱脂奶粉配制5％脱脂牛奶；将PVDF膜放进干净的抗体孵育盒中，加入50mL脱脂牛奶进行封闭，然后放在摇床室温孵育2h；
(2)孵育一抗：弃封闭液，将4mL一抗稀释液滴在PVDF膜中，置于4℃冰箱孵育12h；
(3)1×TBST洗涤PVDF膜10min，重复3次；
(4)孵育二抗：参考二抗说明书，按照适当比例用1×TBST稀释二抗，滴在PVDF膜上，室温摇床孵育2h；
(5)1×TBST洗涤PVDF膜10min，重复3次
(6)显影曝光:按照ECL发光试剂盒说明书，将A液和B液同体积混合，避光放置；将ECL发光液滴在PVDF膜上充分覆盖，设置合适时间进行曝光，显影并保存图像；
(7)用imageJ软件进行灰度值分析，分析待测样品蛋白相对表达量。
实验结果见图7、图8、图9，从图9中可以看出外源性补充HNG可以降低p-Bcl2蛋白的表达，说明外源性补充HNG可以减少环磷酰胺模型大鼠卵巢细胞凋亡。
9、Westren Blot检测各组Tyr705p-STAT3、Ser727p-STAT3和STAT3蛋白的表达情况，具体步骤参照实施例1中8中方法；
实验结果见图10、图11，从图中可以看出外源性补充HNG可以提高Tyr705p-STAT3，Ser727p-STAT3蛋白的表达，说明外源性补充HNG可以激活环磷酰胺模型大鼠卵巢STAT3通路。
10、Westren Blot检测各组p-PI3K,PI3K,p-AKT,AKT and Caspase 3蛋白的表达情况，具体步骤参照实施例1中8中方法；
实验结果见图12、图13，从图中可以看出外源性补充HNG可以提高p-PI3K、p-AKT蛋白的表达并抑制Caspase3蛋白的表达，说明外源性补充HNG可以激活环磷酰胺模型大鼠卵巢PI3K/AKT通路并减少卵巢局部细胞凋亡。
实施例2：构建卵巢颗粒细胞系COV434细胞细胞凋亡模型以及外源性HNG减少细胞凋亡的分子机制实验
1、细胞凋亡模型的构建
分别用0、5、10、15、20μM的4-HC(环磷酰胺体内转化后活性成分)处理卵巢颗粒细胞系COV434细胞，放入培养箱培养24h后用流式细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率，具体操作步骤如下：
(1)用不含EDTA的胰酶消化COV434细胞后，1000rpm，离心5min收集细胞；
(2)准备未经凋亡诱导处理的COV434细胞作为阴性实验对照组；
(3)用4℃预冷的PBS洗涤细胞2次，1000rpm离心5min；
(4)配制1×Annexin-binding buffer：用超纯水按1:5稀释5×Annexin-bindingbuffer；
(5)用1×Annexin-binding buffer重悬细胞，调节其浓度为1×106细胞/mL；
(6)取100μL细胞悬液于5ml流式管中，加入5μL FITC AnnexinV和1～2μLPI，轻轻混匀；
(7)室温、避光、反应15min；
(8)加入400μL 1×Annexin-binding buffer，轻柔混匀，冰上放置；
(9)在1h内，进行流式细胞仪的观察和检测；
实验结果见图14、图15，从图中可以看出COV434细胞的凋亡率随着4-HC浓度的增加而增加，将20μM的4-HC作为后续实验所用浓度。
2、外源性补充HNG对4-HC引起的COV434细胞凋亡的影响实验
用20μM浓度的4-HC分别与0、2.5、5、10μg/mL的HNG处理COV434细胞，24h后用流式细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率，具体步骤参照实施例2中1实验方法；
实验结果见图16、图17，从图中可以看出用4-HC处理的COV434细胞的凋亡率随着HNG浓度增加而降低，将10μg/mL的HNG作为后续实验所用浓度。
3、PI3K抑制剂LY294002对外源性补充HNG在4-HC引起的COV434细胞凋亡的影响实验
将COV434细胞分为以下四组：空白对照组、4-HC处理组、4-HC+HNG处理组、4-HC+HNG+LY294002组，处理24h后用流式细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率，具体步骤参照实施例2中1实验方法；
实验结果见图18、图19，从图中可以看出LY294002能明显抑制HNG对4-HC处理后减少细胞凋亡的影响，说明PI3K抑制剂可以抑制HNG的作用。
4、Westren Blot检测各组卵巢颗粒细胞COV434细胞的p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、bcl2 and Caspase 3蛋白的表达情况：具体步骤参照实施例1中8中方法；
实验结果见图20、图21、图22，从图中可以看出外源性补充HNG可以提高p-PI3K、p-AKT蛋白的表达并抑制Bcl2和Caspase3蛋白的表达，HNG的这种效应能够被LY294002所抑制，说明HNG是通过激活PI3K/AKT信号通路来减少细胞凋亡的。
总之，外源性补充HNG能够明显增加大鼠血清AMH水平，改善大鼠动情周期及卵泡状态，激活大鼠卵巢的STAT3和PI3K/AKT信号通路；在卵巢颗粒细胞系COV434细胞构建的细胞凋亡模型中，HNG能够显著降低细胞凋亡，并激活PI3K/AKT信号通路，这种效应可以被PI3K抑制剂LY294002所抑制。因此，我们可以得出结论，线粒体来源肽Humanin类似物HNG可以通过激活PI3K/AKT信号通路改善大鼠环磷酰胺卵巢损伤模型的细胞凋亡。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.线粒体多肽Humanin或线粒体多肽Humanin类似物在制备保护卵巢功能药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述线粒体多肽Humanin及其类似物通过提高p-PI3K和p-AKT蛋白的表达并抑制Caspase3蛋白的表达，以激活卵巢PI3K/AKT通路并减少卵巢细胞凋亡。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述线粒体多肽Humanin及其类似物用于改善卵巢卵泡丢失。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述线粒体多肽Humanin及其类似物用于增加卵巢湿重并提高卵巢指数。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述线粒体多肽Humanin及其类似物用于提高原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡数量并降低闭锁卵泡数量。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述线粒体多肽Humanin及其类似物用于提高Tyr705p-STAT3和Ser727p-STAT3蛋白的表达，以激活卵巢STAT3通路。
7.如权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述线粒体多肽Humanin及其类似物用于增加抗缪勒氏管激素水平。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述类似物为线粒体多肽Humanin的第14位丝氨酸被甘氨酸替代。
9.线粒体多肽Humanin或线粒体多肽Humanin类似物在制备化疗时保护卵巢功能药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述化疗使用的药物为环磷酰胺。
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